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嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素

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潘兰佳, 李杰, 李春星, 汪印. 嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素[J]. 环境工程学报, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
引用本文: 潘兰佳, 李杰, 李春星, 汪印. 嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素[J]. 环境工程学报, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
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PAN Lanjia, LI Jie, LI Chunxing, WANG Yin. Biodegradation of fluoroquinolones by Thermus thermophilus[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
Citation: PAN Lanjia, LI Jie, LI Chunxing, WANG Yin. Biodegradation of fluoroquinolones by Thermus thermophilus[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
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嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素

  • 中国科学院城市环境研究所，中国科学院城市污染物转化重点实验室，厦门 361021

    • 作者简介: 潘兰佳(1991—)，女，博士，在站博士后。研究方向：废弃物资源化及污染物控制。E-mail：ljpan@iue.ac.cn
    通讯作者: 汪印(1969—)，男，博士，研究员。研究方向：固体废物处置与资源化。E-mail：yinwang@iue.ac.cn
  • 基金项目:
    美丽中国生态文明建设科技工程专项(XDA23030301；XDA23020500)；中日政府间国际科技创新合作重点项目(2016YFE0118000)

  • 中图分类号: X592

Biodegradation of fluoroquinolones by Thermus thermophilus

  • Key Laboratory of Urban Pollutant Conversion, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China

    • Corresponding author: WANG Yin, yinwang@iue.ac.cn

摘要

  • 摘要: 氟喹诺酮类抗生素在各种环境基质中积累造成的生态和耐药基因污染等问题已引起广泛的关注。为了能够有效去除环境中氟喹诺酮类抗生素污染并且探究其生物代谢途径，利用嗜热菌Thermus sp. C419在高温(70 ℃)条件下降解2种典型的氟喹诺酮类抗生素(诺氟沙星和恩诺沙星)，分析了菌株C419对这2种药物在单一和混合添加时的降解特性；通过UPLC-MS/MS检测了其相关的降解产物，并推测了可能的代谢途径；利用平板扩散法对生物降解后的氟喹诺酮类药物进行抑菌活性测定。结果表明：氟喹诺酮类化合物可被菌株C419有效降解，降解率为60%~80%；该生物降解过程符合一级动力学模型，培养基中氟喹诺酮类化合物浓度越高，降解率越高，降解半衰期越短；菌株C419对诺氟沙星的生物降解有3条可能的降解途径和7种降解产物，对恩诺沙星的生物降解有4条可能的降解途径和6种降解产物。此外，与2种药物的母体化合物相比，生物降解后药物对不同细菌的抗菌活性均有一定程度的降低，这说明嗜热菌株C419在热环境中去除氟喹诺酮类污染物方面可能会具有良好的实用性和应用前景。
    Abstract: The problems of environmental matrices pollution and resistance genes generation caused by fluoroquinolones accumulation seriously affect human health, thus its removal and transformation have attracted broad attention. In order to effectively remove fluoroquinolone antibiotics from environment and explored their bio-metabolic pathway, a thermophilic bacterium (Thermus sp. strain C419) was used to biodegrade two representative fluoroquinolones (norfloxacin and enrofloxacin) at high temperature of 70 ℃, the degradation characteristics of these two fluoroquinolone alone and their mixture by C419 were analyzed. The degradation products were detected by UPLC-MS/MS to predict the possible metabolic pathway, the antibacterial activity of the biodegraded fluoroquinolones was test by using disk diffusion susceptibility assays. The results showed that fluoroquinolones could be degraded effectively by strain C419 with a degradation efficiency of 60%~75%, the biodegradation process followed the first order kinetic model. Higher fluoroquinolones concentration resulted in higher degradation efficiency and shorter degradation half-life period. The norfloxacin biodegradation by strain C419 occurred via three pathways and yielded seven biodegradation metabolites, while the enrofloxacin biodegradation occurred via four pathways and yielded six biodegradation metabolites. In addition, the biodegrading-metabolites of norfloxacin and enrofloxacin presented attenuated antibacterial activities. The obtained results indicated that the thermophilic fluoroquinolone-degrading Thermus sp. strain C419 presented useful and meaningful application prospect in removing fluoroquinolone contaminants especially from thermal environments.

  • 重金属具有蓄积性、持久性以及高毒性等特点，且拥有广泛的来源，主要有河流径流、城镇污水、工业废水以及近海养殖等[1 − 4]，现已成为海洋环境中备受关注的重要污染物之一[5]. 作为各种污染物主要的汇[6 − 8]，沉积物富集了大量的重金属，并且受海水环境变化的影响，重金属会从沉积物中释放至海水中，不仅影响海水水质，而且易于在水生生物体内富集，通过食物链转移至捕食者或者人体，对人体健康和海洋生态系统造成长期的影响[9 − 10]. 海湾是链接陆地和海洋的重要界面，受到人类活动影响剧烈，是研究重金属污染物发生沉降、输运、转化和埋藏等生物地球化学过程的重要环境. 因此，对海湾沉积物重金属开展研究，分析海洋重金属的污染程度，对海湾环境生态风险评价具有重要的意义[11].

    位于惠州市南部的大亚湾，由于海产资源丰富，已成为是中国南方重要的海湾之一[12]. 位于广东省南部的红海湾，凭借丰富的海洋渔业资源，使得海水养殖业发展迅速，已被列为汕尾市经济开发区，同时也是南海半封闭型海湾规模化养殖试验区[13]. 然而，近几十年来，随着这两大海湾区域经济的发展，海洋生态环境状况已遭受人类活动所带来的不同程度的危害[14 − 15]，城镇生活污水排放、工业企业污染排放、近海养殖等带来的重金属污染成为该区域面临的主要环境问题[16 − 18]. 例如，杨文超等[18 − 19]对2010—2018年期间大亚湾内表层沉积物中的5类重金属进行研究，发现重金属高值区均集中在石化区一带，推测重金属的主要来源可能是沿岸水产养殖和工业企业排放. 唐得昊等[17]对大亚湾2015年采集的23个表层沉积物种5类重金属分析结果显示，重金属总体污染程度达到了中等污染水平，汞（Hg）是潜在风险最高的. 孙钦帮等[15]2015年对红海湾近岸表层沉积物中7类重金属的分析，发现海域沉积物重金属 Cu、Pb、Zn、Cr和As的主要来源为工业废水与城市污水. 尽管前人对该区域重金属开展了不少研究，但是一方面随着经济发展和人口增加会加剧海洋沉积物污染程度，另外一方面，随着国民海洋环保理念不断增强和国家层面海洋环保政策不断完善，使得已有的报道不能充分反映大亚湾和红海湾沉积物中重金属的生态风险状况.

    本研究以大亚湾和红海湾为研究靶区域，采集表层沉积物并分析其中7种重金属含量，分别为砷（As）、锌（Zn）、镉（Cd）、铜（Cu）、铬（Cr）、汞（Hg）和铅（Pb），研究了重金属的空间分布，并推断其潜在来源. 此外，结合潜在生态风险评价法，对沉积物中重金属的污染程度进行评价，以期为改善大亚湾和红海湾海洋环境质量、建立美丽海湾建设提供科学理论依据.

    1.   材料与方法（Material and methods）

    1.1   研究区域与样品采集

    研究区域位于大亚湾和红海湾近岸（图1），大亚湾和红海湾均属于半封闭海湾，水动力条件整体偏弱. 相对于大亚湾，红海湾更开阔，与近海水体交换面积更大，使得红海湾湾内污染物相对难保存，人类活动产生的污染物相对更容易被运移.

    图 1  大亚湾和红海湾采样点站位
    Figure 1.  Sampling stations in Daya Bay and Honghai Bay
    （注：该图基于国家测绘地理信息局标准地图服务网站下载的审图号为粤S（2019）064号的标准地图制作，底图无修改）
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    2021年9月，利用抓斗采泥器，分别在大亚湾（DYW01—DYW05）和红海湾海域（HHW01—HHW09）采集了14个表层沉积物，详细站位见图1. 将各站位沉积物表层未扰动的0—2 cm沉积物分别放入洁净聚乙烯瓶中，贴上提前打印好的标签，之后将样品运回实验室−20 ℃冻存. 严格按照《海洋监测规范》（GB17378—2007） 要求，采集、保存和运输沉积物样品.

    1.2   样品的处理及分析检测

    本研究严格按照《海洋监测规范第 5 部分：沉积物分析》（GB 17378.5-2007）开展实验，对沉积物样品进行前处理及分析检测. 前处理步骤如下：取一部分沉积物样品置于洁净的环境，在室温下自然干燥，筛除沉积物中的杂质（如石头等大颗粒物），用研钵研碎沉积物，过100目网筛，待测重金属含量；另一部分沉积物样品进行冷冻干燥，待测总有机碳.

    重金属测定方法：取一定量的前处理好的沉积物样品，加入到HCl-HNO3-HF-HClO4中，用石墨消解仪进行消解、定容. 样品中Hg和As采用原子荧光光谱法（原子荧光光度计BAF-2000），Cr、Cu、Zn、Cd和Pb采用电感耦合等离子体质谱法（电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS）. Hg、As、Cr、Cu、Zn、Cd和Pb的检测限分别为0.002、0.01、0.4 g、0.3、0.6、0.03 、2.0 mg·kg−1.

    总有机碳测定方法：按照海洋监测规范第5部分沉积物分析（有机碳重铬酸钾氧化-还原容量法）（GB 17378.5-2007），有机碳含量的分析采用的是重铬酸钾氧化硫酸亚铁滴定法，检出限为0.01%.

    1.3   重金属污染评价方法

    1.3.1   单因子污染指数法

    按照《海洋沉积质量标准》（GB 18668-2002），将沉积物分为三类，分别是第一类、第二类和第三类沉积物（表1），对砷、锌、镉、铜、铬、汞和铅开展单因子污染评价分析[3]，计算如式（1）。

    表 1  我国海洋沉积物中重金属含量的标准值
    Table 1.  The standard values of heavy metals in marine sediments of China
    指标Index 海洋沉积物质量标准值/（ mg·kg−1）Standard value of marine sediment
    As Cd Cr Cu Hg Pb Zn
    第Ⅰ类 Class Ⅰ 20 0.5 80 35 0.2 60 150
    第Ⅱ类 Class Ⅱ 65 1.5 150 100 0.5 130 350
    第Ⅲ类 Class Ⅲ 93 5 270 200 1 250 600
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    Cim=CiCin (1)

    其中，重金属i的污染指数用Cim表示；实测浓度（mg·kg−1）用Ci表示，Cin是沉积物重金属评价标准值. 当沉积物判定为污染程度低时，Cim是≤1，其含量满足第一类标准；当沉积物重金属含量超过第一类标准评价时，Cim>1；当沉积物重金属为中等污染程度时，1<Cim≤3；当沉积物重金属为重污染程度时，3<Cim≤6；当沉积物重金属为严重污染程度时，Cim>6.

    1.3.2   沉积物重金属的潜在生态风险评价

    根据瑞典科学家 Hakanson 提出的潜在生态风险指数法，本研究对沉积物开展重金属污染研究，并推断其潜在生态风险评价[20]. 结合不同地域环境背景重金属差异，Hakanson法依据沉积物中重金属浓度及毒性响应特征和污染物类型，不仅能够实现对某一特定环境下单一重金属对环境的影响的评估，而且能实现对多种重金属对环境影响的综合效应的评价，从而实现对重金属的潜在生态风险程度划分的定量分析. 因此，该方法在海洋沉积物重金属风险评价中广泛应用[3, 17, 19]. 具体公示如（2）和（3）：

    Cf=∑niCim (2)
    RI=∑niEir=∑niTir×∑niCif (3)

    其中，Cim代表某种重金属i的污染指数；Cf代表某种重金属的综合污染系数；Pi代表沉积物重金属总体污染指数；Eir表示某一重金属i的潜在生态风险指数；RI是潜在生态风险指数；Cin为沉积物中重金属i的参考值（mg·kg−1）. 重金属背景值往往具有较强区域特征，受多种因子影响，一方面受生物因子干扰（如生物活动），另一方面受非生物过程影响（如水文地质）等多种外在因素的影响. 本研究采用广东省沿海沉积物含量为背景值，As、Cd、Cr、Cu、Hg、Pb 和 Zn含量分别为13、0.14、106、15.5、0.122、30、63.3 mg·kg−1 [21 − 22]；沉积物中某种重金属i的毒性系数使用Tir来表示，代表该重金属毒性水平及生物对该重金属污染的敏感度，本研究标准化重金属的毒性系数是采用Hakanson制定，汞、铅、砷、镉、铬、铜和锌毒性系数分别为40、5、10、30、2、5和5（表2）.

    表 2  沉积物中重金属污染程度及潜在生态危害程度分类
    Table 2.  Contaminant grades and potential ecological hazard levels of heavy metals in sediment
    Eir 单个重金属潜在生态危害程度Potential ecological hazard of single metal RI 重金属总体潜在生态危害程度Overall potential ecological hazard of metals
    ≤50 低等 ≤150 低等
    40—80 中等 150—300 中等
    80—160 较重 300—600 较重
    160—320 重度 600—1200 重度
    >320 极严重 >1200 极严重
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    2.   结果与讨论（Results and discussion）

    2.1   表层沉积物重金属含量和分布特征

    大亚湾和红海湾7种重金属含量及分布特征见图2和表3. 大亚湾Hg、As、Cr、Cu、Zn、Cd 和 Pb含量分别为0.01—0.04、6.59—10.9、45.9—67.4、10.9—16.6、78.1—109.0、0.03—0.08和30.2—36.6 mg·kg−1, 平均值分别为0.03、8.71、59.78、14.2、99.4、0.05、33.4 mg·kg−1, 这与杨文超等[18 − 19]和唐得昊等[17]研究者的结果基本相当. 大亚湾Hg、As含量从近岸到远岸略有增加，Cr、Cu和Zn含量从近岸到远岸呈降低趋势，Cd和Pb在空间分布上没有差异. 在大亚湾内，这7 种重金属含量在空间上不同的分布规律，说明不同重金属含量在地域上存在差异，这可能是由于受沉积物的来源和输运过程等影响. 与文献中2015年和2018年沉积物结果对比[18-19]，发现近年来Hg、Cr和Cu含量明显降低，这可能与“十三五”期间国家层面推动实施一系列海洋环境保护政策有关，改善了海洋环境质量，而As和Zn含量略有波动增大，Pb没有明显变化，这3种重金属含量均满足第I类沉积物标准 （表3），表明表层沉积物污染程度低，属于正常波动.

    图 2  大亚湾和红海湾表层沉积物中有机碳含量和不同重金属浓度的空间分布规律
    Figure 2.  The spatial distributions of TOC and heavy metals in the surface sediments of Daya Bay and Honghai Bay
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    红海湾Hg、As、Cr、Cu、Zn、Cd 和 Pb含量分别为0.005—0.104、2.63—19.2、14.4—65.2、3.4—36.1、21.7—133.0、0—0.23、14.5—57 mg·kg−1,平均值分别为0.049、9.03、46.29、15.4、77.7、0.07、34.1 mg·kg−1, 与孙钦帮等[15]的结果基本相当. 除重金属Cr之外，其他重金属含量分布特征为远岸明显低于近岸，近岸的HHW01和HHW03站位重金属含量较高，可能受人类活动影响显著，远岸站位可能与南海水体交换频繁，重金属较难保存，且外海陆源污染较少. 与文献中2015年沉积物结果对比，发现本研究红海湾重金属含量明显增大（表3），表明近年来，红海湾重金属呈现一定程度富集.

    整体而言，红海湾重金属Hg、As、Cu、Cd和Pb含量明显高于大亚湾的，而红海湾的Cr和Zn含量低于大亚湾的，可能由于沉积物重金属具有不同来源和不同输运过程，造成了这种空间分布差异. 对比其他区域的研究（表3），本研究中两个湾区沉积物中的重金属含量明显低于深圳湾、大鹏湾和珠江口，也低于广东省近岸沉积物重金属含量，然而却高于北部湾的重金属含量. 不同海湾重金属含量的差异，与海湾的经济发展有密切关系，经济发达的海湾重金属含量相对高，经济落后的湾区重金属含量相对较低，这与张起源等[27]研究结果一致.

    表 3  大亚湾和红海湾沉积物中重金属含量及其他区域对比（mg·kg−1）
    Table 3.  Comparison of heavy metals in surface sediments of Daya Bay, Honghai Bay and other bays（mg·kg−1）
    区域Zone 数据统计Data statistics 汞（Hg） 砷（As） 铬（Cr） 铜（Cu） 锌（Zn） 镉（Cd） 铅（Pb） 采样时间 Sampling time 参考文献Reference
    大亚湾Daya Bay 最小值 0.01 6.59 45.9 10.9 78.1 0.03 30.2 2021.09 本研究
    最大值 0.04 10.9 67.4 16.6 109 0.08 36.6
    平均值 0.03 8.71 59.78 14.2 99.4 0.05 33.4
    标准偏差 0.01 1.38 7.91 2.0 11.1 0.02 2.10
    I 类沉积物数量 5 5 5 5 5 5 5
    红海湾Honghai Bay 最小值 0.005 2.63 14.4 3.4 21.7 0.00 14.5
    最大值 0.104 19.2 65.2 36.1 133 0.23 57.0
    平均值 0.049 9.03 46.3 15.4 77.7 0.07 34.1
    标准偏差 0.025 5.19 16.2 10.3 33.8 0.07 13.1
    1类沉积物数量 9 9 9 8 9 9 9
    大亚湾 Daya Bay 平均值 0.04 7.35 — 18.9 83.1 — 33.2 2018.12 [18 − 19]
    大亚湾 Daya Bay 平均值 0.12 6.78 — 22.8 81.9 — 31.7 2015.01 [18 − 19]
    大亚湾 Daya Bay 平均值 0.10 43.1 23.6 88.6 — 33.2 2015.10 [17]
    红海湾 Honghai Bay 平均值 0.07 7.97 15.32 6.29 57.9 0.03 25.4 2015.05 [15]
    深圳湾 Shenzhen Bay 平均值 — 23.2 — 79.3 307 2.26 74.5 2012.11 [23]
    大鹏湾 Dapeng Bay 平均值 0.05 — 63.6 15.7 87.1 — 35.9 1998—2006 [24]
    珠江口 Pearl River Estuary 平均值 — — — 348 383 1.72 103 2007.07 [25]
    广东省近岸Coast of Guangdong Province 平均值 0.13 20.8 — 43.8 140 0.38 44.3 2008.01 [26]
    北部湾Beibu Gulf 平均值 0.03 3.73 — 11.2 27.8 0.06 18.9 2018.08 [3]
    　　“—”:没有数据. “—”: No data.
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    2.2   表层沉积物重金属污染与TOC的关系

    由于TOC对重金属具有极强的富集和络合作用，研究者常利用TOC含量与重金属含量之间的相关性分析，对重金属的来源进行初步判断[3, 17-18]. 本研究，大亚湾沉积物中TOC含量为0.63%—1.21%（均值为0.93%），红海湾沉积物中的为0.39%—1.62%（均值为0.87%），将大亚湾和红海湾沉积物中7种重金属含量与沉积物TOC含量进行了相关性分析，具体结果如下所示（表4）.

    表 4  大亚湾和红海湾沉积物重金属之间及与TOC之间的相关分析
    Table 4.  Correlation between heavy metals and TOC in sediments of Daya Bay and Honghai Bay
    　 TOC 汞 砷 铬 铜 锌 镉 铅
    TOC 1 　 　 　 　 　 　 　
    汞 0.31 1
    砷 0.588* 0.71** 1
    铬 0.41 0.09 0.37 1
    铜 0.68* 0.74** 0.82** 0.54* 1
    锌 0.66* 0.44 0.71** 0.87** 0.85** 1
    镉 0.60* 0.80** 0.81** 0.38 0.94** 0.71** 1
    铅 0.65* 0.72** 0.75** 0.66* 0.94** 0.88** 0.86** 1
    　　*在0.05水平上显著相关；**在0.01水平上显著相关.　　*Significantly correlated at the 0.05 level; **Significantly correlated at the 0.01 level.
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    沉积物中TOC含量与As、Cu、Zn、Cd和Pb含量分别具有显著正相关关系，表明沉积物中TOC的含量会影响这些重金属元素的富集；然而Hg和Cr与TOC没有显著相关关系，表明这两种重金属在沉积物富集受TOC影响较小，可能受人为输入以及其自身的赋存状态影响大. 由此可见，TOC含量影响了部分重金属的分布. 其中，Cu与TOC的相关系数最大，这表明了Cu更易与TOC形成络合物，富集在沉积物中.

    此外，除了Cr分别与Hg、As、Cd没有显著相关性外，其他重金属两两之间均具有显著相关性，推测沉积物中不同重金属之间可能具有同源性，也可能代表了重金属之间具有类似的沉积物输运过程以及相似的空间分布规律;而Cr的来源和自身赋存状态可能与其他重金属有所不同. 相比其他金属，Cr元素来源可能受人为输入的影响较大. 此外，与其他重金属相比，在沉积物中Cr元素主要以残渣态形式存在，主要分布在原生和次生硅酸盐矿物晶格中, 性质稳定, 难以迁移和被生物利用.

    2.3   表层沉积物重金属污染程度分析

    对大亚湾和红海湾中沉积物重金属含量进行单因子分析，发现大亚湾内所有沉积物的重金属污染因子均<1，表明污染程度低，满足第I类沉积物标准；然而红海湾内，仅有HHW01站位Cu的污染因子超过1，属于中度污染程度，其余站位重金属污染因子均小于1，污染程度低，满足第I类沉积物标准. 大亚湾表层沉积物重金属单因子污染指数在0.06—0.84之间，平均值为0.44±0.23；红海湾的为0.00—1.03之间，平均值为0.42±0.26. 综合大亚湾和红海湾的结果，重金属污染指数平均值大小为Cr>Zn>Pb>As>Cu>Pb>Cd，推测Cr、Zn和Pb是湾区沉积物中主要的环境污染因子. 大亚湾的综合污染指数（Cf）平均值为3.07±0.26，而红海湾Cf平均值为2.95±1.33，其中红海湾近岸的HHW01和HHW03站位的Cf值较高. 除了HHW01站位Cf高于5，属于中等污染水平外，其余站位均低于5，污染较低.

    2.4   重金属潜在生态风险评价

    评价本研究中两个湾区重金属潜在生态风险，获得了2项生态风险指标（表5），分别是单个重金属潜在生态风险指数和综合生态风险指数.

    表 5  大亚湾和红海湾表层沉积物重金属单因子污染指数、综合污染指数、潜在单个重金属生态风险系数和总体生态风险指数
    Table 5.  Single factor pollution index （Cim）, comprehensive pollution index （Cf）, potential ecological hazard coefficients （Eir）, and risk indices （RI） of heavy metals in surface sediments of Daya Bay and Honghai Bay
    站位Station Cim Cf Eir RI
    As Cd Cr Cu Hg Pb Zn As Cd Cr Cu Hg Pb Zn
    DYW01 0.33 0.12 0.82 0.39 0.07 0.54 0.67 2.93 5.07 12.9 1.24 4.35 9.18 5.38 1.58 39.7
    DYW02 0.42 0.10 0.79 0.47 0.17 0.57 0.71 3.23 6.42 10.7 1.20 5.35 21.6 5.70 1.67 52.7
    DYW03 0.44 0.16 0.84 0.45 0.12 0.56 0.73 3.29 6.7 17.1 1.27 5.03 15.1 5.60 1.72 52.6
    DYW04 0.45 0.06 0.57 0.31 0.21 0.50 0.52 2.63 6.95 6.43 0.87 3.52 27.5 5.03 1.23 51.6
    DYW05 0.55 0.10 0.70 0.41 0.21 0.61 0.69 3.28 8.38 10.7 1.06 4.68 27.5 6.10 1.64 60.1
    HHW01 0.81 0.46 0.63 1.03 0.52 0.95 0.82 5.22 12.5 49.3 0.95 11.6 68.2 9.5 1.94 154
    HHW02 0.32 0.06 0.31 0.17 0.28 0.29 0.27 1.69 4.92 6.43 0.46 1.87 36.1 2.92 0.63 53.3
    HHW03 0.96 0.28 0.82 0.87 0.32 0.84 0.89 4.97 14.8 30.0 1.23 9.81 42 8.35 2.1 108.2
    HHW04 0.13 0.00 0.18 0.10 0.03 0.24 0.14 0.82 2.02 0.00 0.27 1.1 3.3 2.42 0.34 9.4
    HHW05 0.41 0.10 0.56 0.29 0.24 0.56 0.45 2.61 6.36 10.7 0.84 3.23 31.5 5.63 1.07 59.3
    HHW06 0.41 0.08 0.57 0.29 0.21 0.54 0.44 2.53 6.36 8.57 0.86 3.23 26.9 5.38 1.03 52.3
    HHW07 0.45 0.16 0.75 0.41 0.23 0.60 0.58 3.18 6.88 17.1 1.14 4.61 30.2 6.00 1.36 67.3
    HHW08 0.14 0.08 0.79 0.47 0.21 0.66 0.61 2.97 2.17 8.57 1.2 5.35 26.9 6.63 1.45 52.3
    HHW09 0.43 0.10 0.60 0.35 0.17 0.44 0.47 2.56 6.58 10.7 0.91 3.94 22.3 4.38 1.12 49.9
    均值 average 0.45 0.13 0.64 0.43 0.21 0.56 0.57 — 6.86 14.23 0.96 4.83 27.73 5.64 1.35 —
    　　“—”:没有数据. “—”: No data.
     | Show Table
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    大亚湾Hg、As、Cr、Cu、Zn、Cd 和 Pb的潜在风险系数平均值为6.70、11.6、1.13、4.59、20.2、5.56和1.57，表明重金属潜在生态风险水平较低，相对而言，Hg潜在风险程度最高，其次是Cd和As.

    红海湾Hg、As、Cr、Cu、Zn、Cd 和 Pb的潜在风险系数平均值为6.95、15.7、0.87、4.97、31.9、5.69和1.23，表明重金属潜在生态风险水平较低，与大亚湾重金属的风险水平相同. 其中，红海湾HHW01站位Cd和Hg的潜在风险系数分别为49.3和68.2，属于中等危害程度.

    通过对红海湾和大亚湾的重金属综合潜在生态风险指数计算，发现两个湾区的指数均<150，属于低等潜在风险水平. 以上研究表明，随着我国不断加强海洋生态环境治理，已经取得较为理想的成效，近年来沉积物污染程度有降低的趋势. 但是，随着大亚湾和红海湾经济区工业化和城市化的不断发展，以及人口的不断聚集，该区域污染程度和潜在生态风险程度未来可能还会增大，仍需要继续加强监管.

    3.   结论（Conclusion）

    1）大亚湾Hg、As含量近岸低于远岸，Cr、Cu和Zn含量近岸高于远岸，Cd和Pb近岸和远岸相差不大. 除重金属Cr之外，红海湾其他重金属含量近岸明显高于远岸. 这表明大亚湾重金属来源可能较为复杂，而红海湾重金属来源较为一致，主要来自于陆源输入.

    2）红海湾重金属Hg、As、Cu、Cd和Pb含量明显高于大亚湾的，而红海湾的Cr和Zn含量低于大亚湾的. 与历史数据相比，大亚湾近年来Hg、Cr和Cu含量明显降低，而As和Zn含量有增大的趋势，Pb没有明显变化，而红海湾重金属有明显富集. 与其他区域相比，大亚湾和红海湾沉积物中重金属含量处于较低水平.

    3）大亚湾和红海湾沉积物中TOC与As、Cu、Zn、Cd和Pb呈良好的线性正相关关系，揭示了TOC含量影响了这些重金属元素在沉积物中的富集；然而Hg和Cr与TOC没有显著相关关系，表明这两种重金属在沉积物富集受TOC影响较小，这可能与该2种元素自身的赋存状态有关.

    4）红海湾和大亚湾重金属综合潜在生态风险分析显示，该区域低等潜在风险水平. 但是红海湾局部近岸站位Cd和Hg的潜在风险系数较高，属于中等危害程度.

  • 图 1  5 mg·L−1和10 mg·L−1体系中诺氟沙星的残留浓度和菌体生长量

    Figure 1.  Residual concentration of norfloxacin and bacterial growth in 5 mg·L−1 and 10 mg·L−1 system

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    图 2  5 mg·L−1和10 mg·L−1体系中恩诺沙星的残留浓度和菌体生长量

    Figure 2.  Residual concentration of enrofloxacin and bacterial growth in 5 mg·L−1 and 10 mg·L−1 system

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    图 3  诺氟沙星和恩诺沙星混合降解体系中2种药物的残留浓度以及菌体生长量

    Figure 3.  Residual concentration of two drugs and the bacterial growth in the mixture of norfloxacin and enrofloxacin

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    图 4  菌株C419降解诺氟沙星的可能反应途径

    Figure 4.  Proposed reaction pathways for norfloxacin degradation by strain C419

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    图 5  菌株C419降解恩诺沙星的可能反应途径

    Figure 5.  Proposed reaction pathways for enrofloxacin degradation by strain C419

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    图 6  菌株C419降解216 h后诺氟沙星和恩诺沙星在培养基中的残留浓度及其相对于母体化合物的抑制率

    Figure 6.  Residual concentrations of norfloxacin and enrofloxacin and their inhibition rates relative to parent compounds in liquid media after 216 h of incubation with strain C419

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    表 1  不同处理组氟喹诺酮类降解的动力学参数及拟合方程

    Table 1.  Kinetic parameters and fitting equations for fluoroquinolones degradation in different treatments

    处理组k/h−1t1/2/hR2拟合方程
    NOR (5 mg·L−1)0.015 644.40.815 6lnC/C0=−0.015 6t−0.104 3
    NOR (10 mg·L−1)0.018 138.30.935 8lnC/C0=−0.018 1t−0.065 1
    ENR (5 mg·L−1)0.019 136.20.911 5lnC/C0=−0.019 1t−0.088 9
    ENR (10 mg·L−1)0.023 229.90.873 4lnC/C0=−0.023 2t−0.093 9
    NOR (混合)0.022 830.40.950 4lnC/C0=−0.022 8t−0.034 3
    ENR (混合)0.022 331.10.941 3lnC/C0=−0.022 3t−0.081 0
    处理组k/h−1t1/2/hR2拟合方程
    NOR (5 mg·L−1)0.015 644.40.815 6lnC/C0=−0.015 6t−0.104 3
    NOR (10 mg·L−1)0.018 138.30.935 8lnC/C0=−0.018 1t−0.065 1
    ENR (5 mg·L−1)0.019 136.20.911 5lnC/C0=−0.019 1t−0.088 9
    ENR (10 mg·L−1)0.023 229.90.873 4lnC/C0=−0.023 2t−0.093 9
    NOR (混合)0.022 830.40.950 4lnC/C0=−0.022 8t−0.034 3
    ENR (混合)0.022 331.10.941 3lnC/C0=−0.022 3t−0.081 0
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    表 2  诺氟沙星及其生物降解代谢产物的质谱数据及化学式

    Table 2.  Mass spectral data and calculated formula of norfloxacin and its biodegradation metabolites

    化合物[M+H]+离子碎片质荷比化学式碎片损失
    NOR320302C16H18FN3O3H2O
    276CO2
    205CO2, C2H4N, C2H5
    N1-1/N1-2336318C16H18FN3O4H2O
    288F, C2H5
    245H2O, CO2, C2H5
    N2-1/N2-2351322C16H17FN3O5C2H5
    284H2O, F, C2H5
    245H2O, CO2, C2H5
    N3322304C14H10FN2O6H2O
    258F, COOH
    231H2O, CO2, C2H5
    N4266248C12H12FN3O3H2O
    221COOH
    N5251233C12H11FN2O3H2O
    205H2O, C2H4
    149H2O, C2H4, 2个CO
    N6223207C10H7FN2O3NH2
    194HCO
    178COOH
    N7278250C14H16FN3O2CO
    232H2O, CO
    207HCO, C2H4N
    N8318300C16H19N3O4H2O
    256H2O, CO2
    N9348330C17H18FN3O4H2O
    274COOH, C2H5
    化合物[M+H]+离子碎片质荷比化学式碎片损失
    NOR320302C16H18FN3O3H2O
    276CO2
    205CO2, C2H4N, C2H5
    N1-1/N1-2336318C16H18FN3O4H2O
    288F, C2H5
    245H2O, CO2, C2H5
    N2-1/N2-2351322C16H17FN3O5C2H5
    284H2O, F, C2H5
    245H2O, CO2, C2H5
    N3322304C14H10FN2O6H2O
    258F, COOH
    231H2O, CO2, C2H5
    N4266248C12H12FN3O3H2O
    221COOH
    N5251233C12H11FN2O3H2O
    205H2O, C2H4
    149H2O, C2H4, 2个CO
    N6223207C10H7FN2O3NH2
    194HCO
    178COOH
    N7278250C14H16FN3O2CO
    232H2O, CO
    207HCO, C2H4N
    N8318300C16H19N3O4H2O
    256H2O, CO2
    N9348330C17H18FN3O4H2O
    274COOH, C2H5
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    表 3  恩诺沙星及其生物降解代谢产物的质谱数据及化学式

    Table 3.  Mass spectral data and calculated formula of enrofloxacin and its biodegradation metabolites

    化合物[M+H]+离子碎片质荷比化学式碎片损失
    ENR360342C19H22FN3O3H2O
    316CO2
    245COOH, C2H4, C3H6
    E1320302C16H18FN3O3H2O
    258OH, COOH
    E2392374C19H22FN3O5H2O
    321C3H6, C2H5
    261CH2COOH, C4H10N
    E3305287C15H13FN2O4H2O
    276HCO
    261CO2
    E4324306C14H14FN3O5H2O
    219C2H6N, COOH, NH2
    E5-1/E5-2308290C14H14FN3O4H2O
    262H2O, CO
    193COOH, C3H4NO
    E6358340C19H23FN3O4H2O
    269H2O, C3H6, C2H5
    243COOH, C2H4, C3H6
    E7374356C19H23N3O5H2O
    312H2O, CO2
    化合物[M+H]+离子碎片质荷比化学式碎片损失
    ENR360342C19H22FN3O3H2O
    316CO2
    245COOH, C2H4, C3H6
    E1320302C16H18FN3O3H2O
    258OH, COOH
    E2392374C19H22FN3O5H2O
    321C3H6, C2H5
    261CH2COOH, C4H10N
    E3305287C15H13FN2O4H2O
    276HCO
    261CO2
    E4324306C14H14FN3O5H2O
    219C2H6N, COOH, NH2
    E5-1/E5-2308290C14H14FN3O4H2O
    262H2O, CO
    193COOH, C3H4NO
    E6358340C19H23FN3O4H2O
    269H2O, C3H6, C2H5
    243COOH, C2H4, C3H6
    E7374356C19H23N3O5H2O
    312H2O, CO2
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  • 期刊类型引用(1)

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-03
  • 录用日期:  2019-09-05
  • 刊出日期:  2020-04-01
潘兰佳, 李杰, 李春星, 汪印. 嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素[J]. 环境工程学报, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
引用本文: 潘兰佳, 李杰, 李春星, 汪印. 嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素[J]. 环境工程学报, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
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PAN Lanjia, LI Jie, LI Chunxing, WANG Yin. Biodegradation of fluoroquinolones by Thermus thermophilus[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
Citation: PAN Lanjia, LI Jie, LI Chunxing, WANG Yin. Biodegradation of fluoroquinolones by Thermus thermophilus[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(4): 1092-1102. doi: 10.12030/j.cjee.201907008
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嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素

    通讯作者: 汪印(1969—)，男，博士，研究员。研究方向：固体废物处置与资源化。E-mail：yinwang@iue.ac.cn
    作者简介: 潘兰佳(1991—)，女，博士，在站博士后。研究方向：废弃物资源化及污染物控制。E-mail：ljpan@iue.ac.cn
  • 中国科学院城市环境研究所，中国科学院城市污染物转化重点实验室，厦门 361021
  • 收稿日期:  2019-07-03
  • 录用日期:  2019-09-05
  • 网络出版日期:  2020-05-06
基金项目:
美丽中国生态文明建设科技工程专项(XDA23030301；XDA23020500)；中日政府间国际科技创新合作重点项目(2016YFE0118000)

摘要: 氟喹诺酮类抗生素在各种环境基质中积累造成的生态和耐药基因污染等问题已引起广泛的关注。为了能够有效去除环境中氟喹诺酮类抗生素污染并且探究其生物代谢途径，利用嗜热菌Thermus sp. C419在高温(70 ℃)条件下降解2种典型的氟喹诺酮类抗生素(诺氟沙星和恩诺沙星)，分析了菌株C419对这2种药物在单一和混合添加时的降解特性；通过UPLC-MS/MS检测了其相关的降解产物，并推测了可能的代谢途径；利用平板扩散法对生物降解后的氟喹诺酮类药物进行抑菌活性测定。结果表明：氟喹诺酮类化合物可被菌株C419有效降解，降解率为60%~80%；该生物降解过程符合一级动力学模型，培养基中氟喹诺酮类化合物浓度越高，降解率越高，降解半衰期越短；菌株C419对诺氟沙星的生物降解有3条可能的降解途径和7种降解产物，对恩诺沙星的生物降解有4条可能的降解途径和6种降解产物。此外，与2种药物的母体化合物相比，生物降解后药物对不同细菌的抗菌活性均有一定程度的降低，这说明嗜热菌株C419在热环境中去除氟喹诺酮类污染物方面可能会具有良好的实用性和应用前景。

English Abstract

    全文HTML

  • 氟喹诺酮类药物因其广谱性和疗效好而被广泛应用于兽医临床治疗，目前使用最多的是第3代产品，包括氧氟沙星，诺氟沙星(NOR)、恩诺沙星(ENR)和环丙沙星等。进入动物体内的药物不能被完全吸收，50%以上会随动物粪尿排出体外，最终导致大量氟喹诺酮类化合物进入环境中。有研究[1-3]表明，此类药物可以在许多环境基质中检出，甚至在一些居民生活供水中也有少量存在。在对广州多处饮用水进行药物检测分析时发现，氟喹诺酮药物的浓度为1.0~679.7 ng·L−1 [4]；FICK等[5]从多个饮用水井取样检测，结果显示其中某些氟喹诺酮类药物浓度高达1 µg·L−1。不同环境基质中的氟喹诺酮类药物可能会影响环境过程、破坏生态系统服务并导致氟喹诺酮类耐药基因的产生和传播[6]，最终会对人类健康造成威胁。为使畜禽粪便在作为肥料资源利用之前能够尽可能地去除其中残留的抗生素药物，通常利用高温堆肥工艺对其进行处理，但氟喹诺酮类药物因喹诺酮环的存在而表现出较高的稳定性，特别是耐水解和耐高温等性质，普通的堆肥很难实现该类药物的完全去除。而且，氟喹诺酮类化合物作为抗菌药物，还可抵抗微生物的降解转化[7]。据报道[8]，氟喹诺酮类药物在高温堆肥中具有较强的抗逆性，因此，其在堆肥产品中的大量残留已成为一个急待解决的问题。

    近年来，研究者探索了电化学氧化[9]、高级氧化[10]、光降解[11]、材料吸附[12]和生物降解法[13]等多种方法以去除环境中的抗生素污染。生物降解法作为一种环境友好且有效的抗生素去除方法受到了广泛的关注，而微生物在环境污染物的生物降解中起着重要的作用。有研究[14]发现，堆肥中氟喹诺酮类药物的完全去除可通过接种微生物来实现。目前，已发现多种微生物具有降解氟喹诺酮类药物的能力，如微杆菌属的细菌可降解NOR，白腐真菌(Irpex lacteus, Panus tigrinus, Dichomitus squalens等)能降解转化NOR、氧氟沙星和环丙沙星[15-18]。另外，为了确定该类药物的生物降解模式，一些研究[19-20]分析了典型的氟喹诺酮类药物生物降解后的产物。据报道[21]，ENR可以通过木腐真菌转化为CO2和其他一些代谢物；环丙沙星也可被木腐菌通过羟基化、脱羧、脱氟和哌嗪环降解等途径转化。然而以上关于微生物降解转化氟喹诺酮类药物性能和降解机制的实验均是在常温(25~30 ℃)的条件下进行，在与堆肥温度相近的热环境中(70 ℃)的相关研究报道较少。

    本研究以前期从药厂污泥筛选得到的嗜热菌Thermus sp. C419(CGMCC 1.16184, GenBank登录号: KY784655C419)[22]为降解菌株，探究其在70 ℃的高温条件下对常用的2种氟喹诺酮类药物(NOR和ENR)单独和混合存在时的生物降解情况，并对药物的降解动力学、生物降解产物和可能的代谢途径进行研究分析，最后通过鉴定生物降解后药物的残留抗菌活性，分析其对微生物的毒性大小。本研究探索了氟喹诺酮类药物在高温条件下的降解转化，以期为畜禽粪便高温堆肥工艺提供可降解氟喹诺酮类药物的堆肥菌剂，实现堆肥过程畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的高效降解。

1.   材料与方法

    1.1.   药品与培养基

  • 本实验过程中所用的NOR和ENR购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验采用无机盐培养基(MMSM)进行生物降解实验，主要成分包括FeSO4·7H2O 0.013 g·L−1、CaCl2·2H2O 0.013 g·L−1、Na2EDTA·2H2O 0.018 g·L−1、MgSO4·7H2O 0.25 g·L−1、KH2PO4 5 g·L−1、NH4NO3 5 g·L−1、Na2HPO4 7.5 g·L−1、酵母提取物0.6 g·L−1、乙酸钠0.5 g·L−1、NOR/ENR 5 mg·L−1或10 mg·L−1。采用Luria-Bertani(LB)培养基(胰蛋白胨10 g·L−1、NaCl 5 g·L−1、酵母提取物5 g·L−1)进行细菌细胞的增殖培养。

    • 1.2.   实验方法

  • 1)生物降解实验。250 mL的锥形瓶中添加100 mL的MMSM培养基(乙酸钠浓度0.5 g·L−1)，接种3%的菌株C419菌悬液，并根据畜禽粪便中抗生素的典型浓度(1~10 mg·kg−1)[23]，设定降解单一药物实验中的低剂量组NOR/ENR药物浓度为5 mg·L−1，高剂量组NOR/ENR药物浓度为10 mg·L−1；2种药物混合降解实验体系中，NOR/ENR药物浓度各为5 mg·L−1。培养液置于70 ℃、转速为150 r·min−1的摇床避光培养，在0、12、24、48、72、120、168和216 h取样测定药物残留浓度以及菌体生长量。实验中通过称重法确定培养期间蒸发水的量，并在取样前添加无菌水至原重量。取样后，样品利用0.45 µm针式滤膜过滤，所获液体保存在棕色色谱瓶中并存放在4 ℃的冰箱中待测。

    利用一级动力学模型拟合菌株C419对氟喹诺酮类生物降解动力学，计算方法见式(1)。

    式中：C0为初始浓度，mg·L−1；C为实验时间t时的药物浓度，mg·L−1；k为降解速率常数，h−1。

    生物降解的半衰期t1/2的计算方法如式(2)所示。

    2)生物降解代谢物的提取。取氟喹诺酮药物生物降解后的上清液进行离心(8 000 r·min−1)，并用针式滤膜(0.22 µm)过滤。用与样品等量的乙酸乙酯提取样品中的降解产物，提取步骤重复3次。收集乙酸乙酯，用氮吹仪将其吹干，最后用甲醇溶解提取物，所获液体保存在棕色色谱瓶中并存放在4 ℃的冰箱中待测。

    3)残留抗菌活性测定。通过改进的平板扩散药敏实验，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，革兰氏阴性)和大肠杆菌K12 (Escherichia coli，革兰氏阴性)对氟喹诺酮类药物及其代谢物的残留抗菌活性进行检测[18]。主要实验步骤：将1 mL的菌悬液(OD600 = 1.0)接种到LB半固体培养基(琼脂含量0.8%)中混合均匀，并分装至培养皿中。待培养基凝固后，在培养基上放置4个直径为6 mm的牛津杯，并在杯子中加入样品和氟喹诺酮类药物(5 mg·L−1)各200 µL。将培养皿置于在37 ℃培养箱中，20 h之后取出测定抑菌圈的大小。通过对比原始药物的抑菌圈与降解后样品抑菌圈的大小得到相对的抑制率，以此来评估实验样品残留的抗菌活性。

    • 1.3.   分析方法

  • 利用高效液相色谱(Hitachi L-2000, 日本)测定各氟喹诺酮类抗生素的浓度。检测条件如下：流动相为0.02 mol·L−1的三氯乙酸、乙腈和甲醇(74∶22∶4，体积比)，利用安捷伦C-18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)进行色谱分离，柱温设定为30 ℃，激发波长设定为278 nm，进样量为10 µL。

    利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS, AB Sciex 6500，美国)对氟喹诺酮类抗生素的微生物降解代谢产物进行分析。色谱柱为岛津C18色谱柱(20 mm×75 mm, 1.6 µm，日本)，色谱分离温度为30 ℃。流动相由0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)组成。流速为0.3 mL·min−1，样品注入量为10 µL。洗脱程序为：B相在20 min内完成10%~100%的梯度洗脱，随后以10%的B相等度洗脱5 min。该质谱仪配备了一个电喷雾接口(ESI)，ESI源设定为正离子模式，温度为350 ℃，电压设置为4.5 kV。检测器于质荷比为50~700时对样品进行全面扫描，获得代谢物。检测结束后，利用分析软件Analyst 1.6.3对结果进行分析。根据查阅的文献和EAWAG-BBD代谢通路预测系统(http://eawag-bbd.ethz.ch/UNK t/)的预测路径确定降解产物，并在Low-MS条件下对产物进行鉴定，进一步证实了降解产物的结构。

2.   结果与讨论

    2.1.   NOR和ENR的生物降解

  • 菌株C419对单一药物NOR的降解情况如图1所示。低剂量(5 mg·L−1)处理组中，菌株C419在初始24 h的生长速度快于高剂量(10 mg·L−1)处理组，但2组的最大生长量无明显差异。高、低剂量处理组在72 h内，对NOR的降解率分别为66%和60%；72 h后，NOR浓度基本不再降低。出现以上现象的主要原因可能是，在72 h后，菌体的生物量开始下降，菌体不再生长或者繁殖速率低于菌体的死亡速率，进而说明NOR降解主要发生在菌体生物量增长阶段。图2反映了菌株C419降解单一药物ENR的结果。低剂量(5 mg·L−1)处理组中，ENR的生物降解在初始48 h逐渐增加，与细菌的生长趋势一致；高剂量(10 mg·L−1)处理组也出现类似的现象。随着降解时间继续延长，虽然菌体生长量开始下降，但是ENR的降解还在继续，120 h后低剂量组达到最高降解率(75%)，168 h后高浓度处理组达到最高降解率(80%)。由以上结果可知，ENR的降解不局限于菌体生物量的增长阶段，高浓度ENR的降解需要更长时间，且最终的降解率更高；同时，结果也表明菌株C419在氟喹诺酮药物高剂量处理组中表现出更强的降解能力。

    对比NOR与ENR的降解，菌株C419对单一药物NOR或ENR(5 mg·L−1)的降解率分别为60%和75%，这说明菌株C419对ENR的降解效率更高，但是需要的时间更长。对比该菌株降解环丙沙星的效率(57%)[22]，本研究中菌株C419对NOR与ENR的降解效率更高，这主要是因为不同类型氟喹诺酮类药物降解效果与药物分子结构的差异及其对微生物的毒性有关[23]。在3种氟喹诺酮药物(NOR、ENR、环丙沙星)中，环丙沙星对菌株C419的降解活性的抑制毒性最强，NOR次之，ENR最弱。该结果与AMORIM等[17]的研究结果一致。

    在环境基质中，氟喹诺酮类化合物通常是同时存在的，因此，评价菌株对混合药物的生物降解能力具有重要意义。图3反映了在2种氟喹诺酮类药物(NOR和ENR)混合体系中，菌株C419对他们的降解以及菌体生长的情况。在混合降解体系中，65%以上的NOR在培养48 h后被去除；ENR降解率则在培养120 h后达到最大值77%。与单一抗生素降解结果(5 mg·L−1 NOR：72 h降解60%；5 mg·L−1 ENR：120 h降解75%)相比，混合降解体系中各抗生素的降解效率更高，降解完成的时间更短。

    综合以上结果可知，培养基中氟喹诺酮类药物种类越多或者抗生素浓度越高，菌株对抗生素的降解效率越高。其原因可能是，本研究中利用的菌株Thermus sp. C419是一种被证明具有合成淀粉酶、漆酶、锰过氧化物酶等耐热酶能力的嗜热菌[24]。根据已有研究[18, 25]，这些酶广泛存在于真菌、细菌和植物中，并已被用于降解各种有机污染物，包括氟喹诺酮类药物，而且酶降解和修饰是抗生素药物等有机污染物生物降解的重要机制。由此推断，菌株C419对氟喹诺酮药物的降解是酶的作用结果。但是底物浓度过低将无法刺激微生物降解酶的产生，这会导致生物降解受到限制[26]。另有研究[27]指出，底物浓度的增加可以提高降解酶的活力。因此，高浓度或者种类多样的氟喹诺酮药物可以促进菌株C419合成更高酶活的降解酶，从而提高生物降解效率。另外，氟喹诺酮类药物的降解速率在菌体生长初期速度较快，这可能是由于乙酸钠作为外加碳源的促进作用导致的。随着乙酸钠的逐渐消耗，氟喹诺酮类药物的降解随之减弱。有研究[28]表明，易降解碳源的存在可以增加菌株生物量，并诱导参与化合物降解的特定酶的合成。而且，营养物质可以明显改善微生物生长和关键酶的活性，进一步增强微生物的共代谢作用[29]。

    • 2.2.   NOR和ENR的生物降解动力学分析

  • 一级动力学模型通常被用于描述抗生素的降解行为[13, 17, 30]，因此，本研究采用该模型拟合NOR和ENR的生物降解过程。由表1可以看出，各处理组的可决系数(R2)为0.815 6~0.950 4，这说明本实验数据与一级动力学模型拟合较好。不同浓度的NOR和ENR的降解速率常数(k)为0.015 6~0.023 2 h−1；2种药物混合体系中的降解速率常数分别为0.022 8 h−1和0.022 3 h−1；菌株C419在不同实验条件下对于这2种氟喹诺酮类药物的降解半衰期为29.9~44.4 h。对于单一药物的降解而言，低剂量处理组的NOR和ENR的半衰期都高于高剂量处理组，而降解速率常数均小于高剂量处理组，这说明高浓度下2种氟喹诺酮类药物的去除速率更快。此外，当菌株C419降解NOR和ENR混合液时，这2种药物的半衰期均低于单一药物降解时的半衰期，同时，降解速率常数均大于单一药物降解情况。

    • 2.3.   生物降解产物的鉴定

  • 利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)对NOR和ENR的微生物降解代谢产物进行分析。相关产物的结构是基于参考文献中的方法[16-19]和EAWAG-BBD途径预测系统所得出，并通过产物离子分析进一步确认。NOR和ENR产物的质谱数据、相关的化学式和产物分子离子碎片损失结果见表2和表3。根据这些结果，提出了降解NOR和ENR可能的代谢途径(如图4和图5所示)，氟喹诺酮类化合物有多条微生物降解途径，这与已有的研究结果[31]一致。

    菌株C419降解NOR的代谢途径如图4所示。NOR的哌嗪环通过生物降解后由2个不同的途径开环并转化为2种不同的化合物(N1-1和N1-2)。产物N1-1和N1-2可被进一步氧化生成N2-1和N2-2[16]。在N2-1到N4的过程中，发生了一系列反应，包括脱羧反应和侧链基团的去除。虽然N1-1和N4之间存在中间产物，但由于这些化合物的不稳定性，因此，质谱检测并未获得相关信息。从N2-2到N4和N5的反应是通过胺氧化去除一个“R基团”的方式进行的。产物N6是由N5的吡啶环去除C2H5而获得的。上述代谢途径主要是基于EAWAG-BBD途径预测系统提出的，N1、N2、N3、N4和N6这5种降解产物首次在本研究中被提出。产物N1(C16H18FN3O4, m/z 336)和N5(C12H11FN2O3, m/z 251)曾在白腐真菌降解NOR的实验中[16]被检测出。另外，在菌株Labrys portucalensis F11 降解 NOR 生成的中间体中首次发现产物 N7(C14H16FN3O2, m/z 278) 和 N8(C16H19N3O4, m/z 318)。产物N9(C17H18FN3O4, m/z 348)降解木质素真菌的研究[18]表明其为代谢产物之一。

    菌株C419降解ENR的代谢途径如图5所示。首先产物E1是通过氧化去除吡啶环上的环丙基而得到的，然后将E1的哌嗪环氧化开环生成产物E4和E5。E5有2种可能的结构，包括E5-1和E5-2。ENR也可能被氧化成E2，并通过氧化去除胺的“R基团”的方式进一步转化为E3。氟喹诺酮类化合物的转化都有相同的趋势，即哌嗪取代基始终是酶的作用位点[17]。产物E6(C19H23FN3O4, m/z 358)和E7(C19H23N3O5, m/z 374)也为褐腐菌降解ENR的产物[19]。产物E6可能是由羟基自由基对初始的ENR分子上氟位点的攻击所产生的，产物E7是E6进一步羟基化所生成的。由于ENR的代谢反应复杂，只有稳定的中间体才能被分离和鉴定出。

    • 2.4.   残留抗菌活性分析

  • 本研究利用革兰氏阴性菌-大肠杆菌K12和革兰氏阳性菌-枯草芽孢杆菌作为检测降解后药物的残留抗菌活性的目标微生物，通过比较氟喹诺酮类原药和生物降解后样品的抑菌圈大小得出样品对微生物的相对抑制率，来评估降解产物的残留抗菌活性。图6展示了生物降解后氟喹诺酮药物的残留浓度以及对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌K12的相对抑制作用，结果表明，与母体化合物抑菌活性(100%)相比，2种氟喹诺酮类药物通过生物降解之后，其抑菌活性均有一定程度的降低。实验发现，NOR溶液和生物降解后的NOR样品对枯草芽孢杆菌均无抑制作用，因此，图6中没有显示相应结果。生物降解后的NOR样品对大肠杆菌K12的抑制作用与原始的NOR溶液相比降低了30%左右。而经生物降解后的ENR对大肠杆菌K12的抑制活性仍较高，与母体化合物相比仅降低20%，对枯草芽孢杆菌的抑制降低了45%。

    由以上实验结果可知，生物降解之后的喹诺酮类药物仍然具有一定的抗菌活性。氟喹诺酮类药物的降解不彻底是其抗菌活性高的原因之一。氟喹诺酮类药物的抑菌活性主要在于哌嗪环和氟取代基[15]。虽然哌嗪环通常是降解酶的作用点，但本研究中其代谢产物结构复杂，一些活性基团未被完全清除，因此，其抗菌活性并未完全消失。同时，培养基中未被生物降解的母体化合物同样会造成较高的抗菌活性。ČVANČAROVA等[18]利用从环境中获得的多种微生物检测降解之后的氟喹诺酮药物的毒性，发现所有被测微生物均被高度抑制，这表明代谢产物仍然具有很高的抗菌活性。BECKER等[32]利用真菌漆酶去除废水中的抗生素(包括10种氟喹诺酮类抗生素)，发现抗生素的毒性仅略有下降。因此，生物降解并不能完全去除氟喹诺酮类药物的毒性，一些物理化学降解方法也是如此[33]。由此推断，如果氟喹诺酮类未被彻底矿化，复杂的降解产物的残留抗菌活性仍不可低估。

3.   结论

  • 1)菌株C419具有降解NOR和ENR的能力。C419单独降解NOR时，在高剂量和低剂量处理组中，NOR的去除率分别为66%和60%；C419单独降解ENR时，在高剂量和低剂量处理组中，ENR的去除率分别为80%和75%。

    2)菌株C419降解NOR和ENR混合物时，对2种药物的去除率分别为65%和77%，均比降解单一药物时的去除率高。

    3)NOR和ENR的生物降解遵循一级动力学模型。通过模型解析可以发现，培养基中氟喹诺酮类药物浓度越高或者混合降解时，药物的半衰期越短，降解效率越高。

    4)利用UPLC-MS/MS确定了NOR和ENR可能的生物降解产物，并根据文献和代谢途径预测系统提出2种药物可能的代谢途径。另外，生物降解后的氟喹诺酮类药物抗菌活性减弱，但并未完全消失。因此，须进一步减少代谢产物的活性，以实现该菌株的工程应用。

参考文献 (33)

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