本研究富集反硝化菌群及A²/O反应器内的接种污泥均取自北京高碑店污水处理厂A²/O工艺回流污泥。A²/O反应器进水由北京东坝污水处理厂提供，为实际生活污水，其主要指标为：COD 72.33~228.47 mg·L⁻¹、NH₄⁺-N 22.36~79.91 mg·L⁻¹、总磷(TP) 1.09~5.15 mg·L⁻¹、COD/N 1.2~4.2、pH 7.38~7.85。

A²/O反应器的有效容积为102 L，结构如图1所示。反应器包含3个独立的反应池和1个二次沉淀池，二沉池有效容积为16 L。第1个和第2个圆柱体反应器分别是厌氧(有效容积16 L)和缺氧池(有效容积16 L)。第3个反应池(有效容积54 L)为好氧池，被分成了4个室，泥水混合液在其中经“S”型缺口流动。

系统总体运行近110 d。厌氧池、缺氧池、好氧池和二次沉淀池的水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)分别控制在2 h、2 h、6.7 h和2 h。机械搅拌器(HJ-541/HJ-931，SUNSUN公司，中国)用于进水箱中污水搅拌、促进厌氧池和缺氧池污泥内循环，以及好氧池中的污泥流动。实际污水的pH为7.38~7.85，储存于1个水箱中，由泵引入反应器。内循环由最后一个好氧室到缺氧池进行污泥回流，外循环由二次沉淀池到厌氧池进行污泥回流。进水流量、内外循环流量均由蠕动泵控制(BT100-2J/BT300-2J，LONGER公司，中国)，流量为193 L·d⁻¹。对厌氧池和缺氧池进行污泥循环，以使得污水和活性污泥完全混合，流量为386 L·d⁻¹。由气泵提供连续曝气(最大流速50 L·min⁻¹，SQG Corp公司，中国)，并连接穿孔管至每个好氧室，溶解氧(dissolved oxygen，DO)保持在0.3~2.0 mg·L⁻¹，采用空气流量计控制曝气量。pH和DO由pH和DO测定仪监测(HQ30d，HACH公司，美国)。反应液温度控制在15~29 ℃。当温度低于15 ℃时，进水箱和好氧池第三室采用加热装置(JRB-230/JRB-210，SUNSUN公司，中国)进行加温。污泥停留时间(sludge retention time，SRT)为20~30 d，通过手动从二次沉淀池排放适量污泥以控制污泥龄。

1)启动阶段(第1天至第15天)。接种污泥至A²/O反应器，初始反应器内平均污泥质量浓度接近5 000 mg·L⁻¹。随着反应器运行，接种污泥逐渐适应厌氧-缺氧-好氧的环境及本研究所采用的实验参数，期间对反应器的生物除磷能力进行分析，以明确生物除磷途径。

2)阶段1(第16天至第41天)。考察系统的生物除磷性能及生物除磷途径。

3)阶段2(第42天至第110天)。在第41天，向A²/O反应器中加入富含反硝化菌群的活性污泥，添加比例约为3.4%(由3.5 L添加至102 L)。该菌群来源于SBR在(20±2) °C、pH(7.5±0.2)和DO为0的条件下，以亚硝酸钠和乙酸钠为底物，根据前一周期的底物反应速率和COD/N适当调节本周期的底物流加速率即底物浓度，富集培养得到反硝化菌群。该菌群中含假单胞菌属Pseudomonas 56.13%，脱氯单胞菌属Dechloromonas 5.19%，黄杆菌属Flavobacterium 11.70%，陶厄氏菌属Thauera 7.76%和红杆菌属Rhodobacter 3.48%，总占比为84.26%。系统的最高亚硝酸盐反硝化速率超过270 mg·(L·h)⁻¹，COD/N约为2.7。该菌群可同时利用亚硝酸盐和硝酸盐为电子受体进行反硝化^[29]，实验评价添加反硝化菌群后系统的生物除磷性能及生物除磷途径。

在进行化学分析前，样品首先采用中速定性滤纸进行过滤。分析指标有TP、COD、NO₃⁻-N等，按照国家环保总局规定的标准方法测定^[30]。

反硝化除磷率 (η) 定义为反硝化吸磷量占总吸磷量的比例^[31]。计算式为式 (1) 。

式中：C_TP-Ano-S和C_TP-Ano-E分别指缺氧段磷吸收开始和结束时TP，mg·L⁻¹；C_TP-Aer-S和C_TP-Aer-E分别指好氧段磷吸收开始和结束时的TP，mg·L⁻¹。

取污泥样品进行DNA提取、PCR扩增(V3–V4)、琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化，采用Illumina Miseq03测序平台进行16S rRNA高通量测序(生工生物工程股份有限公司，上海)。对结果进行过滤处理，得到优化序列。在97%相似度水平下进行操作分类单元(OTU)聚类分析，研究结果用于描述不同微生物群落之间的相似性和差异性，从而明确主要物种比例。

在近15 d的反应器启动期内，TP去除率呈逐渐上升趋势且跨度很大，由34.69%经49.85%至61.68%。COD去除率较为稳定，为52.53%~61.86%。这说明取自污水处理厂的接种污泥在本研究的设计参数下，已逐渐适应了A²/O工艺的运行，结果如图2所示。从除磷效果来分析，在阶段1，TP的去除途径以厌氧释磷和好氧吸磷为主，反硝化除磷现象并不显著。

待反应进行至第41天，A²/O系统加入富集的反硝化菌群，添加比例约为3.4%(3.5 L添加至102 L)。该菌群来源于SBR在(20±2) °C、pH(7.5±0.2)和DO为0的条件下，根据底物反应速率调节底物的流加速率，富集得到的富含反硝化菌群的活性污泥，其最高亚硝酸盐反硝化速率超过270 mg·(L·h)⁻¹，系统中COD/N约为2.7，且该菌群可同时利用亚硝酸盐和硝酸盐为电子受体进行反硝化^[29]。系统运行至第65天后，出现了显著的反硝化除磷现象，进水TP为4.34 mg·L⁻¹，厌氧释磷后TP升至17.52 mg·L⁻¹，缺氧出水TP大幅降至3.02 mg·L⁻¹。即使温度低至约15 °C，反硝化除磷效果仍很显著，在TP去除率为88.48%的前提下，反硝化除磷率高达85.19%。当反应进行至第69天，好氧第4室的TP为最小值 (0.28 mg·L⁻¹) 。在第65天后，反硝化除磷率持续保持在较高且稳定的水平，平均值约为64.62%，反硝化除磷途径TP去除负荷均值约为0.014 8 kg·(m³·d)⁻¹。

图2(b)表明，在阶段2，反硝化菌群添加到A²/O系统内，厌氧区COD利用率逐渐增加至约80%，并且伴随着明显的厌氧释磷现象。这表明在厌氧区用于释磷的COD比例逐渐增加。然而，缺氧区COD的减少量较小，这说明细菌是利用储存的内碳源PHA进行的有效吸磷。已证实短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)，即挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)在厌氧区可作为碳源用于PHA的释放和储存，然后将储存的PHA用于缺氧区磷吸收^[32]。本研究富集培养反硝化菌群采用的碳源是乙酸钠，属于VFA，故该菌群可利用实际生活污水中所含的VFA。此外，缺氧出水的NO₃⁻-N大体约为1 mg·L⁻¹，这表明NO₃⁻基本上已通过反硝化除磷和反硝化2种途径实现脱氮，而缺氧出水中TP仍较高，这表明因硝酸盐不足致使磷被吸收的目标并未在缺氧段全部实现。

结合研究结果对此现象进行解释：1) 在启动期、阶段1和阶段2前期，虽然A²/O反应器中存在土著反硝化菌群，但并未发挥出显著的反硝化除磷能力，可能是由于能发挥反硝化除磷功能的细菌比例小、活性低；2) 以往研究表明，A²/O反应器常规运行，未能将土著反硝化菌群驯化发挥出反硝化除磷功能，本研究通过外加功能菌且保留，并淘洗无用细菌 (“换泥”) 方能实现；3) 本研究为单因素实验，在未改变A²/O反应器运行参数的前提下，只投加了富集得到的富含反硝化菌群的活性污泥，故出现的显著反硝化除磷现象归因于添加的富集得到的反硝化菌群；4) 已有研究报道某些类型的反硝化细菌具有除磷功能^[24-28]，有些类型的PAOs也可进行反硝化除磷，通过在A²/O系统交替的厌氧-缺氧-好氧条件，刺激反硝化菌群逐渐发挥生物除磷功能，此过程需要一段时间；5) 富集得到的富含反硝化菌群的活性污泥，反硝化菌比例和活性均极高 (相比于土著反硝化菌) ，且投加比例适宜。

图3表明系统中生物除磷的途径在反硝化菌群添加前后发生了显著变化。由厌氧释磷-好氧吸磷逐渐过渡到厌氧释磷-缺氧吸磷的反硝化除磷途径，通过阶段1和阶段2不同反应池TP稳定期均值变化可证实。添加反硝化菌群之前(阶段1)，进水、厌氧出水、缺氧出水和好氧第4室出水的TP平均值分别为2.66 mg·L⁻¹、3.91 mg·L⁻¹、3.14 mg·L⁻¹和1.33 mg·L⁻¹。因此，计算得到的缺氧吸磷量(0.77 mg·L⁻¹)与好氧吸磷量(1.81 mg·L⁻¹)的比率约为0.43，即平均反硝化除磷率约为29.84%。这表明好氧吸磷在生物除磷中发挥了重要作用。然而，在A²/O系统中添加富集的反硝化菌群后(阶段2自第65天起)，进水、厌氧出水、缺氧出水和好氧第4室出水的TP分别为2.86 mg·L⁻¹、11.95 mg·L⁻¹、4.10 mg·L⁻¹和0.83 mg·L⁻¹，缺氧吸磷量(7.85 mg·L⁻¹)与好氧吸磷量(3.27 mg·L⁻¹)的比率显著增加到2.40，即平均反硝化除磷率提高至73.34%。这说明反硝化除磷在生物除磷中起主导作用。上述分析证明了该单污泥A²/O系统可达到反硝化除磷的预期效果。此外，由于二次沉淀池出现二次释磷现象，故将其有效体积缩小至11 L，以缩短水力停留时间，缓解二次释磷的程度。

属水平细菌群落结构如图4所示。yrd2_1为接种污泥；yrd2_3为富集培养后的反硝化菌群；S_1为A²/O反应器添加菌群前(运行第41天)的混合污泥样品；A1_2为A²/O反应器添加菌群后(运行第42天)的厌氧池污泥样品；A2_2为A²/O反应器添加菌群后(运行第42天)的缺氧池污泥样品；O_2为A²/O反应器添加菌群后(运行第42天)的好氧池污泥样品；S_3为A²/O反应器添加菌群后(运行第101天)的混合污泥样品。反硝化菌群富集后，已报道的具有反硝化功能的假单胞菌属Pseudomonas、脱氯单胞菌属Dechloromonas、黄杆菌属Flavobacterium、陶厄氏菌属Thauera、红杆菌属Rhodobacter、热单胞菌属Thermomonas为主要优势菌属，相对丰度分别增加至56.13%、5.19%、11.70%、7.76%、3.48%和0.87%，较接种污泥显著提高^[29]。A²/O反应器运行至第41天(未添加反硝化菌群)，未出现显著的反硝化除磷现象。此时，混合污泥样品S_1中Thauera、Ottowia、Ferruginibacter、Novosphingobium、Sulfuritalea等几种菌属比例相对较高，约为3%~6%，主要发挥其反硝化功能^[33-36]。

待在A²/O反应器缺氧区添加了富集的反硝化菌群后，由于活性污泥A²/O工艺为连续流运行，活性污泥流动和混合良好，故不同反应池的细菌群落结构相似(见图4中的A1_2、A2_2和O_2样品)。运行至第101天时，混合污泥样品S_3显示，Terrimonas、Ferruginibacter、Ottowia、Rhodobacter、Thermomonas、Dechloromonas等菌属占优势，其中已知Dechloromonas、Rhodobacter属DPAOs，Thermomonas属PAOs^[24-28]。这几种具有反硝化除磷功能的菌属在反硝化菌群富集后比例升高，且在A²/O反应器运行至第101天反硝化除磷现象显著时为相对优势菌属。在接种污泥中Dechloromonas、Rhodobacter、Thermomonas占比分别为0.27%、1.33%、0.11%，反硝化菌群富集后分别占比4.95%、3.49%、0.87%，A²/O反应器运行至第101天分别占比0.66%、1.27%、3.38%。推测所富集的反硝化菌群添加至A²/O反应器内，在长期运行中，受反应参数等因素影响，如Dechloromonas、Rhodobacter、Thermomonas等几类具有反硝化除磷功能的菌属与反应器内活性污泥中的其他一部分菌属产生协同或竞争作用并逐渐发挥优势作用，因而出现较为显著的反硝化除磷现象。尽管比例较小，但生物活性较高。具体涉及的菌属间的作用机制较为复杂，尚需进一步探究。

采用单一和易降解有机碳源会产生污泥膨胀现象^[37]，而本研究所添加的反硝化菌群由SBR富集培养得到，在富集期间以乙酸钠作为唯一有机碳源^[29]，未发生污泥膨胀且污泥沉降性能提高(SVI由高于110 mL·g⁻¹下降至低于70 mL·g⁻¹)。该结果与间歇运行每周期开始快速进料模式和晶核假说原理有关^[38-39]。结果表明，沉降能力强的污泥易分布于沉淀池底部靠近中心管的位置^[40]。由于A²/O反应器内的接种污泥与SBR内的接种污泥均取自同一污水处理厂回流污泥，且SBR富集培养后活性污泥沉降性提高，故添加的富含反硝化菌群的活性污泥易分布于A²/O反应器的二次沉淀池底部。传统活性污泥工艺二次沉淀池的剩余污泥与外回流污泥均由沉淀池底部输出，如图5所示。因此，为防止添加的反硝化菌群随剩余污泥排放而流失，可将二次沉淀池剩余污泥排泥位置由池底部提高^[41]，至沉淀泥面层下方接近泥面层位置，使得该菌群保留于A²/O反应器内，延长其污泥龄并提高其比例，实现生物强化作用。

1)将反硝化菌群添加到单污泥A²/O工艺中，通过活性污泥在厌氧-缺氧-好氧的环境下交替运行，刺激反硝化菌群发挥生物除磷功能，简化了DPAOs在厌氧-缺氧条件或厌氧-缺氧-好氧条件下的富集培养程序。研究结果可为探索基于传统活性污泥系统的低碳途径生物脱氮除磷工艺、并更好地利用反硝化除磷菌提供参考。

2)在该反硝化菌群添加于A²/O工艺后，体系的除磷途径由明显的厌氧释磷-好氧吸磷途径向厌氧释磷-缺氧吸磷的反硝化除磷途径过渡，表现出显著的反硝化除磷现象，且具有反硝化除磷功能的菌群为相对优势菌属。

3)添加的富含反硝化菌群的活性污泥的沉降能力高于A²/O系统内的活性污泥，将传统二次沉淀池剩余污泥排泥位置由池底部提高至沉淀泥面层下方接近泥面层位置，可防止添加的反硝化菌群随剩余污泥排放而流失。