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挺水植物(emergent macrophytes),作为水生植物的重要类型以及淡水水域重要的初级生产力之一,对淡水生态系统具有重要作用. 挺水植物地上组织(茎和叶)挺出水面,而地下组织(根或根茎)一般生长于水陆交界处浅水区域沉积物中[1 − 2]. 挺水植物主要从沉积物中获取生长所需营养物质[3 − 5],其庞大根系所在区域(根区)微生物数量和种类远高于非根区沉积物,形成明显的根际效应[6 − 8]. 因此,挺水植物根区是沉积物-根系-微生物三者紧密结合相互影响的关键场所,其影响可归纳为以下方面:一方面,挺水植物通过其根系向沉积物输送氧气,促进了好氧条件下营养元素的物质循环[9]. 如成水平等[10]发现植物根系泌氧将增强硝化过程提高沉积物硝态氮(NO3−-N)含量. 王文林等[9]则报道菖蒲成株根系的氧扩散能力显著高于幼苗阶段,这可能与植物叶面积以及根系生物量、根表面积的大小等有密切关系. 可见,挺水植物的氧气扩散能力受物种以及生长阶段的强烈影响;另一方面,挺水植物的根系能释放超过200种的分泌物,如糖、氨基酸、有机酸等,这些分泌物不仅影响根区沉积物的微生境,还为沉积物微生物提供了碳源和营养物质[11],使根际微生物的数量及代谢活性远高于非根际沉积物[12]. 因此,吴林坤等[13]等认为,根系分泌物对根际微生物具有选择塑造作用,其群落结构的独特性与代表性将受植物物种差异以及生长阶段的影响. 可见,物种及其生长阶段将是影响挺水植物根区微生物的关键因子.
菖蒲(Acorus calamus),天南星科菖蒲属,典型的多年生挺水植物,广泛分布于河流、沼泽以及湖泊岸边等浅水水域. 菖蒲根系发达,对氮、磷等营养盐有很强的吸收能力[2,9,14],加之其形态美观,常被用于人工湿地或园林景观中[7]. 近年来,关于菖蒲根区沉积物微生物已有一些研究报告. 如顾诗云等[2]研究了淹水胁迫对菖蒲生理特性及其根际细菌群落特征的影响. 寄博华[15]发现斗南湿地菖蒲植物群丛沉积物细菌群落的丰富度和多样性均最大,高于芦苇和美人蕉植物群从. 赵良元等[16]通过90 d的培养发现,菖蒲的生长可大大提高沉积物中微生物的活性及多样性. 但现有研究均仅为短期内针对菖蒲的培养实验所获得的结果,对不同生长阶段菖蒲根区沉积物微生物的变化特征的认识仍十分不足.
本研究通过为期 175 d的培养时间,基于16S-rRNA高通量测序技术并结合FAPOTAX功能预测,探究菖蒲根区沉积物细菌群落结构和功能特征在三个生长阶段(生长期、成熟期、衰亡期)的差异,以期进一步阐明挺水植物的生长对其根区细菌群落结构及其功能组成的影响.
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本研究所用菖蒲和沉积物采自江苏大学校内湖泊(119°30′23'' E,32°11′58'' N),所采植物株高约60 cm,块状茎保持完整. 采样完成后,将植物样品迅速带回实验室后,用自来水冲洗根系以及植物表面泥土等供后续实验所用;表层沉积物(0—20 cm)样品带回实验室后用不锈钢网(20目)先过滤掉大颗粒以及各种杂质,然后使用混合器彻底将所采沉积物样品混合均匀,以确保各实验系统沉积物初始状态一致.
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采用直径40 cm,深度60 cm的圆形桶作为实验容器. 首先在各实验桶中铺设预先混匀的30 cm厚沉积物,将所采植物种植于各实验桶(CA),随后沿桶壁注入自来水,注水深度为桶壁45 cm处;另设一组不种植植物的系统作为对照(CK,仅包含沉积物和水体). 实验组和对照组分别设置3组重复. 实验过程中,定期补充各实验桶中自来水,以确保上覆水始终在同一深度. 实验于2022年5月—11月在室外培养(培养环境可以避免降雨的影响),共培养175 d.
实验第35、105和175 天时分别采集各实验桶内沉积物样品,按照菖蒲生长习性,这3次采样时间可代表菖蒲的旺盛生长期、成熟期和衰亡期. 采集的沉积物随机分成两部分,一部分经干燥、研碎、混匀、过100目筛,自封袋封装,于4 ℃保存,供沉积物理化指标测定,另一部分于 −25 ℃条件下保存用于沉积物NO3−-N和微生物测定.
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沉积物pH值(固水比为2.5:1)采用pH计测定(雷磁PHSJ-3F,INESA,上海);沉积物全碳(TC)和总氮(TN)采用元素分析仪(Vario EL cube,德国)测定;沉积物硝态氮(NO3−-N)和氨态氮(NH4+-N)用 2 mol·L−1 氯化钾(KCL)浸提后用紫外可见分光光度计(N4)测定;有机物质(O.M)采用水合热重铬酸钾氧化-比色法(《土壤农化分析》)进行测定;总磷(TP)采用高氯酸-浓硫酸(HClO4-H2SO4)消煮后用钼锑抗比色法测定.
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沉积物样品通过FastDNAchen® Spin Kit for Soil试剂盒提取总DNA,每个样本3个重复. 通过1%的琼脂凝胶电泳检测DNA提取质量,使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度. 采用细菌通用引物338F (5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 对细菌16S rRNA 基因 V3-V4 区进行 PCR 扩增. PCR体系为 20 μL,含有 5×FastPfu Buffer 缓冲液 4 μL,2.5 mmol.L−1 d NTPs 2 μL,正向引物0.8 μL,反向引物0.8 μL,FastPfu 聚合酶 0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,最终ddH2O至 20 μL. PCR扩增程序为:95 ℃ 初始变性3 min,随后95 ℃ 变性30 s,55 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸45 s共27个循环,最后72 ℃ 延伸10 min,10 ℃ 结束. PCR扩增产物通过2% 琼脂糖凝胶胶电泳检测,后委托上海美吉生物医药科技有限公司(Illumina Miseq PE300平台,美国)完成高通量测序.
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原始序列经质控、过滤、拼接后利用UPARSE 软件(http://drive5.com/uparse/)进行聚类,得到97% 相似水平下的操作分类单元(OTU). 本研究中按最小样本序列数将各样品抽平处理后共得到13835个OTUs. 基于所获OTUs,经RDP classifier(https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/,RDP:http://rdp.cme.msu.edu/)获得各样品细菌物种分类信息(分类置信度:0.7);通过Mothur软件计算各实验组沉积物样品细菌Alpha多样性指数(Shannon、Simpson、Sobs、ACE和Chao);采用非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)解析菖蒲根区及对照系统沉积物细菌群落Beta多样性;基于韦恩图(Venn)和柱形图研究沉积物细菌物种组成和相对丰度的变化;采用冗余分析(RDA)、相关热图分析(Correlation heatmap diagram)、排序回归分析(Sorting regression analysis)和 Mantel Test等方法评价细菌群落与沉积物理化参数之间的关系. 使用FAPROTAX(functional annotation of prokaryotic taxa)对微生物群落进行功能预测. 通过Wilcoxon秩和检验(对照组CK与菖蒲组CA)和 Kruskal-Wallis H检验(3个培养时间)对细菌群落Alpha多样性指数和优势门显著性差异进行检验;通过相似性分析(Analysis of similarities,ANOSIM)以及置换多元方差分析(Permutational Multivariate Analysis Of Variance,PERMANOVA)对群落结构差异进行统计学分析. 以上与微生物相关的分析均在美吉生物云平台在线完成 (http://cloud.majorbio.com). 其他数据(平均值±标准差)采用 Microsoft Excel和 SPSS 软件进行计算与分析. P<0.05和P<0.01分别为差异显著和差异极显著.
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实验期间,菖蒲根区和对照系统中沉积物pH值分别介于7.15—7.91以及之间7.60—8.03,呈弱碱性(图1). 实验过程中菖蒲组沉积物pH值始终低于对照组,这与菖蒲根系活动及其根系分泌物有密切关系,其影响途径表现在:植物根系呼吸所释放的二氧化碳以及分泌的有机酸类等物质,在一定程度上降低了沉积物pH值[17];此外,植物根际微生物的活动所产生的酸性物质也可降低根际土壤pH值[13]. 张金萍[18]针对挺水植物香蒲的研究证实了同样的规律.
菖蒲根区沉积物TN、NH4+-N、NO3−-N的平均含量分别为1.07 g·kg−1、1.10 mg·kg−1和3.83 mg·kg−1,稍低于对照组氮素含量,其值分别为1.08 g·kg−1、1.43 mg·kg−1以及4.13 mg·kg−1(图1). 菖蒲根区沉积物和对照系统沉积物TC含量分别介于8.60—9.40 g·kg−1以及9.00—9.60 g·kg−1之间(图1),表现为对照>菖蒲. 菖蒲庞大的根系组织将吸收沉积物中碳氮磷等营养元素以供植物良好的生长发育,在这一过程中植物根区沉积物元素含量有所下降. 这与余居华等[4]研究的结果一致. 陈登等[19]同样证实水生植物水蕴草(Egeria densa)、狐尾藻(Myriophyllum verticillatum)和苦草(Vallisneria natans)能显著降低了沉积物铵态氮含量,除了植物根系的直接吸收外,根区沉积物氮循环菌所驱动的硝化-反硝化以及厌氧氨氧化等作用也是铵态氮含量降低的原因之一. 此外,生长过程中挺水植物往往通过根系释放氧气和氧化性物质[20],从而在植物根系表面形成铁锰氧化物胶膜等具有胶体性质的物质,可进一步促进植物根系对磷的吸收,降低根际沉积物磷元素的含量[18]. 对于O.M来说,植物根区及对照系统沉积物中含量分别为1.39—4.05 g·kg−1和1.33—3.93 g·kg−1(图1),表现为对照<菖蒲. 以上结果证实了菖蒲的生长对沉积物理化参数将产生一定的影响.
进一步分析了沉积物理化参数随采样时间的变化规律. 结果发现(图1),菖蒲根区沉积物TN、NH4+-N、O.M以及pH值大小顺序为105 d>175 d>35 d;TP表现为:175 d>35 d>105 d;TC含量表现为175 d>105 d>35 d,沉积物C/N则表现为35 d>175 d>105 d,表明植物根区沉积物理化参数随植物生长发育而波动变化. 对于菖蒲而言,从快速生长期到成熟期,植物快速生长,根系活力增强,植物需从沉积物中获取大量氮素用于自身生长发育,对周围环境的影响也较大;如王文林等[9]利用溶氧微电极发现,菖蒲幼苗、成株根系的不同部位均存在从根表面至沉积物氧饱和度由高到低的氧扩散层,证实了不同生长阶段菖蒲根系氧扩散能力的差异. 加之本研究在该时间段环境温度较高(平均温度29.8 ℃),加剧了沉积物中微生物的生长代谢过程. 当植物进入衰亡阶段,植物生理活动减缓,且逐渐开始衰亡,部分植物残体及根系脱落物等进入沉积物并开始腐烂,在短时间内可增加沉积物元素含量. 对于对照系统沉积物而言,沉积物TN、NO3−-N以及O.M值最高值出现在实验第105 d,NH4+-N、TC、TP以及pH值峰值则出现在实验第175 d;沉积物C/N在实验第35 d最高,其次为175 d,最低值出现在实验第105 d. 由此可见,实验过程中,无植物的对照系统以及菖蒲根区沉积物理化因子均随培养时间呈现不同变化趋势的波动.
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对3个采样时间所采菖蒲根区及对照系统沉积物样品进行高通量测序及数据分析,共得到13835个OTUs,分属64门、201纲、477目、768科、1430属和3256种. 其中,菖蒲根区沉积物样品中共检测到OTUs共计11659个(细菌63门196纲455目733科1339属2991种),对照组沉积物共获得OTUs数量为10337个(细菌62门196纲450目709科1290属2863种). 基于OTUs,对沉积物中细菌群落Alpha多样性、Beta多样性以及物种组成特征等进行分析.
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细菌群落的多样性对于维持沉积物的稳定性和功能具有重要的生态意义[21 − 22]. Shannon和Simpson指数指示了物种的多样性,Shannon指数与物种多样性成正比,该指数越大,群落多样性就越高[15],而Simpson指数则与物种多样性成反比[23];Sobs、ACE和Chao指数表示了物种的丰富度,指数越大意味着群落丰富度越高[15]. 本研究对菖蒲根区及对照沉积物细菌群落Alpha多样性指数(Shannon、Simpson、Sobs、ACE和Chao)的统计结果见图2所示. 沉积物细菌群落Shannon、Sobs、ACE和Chao指数平均值表现为CA>CK,而Simpson指数平均值则切好相反,表明菖蒲的生长在一定程度上提高了沉积物细菌的丰富度以及多样性(图2). 马玉等[20]利用菖蒲湿地处理含油废水时同样发现菖蒲根区功能性微生物种类和数量多于对照区域,这与植物庞大的根系为微生物附着提供的更大的表面积和附着点[24]以及植物根系分泌物为附着微生物提供碳源和营养物质等有密切关系[19,25]. 此外,植物根系可以通过一系列行为,如改变水流速度、沉降特性和水里传导率等[26],为细菌的粘附和生长提供有力的条件,从而提高沉积物中的微生物的多样性.
进一步,对三个采样时间沉积物样品Alpha多样性指数进行分析(图2). 由图2可知,CA组沉积物Sobs、ACE和Chao指数随实验时间的增加呈增加趋势,表现为35 d<105 d<175 d. 基于Kruskal-Wallis秩和检验,ACE、Chao和Sobs指数在第35和第175 天之间存在显著性差异(P<0.05),ACE、Sobs指数在第105 天与第175 天亦有显著差异(P<0.05). ACE、Chao和Sobs指数的变化证实了菖蒲的不同生长阶段对其根区沉积物细菌群落丰富度将产生不同的影响. CA组沉积物Shannon指数最高值分别出现在实验第175 d,最低值出现在105 d,Simpson指数变化趋势与Shannon值恰好相反,即105 d>35 d>175 d. 线性回归模型显示,ACE、Sobs和Chao指数与培养时间成显著正相关(ACE指数:y=5.058x+5495.908,P<0.01;Sobs指数:y=2.644x+4071.042,P<0.01;Chao指数:y=4.153x+5290.131,P<0.01).
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细菌群落Beta多样性主要聚焦于不同生境间微生物群落结构多样性的比较[23,27],群落结构特征的差异是微生物与所处生境相互响应的结果[23]. 基于Bray-Curtis距离算法(OTUs水平)通过NMDS对各实验组沉积物细菌群落结构进化了可视化分析(图3). 由图3可知,CK和CA实验组沉积物细菌群落结构可分成重叠的两个区域,PERMANOVA结果证实了两个系统沉积物细菌群落结构无显著差异(F=0.950;R2=0.056;P>0.01). 尽管CK和CA实验组沉积物细菌群落结构呈现重叠,但图3显示,无植物的对照系统各样点间距离较近,意味着对照系统各样点沉积物细菌群落结构波动较小,而菖蒲根区沉积物各样品间更为离散,表明菖蒲系统中沉积物细菌群落结构变化较大,这可能是菖蒲在生长过程对沉积物的影响所致. 由图3可知,同一时间所采样品集聚起来,3个采样时间菖蒲根区沉积物细菌群落则明显区分成3个区域,尤其是第35 天所采样品与第105和175 天时区分明显(ANOSIM,P<0.01). PERMANOVA进一步验证了3个采样时间菖蒲根区沉积物细菌群落结构差异显著(F=1.64;R2=0.353;P<0.01). 张丁予等[28]等同样发现,植物根区沉积物微生物群落结构随着生长周期变化而变化,而且时间越长差异越显著,这与植物不同生长阶段根系活力以及根系分泌物的变化有密切关系. 植物生长过程中,其根系可分泌包括糖、氨基酸、有机酸、生物酶等多达200种以上的物质,这些物质敏感地响应植物的不同生长状态,并因此为微生物的生存创造良好的条件[1, 29].
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基于OTUs绘制韦恩图对菖蒲根区及对照系统各样品中共有和独有细菌进行分析(图4). 由图4a可知,整个实验过程中,菖蒲根区及对照系统中共有的细菌OTUs为8161,占OTUs总数的58.99%,意味着超50% 的细菌同时存在于菖蒲根区以及无植物的对照系统沉积物中. 进一步分析后发现,菖蒲根区沉积物和对照组沉积物样品中独有的OTUs数量分别为3498和2176,分别占总OTUs的25.28% 以及15.73%,独有的OTUs反映了不同来源样本中细菌群落组成的差异性. 相比于对照组而言,菖蒲根区独有的OTUs数量略高,意味着植物生长可能会丰富根区沉积物细菌的物种组成,在植物根区沉积物中细菌群落的多样性更好,物种组成更为丰富,这与菖蒲根区沉积物细菌Alpha多样性的结果一致.
门水平(Phylum)上(图4b),菖蒲根区和无对照系统沉积物细菌群落相对丰度前10的门主要为变形菌门(Proteobacteria,21.21% 和19.34%),绿弯菌门(Chloroflexi,17.29% 和17.42%)、酸杆菌门(Acidobacteriota,13.05% 和14.30%)、放线菌门(Actinobacteriota,10.60% 和11.69%)、厚壁菌门(Firmicutes,4.539% 和5.474%)、脱硫菌门(Desulfobacterota,5.192% 和4.613%)、拟杆菌门(Bacteroidota,4.258% 和4.358%)、粘菌门(Myxococcota,3.871% 和3.524%)、硝化螺旋门(Nitrospirota,2.569% 和2.384%)和芽单胞菌门(Gemmatimonadota,1.648% 和1.734%),这10类约占总测序序列的84.22%—84.83%. 以上优势菌群在淡水沉积物中已被广泛检出[10,28]. 顾诗云等[2]发现菖蒲根际细菌优势门类为变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和厚壁菌门;秦玉春等[24]发现5种湿地植物根系沉积物优势菌门均为变形菌门、放线菌门和拟杆菌;寄博华等[15]同样发现变形菌门、绿弯菌、放线菌门以及酸杆菌门为滇池湖滨湿地3种优势挺水植物(菖蒲、芦苇、美人蕉)根区沉积物的优势细菌门. 这些优势细菌群落中,变形菌门在生物脱氮除磷和降解污染物等方面均发挥重要作用[11,17,24]. 绿弯菌门为光能自养菌,该类群可通过光合作用产生能量,在湿地中广泛存在,且与沉积物碳循环有关,具有发酵、固定二氧化碳(CO2)和乙酸化作用[23,30]. 绿弯菌门是本研究中相对丰度仅次于变形菌门的第二大优势细菌,现有研究证实菖蒲根际对绿弯菌门具有选择性,且随着菖蒲的生长其选择性不同[31]. 绿弯菌门可从环境中吸收和同化多种生物和非生物来源的有机物,菖蒲根区大量存在的绿弯菌门为其改善沉积物环境提供了有力条件. 放线菌门和酸杆菌门则被认为是重要的根际细菌[15,25],尤其是放线菌门,大部分固氮细菌以及部分硝化、反硝化细菌等菌属于该门类,在氮循环中占有重要地位[32]. 本文研究发现,随菖蒲的生长其根区沉积物芽单胞菌门以及甲基菌门(Methylomirabilota)等细菌类群相对丰度差异显著(Kruskal-wallis秩和检验,P<0.05),具体表现为:根区沉积物细菌芽单胞菌门、甲基菌门相对丰度随着菖蒲的生长而逐渐减少,其原因可能在于同一生境中,优势菌的丰度较高会对其它非优势菌群的生存产生压迫[31],从而导致其相对丰度的下降.
在纲水平(Class)上,相对丰度前10位的优势纲占据菖蒲根区及对照系统沉积物细菌群落的57.21% 和57.11%. γ‐变形菌纲(Gammaproteobacteria)、厌氧蝇菌纲(Anaerolineae)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、Vicinamibacteria和拟杆菌纲(Bacteroidia)为菖蒲根区沉积物细菌群落相对丰度前5的纲. 其中,α-变形菌纲和γ-变形菌纲属于变形菌门中2个亚类,该门还包括δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)2个亚类. 拟杆菌纲是拟杆菌门中的优势类群,厌氧蝇菌纲则为绿弯菌门中主要亚类. 此外,共有6个纲在植物及对照系统中存在显著差异(Wilcoxon rank-sum test,P<0.05),且相对丰度均小于1%. 研究表明,α-变形菌纲、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和γ-变形菌纲含有许多反硝化细菌,可促使自养或异养反硝化过程[15,26]. 此外,刘忠航等[33]发现,α-变形菌纲中的部分菌群可以利用有机磷,加速有机磷的矿化,在沉积物磷元素循环中亦发挥重要作用.
而在目水平(Order)上,菖蒲根区及对照系统沉积物各样品共有13个目相对丰度小于1%的物种存在显著差异(Wilcoxon rank-sum test,P<0.05). 属水平(Genus),CA和CK组沉积物分别有15个和16个优势物种相对丰度大于1%,分别占26.87% 和29.44%;两组沉积物中细菌群落组成属水平上相对丰度小于 0.5% 的菌属分别占了51.29% 和48.26%. 统计分析后发现共有36个相对丰度低于 0.5% 的属在菖蒲根区以及对照沉积物二者间存在显著性差异(Wilcoxon rank-sum test,P<0.05). 综合纲、目、属水平的分析结果可知,菖蒲的生长可能对沉积物细菌群落中占比较小的物种产生更显著的影响.
植物不同生长阶段,其优势菌群的变化,可能与植物生长不同阶段所分泌的不同根系分泌物对微生物产生促进或抑制作用有关[11,34],也可能受根系泌氧的因素所致. 研究表明,植物根系在促使微生物富集等方面发挥着至关重要的作用[15]. 受植物物种以及所处生长阶段差异等因素的影响,植物根系形态、根系分泌物、根系泌氧量等呈现明显差异,这些因素将驱动植物根区微生物群落的影响变化[15]. 如张丁予[28]报道,根系发达的植物其分泌的营养物质可以有效地提高根际微生物的数量. 菖蒲是典型的挺水植物,其根系非常发达,属于毛发状须根,可扎入沉积物中并从多方面对沉积物产生影响. 一方面:本文研究证实了植物生长对根区沉积物理化参数的影响. 研究发现3次采样所获菖蒲根区沉积物pH值均小于无植物生长的沉积物,其原因在于植物根系呼吸释放二氧化碳以及分泌有机酸类物质,在一定程度上降低了沉积物pH值[20]. 此外,前人研究表明,菖蒲等挺水植物可通过径向泌氧(ROL)补充水体溶解氧[15,31],并因此对水-沉积物界面好氧微生物的生存提供条件. 本文研究证实了这一点,相对于无植物的对照沉积物,菖蒲根区沉积物存在更多的硝化螺旋菌属(Nitrospira)和亚硝酸菌属(Nitrosomonas),这与张丁予等[28]和Cordovez等[35]的研究一致,其发现根系越发达的植物其分泌的营养物质可以更有效地提高根际微生物的数量.
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细菌是介导沉积物物质循环的主要微生物类群,在营养元素的生物地球化学循环中发挥着重要作用[36]. 沉积物细菌群落结构及物种组成的差异将在一定程度上影响其在物质循环中的潜力. 本文通过FAPROTAX对菖蒲根区及对照系统沉积物细菌代谢及生态功能进行注释,共得到67种细菌群落功能类型,相对丰度最高的为化能异养(chemoheterotrophy)(21.36% 和21.83%),其次为需氧化能异养(aerobic chemoheterotrophy)(14.35% 和14.84%),发酵(fermentation)、固氮作用(nitrogen fixation)、光能自养作用(Photoautotrophy)、硝酸盐还原功能(nitrate reduction)等功能类群的相对丰度介于1%—10% 之间(图5). 有6个功能类型在菖蒲根区及对照系统沉积物样品中表现出显著差异(P<0.05),分别为氮呼吸(nitrogen respiration)、硝酸盐呼吸(nitrate respiration)、无氧光自氧硫氧化(anoxygenic photoautotrophy S oxidizing)、厌氧自养性(anoxygenic photoautotrophy)、动物寄生虫或共生体(animal parasites or symbionts)以及human pathogens all,这些差异性的功能类群涉及到沉积物氮和硫的循环过程.
氮代谢是生物地球化学循环的关键过程. 研究表明,氮代谢一般包括同化、氨化、固氮、硝化、反硝化和厌氧氨氧化过程[36 − 37]. 本研究中发现,硝酸盐呼吸所占丰度最高,其次为尿素分解功能(ureolysis)和亚硝酸盐呼吸(nitrite respiration). 反硝化作用(denitrification)、硝酸盐氨化(nitrate ammoniation)、亚硝酸盐氨化(nitrite ammoniation)、氧化亚氮脱氮(nitrous oxide denitrification)、硝酸盐反硝化(nitrate denitrification)、硝化作用(nitrification)以及氮呼吸等相对丰度在菖蒲根区及对照系统发生变化,相对丰度均表现为CA>CK,例如对功能预测相对丰度前20的菌群进行分析后发现菖蒲根区沉积物细菌群落硝酸盐还原以及氮呼吸作用功能相对丰度分别为无植物的对照系统的1.17倍以及1.31倍,证实菖蒲的存在对沉积物氮循环过程产生一定的影响,这种影响将随菖蒲的不同生长阶段而有所变化.
在硫循环中,菖蒲根区沉积物显著增加了暗硫化物氧化作用(dark sulfide oxidation)(与CK相比相对丰度增加了5.36%). 菖蒲的存在降低了沉积物无氧光自氧硫氧化的相对丰度(仅为对照系统的0.43)(P<0.05).
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对沉积物理化参数与细菌群落Alpha多样性、Beta多样性以及群落物种组成以及功能特征间的作用关系进行分析. 结果发现,沉积物NO3−-N含量与Chao、Shannon和Sobs指数间呈显著相关关系(P<0.05),这与曹洋等[23]的研究相一致,其认为沉积物中细菌群落多样性随营养盐水平升高而下降.
基于Mantel分析(OTUs水平上)结果,菖蒲根区沉积物(Mantel r statistic:0.4046,P<0.05)和无植物对照系统沉积物(Mantel r statistic:0.4461,P<0.05)理化参数与细菌群落结构间存在显著相关关系(P<0.05). RDA分析(OTUs水平上)结果发现菖蒲根区以及对照沉积物理化特征对细菌群落结构变异的累计解释率分别为58.47% 和56.75%,菖蒲根区细菌群落受TN影响较多,而对照组则更受沉积物TP含量的影响. 这与马率等[17]的研究结果一致,其认为O.M和TN对沉积物微生物群落有明显的驱动作用.
除此之外,沉积物理化因子参数对细菌物种组成具有显著影响(图6). 如,对于菖蒲组而言,优势门变形菌门受沉积物NO3−-N的影响(P<0.05);绿弯菌门受到沉积物TN和C/N的影响(P<0.05);拟杆菌门则与沉积物pH、TN、NH4+-N以及O.M值之间存在显著相关关系(P<0.05);而对照组变形菌门受沉积物TC的显著影响(P<0.05).
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挺水植物菖蒲的生长将提高植物根区沉积物细菌Alpha多样性并丰富细菌的物种组成,改变细菌群落的结构特征,这种影响随菖蒲生长发育的不同阶段而呈现显著差异. 基于FAPROTAX的功能预测证实了菖蒲的存在将对氮呼吸、硝酸盐呼吸、无氧光自氧S氧化以及无氧光自氧等涉及到沉积物氮和硫的循环过程的功能类群产生显著影响. 总之,本研究证实了菖蒲根区改变了沉积物原有细菌群落结构将引起沉积物细菌代谢及生态功能的变化,研究结果将对进一步揭示水生植物与微生物间的互作关系提供一定的依据.
挺水植物菖蒲根区沉积物细菌群落结构和功能特征分析
The structural and functional characteristics of the sedimentary bacterial community in the root area of Acorus calamus
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摘要: 挺水植物根区是湖泊等淡水生态系统物质循环最为活跃的微生态区域之一. 为了进一步明确挺水植物在不同生长阶段对根区沉积物微生物的影响,本论文以挺水植物菖蒲(Acorus calamus)为研究对象,构建室外盆栽实验系统,采集实验第35、105和175 天时菖蒲根区及无植物对照系统沉积物样品,研究菖蒲生长发育对根区沉积物细菌群落及功能的影响. 结果表明,菖蒲根区沉积物共检测OTUs数量11659个,无植物的沉积物样品获得OTUs数量为10337个. 基于OTUs结果的分析发现,菖蒲根区沉积物Shannon、Sobs、ACE和Chao指数平均值表现为CA>CK;相比于对照组而言,菖蒲根区独有的OTUs数量略高,意味着菖蒲生长可能会丰富根区沉积物细菌的物种组成,尤其是对于细菌群落中相对丰度占比较小的物种产生显著影响;通过FAPROTAX对菖蒲根区及对照系统沉积物细菌代谢及生态功能进行注释,共得到67种细菌群落功能类型,以化能异养、需氧化能异养、发酵、固氮作用、光合自养、亚硝酸盐还原功能等类群为主,菖蒲的生长将提高氮循环功能类群的相对丰度从而对沉积物氮循环过程产生一定的影响,且这种影响将随菖蒲的不同生长阶段而有所变化. 沉积物理化参数是驱动菖蒲根区细菌群落的关键因子.Abstract: The root zone of emergent plants is one of the most active microecological regions for nutrients biogeochemical cycles in freshwater ecosystems. To further clarify the influence of different growth stages of emergent plants on the bacterial community and function in their root zone, Acorus calamus was chosen and used to construct the outdoor experiment system in this study. The sediments samples were collected from both Acorus calamus' root zone and the control system (non-plant sediment) on the 35, 105 and 175 days, respectively. A total of 11659 and 10337 OTUs were detected in Acorus calamus and control groups, respectively. The average values of Shannon, Sobs, ACE and Chao indexes were CA>CK. The number of unique OTUs in Acorus calamus root zone sediments was higher than in the non-plant control system. This suggests that plant growth may enrich the bacteria composition in their root zone, especially for the lower relative abundance species in the bacterial community. A total of 67 functional types of bacteria were predicted by FAPROTAX from the Acorus calamus root zone sediment and non-plant sediment. The main functional groups are chemoheterotrophic, aerobic heterotrophic, fermentation, nitrogen fixation, photosynthetic autotrophic, and nitrite reduction. The growth of Acorus calamus has the potential to increase the relative abundance of nitrogen cycling functional groups and have a certain impact on the nitrogen cycling process in sediment. This influence will vary with different growth stages of Acorus calamus. The bacterial community was influenced by the physicochemical parameters of the sediment in the root zone of Acorus calamus.
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Key words:
- Acorus calamus /
- root zone /
- sediment /
- bacterial community /
- function
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挥发性有机物(volatile organic compounds,VOCs)是城市大气光化学氧化剂和有机气溶胶的重要前体物,对臭氧和细颗粒物的生成起到重要作用[1-3]。工业源VOCs排放占全国人为源排放总量的56.8%,主要来自石化、化工、工业涂装、包装印刷等行业[4]。根据北京、上海和天津3个城市的VOCs源解析结果,汽车尾气和汽油挥发对VOCs的贡献率分别为(40.2%±16.9%)和(19.7%±7.5%)[5-6]。为了加强油气污染的控制,生态环境部先后颁布了《排污许可证申请与核发技术规范 储油库、加油站》(HJ 1118-2020)[7]和《加油站大气污染物排放标准》(GB 20952-2020)[8],对加油和卸油过程的油气回收、油气处理装置和在线监测系统等提出明确要求。
加油站VOCs排放如图1所示包括5个环节:卸油排放、加油排放、呼吸排放、加油枪滴油和胶管渗透排放[9]。其中呼吸排放是加油站埋地油罐内油气压力在达到排放管压力/真空阀(pressure/vacuum valve,P/V阀)的开启压力后排放的VOCs。卸油排放和加油排放分别通过一次和二次油气回收技术控制,埋地油罐呼吸排放通过安装油气处理装置控制,油枪滴油和胶管渗透分别采取防滴油加油枪和低渗透胶管等措施进行控制。目前,国内加油站已实施一次、二次油气回收技术。然而,针对呼吸排放是否需要安装油气处理装置仍存在较大争议,因此开展加油站呼吸排放因子检测可为油气排放控制提供依据。
针对加油站不同工艺过程的排放因子,美国环保署(Environmental Protection Agency,EPA)、加州空气资源委员会(California Air Resources Board,CARB)和欧洲环境署(European Environment Agency,EEA)等机构开展了相关研究[10-12]。我国研究者也在北京、上海等地开展了加油站排放因子的研究工作[13-16]。黄玉虎[17]对比了国内外未控制排放因子(Uncontrolled Emission Factor,UEF),即未采取油气回收措施时,每加注1 L汽油所排放的VOCs质量,中国、美国和欧洲加油站的总UEF分别为3 743 mg·L−1、2 902 mg·L−1、1 787 mg·L−1。
国内加油站排放因子的测算是基于典型加油过程现场测试数据,并类比国外的加油排放因子,通过统计学的方法获得。呼吸排放因子与油品特性、气液比、P/V阀设定值、日均加油量、环境温度、埋地油罐内油品温度等因素相关。如我国颁布的国家标准GB 17930-2016《车用汽油国家标准》[18]中规定,每年11月1日—4月30日,国V油品雷氏蒸气压为45~85 kPa;每年5月1日—10月31日,油品雷氏蒸气压为40~65 kPa;美国EPA在AP-42中计算机动车加油过程排放因子时雷氏蒸气压设定为78.6 kPa。我国普遍采用真空辅助式二次油气回收系统,气液比在1.0~1.2,高于国外接近于1.0的设定值[17,19]。GB 20952-2020要求P/V阀正压开启压力为2.2~3.0 kPa[8],高于国外的设定值0.75~1.5 kPa [9]。本研究采用实验测试和数据统计拟合相结合的方法,测定加油站呼吸排放因子随加油量变化的规律,可为不同规模加油站分级管理提供参考。
1. 研究方法
为了准确检测加油站呼吸排放因子,本研究借鉴美国CARB相关的测试规程[20],开发了如图2所示专用的排放采集系统。通过在每台加油机内部的油气回收管路上设置涡街流量计,采集加油过程中的加油机脉冲信号和流量信号,获得每次加油作业的加油量、回气量和气液比;在油罐区的排放管上安装罗茨流量计和压力变送器,连续监测油罐压力和呼吸排放累计流量[21-23]。流量计采用Dresser公司专门用于测量油气挥发物的罗茨CRM8C175型,误差值为±0.75%;压力变送器为北京昆仑海岸公司定制JYB-315MG,测量结果的最大允许误差为0.2%。
为确保实验测试结果具有代表性,本研究选取北京某年销汽油量约9 000 t的二级加油站为测试站点。测试站点配有4个30 m³地下汽油埋地油罐,使用电子式调节系统使加油气液比约维持在1.10,且卸油排放和加油排放油气回收设施性能良好;油罐通气管联通后共用1根通气立管和P/V,测试站点埋地油罐呼吸排放未安装油气回收系统。
在实验前,按GB 20952-2020附录A-C要求,检测站点加油油气回收系统的气液比和密闭性、油气回收管线液阻液阻等指标;同时,校准所有监测仪表,并在随后的实验过程中定期开展校准工作。排放监测流量计和压力表的安装位置如图3(a)和(b)所示,控制界面见图3(c)。从2021年7月起,对测试站点的加油量、回气量、油罐压力、呼吸排气流量等开展了近1年的连续监测。
根据气液两相平衡原理,埋地油罐和通气管形成的气相空间内油气浓度与温度、压力等物理量有关,呼吸阀排放的油气为罐内饱和汽油蒸气。因此,为降低采样难度和提高准确性,在通气管距离地面1 m处设置浓度检测采样口 (图3(b)) 。通过真空负压采样法,用TEDLAR气袋采集立管内的油气;气样经预处理后,采用安捷伦7890气相色谱检测气体中非甲烷总烃(non-methane hydrocarbon,NMHC)的浓度。
2. 结果与讨论
2.1 日加油量和呼吸排放量的相关性
《加油站大气污染物排放标准》(GB 20952-2020)中规定,各种加油油气回收系统的气液比均应为1.00~1.20。每次加油过程通过油气回收型加油枪回收油气多于加油的体积,导致埋地油罐油气压力增大,发生呼吸排放。在气液比保持稳定的情况下,站点超量回收的油气体积与日加油量相关。因此,本研究根据站内监控系统的加油数据,以及所采集的罗茨流量计数据,对2021年10月15日—11月10日期间的单日累计加油量与单日累计P/V阀排放油气量进行了统计分析,结果见图4。
使用SPSS软件进行相关性分析,由于样本数据小于50个,选择Shapro-Wilk检验样本数据的正态分布[24],计算可得单日加油量Po=0.003<0.05,单日排放量Pg=0.276>0.05,这表明单日加油量不具备正态分布特征。对经过现场观测发现,在加油站的日常作业中,油气回收检测、计量检定、设备维修维护等偶发性作业均可能影响油罐压力。虽然此类作业根据操作规程会不定期开展,但每次均会关停加油设施,对单日加油量产生较大影响,为53 000~92 000 L。
选用Spearman相关系数来度量单日加油量(x)和单日排放量(y)2个变量之间的相关性。计算得到r值为0.319,P值为0.105>0.05。这说明单日加油量和单日排放量之间没有显著的相关关系。因此,对于实际加油站而言,由于单日作业过程存在较多干扰因素,不具备总结单日加油量和单日排放量规律的条件。
2.2 累计加油量和呼吸排放量的相关性
影响加油站VOCs排放清单的不确定性因素较多,包括活动水平的可靠性及VOCs 排放因子的适用性和准确性。
为了减少偶发性作业对单日排放量的波动影响,本研究进一步对多日累计加油量和多日累计排放量进行分析。图5为2021年10月15日—11月10日期间多日累计加油量和多日呼吸排放量数据的变化图,累计排放量与累计加油量之间呈现明显线性关系。
通过SPSS计算Pearson相关系数r=0.998 8,这说明2个变量显著线性相关。使用最小二乘估计法对图5的数据序列做线性回归,即使每个样本点
与回归线上的对应点(xi,yi) 在垂直方向上的距离偏差总和最小。使用SPSS内置工具对上述数据做线性回归,可得公式(1)。(xi,f(xi)) y=0.0366x+1052.7 (1) 式(1)线性相关系数R2=0.997 5,回归方程对样本数据点的拟合优度很高。回归方程的截距为1 052.7 L,对比样本总累计呼吸排放量65 419 L ,仅为1.6 %;对比样本总累计加油量1.73×106 L,仅为0.061%。加油站不进行加油作业时,埋地油罐没有大呼吸,且小呼吸明显小于大呼吸,不会引起超压排放,需要对公式(1)进行修正。根据《大气挥发性有机物源排放清单编制技术指南(试行)》[25],油品储运源主要包括油品储运和加油站,VOCs排放总量可按公式Ei=Pi×EFi计算,仅与排放因子EFi和活动水平Pi有关,其中活动水平Pi为油品的周转量,公式中没有设置截距。因此,对回归方程进一步优化,重新拟合所得回归方程见公式(2)。
y=0.0379x (2) 式(2)的线性相关系数R2=0.995 3,即在特定时间段内累计排放量与累计加油量具有固定斜率的显著线性关系。
《石化行业VOCs污染源排查工作指南》[26]、US EPA参考AP-42[8]文件中(石油液体运输和销售)公式计算加油过程VOCs排放量均与加油站汽油销售量或者排放源的活动水平呈线性相关,这与本研究得到的结论一致。
2.3 排放斜率的影响因素
为了验证上述拟合方程在累计加油量变量上的通用性,本研究选取检测周期内的若干个时间段,使用最小二乘估计法对累计加油和累计排放数据进行线性回归,回归结果如表1所示。
表 1 不同时间段累计加油量与累计排放量线性回归参数Table 1. Linear regression parameters of cumulative refueling volume and cumulative emissions in different test periods时间段 排放斜率 拟合优度 气液比 日均加油量Q /L 2021-10-15至2021-10-23 0.039 7 0.956 9 1.062 70 718 2021-10-24至2021-11-10 0.039 2 0.978 2 1.059 62 746 2022-01-05至2022-01-12 0.035 4 0.982 8 1.066 68 365 2022-02-09至2022-03-22 0.041 2 0.989 8 1.133 29 896 2022-04-15至2022-04-28 0.045 0 0.922 2 1.082 33 791 2022-04-29至2022-05-11 0.015 5 0.851 5 1.080 21 075 2022-05-12至2022-05-31 0.007 6 0.644 2 1.102 15 918 2022-07-01至2022-07-31 0.038 3 0.953 2 1.061 33 474 该加油站所有时间段的加油气液比均为 (1.08±0.05) ,气液比处于非常稳定的状态。气液比与拟合所得斜率的相关系数r=−0.060 5,说明这2个变量的相关性不显著,故暂不考虑气液比对排放量的影响。
对于指定加油站,加油站内外部环境、油非互动等是影响油品销售量的重要因素。在2021年10月至2022年4月期间,测试站点日均加油量较大,排放斜率稳定在0.035 4~0.045;2022年4月底到6月期间,北京因新型冠状病毒肺炎疫情发布系列社会面防控要求社会面流动和活动的显著减少直接导致了加油站日均加油量的减少,排放斜率相应明显降低。测试站点5月12日至31日,日均加油量降至15 918 L,排放斜率下降至0.007 6。根据现场测试流量和压力数据,2022年5月份仅有9天发生了P/V阀超压开启情况,且油气总排放量仅为6 034 L。
根据EPA在AP-42中油罐车卸油过程排放因子LL和机动车加油过程排放因子LD(1995年)计算公式[9],排放因子与装卸方式、环境温度、油品的雷氏蒸气压等因素有关。2022年4月15日到28日周期内统计所得排放斜率为0.045,高于前4个测试周期的数据。这与环境温度升高,油品的蒸发速率加快,雷氏蒸气压升高有关,因此在以后的研究中,还需进一步细化分析这些参数对排放斜率的影响。同时,由于2022年4月29日以后的3个测试周期内,出现29个样本P/V阀单日排放量为0,这3个周期的排放斜率变化也需从温度、加油量等方面开展进一步的分析。
测试站点不同时间段日均加油量与排放斜率的散点图如图6所示,排放斜率k先随着日均加油量的升高而增大;当日均加油量升至约28 800 L时,k的变化逐渐变小。因此,k是与某个年均销售规模Q加油站排放因子相关的参数。使用最小二乘估计法对日均加油量和排放斜率进行拟合,见式(3)。
k=6.66×10−16×Q3−1.17×10−11×Q2+6.44×10−6×Q−0.069 (3) 式(3)线性相关系数R2=0.935 2。对式(3)求解,日均加油量Q为15 920 L时,排放斜率k=0。上述现象是由于埋地油罐P/V阀的开启压力设定为+(2.2-3.0) kPa,具有一定的保压效果,当日均加油量低于15 920 L时,埋地油罐P/V阀基本没有呼吸排放。这与实际加油站作业中检测的数据基本一致,说明可通过日平均加油量Q(L)分段计算不同规模加油站的排放斜率k,并以此计算排放量,如式(4)所示。
k={6.66×10−16Q3−1.17×10−11Q2+6.44×10−6Q−0.069Q≥159200Q<15920 (4) 2.4 排放斜率与排放因子换算
在实验测试过程中,在加油站通气管采样检测油气的体积浓度,并根据《石化行业VOCs污染源排查工作指南》[26]附表二-19,15.6 ℃时油气分子量为68 g
,得到呼吸排放的非甲烷总烃NHMC平均质量浓度为777 mg·L−1,即呼吸排放因子·mol−1 。UEF=k·777mg·L−1 根据《HJ 1118-2020》中汽油密度为760 g·L−1[18],计算典型规模加油站的排放因子如表2。日加油量44 717 L,即年销售量12 400 t时,呼吸排放因子最高为34.65 mg·L−1;当日加油量增加到72 098 L时,呼吸排放因子与28 839 L的计算结果基本接近。
表 2 不同年汽油销售规模加油站的排放因子Table 2. Emission factors of the gasoline filling station with different annual sales scale年汽油销售规模Qa/t 日均汽油销售量Q/L 呼吸排放因子 / (mg·L-1)UEF 4 416 15 918 0 5 000 18 024 9.50 8 000 28 839 29.45 10 000 36 049 32.83 12 400 44 717 34.65 20 000 72 098 29.07 表1说明,当日加油量Q超过29 000L时,采集足够多样本且在气象因素基本一致情况下,排放斜率k取值为0.037 9~0.041 2;取其平均值0.038 3,也可估算排放因子,
=0.038 3×0.777 g·L−1=29.76 mg·L−1。UEF 对比表2,当日加油量Q为28 839 L时,即年销售量为8 000 t时,排放因子为29.45 mg·L−1。这与上述所得排放因子29.76 mg·L−1基本一致,说明实验测试与拟合公式计算值可以相互验证。
参考黄玉虎等[13,17,19]的研究结果,本研究得出的排放因子为给非ORVR (Onboard Refueling Vapor Recovery,车载加油油气回收系统)车辆加油,且加油站内具备一次和二次油气回收、在线监测系统时,加油站正常运行条件下,埋地油罐呼吸的排放因子约为30 mg·L−1。文献报道的国内外研究机构得出的呼吸排放因子如表3所示。
表 3 国内外不同研究机构得出的排放因子Table 3. Emission factors obtained by different research institutions at home and abroad各研究机构得出的数据为8~122 mg·L−1,与本研究通过实验测试所得的呼吸排放因子相比均不超过同一个数量级,检测结果较为接近。美国EPA、欧洲EEA和上海市环科院是未采安装油气处理装置时的呼吸排放因子,国外的P/V阀正压开启压力设定值普遍低于国内。这说明加装油气处理装置可显著降低呼吸排放因子。美国CARB和北京市环科院呼吸排放因子较本研究得出的结果要低。
2.5 油气处理装置安装的可选择性
《加油站大气污染物排放标准》(GB 20952-2020)实施后,加油站是否需要安装油气处理装置由各省级环保主管部门自行决定,在《排污许可证申请与核发技术规范 储油库、加油站》(HJ 1118-2020)执行过程中,多个省市环保部门均强制要求所有加油站必须安装油气油气处理装置。
与现有文献中基于统计采样分析得出的排放因子相比,本研究进一步明确了加油规模对呼吸排放因子的影响,年汽油销售规模超过4 500 t的加油站才有必要安装油气处理装置对埋地油罐的呼吸排放进行控制。以我国东部某省为例,全省共计有10 000多座加油站,年销汽油量超过4 500 t的油站数量占比仅约10%,有近9 000余座站点并不需要安装油气处理装置,油气处理设施安装后减排效益不明显,而且存在着自身能耗较高、容易产生危废等问题,造成了较大的环保投入浪费,并没有体现“协同增效、减污降碳”的发展思路[27]。按油气处理装置单价10万元计算,全省可减少油气处理装置投资约8亿元;将这些费用投入到其它油气回收环节的技术升级,能起到更好的油气排放控制效果。
3. 结论
1) 加油站的埋地油罐呼吸排放因子与日均加油量密切相关。对于常规配置4台汽油埋地油罐的标准化加油站,加油气液比设定为1.10、P/V阀正压开启压力为2.2~3.0 kPa条件下,日均加油量小于15 920 L时,呼吸排放因子为0;随着日均加油量的升高,呼吸排放因子将逐步升高,超过28 800 L左右后,呼吸排放因子变化趋于稳定,呼吸排放因子约为30 mg·L−1。
2) 综合考虑油气处理装置安装成本和产生的环境效率,年汽油销售规模超过4 500 t的加油站才有必要安装油气处理装置,以降低呼吸排放的油气量。
3) 目前实验加油站的气液比、P/V阀开启压力均按照国家标准要求设定,需要将进一步研究不同气液比设定范围、不同P/V阀开启压力对呼吸排放因子的影响,降低加油站呼吸排放因子,减少呼吸排放的油气量。
4) 我国在2020年开始实施GB 18352.6-2016标准,具备车载油气回收ORVR功能的车辆将越来越多。有必要对ORVR与二次油气回收系统的不兼容排放因子开展研究,可为ORVR兼容型油气回收控制技术的研发提供数据支撑。
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