藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响

易涛, 山鹰, 黄渤, 唐涛, 高旻天, 魏伟. 藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082
引用本文: 易涛, 山鹰, 黄渤, 唐涛, 高旻天, 魏伟. 藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082
YI Tao, SHAN Ying, HUANG Bo, TANG Tao, GAO Mintian, WEI Wei. Effect of algae-bacteria co-culture on Chlorella sp. growth and phenol degradation[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082
Citation: YI Tao, SHAN Ying, HUANG Bo, TANG Tao, GAO Mintian, WEI Wei. Effect of algae-bacteria co-culture on Chlorella sp. growth and phenol degradation[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082

藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响

    作者简介: 易涛(1995—),男,硕士研究生。研究方向:微藻废水处理。E-mail:yitao@sari.ac.cn
    通讯作者: 唐涛(1984—),男,博士,副研究员。研究方向:微藻生物技术。E-mail:tangt@sari.ac.cn
  • 中图分类号: X703

Effect of algae-bacteria co-culture on Chlorella sp. growth and phenol degradation

    Corresponding author: TANG Tao, tangt@sari.ac.cn
  • 摘要: 工业苯酚废水无序排放会对环境造成极大危害,构建既能去除苯酚又能积累微藻生物质的藻菌组合对实现苯酚废水净化及其资源化利用具有重要意义。首先,研究了小球藻对苯酚的耐受性和降解性能;然后,构建了其与简单芽胞杆菌Bacillus simplex的共培养体系;最后,测试了藻菌比、藻菌接种浓度和苯酚浓度等对小球藻生长及苯酚降解的影响。结果表明:小球藻能耐受400 mg·L−1的苯酚,但其对100~600 mg·L−1苯酚的降解率仅为1.21%~11.66%;对于藻菌共培养体系,在固定小球藻接种浓度为0.2 g·L−1、藻菌比为1∶4~4∶1条件下,3~5 d完全降解了400 mg·L−1的苯酚,小球藻叶绿素(a+b)含量较单藻组增加了0.14~2.21倍,且随着藻菌比降低,苯酚降解效率及小球藻生物量逐步提高;在固定藻菌比为1∶1、小球藻初始接种浓度为0.05~0.4 g·L−1条件下,4~5 d完全降解400 mg·L−1苯酚,且在藻接种浓度为0.2 g·L−1条件下,小球藻具有最高的比生长速率;在藻菌接种浓度0.2 g·L−1、藻菌比1∶1条件下,6 d内完全降解500 mg·L−1的苯酚,且在各苯酚浓度(200~600 mg·L−1)下,小球藻叶绿素(a+b)含量较初始接种值增加了1.54~4.71倍。与简单芽胞杆菌共培养可以促进小球藻生长并提高其苯酚降解能力,在苯酚废水净化及资源化利用领域展现了一定的应用潜力。
  • 相较于传统硝化-反硝化生物脱氮工艺,厌氧氨氧化技术因其高效低耗的显著优势而受到研究者的广泛关注[1]。在实际应用中,厌氧氨氧化技术常常与亚硝化技术耦合,共同实现污水中氮素的去除,称为部分亚硝化-厌氧氨氧化工艺(partial nitrification-anammox,PNA),也叫自养脱氮工艺。根据亚硝化与厌氧氨氧化2个反应是否在同一个反应器中发生,能将PNA工艺分为一段式和两段式。从经济性和操作方便来看,一段式PNA工艺更具优势,但工艺稳定运行的控制也更为困难。目前,PNA工艺已经成功应用于高氨氮污水处理(侧流污泥消化液、垃圾渗滤液等)[2-3],但是对于低氨氮浓度的主流城市污水,可以普及的工程化应用尚为空白。特别对于曝气量、溶解氧等环境条件的变化,会导致工艺性能失稳、脱氮效能下降,严重影响了该工艺的工程化推广,有效的恢复策略亟待研究。

    在一段式PNA工艺中,曝气操作是控制工艺性能稳定性的关键因素[4],曝气速率能直接影响体系内溶解氧浓度的大小。亚硝化过程需要好氧条件,而厌氧氨氧化需要较为严格的厌氧环境,这给一段式PNA工艺高效脱氮性能的发挥带来了困难。曝气量较低,不利于亚硝化反应,同时也难以为厌氧氨氧化过程提供充足的反应基质;而曝气量过高,抑制了厌氧氨氧化反应活性,也会导致亚硝酸盐氧化菌的大量增殖,使得性能恶化、体系崩溃[5]。尽管通过曝气操作维持PNA工艺稳定性的相关研究已有报道[6],但是很少关注失稳后工艺性能恢复的调控策略,特别是仅通过曝气调控原位恢复工艺脱氮性能。

    本研究采用气升式内循环反应器构建一段式PNA工艺系统,通过曝气调控考察反应器脱氮性能的变化,解析自养脱氮污泥变化特征及反应活性,探究过量曝气失稳后PNA工艺性能恢复的可行性及调控策略,解析恢复过程中功能微生物丰度变化,以期为厌氧氨氧化工艺在主流条件下应用提供理论指导和技术支持。

    一段式PNA工艺系统,见图1

    图 1  一段式PNA系统

    主反应器由有机玻璃制成,总有效体积为2 L,其中反应区容积为1.6 L,沉淀区容积为0.4 L。空气泵为系统提供曝气,通过气体流量计调控曝气速率,曝气位点设置于反应区底部。利用进水泵将基质桶中的模拟废水输送至反应区,回流泵用于回流沉淀区底部的污泥。整个系统的混合液随着气泡的提升而在反应区形成循环。系统温度维持在25 ℃,进水pH值维持在7.8~8.2。

    接种污泥取自实验室已稳定运行的一段式PNA反应器混合絮体污泥,VSS为0.67 g/L,TS为1.35 g/L,总氮去除率达到0.47 kg N/m3·d。

    实验用水为人工配置的低氨氮废水[4],以NH4HCO3为唯一氮源,以KH2PO4为磷源,不含有机碳源。具体废水组成如下:NH4HCO3 50 mg/L,KH2PO4 41 mg/L,CaCl2 36 mg/L,MgCl2 40 mg/L, ZnSO4 0.215 mg/L,NiCl2 0.095 mg/L,NaSeO4 0.21 mg/L,MnCl2 0.495 mg/L,H3BO3 0.007 mg/L,Na2·EDTA 8.304 mg/L, CuSO4 0.125 mg/L,CoCl2 0.12 mg/L,NaMo4 0.11 mg/L,FeSO4 5 mg/L。

    实验共连续运行160 d,整个过程可以分为4个阶段:阶段Ⅰ(启动及稳定阶段,1~25 d),阶段Ⅱ(失稳阶段,26~40 d),阶段Ⅲ(恢复阶段,41~134 d),阶段Ⅳ(再稳定阶段,135~160 d)。其中,失稳阶段人为地增大曝气速率,造成工艺脱氮性能恶化。各阶段的操作条件,见表1。分别在第20、40和155 d,采集污泥样品并测定污泥浓度,提取细胞外聚合物测定蛋白质含量。同时开展批次实验测定污泥的氨氧化活性(不含厌氧氨氧化)、亚硝酸盐氧化活性、厌氧氨氧化活性和反硝化活性,并送样检测微生物群落结构及多样性。

    表 1  工艺操作条件
    阶段t/d曝气速率/L·min−1溶解氧/mg·L−1进水氨氮/mg·L−1进水氮负荷/kg N·(m3·d)−1
    1~250.200.10~0.2550±1.810.60±0.02
    26~401.000.85~1.05
    41~640.100.05~0.10
    65~1100.200.10~0.15
    111~1340.300.25~0.30
    135~1600.300.25~0.30
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    采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮浓度;采用离子色谱法测定亚硝氮、硝氮浓度;利用pH计原位测定反应区的pH;溶解氧浓度由便携式溶解氧仪原位测定;称量法测定污泥的VSS和TS;采用热碱水解结合高速离心和涡旋振荡的方法提取胞外聚合物中的蛋白质 [5],蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法;污泥活性的测定参考CHEN et al[4]的研究;氮反应速率的计算参考先前的研究报道[5];定期采集污泥样品并送检,在上海美吉生物公司云平台分析高通量测序结果。

    整个实验过程中,各阶段进出水氮浓度,见图2

    图 2  进出水氮浓度

    由于实验用泥直接取自运行稳定的PNA反应器,所以阶段Ⅰ中工艺的脱氮性能在初始就维持较高水平。在进水总氮浓度为(50±1.81) mg/L、曝气速率为0.20 L/min的条件下,出水氨氮、亚硝氮和硝氮浓度分别为5.69、0.24和4.79 mg/L。在阶段Ⅱ中,为了探究工艺性能恢复的可行性,人为的增大曝气速率、造成高溶解氧状态,破坏工艺稳定的运行性能。当曝气速率由0.20 升至1.00 L/min,出水氨氮和亚硝氮浓度迅速减至0.85和0.02 mg/L,硝氮浓度急剧增至40.94 mg/L。结果表明,过量的曝气造成的高溶解氧环境使得体系内氨氮和亚硝氮氧化完全,同时破坏了厌氧氨氧化所需的厌氧条件,导致出水中硝氮积累、体系失稳性能恶化。

    增大曝气后总氮去除率由78.4%降至14.8%,这也表明工艺的脱氮性能失稳恶化。出水中硝氮浓度的生成量与氨氮浓度变化之比是衡量自养脱氮反应是否占主导的一个重要指标,△硝氮浓度/△氨氮浓度的比值越接近11%,表明反应体系中厌氧氨氧化脱氮过程为主要脱氮途径[7]。而在过量曝气条件下,△硝氮浓度/△氨氮浓度的比值也由11.3%增加至84.0%,说明亚硝化过程失稳、厌氧氨氧化反应完全被破坏,亚硝酸盐被氧化成硝酸盐,出水中硝氮积累,见图3

    图 3  总氮去除率和化学计量比

    在阶段Ⅲ中,通过调控曝气速率,探讨主流条件下工艺性能恢复的可行性。曝气速率由1.00降低至0.10 L/min,而后逐级增加至0.30 L/min,脱氮性能也逐渐实现了恢复。阶段Ⅳ的再稳定过程中,出水中氨氮、亚硝氮和硝氮浓度分别达到4.99、1.58和6.90 mg/L,总氮去除率也恢复至74.8%。结果表明,通过适宜的曝气调控,可以实现主流条件下失稳后PNA工艺的性能恢复。

    进一步计算分析反应体系中的氮反应速率(图4),进水氮负荷一直维持在0.60 kg N/m3·d,氮去除速率初始阶段稳定在0.42 kg N/m3·d。随着过量曝气的实施,氨氧化速率由0.28 增至0.56 kg N/m3·d,亚硝酸盐氧化速率由0.02增加至0.51 kg N/m3·d。这表明,过量曝气同步增强了氨氧化反应和亚硝酸盐氧化反应,使得亚硝化过程失稳。因此,氮去除速率也减少至0.07 kg N/m3·d。恢复阶段通过曝气速率的调控,氨氧化速率随着曝气量的增大而逐步提升,亚硝酸盐氧化速率被抑制,氮去除速率逐步恢复至0.46 kg N/m3·d。在性能恢复的过程中,曝气速率是重要的调控要素,曝气量较低无法促进氨氧化过程,也间接的抑制了后续的厌氧氨氧化反应。所以,曝气调控要结合出水中氨氮浓度综合考虑。实验结果表明,利用氨氧化反应和亚硝酸盐氧化反应的需氧差异,调控适宜的曝气能够强化氨氧化反应、控制亚硝酸盐氧化反应,有效地提升氮去除性能。

    图 4  氮反应速率变化

    厌氧氨氧化菌具有较长的倍增周期[8],所以PNA工艺常常因为生物量流失而造成功能菌丰度不足,从而使得脱氮性能下降。实验各阶段污泥的组成及含量,见图5

    图 5  污泥组成及含量

    在过量曝气作用下,VSS由稳定阶段的0.67降至0.23 g/L,VSS/TS也由0.49减至0.34。这表明,过量曝气加速了生物量流失,降低了污泥浓度,也是性能下降的主要原因。此外,蛋白质含量和占比也明显下降。胞外聚合物中较高的蛋白质含量有利于颗粒化的形成,从而提高生物量的持留能力[9],所以蛋白质含量的降低也与污泥浓度变化相一致。随着恢复阶段的曝气调控,VSS和TS恢复至0.73和1.48 g/L,蛋白质含量也增至0.35 g/L。结果表明,有效的曝气调控可以强化生物量的持留,提高污泥浓度,这对于工艺脱氮性能的恢复有积极作用。

    工艺的脱氮性能与污泥活性密切相关,由污泥浓度和活性共同决定[10-11],各阶段污泥活性变化,见图6

    图 6  污泥活性变化

    在阶段Ⅱ中,过量曝气和高溶解氧浓度极大地促进了硝化反应,同时抑制了厌氧氨氧化反应和反硝化活性。氨氧化活性和亚硝酸盐氧化活性由0.91和0.08 kg N/m3·d增长至1.13和1.05 kg N/m3·d;而厌氧氨氧化活性和反硝化活性降低至0.21和0.12 kg N/m3·d。这也与2.1节脱氮性能的变化相一致,污泥活性的变化影响了工艺的宏观脱氮性能。随着恢复阶段的曝气调控,氨氧化活性略微下降,厌氧氨氧化活性恢复至0.89 kg N/m3·d,而亚硝酸盐氧化活性得到了抑制。结果表明,适宜曝气调控不仅能够提高污泥浓度,同时可以强化功能反应的活性;氨氧化反应活跃、厌氧氨氧化反应主导和亚硝酸盐氧化反应抑制是主流PNA体系脱氮性能提升和恢复的关键。

    氨氧化菌和厌氧氨氧化菌是PNA工艺中的脱氮功能微生物,亚硝酸盐氧化菌属于干扰菌群[1]。各阶段污泥样品中功能微生物在属水平上的相对丰度,见图7

    图 7  属水平上功能微生物相对丰度

    整个过程中,检出的厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadia属,氨氧化菌为Nitrosomonas属,亚硝酸盐氧化菌为Nitrospira属。当工艺启动达到稳定阶段时,Candidatus Brocadia属和Nitrosomonas属的相对丰度达到6.4%和10.2%,Nitrospira属几乎未检出。在阶段Ⅱ中,过量曝气和高溶解氧抑制了厌氧氨氧化菌的生长(1.1%),使得Nitrospira属过度增殖(6.5%),这也是性能失稳后出水中出现硝氮积累的原因。但随着恢复操作的实施,Candidatus Brocadia属和Nitrosomonas属的相对丰度恢复至5.3%和8.7%,Nitrospira属的相对丰度减少至0.2%。结果表明,适宜的曝气调控可以抑制亚硝酸盐氧化菌的生长,促进氨氧化菌和厌氧氨氧化菌的富集,能够优化主流PNA体系中功能菌群结构,从而使得工艺性能得到改善甚至恢复。

    针对脱氮性能失稳的PNA工艺,通过适宜的原位曝气调控,实现了主流条件下PNA工艺失稳后性能的恢复。在进水氮浓度为(50±1.81) mg/L、曝气速率为0.30 L/min的条件下,总氮去除率达到74.8%,氮去除速率达到0.46 kg N/m3·d。

    适宜的曝气调控能够有效地提升污泥浓度和促进颗粒化的形成,使得系统内恢复并维持较高的生物量;此外,曝气调控能够强化氨氧化反应和厌氧氨氧化反应、提高功能菌群的丰度水平,抑制亚硝酸盐氧化菌的过度增殖。

    本研究验证了曝气调控原位恢复主流PNA工艺脱氮性能的可行性,适宜的曝气调控是PNA工艺性能恢复和提升反应速率及污泥丰度的关键要素,这为厌氧氨氧化工艺在主流条件下的应用提供了策略。

  • 图 1  不同苯酚浓度下小球藻浓度、叶绿素(a+b)含量、Fv/Fm的变化

    Figure 1.  Change of dry weight, chlorophyll(a+b) content, Fv/Fm at different phenol concentrations

    图 2  不同苯酚浓度下苯酚降解率的变化

    Figure 2.  Change of phenol removal rate at different phenol concentrations

    图 3  不同藻菌比下苯酚浓度和叶绿素(a+b)含量的变化

    Figure 3.  Change of phenol concentration and chlorophyll(a+b) content at different algal-bacteria inoculation ratios

    图 4  不同藻菌初始接种浓度下苯酚浓度和叶绿素(a+b)含量的变化

    Figure 4.  Change of phenol concentration and chlorophyll (a+b) content at different initial inoculation concentrations of algae/bacteria

    图 5  不同初始苯酚浓度下苯酚浓度和叶绿素(a+b)含量的变化

    Figure 5.  Change of phenol concentration and chlorophyll(a+b) content at different initial phenol concentrations

    表 1  微藻和藻菌共培养处理苯酚废水的培养条件和研究结果的对比

    Table 1.  Comparison of culture conditions and research results on phenol wastewater treatment by microalgae alone and co-culture with bacteria

    微生物培养条件结果来源
    Chlorella pyrenoidosa添加苯酚(25~200 mg·L−1)为唯一碳源的Fog’s培养基;在实际炼化废水(23.33 mg·L−1苯酚)中培养模拟废水中,6 d内完全降解苯酚;实际炼化废水中,7 d内降解了38.32%的苯酚[31]
    Chlorella pyrenoidosa煤气化排放废水(酚类化合物:1.475 g·L−1),微藻接种量4 g·L−1,添加与未添加营养物(K、尿素)进行比较添加营养物时,7 d内降解了95%的苯酚;未添加营养物时,7 d内降解了46%的苯酚[32]
    Chlorella sp.小球藻(0.6 g·L−1)经过驯化,TAP培养基中添加苯酚至1 000 mg·L−1,分批培养苯酚浓度为500 mg·L−1时,7 d内完全降解苯酚;700 mg·L−1时,8 d内降解了86%的苯酚[33]
    Scenedesmus sp.BG11培养基中添加体积分数为9%的未灭菌橄榄油废水(苯酚浓度为440 mg·L−1),分批培养苯酚浓度为440 mg·L−1,11 d内降解了22%的苯酚[34]
    Scenedesmus quadricauda与活性污泥共培养5个稀释度(20%~100%)的焦化废水(苯酚浓度,24~120 mg·L−1),分批培养苯酚浓度≤96 mg·L−1时,94 h内苯酚完全降解;120 mg·L−1时,144 h内完全降解苯酚[14]
    Scenedesmus obliquus、Chlorella vulgaris、Raoultella terrigena、Pantoea agglomerans以苯酚(50、100、150 mg·L−1)为唯一碳源的模拟橄榄油废水,藻/菌(1012 cell·mL−1/103 CFU·mL−1)苯酚浓度为50、100、150 mg·L−1时,48 h内降解了99%的苯酚[15]
    Chlorella sp.、Bacillus simplex以苯酚为唯一碳源的BG11培养基,初始藻菌比为1∶1(0.2 g·L−1∶0.2 g·L−1),苯酚浓度200~600 mg·L−1苯酚浓度为400 mg·L−1时,4 d内苯酚完全降解;500 mg·L−1时,6 d内苯酚完全降解本研究
    微生物培养条件结果来源
    Chlorella pyrenoidosa添加苯酚(25~200 mg·L−1)为唯一碳源的Fog’s培养基;在实际炼化废水(23.33 mg·L−1苯酚)中培养模拟废水中,6 d内完全降解苯酚;实际炼化废水中,7 d内降解了38.32%的苯酚[31]
    Chlorella pyrenoidosa煤气化排放废水(酚类化合物:1.475 g·L−1),微藻接种量4 g·L−1,添加与未添加营养物(K、尿素)进行比较添加营养物时,7 d内降解了95%的苯酚;未添加营养物时,7 d内降解了46%的苯酚[32]
    Chlorella sp.小球藻(0.6 g·L−1)经过驯化,TAP培养基中添加苯酚至1 000 mg·L−1,分批培养苯酚浓度为500 mg·L−1时,7 d内完全降解苯酚;700 mg·L−1时,8 d内降解了86%的苯酚[33]
    Scenedesmus sp.BG11培养基中添加体积分数为9%的未灭菌橄榄油废水(苯酚浓度为440 mg·L−1),分批培养苯酚浓度为440 mg·L−1,11 d内降解了22%的苯酚[34]
    Scenedesmus quadricauda与活性污泥共培养5个稀释度(20%~100%)的焦化废水(苯酚浓度,24~120 mg·L−1),分批培养苯酚浓度≤96 mg·L−1时,94 h内苯酚完全降解;120 mg·L−1时,144 h内完全降解苯酚[14]
    Scenedesmus obliquus、Chlorella vulgaris、Raoultella terrigena、Pantoea agglomerans以苯酚(50、100、150 mg·L−1)为唯一碳源的模拟橄榄油废水,藻/菌(1012 cell·mL−1/103 CFU·mL−1)苯酚浓度为50、100、150 mg·L−1时,48 h内降解了99%的苯酚[15]
    Chlorella sp.、Bacillus simplex以苯酚为唯一碳源的BG11培养基,初始藻菌比为1∶1(0.2 g·L−1∶0.2 g·L−1),苯酚浓度200~600 mg·L−1苯酚浓度为400 mg·L−1时,4 d内苯酚完全降解;500 mg·L−1时,6 d内苯酚完全降解本研究
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-16
  • 录用日期:  2020-02-28
  • 刊出日期:  2020-06-01
易涛, 山鹰, 黄渤, 唐涛, 高旻天, 魏伟. 藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082
引用本文: 易涛, 山鹰, 黄渤, 唐涛, 高旻天, 魏伟. 藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082
YI Tao, SHAN Ying, HUANG Bo, TANG Tao, GAO Mintian, WEI Wei. Effect of algae-bacteria co-culture on Chlorella sp. growth and phenol degradation[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082
Citation: YI Tao, SHAN Ying, HUANG Bo, TANG Tao, GAO Mintian, WEI Wei. Effect of algae-bacteria co-culture on Chlorella sp. growth and phenol degradation[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(6): 1679-1687. doi: 10.12030/j.cjee.201909082

藻菌共培养对小球藻生长及苯酚降解的影响

    通讯作者: 唐涛(1984—),男,博士,副研究员。研究方向:微藻生物技术。E-mail:tangt@sari.ac.cn
    作者简介: 易涛(1995—),男,硕士研究生。研究方向:微藻废水处理。E-mail:yitao@sari.ac.cn
  • 1. 上海大学生命科学学院,上海 200444
  • 2. 中国科学院上海高等研究院,低碳转化科学与工程重点实验室,上海 201210

摘要: 工业苯酚废水无序排放会对环境造成极大危害,构建既能去除苯酚又能积累微藻生物质的藻菌组合对实现苯酚废水净化及其资源化利用具有重要意义。首先,研究了小球藻对苯酚的耐受性和降解性能;然后,构建了其与简单芽胞杆菌Bacillus simplex的共培养体系;最后,测试了藻菌比、藻菌接种浓度和苯酚浓度等对小球藻生长及苯酚降解的影响。结果表明:小球藻能耐受400 mg·L−1的苯酚,但其对100~600 mg·L−1苯酚的降解率仅为1.21%~11.66%;对于藻菌共培养体系,在固定小球藻接种浓度为0.2 g·L−1、藻菌比为1∶4~4∶1条件下,3~5 d完全降解了400 mg·L−1的苯酚,小球藻叶绿素(a+b)含量较单藻组增加了0.14~2.21倍,且随着藻菌比降低,苯酚降解效率及小球藻生物量逐步提高;在固定藻菌比为1∶1、小球藻初始接种浓度为0.05~0.4 g·L−1条件下,4~5 d完全降解400 mg·L−1苯酚,且在藻接种浓度为0.2 g·L−1条件下,小球藻具有最高的比生长速率;在藻菌接种浓度0.2 g·L−1、藻菌比1∶1条件下,6 d内完全降解500 mg·L−1的苯酚,且在各苯酚浓度(200~600 mg·L−1)下,小球藻叶绿素(a+b)含量较初始接种值增加了1.54~4.71倍。与简单芽胞杆菌共培养可以促进小球藻生长并提高其苯酚降解能力,在苯酚废水净化及资源化利用领域展现了一定的应用潜力。

English Abstract

  • 苯酚是一种对环境有污染的芳香族有机化合物,广泛存在于石油炼制、木材防腐、焦化等行业的废水中[1]。苯酚属于高毒物质,可以通过皮肤、黏膜、口腔进入人体内,低浓度苯酚可使细胞蛋白变性,高浓度可使蛋白质沉淀[2]。此外,苯酚被证明有致癌、致突变、致畸性等危害,被世界各国列为重点处理的有机污染物之一[3]。含酚废水的处理方法可分为物化法和生物法。其中,物化法具有成本高、容易造成二次污染等缺点。相比之下,生物法具有环境友好、成本低、不产生二次污染等优点[4-5]。微生物能利用酚类化合物作为碳源或能源,并将其代谢转化,因此,细菌[6]、真菌[7]、藻类[8]等去除酚类化合物得到了广泛研究。

    苯酚降解细菌大多具有繁殖速度快、苯酚耐受性强和降解效率高等特点,常用于苯酚废水处理,并取得了良好的效果。但其在处理过程中存在一些限制,如曝气成本高、产生CO2等温室气体及难处理的污泥等[9]。藻菌共培养对废水中污染物的去除更加有效,且具有以下优势:微藻通过光合作用产生异养细菌降解有机物所需的O2,较细菌处理技术节省了曝气成本并减少污染物的挥发;微藻吸收利用细菌呼吸作用降解有机物时释放的CO2,进而减少温室气体排放;获得的微藻生物质可进一步加工制备高附加值产品,提高经济效益[10-13]。RYU等[14]利用四尾栅藻和活性污泥处理焦化废水,发现藻菌共培养可于144 h内完全降解初始浓度为24~120 mg·L−1的苯酚,而单藻体系在144 h时最高的降解率仅为27.3%(初始苯酚浓度24 mg·L−1)。MAZA-MÁRQUEZ等[15]利用斜生栅藻和小球藻与酚类物质降解菌Raoultella terrigenaPantoea agglomerans,构建菌藻共生体系,可在48 h内去除99%以上的苯酚(50、100、150 mg·L−1)。

    尽管藻菌共培养处理苯酚废水较细菌具有一定优势,但目前处理的苯酚浓度仍然较低。高浓度苯酚会对微生物产生毒害作用、抑制其活性功能,从而影响了该技术的实际应用。同时,大多研究关注藻菌共培养对含酚废水的处理效果,而对处理过程中微藻生长的变化关注较少,但微藻生物质的获得对提高该技术的经济性具有重要作用。简单芽胞杆菌已被证明是一种高效苯酚降解菌。袁利娟等[16]分离出1株高效苯酚降解菌JY01,其16S rDNA序列与 Bacillus simplex (AM9216370)的相似性为99.01%,在苯酚浓度为1 100 mg·L−1和1 300 mg·L−1时,该菌株30 h内可分别降解99.16%和74.76%的苯酚。本研究旨在构建小球藻与简单芽胞杆菌的共培养体系用于高浓度苯酚废水处理,探索其处理高浓度苯酚废水和积累微藻生物质的潜力,研究藻菌比、藻菌接种浓度和苯酚浓度对共培养体系苯酚降解能力和微藻生长的影响,以期为藻菌共培养处理苯酚废水同时积累微藻生物质的进一步研究提供参考。

  • 小球藻接种于灭菌(121 ℃,30 min)的BG11培养基[17]中,于柱形光生物反应器(高40 cm、直径4.5 cm、体积为350 mL)中持续光照培养至对数增长期,光量子通量密度为150 μmol·(m2·s)−1,温度为(25±2) ℃,通入体积分数为1%的CO2加快微藻生长。

    简单芽胞杆菌Bacillus simplex(NO.1.3471)购于中国微生物菌种保藏中心。细菌接种于灭菌的营养肉汤培养基(蛋白胨10 g·L−1、牛肉提取物3 g·L−1、氯化钠5 g·L−1、去离子水1 L),于250 mL锥形瓶内振荡培养至对数增长期,温度为(30±2) ℃、摇床转速为150 r·min−1

    实验所用废水为含苯酚模拟废水,即在灭菌BG11培养基内添加一定浓度苯酚。接种方法:对数期的藻液和菌液分别经4 000 r·min−1离心5 min和8 000 r·min−1离心10 min,并弃上清液后获得藻泥和菌泥,用灭菌水清洗3次去除残余培养基后,接种于苯酚模拟废水中。

  • 为考察小球藻对苯酚的耐受性,设置了100、200、300、400、500、600 mg·L−1的苯酚浓度梯度,并设置1组不添加苯酚的对照。小球藻接种于模拟苯酚废水,于250 mL锥形瓶(工作体积为100 mL)中振荡培养,藻初始接种浓度(以干质量计)为0.2 g·L−1,光量子通量密度为110 μmol·(m2·s)−1,温度为(25±2) ℃,转速为150 r·min−1,每组实验3个重复。每日取样测定干质量浓度、叶绿素(a+b)含量、Fv/Fm (Fv/Fm表示PSⅡ的最大光化学量子产量,Fv为可变荧光,Fm为最大荧光产量)、苯酚浓度。

    在小球藻初始接种浓度和苯酚浓度分别为0.2 g·L−1和400 mg·L−1条件下,考察不同藻菌比对苯酚降解和小球藻生长的影响,设置藻菌比(干质量比)为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4,并设置1组只接种小球藻不接种简单芽胞杆菌的处理组作为对照。

    在初始藻菌比1∶1、苯酚浓度400 mg·L−1条件下,考察不同初始接种浓度对苯酚降解和小球藻生长的影响,设置小球藻和简单芽胞杆菌初始接种浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g·L−1

    在初始藻菌比为1∶1 (0.2 g·L−1∶0.2 g·L−1)条件下,考察不同苯酚浓度对苯酚降解和小球藻生长的影响,设置了200、300、400、500、600 mg·L−1的苯酚浓度梯度。在实验中,藻、菌接种于250 mL锥形瓶(体积为100 mL)中振荡培养,条件为110 μmol·(m2·s)−1、(25±2) ℃、150 r·min−1,每日取样测定苯酚浓度和叶绿素(a+b)含量,每组实验设3个重复。

  • 微藻干质量浓度采用重量法[18]测定,醋酸纤维微孔滤膜(φ=0.45 μm),烘箱温度105 ℃;Fv/Fm值通过FMS-2便携脉冲调制式荧光仪[19]测定;藻液内叶绿素(a+b)含量采用分光光度法[20]测定,离心转速为13 400 r·min−1,提取试剂为甲醇,测定波长为652、665、750 nm。在藻菌共培养体系内,以叶绿素(a+b)含量变化评估微藻生长性能[21],并通过式(1)计算微藻比生长速率。

    式中:μ为比生长速率,d−1NtN0为培养时间为t和0时的叶绿素(a+b)含量,mg·L−1

    苯酚浓度的测定参照4-氨基安替比林分光光度法[22],苯酚去除率用式(2)进行计算。

    式中:r为苯酚去除率;CtC0分别为培养时间为t和0时的苯酚浓度,mg·L−1

  • 图1(a)所示,在100、200、300、400 mg·L−1苯酚浓度下,小球藻在3~4 d时到达稳定期,4 d时小球藻浓度分别较对照组高26.67%、22.22%、20.00%、13.33%。这说明小球藻不仅能耐受较低浓度(≤400 mg·L−1)苯酚,并且低浓度苯酚能够促进小球藻生长。但随着苯酚浓度继续增加到500~600 mg·L−1,小球藻生长较对照组慢,小球藻浓度从2~3 d时开始下降,4 d时小球藻浓度分别较对照组低35.56%、51.11%,这说明高浓度苯酚抑制了小球藻的生长。任佳等[23]发现,低浓度苯酚(<100 mg·L−1)可以促进螺旋藻生长,而苯酚浓度升高(200、300 mg·L−1)对螺旋藻生长有抑制作用。苯酚可能起到类似双酚A的毒物兴奋效应,在低浓度下刺激小球藻生长,在高浓度下抑制小球藻生长[24]

    微藻叶绿素(a+b)的含量可以反映微藻的生长状况和细胞生存能力。如图1(b)所示,叶绿素(a+b)含量的变化趋势与小球藻浓度的变化趋势相一致。在4 d时,100~400 mg·L−1苯酚浓度下,叶绿素(a+b)含量较对照组高16.96%~33.46%;而在苯酚浓度为500、600 mg·L−1时,叶绿素(a+b)含量分别较对照组低30.14%、45.86%。RYU等[14]研究发现,四尾栅藻在60%、80%、100%的焦化废水下生长时,叶绿素a含量较20%、40%焦化废水下低,与本研究结果类似。这可能是由于在高浓度的苯酚条件下,会存在大量的活性氧,活性氧会攻击叶绿素a,同时抑制光合作用,对微藻的生长不利[25]

    Fv/Fm可以反映绿色植物潜在最大光合作用潜力。如图1(c)所示,在较低的苯酚浓度下(≤400 mg·L−1),Fv/Fm在0~1 d有小幅度的下降(4.21%~18.20%),然后迅速恢复并维持较高水平。这可能是由于在初始阶段微藻生长处于迟滞期,细胞光合活性较低;500、600 mg·L−1苯酚浓度条件下,Fv/Fm值在1 d后迅速降低,在4 d时分别降至0.17±0.05、0.07±0.02,较初始值分别下降了73.61%、89.29%。这说明此条件下小球藻光合活性急剧降低,高浓度苯酚对小球藻具有毒性效应。

  • 不同苯酚浓度下苯酚降解率随时间的变化如图2所示。4 d时,100、200、300、400、500、600 mg·L−1苯酚条件下,苯酚降解率分别为11.66%、8.99%、8.17%、7.33%、2.03%、1.21%。这说明小球藻对各浓度苯酚的去除能力较低,且随着苯酚浓度的增加,降解率降低。据SCRAGG等[26]报道,Chlorella VT-1在14 d内对100~400 mg·L−1苯酚的降解率仅为1%~10%,这与本研究中小球藻降解苯酚的能力相当。

  • 藻菌接种比例是影响藻菌体系的协同关系和污染物的去除率的关键因素之一[27-28]。在不同藻菌比下,苯酚浓度随时间的变化如图3(a)所示。可以看出,对照组苯酚降解能力较低,在3、4、5 d时,苯酚仅降解了6.63%、7.38%、8.62%。藻菌比为1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1时,分别在3、3、4、4、5 d完全降解400 mg·L−1苯酚。这表明,接种简单芽胞杆菌明显提高了苯酚降解效率,且随着细菌添加量的增加,苯酚降解效率逐渐提高。由此可知,在共培养体系中苯酚降解主要是细菌的贡献。

    叶绿素(a+b)含量随时间的变化如图3(b)所示。在初始小球藻接种浓度相同的情况下,藻菌比对小球藻叶绿素(a+b)含量的变化影响显著(P<0.05)。藻菌比为1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1时,小球藻叶绿素(a+b)含量(4 d)分别较单藻组增加了2.21、1.57、0.83、0.36、0.14倍。可见,随着细菌浓度的增加,叶绿素(a+b)含量,即微藻生物量也随之增加。在藻菌共培养中,细菌促进微藻生长已有类似报道,如在20%和40%的焦化废水下,与活性污泥共培养的四尾栅藻叶绿素a含量分别较单藻高1.63倍和2倍[14]。在本研究中,藻菌比为1∶4、1∶2、1∶1时,藻菌组叶绿素(a+b)含量较单藻组可增加0.83~2.21倍。这说明此藻菌组合有收获微藻生物质的潜力。虽然高的菌藻接种比具有高的苯酚降解效率和微藻生物量,但高细菌浓度在实际应用中会增加细菌生产及后续处理成本,因此,本研究选择藻菌比1∶1进一步考察。

  • 除藻菌接种比例外,微藻与细菌的初始接种浓度对苯酚降解也具有重要影响。在不同藻菌初始接种浓度下,苯酚浓度随时间的变化如图4(a)所示。可以看出,0.1~0.4 g·L−1的初始接种浓度可在4 d内完全降解苯酚,而0.05 g·L−1在5 d内完全降解苯酚。叶绿素(a+b)含量随时间的变化如图4(b)所示。可以看出,0.1、0.2、0.3、0.4 g·L−1的藻菌组随着培养时间的增加,各组叶绿素(a+b)含量增加,而0.05 g·L−1接种组内叶绿素(a+b)含量增加较少。4 d时,初始接种浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g·L−1条件下,各接种浓度下微藻比生长速率分别为0.22、0.39、0.41、0.25、0.24 d−1,初始接种浓度为0.2 g·L−1时具有最高的比生长速率。综合微藻生长和苯酚降解效率,在微藻和细菌接种浓度分别为0.2 g·L−1时具有最优效率。CHENG等[29]报道,在小型黄丝藻初始接种浓度为3 g·L−1、6 d时,模拟废水中250 mg·L−1苯酚的降解率为94.6%。LEE等[30]采用0.8 g·L−1的螺旋藻在6 d内可将400 mg·L−1苯酚降解97%左右。可见,本研究采用较低的微藻和细菌接种浓度,也可以达到较高的苯酚降解效率及微藻生物量。

  • 初始苯酚浓度对苯酚降解性能有重要影响,苯酚浓度越高,对微生物的毒性作用越大。选择藻菌比为1∶1、接种浓度为0.2 g·L−1作为苯酚降解体系,不同苯酚浓度对该体系苯酚降解性能的影响如图5(a)所示。可以看出,200、300、400、500 mg·L−1浓度的苯酚分别在3、3、4、5 d内被完全降解,600 mg·L−1的苯酚6 d被降解了29.8%。随着苯酚浓度的升高,苯酚完全降解时间增加。相比于单藻体系仅能耐受400 mg·L−1,其4 d苯酚降解率仅为7.33%,藻菌体系可完全降解400和500 mg·L−1苯酚,表现出较高的苯酚降解性能。不同苯酚浓度下叶绿素(a+b)含量的变化趋势如图5(b)所示。可以看出,在各苯酚浓度(200~600 mg·L−1)下,小球藻叶绿素(a+b)含量较初始接种值增加了1.54~4.71倍,这可能是由于细菌高的苯酚降解性能降低了苯酚对微藻的胁迫;同时,细菌降解苯酚产生CO2,为微藻生长提供碳源,提高微藻生物量,实现苯酚降解的同时积累微藻生物质[14-15]。近年来,部分微藻和藻菌共培养处理苯酚废水的研究结果如表1所示。可以看出,本研究在较低的藻菌接种浓度下,取得了较高的苯酚降解效率,并实现微藻生物质的多倍增长,这展现了藻菌共培养应用于处理苯酚废水同时积累微藻生物质的潜在优势。

  • 1) 本研究构建了小球藻与简单芽胞杆菌的共培养体系用于高浓度苯酚废水处理,该体系在处理高浓度苯酚废水同时达到了积累微藻生物质的目的。

    2) 小球藻能耐受400 mg·L−1苯酚,但对100~600 mg·L−1的苯酚降解率仅为1.21%~11.66%。在考察藻菌比、藻菌初始接种浓度基础上获得藻菌共培养体系的最优藻菌接种浓度(0.2 g·L−1和0.2 g·L−1)。在此条件下,藻菌体系6 d内完全降解500 mg·L−1的苯酚,且在各苯酚浓度(200~600 mg·L−1)下,小球藻叶绿素(a+b)含量较初始接种值增加了1.54~4.71倍。

    3) 小球藻和简单芽胞杆菌共培养可以提高苯酚降解能力并促进小球藻生长,在苯酚废水净化及资源化利用领域展现了一定的应用潜力。

参考文献 (34)

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