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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展

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张毅波, 马明, 王明仕, 常天俊. 基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展[J]. 环境化学, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
引用本文: 张毅波, 马明, 王明仕, 常天俊. 基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展[J]. 环境化学, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
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ZHANG Yibo, MA Ming, WANG Mingshi, CHANG Tianjun. Advances in CRISPR/Cas-based biosensors for environmental analysis applications[J]. Environmental Chemistry, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
Citation: ZHANG Yibo, MA Ming, WANG Mingshi, CHANG Tianjun. Advances in CRISPR/Cas-based biosensors for environmental analysis applications[J]. Environmental Chemistry, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展

  • 1.

    河南理工大学资源环境学院，焦作，454003

  • 2.

    宁波海关技术中心，宁波，315012

    • 通讯作者: E-mail：changtj@hpu.edu.cn
  • 基金项目:
    国家自然科学基金（U1704241）资助.

  • 中图分类号: X-1；O6

  • CSTR: 32061.14.hjhx.2023110205

Advances in CRISPR/Cas-based biosensors for environmental analysis applications

  • 1.

    School of Resources and Environment, Henan Polytechnic University, Jiaozuo, 454003, China

  • 2.

    Ningbo Customs Technology Center, Ningbo, 315012, China

    • Corresponding author: CHANG Tianjun, changtj@hpu.edu.cn
  • Fund Project: National Natural Science Foundation of China (U1704241).

摘要

  • 摘要: CRISPR/Cas可改造为靶核酸刺激-响应的传感系统，可视为集“分子识别与信号输出”一体的生物传感器，目前在核酸即时诊断中已得到广泛应用. 鉴于该系统具有成熟、可靠和可扩展的优点，研究人员尝试将其用于环境分析领域的非核酸分析物检测，已开发了一系列具有应用前景的便携式设备. 然而，如何将非核酸靶标信息转换为核酸信息仍存在挑战，这限制了CRISPR/Cas系统在环境分析中的应用推广. 为此，本文综述了CRISPR/Cas系统在重金属离子和阴离子、新污染物、农药与真菌毒素以及有害细菌等非核酸靶标检测中的应用进展，重点介绍了构筑非核酸靶标信息转换元件的策略，以期为推进该系统在环境分析中的应用提供支持.
    Abstract: The CRISPR/Cas can be engineered as a stimuli-responsive sensing system for the target nucleic acids, which enables it to serve as a “two-in-one” biosensor with both molecular recognition element and signal output element. Up to date, this type of biosensing systems have been widely employed in the Point of Care Testing (POCT) for nucleic acids. Taking advantage of being mature, reliable and scalable, the CRISPR/Cas system has been developed as portable devices for the identification of non-nucleic acid analytes in the field of environmental analytical chemistry. However, challenges remain to be resolved in converting the information from non-nucleic acid targets to nucleic acids, and thus limiting its utilization in environmental analysis. Here, we review the applications of the CRISPR/Cas system in the detection of non-nucleic acid targets, including heavy metal ions and anions, emerging contaminants, pesticides, mycotoxins, and harmful bacteria. Moreover, we focus on the strategies of constructing non-nucleic acid target transducers in order to promote the utilization of this system in environmental analysis.

  • 混凝是一种常见的水处理工艺，混凝剂可使水中胶体粒子和微小悬浮物发生聚集，从而通过沉淀作用将其分离，进而达到净化水的目的[1]。铝盐混凝剂是一种高效无机混凝剂，不同类别铝盐在水解时形态差异较大，按照与Ferron试剂的反应速度不同，其可分为Ala、Alb和Alc[2]，3种形态的铝分子质量和稳定性都逐步增强[3]。一般来讲，Ala形态只具有压缩双电层性能；Alb形态具有最强的电中和性能；而Alc形态由于其颗粒粒度已达到一定的尺寸，从而具有较高的吸附架桥性能[4-5]。

    虽然铝系混凝剂对于水中污染物具有显著的去除作用，但水体中的残余铝对人体健康和输水过程具有显著影响。有研究表明，铝的毒性不仅与总铝浓度有关，还与铝的存在形态密切相关[6]。溶解态铝对人体造成的危害较大，其会通过饮食摄入的方式进入人体并积累残留，从而产生一定慢性中毒，如引发学习记忆障碍、骨软化、抑制免疫功能、睾丸毒性病理改变以及胚胎发育致畸形等[7-9]。溶解态余铝的产生是由于铝盐混凝剂在净化水过程时容易以溶解态的单体或小聚合体的形式与溶解性有机物中的羧基、酚基类活性基团络合，形成溶于水的有机络合态铝而残留在水中[10-12]。总体而言，目前对出水残余铝的研究主要集中在分子质量小于1 000、1 000~3 000和3 000~10 000 Da的溶解态铝、颗粒态铝以及总铝5个方面，溶解态铝由于其尺寸在超滤范围内[13]，因此，又被称为超滤膜分级余铝。

    本文主要对出水中超滤膜分级余铝和混凝过程进行了研究，以黄河上游水源水作为实验样本，研究了Al13和AlCl3 2种不同铝形态的混凝剂在不同投加量下的混凝过程，结合出水中的溶解态余铝含量、UV254、pH、浊度和絮体特性的变化趋势，探究了铝形态对出水残余铝及混凝过程的影响机制，以期为实际工程生产中余铝的控制及絮体调控提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   材料与设备

    1)实验原水。本实验选用黄河上游水源水作为原水进行实验，对其进行水质分析，其表征结果为UV254为 0.045 cm−1，pH为7.94，浊度为2.13 NTU，水中总有机碳的质量浓度(以TOC计)为2.143 mg·L−1。

    2)混凝剂。氯化铝(AlCl3·6H2O)分析纯，购自上海升德医药科技有限公司。利用慢速滴碱法制备出 OH+与Al3+物质的量的比为2.2:1的PACl溶液，然后加硫酸钠形成硫酸铝十三沉淀，利用氯化钡溶液置换出Alb含量大于 90%，Al含量为0.1 mol·L−1的Al13溶液[14]。利用Ferron络合比色法[15]测定Al13和AlCl3 2种混凝剂中Al的形态，实验结果列于表1。结果表明，AlCl3中主要的铝形态为Ala，而Al13中主要铝形态为Alb，选择此2种混凝剂可有效探究铝形态对混凝过程及出水余铝的影响。

    表 1  混凝剂的Al形态分布
    Table 1.  Al species for coagulants used in this study
    Al形态Ala/%Alb/%Alc/%
    AlCl395.213.281.51
    Al132.9396.270.80
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    3)实验设备。搅拌采用HJ-6A型六联电动搅拌仪(上海汗诺)，药品称量采用FA2204C型电子天平(上海天美)，测试余铝含量采用EXPEC 7000型ICP-MS(北京吉天仪器)，UV254的测定765型紫外可见分光光度计(上海仪电)，pH的测定采用pHs-3C型pH仪(上海理达仪器厂)，浊度测试采用2100P型的浊度仪(美国Hach公司)，粒度的测定采用Mastersizer 2000型的激光粒度仪(Malvern，UK)。

    1.2   实验方法

    1)混凝实验。首先取1 L实验原水倒入烧杯中，以250 r·min−1搅拌30 s，再加入一定量混凝剂，以200 r·min−1搅拌90 s，之后以40 r·min−1搅拌10 min，最后静置沉淀30 min。混凝剂投加量为0.01~0.08 mmol·L−1(以Al原子量计算)，浓度梯度为0.01 mmol·L−1。

    2)分级实验。在混凝结束后，利用膜分离技术进行过滤分级实验[13]。利用从大到小多种孔径的滤膜，逐步分离出溶解态铝、3 000~10 000、1 000~3 000 和小于1 000 Da的溶解态铝。首先，将含有颗粒态和溶解态铝的混凝后出水利用0.45 μm的膜进行过滤，颗粒态铝被截留；利用截留分子质量为10 000 Da的膜对第1次渗出液进行过滤，分子质量大于10 000 Da的铝被截留；再利用截留分子质量为3 000 Da的膜对第2次渗出液进行过滤，在3 000~10 000 Da的铝被截留；利用截留分子质量为1 000 Da的膜对第3次渗出液进行过滤，1 000~3 000 Da的铝被截留，小于1 000 Da的铝存在于最终渗出液中。

    1.3   表征方法

    使用ICP-MS测定出水中的余铝含量，使用紫外分光光度计分析出水中的UV254，使用pH计测试出水pH，使用浊度仪分析出水浊度，使用马尔文激光粒度仪测试絮体粒度，强度因子，恢复因子以及分形维数。

    2.   结果与讨论

    2.1   出水水质分析

    1)溶解态余铝。图1反映了2种混凝剂在不同投加量下出水中溶解态铝浓度变化的趋势。结果表明，随着混凝剂投加量的增加，残余铝质量浓度均呈现出先增后减的趋势。当使用0.05 mmol·L−1 AlCl3作为混凝剂时，余铝质量浓度最大值为280.59 μg·L−1，之后开始迅速下降；而当0.06 mmol·L−1 Al13作为混凝剂时，余铝质量浓度最大值为72.43 μg·L−1。这是因为在混凝剂投加量较低时，铝以络合体形式存在于出水中，导致余铝浓度上升，而随着投加量的增加至一定限值，水中开始形成絮体，余铝浓度出现下降[2]。总体来看，在投加量范围内，Al13作为混凝剂时，出水中余铝质量浓度均低于0.2 mg·L−1，且受混凝剂投加量影响较小。

    图 1  出水溶解态余铝浓度变化的趋势图
    Figure 1.  Dissolved residual aluminum at different coagulant dosages
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    2) UV254变化。图2反映了2种混凝剂在不同投加量下出水中UV254变化的趋势。在投加量范围内，2种混凝剂出水中UV254均随着投加量的增加出现下降趋势，对有机物均有一定去除效果。在投加量较低时，Al13有更强的电中和能力，其表现出比AlCl3更高的芳香类物质去除率；但当投加量超过0.06 mmol·L−1时，Al13出水中UV254从0.026 cm−1急剧上升至0.034 cm−1，这是因为Al13浓度过高导致的电荷逆转，Al13的正电荷较高使颗粒和胶体带有较高的同号正电荷，相对排斥而复稳，而AlCl3通过吸附架桥和网捕卷扫作用仍对UV254有较好的去除效果[16]。

    图 2  出水UV254变化的趋势图
    Figure 2.  Residual UV254 at different coagulant dosages
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    3) pH的变化。图3反映了2种混凝剂在不同投加量下出水pH的变化趋势。可见，在不同投加量下，Al13作为混凝剂时对出水pH影响较小。分析原因在于Al13具有更好的形态稳定性，对于出水水质的影响较小。当AlCl3作为混凝剂时，随着投加量的增加，AlCl3水解反应导致出水pH逐渐降低。

    图 3  出水pH变化的趋势图
    Figure 3.  Residual pH at different coagulant dosages
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    4)浊度的变化。图4反映了2种混凝剂在不同投加量下出水浊度变化的趋势。对比图1溶解态余铝浓度的变化可以看出，余铝和余浊存在一定的相关性[17]。随着AlCl3投加量的增加，出水浊度变化较大，在投加量较低时，出水浊度较高，在投加量从0.04 mmol·L−1增加到0.05 mmol·L−1时，出水浊度从1.3 NTU降至0.735 NTU，进一步增加投加量，出水浊度仍表现出下降趋势。而当Al13作为混凝剂时，出水浊度相对较低且稳定，均在0.73~0.895 NTU。分析原因在于Al13具有较高的正电荷，在低投加量时可以通过吸附电中和作用中和悬浮和胶体颗粒之间的静电排斥力[14]，而且其水解后的Alb形态能通过表面络合等模式与腐殖酸形成沉淀物，然后通过网捕卷扫作用去除体系中存在的颗粒，从而达到较好的除浊效果[2]。

    图 4  出水浊度变化的趋势图
    Figure 4.  Residual turbidity at different coagulant dosages
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    2.2   混凝过程中絮体特征

    图5反映了2种混凝剂在不同投加量下絮体特征的变化(当AlCl3作为混凝剂时，在浓度为0.04 mmol·L−1时未出现絮体)。图5(a)为平衡时絮体的粒度变化。当Al13作为混凝剂时，絮体粒度均较大，且当Al13浓度为0.06 mmol·L−1时粒度达到最大；当AlCl3作为混凝剂时，絮体粒度表现为随投加量的增加而变大。图5(b)为平衡时絮体的强度因子变化。絮体强度因子越高，代表其抗剪切能力越强，当Al13作为混凝剂时絮体强度因子较稳定，而当AlCl3作为混凝剂时，絮体强度为随投加量的增加而迅速增加，且在AlCl3为0.08 mmol·L−1时超过Al13。这说明低投加量下Al13形成的污泥絮体抗剪切能力更强，而高投加量下则AlCl3的更强。图5(c)为平衡时絮体的恢复因子变化，絮体恢复因子越高，代表絮体被破坏后越容易重新团聚成絮体，2种混凝剂均表现出较稳定的性能，在低浓度时，Al13作为混凝剂的恢复因子较大，絮体受到破坏后更容易恢复；而在高浓度时，AlCl3作为混凝剂形成的絮体受到破坏后更容易恢复[18]。图5(d)中的分形维数代表平衡时絮体的分形体不规则的量度[19]，分形维数越高，意味着絮体越紧实[20]，2种混凝剂均表现出随投加量增加而下降的趋势，且不同投加量下AlCl3紧实度均高于Al13。

    图 5  2种混凝剂在不同投加量下絮体的粒度、强度因子、恢复因子和分形维数变化
    Figure 5.  Changes of floc size, strength factor, recovery factor and fractal dimension of flocs at different coagulant dosages
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    2.3   不同条件下出水残余铝的分析

    图6反映了2种混凝剂在不同投加量下出水中总溶解铝及各分子质量铝的质量浓度变化。可见，不同浓度下AlCl3做混凝剂时出水总溶解铝均高于Al13体系，值得注意的是，随着混凝剂投加量从0.04 mmol·L−1增加至0.06 mmol·L−1，投加Al13的出水中总溶解铝质量浓度从52 μg·L−1略微增长至67 μg·L−1，但投加AlCl3的则从267 μg·L−1急剧下降123 μg·L−1，质量浓度急剧的下降是由于水中的浊度变化导致总溶解铝的质量浓度出现变化[10]，图4中的浊度变化也证明了这一点。

    图 6  2种混凝剂在不同投加量下出水中各分子质量铝的质量浓度
    Figure 6.  Mass concentration of molecular weight aluminum in effluent at different dosages of two kinds of coagulants
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    从各分级铝的质量浓度来看，AlCl3在不同投加量下出水中均为小于1000 Da的铝占比最大(分子质量较低的余铝不容易在滤池中被去除，造成出水中余铝质量浓度升高)，而Al13在投加量为0.04 mmol·L−1时1 000~3 000 Da的铝占比最高，在投加量为0.06 mmol·L−1时，3 000~10 000 Da的铝占比最高，这与图6(a)中相应不同投加量下的絮体粒度变化趋势一致。

    2.4   絮凝处理后出水的三维荧光光谱分析

    图7为原水的三维荧光图[14]，其中区域I为蛋白质1，区域II为蛋白质2，区域III为富里酸，区域IV为微生物代谢产物，区域V为腐殖酸。根据计算，原水中的有机物主要为腐殖酸及微生物代谢产物，总计含量超过65%，而亲水性的蛋白质含量较低(约为23%)。

    图 7  实验原水三维荧光图
    Figure 7.  3D-EEM for source water
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    图8为在不同Al13投加量下出水的三维荧光光谱。可见，在不同Al13投加量下，荧光图中各区域的响应强度无明显变化。对比图7中的原水三维荧光图可发现，富里酸和腐殖酸区域的响应强度明显下降。这是因为Al13有很强的电中和能力，在低投加量下就可达到芳香类物质较高的去除率[14]。

    图 8  Al13处理后出水三维荧光图
    Figure 8.  3D-EEM for Al13 treated water samples
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    图9反映了AlCl3在不同投加量下出水的三维荧光光谱。AlCl3投加量对荧光光谱中各区域的响应强度影响较大。对比图1中的原水三维荧光光谱可见，当投加量小于0.04 mmol·L−1时，富里酸、腐殖酸、蛋白质和微生物代谢产物区域的响应强度有所增加；而AlCl3超过0.04 mmol·L−1后，以上4个区域的响应强度均出现明显下降，这说明在AlCl3高投加量下对几种有机物均有一定的去除能力。

    图 9  AlCl3处理后出水三维荧光图
    Figure 9.  3D-EEM for AlCl3 treated water samples
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    对比图8和图9可以发现，Al13对富里酸和腐殖酸的去除效果要优于AlCl3，且在较低投加量下就表现出较好的去除效果，但其对蛋白质和微生物代谢产物的去除效果较弱；而AlCl3对4种有机物均能去除，但由于其工作原理是通过吸附架桥和网捕卷扫作用，因此需要在较高质量浓度时才有效果[14]。

    3.   结论

    1)混凝剂的投加量限值为0.01~0.08 mmol·L−1，投加量过高会造成混凝剂的浪费，但投加量过低则会导致水中残余铝浓度较高。2种混凝剂的最优投加量均为0.06 mmol·L−1。

    2)对比2种混凝剂可以发现，Al13具有更优的混凝性能，在0.06 mmol·L−1的最佳Al13投加量时，残余铝质量浓度为72.43 μg·L−1，UV254为0.034 cm−1，pH为7.86，浊度为0.895 NTU，而且在投加量为0.01 mmol·L−1时对芳香类物质有较高的去除率。

  • 图 1  基于CRISPR/Cas系统的离子传感器：（a）RCD-AuNP球形核酸与CRISPR/Cas整合的Pb2+传感器[17]；（b）适配体-CRISPR/Cas系统检测Cd2+[21]；（c）核糖开关-CRISPR/Cas系统检测F−[22]

    Figure 1.  CRISPR/Cas-based biosensor for the detection of heavy metal ions and anion （F−）: （a） RCD-AuNP spherical nucleic acids and CRISPR/Cas system for the sensing of Pb2+ [17]; （b） An aptamer-CRISPR/Cas system as a Cd2+ sensor [21]; （c） A riboswitch-CRISPR/Cas system for the detection of F− [22]

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    图 2  基于CRISPR/Cas系统的内分泌干扰物、抗生素和持久性有机污染物的生物传感器：（a）适配体-CRISPR/Cas系统检测E2[25]；（b）整合ELISA与CRISPR/Ca系统检测E2[26]；（c）基于适配体-HCR-CRISPR/Cas的卡那霉素传感器[28]；（d）基于适配体-SDA-CRISPR/Cas的妥布霉素传感器[30]；（e）检测BaP、AFB1和CAP的“iPOCT”系统[34]

    Figure 2.  CRISPR/Cas-based biosensors for the detection of endocrine disrupting chemicals, antibiotics, and persistent organic pollutants: （a） Aptamer-CRISPR/Cas system for the sensing of E2[25]; （b） Combination of ELISA and CRISPR/Cas system for the detection of E2[26]; （c） Aptamers, HCR, and CRISPR/Cas-based biosensors for kanamycin[28]; （d） Aptamer-SDA-CRISPR/Cas system for Tobramycin detection[30]; （e） An “iPOCT” system for the detection of BaP, AFB1, and CAP[34]

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    图 3  基于CRISPR/Cas系统检测农药和真菌毒素的生物传感器：（a）检测农药的三酶级联系统 [36]；（b）适配体-CRISPR/Cas系统检测AFB1[39]；（c）适配体-CRISPR/Cas系统检测胶霉毒素[40]

    Figure 3.  CRISPR/Cas -based biosensors for the detection of pesticides and mycotoxins: （a） A three-enzymes-cascade system for the detection of pesticides[36]; （b）, and （c） Aptamer-CRISPR/Cas-based biosensor for AFB1 （b） [39]; and gliotoxin （c） [40]

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    图 4  基于CRISPR/Cas检测细菌的生物传感器. （a）适配体-CRISPR/Cas系统检测鼠伤寒沙门菌[42]；（b）基于RNA-cleaving DNAzyme切割ccrRNA激活CRISPR/Cas系统的策略检测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌[43]

    Figure 4.  CRISPR/Cas-based biosensors for the detection of bacteria: （a） Aptamer-CRISPR/Cas-based biosensor for Salmonella typhimurium[42]; （b） A CRISPR/Cas-based biosensor that is activated by a ccrRNA-cleaving DNAzyme for the detection of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae[43]

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    表 1  基于CRISPR/Cas系统的传感器在环境分析中的应用

    Table 1.  Application of CRISPR/Cas-based biosensors in the environmental analysis field

    靶标Targets 信息转换元件Information converting element 效应蛋白The type of Cas 检出限Limit of detection 检测时间Detection time 信号输出Signal output 样品Samples 检测设备Testing equipment 文献Ref.
    重金属离子 Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.053 nmol·L−1 15 min 荧光法 — — [16]
    Pb2+ DNAzyme（8-17E） Cas12a 86 fmol·L−1 — 荧光法 血清、空气颗粒、土壤 智能手机 [17]
    Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.54 nmol·L−1 — 比色法 食用油、白酒 肉眼观察 [18]
    Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.02 pmol·L−1 — 电化学 酒、花生、大米、食用油 电化学分析仪 [19]
    Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.48 nmol·L−1 — 荧光法 矿泉水 便携式3D打印设备 [20]
    Cd2+ 适配体 Cas12a 60 pmol·L−1 120 min 荧光法 湖水、大米 — [21]
    Zn2+ 变构转录因子（SmtB） Cas13a 1 μmol·L−1 20 min 荧光法 市政水样 便携式3D打印设备 [22]
    阴离子 F− 核糖开关（crcB） Cas13a 1 μmol·L−1 20 min 荧光法 — 便携式3D打印设备 [22]
    F− 核糖开关 Cas13a 1.7 μmol·L−1 30 min 荧光法 瓶装水、自来水、湖水 荧光计 [23]
    内分泌干扰物 双酚A、雌二醇 适配体 Cas12a 0.06、0.08 nmol·L−1 20 min 荧光法 尿液、污水 — [24]
    雌二醇 适配体 Cas12a 0.015 ng·mL−1 — 比色法 牛奶、蛋类、猪肉 肉眼观察 [25]
    内分泌干扰物 雌二醇 适配体 Cas12a 180 fmol·L−1 — 比色法 牛奶、自来水、血清、尿液 LFA [26]
    抗生素 卡那霉素 适配体 Cas12a 4.06 pmol·L−1 30 min 同位素法 野生鱼血清、肌肉、肝脏 电感耦合等离子体-质谱法 [27]
    卡那霉素 适配体 Cas12a 1 pmol·L−1 — 酶催化蔗糖转化为葡萄糖 河水、牛奶 血糖仪 [28]
    卡那霉素 适配体 Cas12a 14.8 nmol·L−1 26min 比色法 牛奶 侧向层析测定 [29]
    妥布霉素 适配体 Cas12a 1.542 pmol·L−1 — 荧光法 湖水、牛奶 紫外灯 [30]
    四环素 变构转录因子（TetR） Cas12a 2 μmol·L−1 — 荧光法 环境水样 手持可视化荧光仪 [31]
    氨苄青霉素 适配体 Cas12a 0.01 nmol·L−1 30 min 荧光法 鲜奶、生蛋清、生蜂蜜 荧光仪 [32]
    氨苄青霉素 适配体 Cas14a 2.06 nmol·L−1 45 min 同位素法 江河水样 ICP-MS [33]
    持久性有机污染物 苯并[a]芘 抗体 Cas12a 4.971 fg·mL−1 — 荧光法 湖水、大豆油 智能手机 [34]
    对羟基苯甲酸 变构转录因子 Cas12a 1.8 nmol·L−1 — 荧光法 — 荧光仪 [35]
    农药 对氧磷、敌敌畏、内吸磷 DNAzyme（8-17E变体） Cas12a 270、406、218 pg·mL−1 — 荧光法 柑橘类水果、卷心菜 — [36]
    啶虫脒 适配体 Cas12a 2.7 pmol·L−1 — 电化学发光 生菜 肉眼观察 [37]
    真菌毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 抗体 Cas12a 0.061 ng·mL−1 30 min 粒子计数 玉米、水 粒子计数器 [38]
    黄曲霉毒素 抗体 Cas12a 0.00257 fg·mL−1 — 荧光法 花生、面粉 智能手机 [34]
    黄曲霉毒素 适配体 Cas12a 0.8 ng·mL−1 20 min 比色法 红酒、啤酒、牛奶 荧光板读取仪 [39]
    胶霉毒素 适配体 Cas12a 2.4 fmol·L−1 55 min 电化学 苹果、胡萝卜、红薯、马铃薯、玉米 手持式电化学分析仪 [40]
    赭曲霉毒素 适配体 Cas12a 0.83 ng/mL 60 min 荧光法 玉米粉 荧光仪 [41]
    细菌 沙门氏菌 适配体 Cas12a 20 CFU·mL−1 — 电化学 牛奶 电化学工作站 [42]
    大肠杆菌 DNAzyme（EC1） Cas12a 102 CFU·mL−1 107 min 荧光法 尿液 荧光仪 [43]
    肺炎球菌 DNAzyme（KP6） Cas12a 102 CFU·mL−1 — 荧光法 — 荧光仪 [43]
    　　“—”，文献缺乏相应信息. “—”, Lack of information.
    靶标Targets 信息转换元件Information converting element 效应蛋白The type of Cas 检出限Limit of detection 检测时间Detection time 信号输出Signal output 样品Samples 检测设备Testing equipment 文献Ref.
    重金属离子 Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.053 nmol·L−1 15 min 荧光法 — — [16]
    Pb2+ DNAzyme（8-17E） Cas12a 86 fmol·L−1 — 荧光法 血清、空气颗粒、土壤 智能手机 [17]
    Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.54 nmol·L−1 — 比色法 食用油、白酒 肉眼观察 [18]
    Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.02 pmol·L−1 — 电化学 酒、花生、大米、食用油 电化学分析仪 [19]
    Pb2+ DNAzyme（GR-5） Cas12a 0.48 nmol·L−1 — 荧光法 矿泉水 便携式3D打印设备 [20]
    Cd2+ 适配体 Cas12a 60 pmol·L−1 120 min 荧光法 湖水、大米 — [21]
    Zn2+ 变构转录因子（SmtB） Cas13a 1 μmol·L−1 20 min 荧光法 市政水样 便携式3D打印设备 [22]
    阴离子 F− 核糖开关（crcB） Cas13a 1 μmol·L−1 20 min 荧光法 — 便携式3D打印设备 [22]
    F− 核糖开关 Cas13a 1.7 μmol·L−1 30 min 荧光法 瓶装水、自来水、湖水 荧光计 [23]
    内分泌干扰物 双酚A、雌二醇 适配体 Cas12a 0.06、0.08 nmol·L−1 20 min 荧光法 尿液、污水 — [24]
    雌二醇 适配体 Cas12a 0.015 ng·mL−1 — 比色法 牛奶、蛋类、猪肉 肉眼观察 [25]
    内分泌干扰物 雌二醇 适配体 Cas12a 180 fmol·L−1 — 比色法 牛奶、自来水、血清、尿液 LFA [26]
    抗生素 卡那霉素 适配体 Cas12a 4.06 pmol·L−1 30 min 同位素法 野生鱼血清、肌肉、肝脏 电感耦合等离子体-质谱法 [27]
    卡那霉素 适配体 Cas12a 1 pmol·L−1 — 酶催化蔗糖转化为葡萄糖 河水、牛奶 血糖仪 [28]
    卡那霉素 适配体 Cas12a 14.8 nmol·L−1 26min 比色法 牛奶 侧向层析测定 [29]
    妥布霉素 适配体 Cas12a 1.542 pmol·L−1 — 荧光法 湖水、牛奶 紫外灯 [30]
    四环素 变构转录因子（TetR） Cas12a 2 μmol·L−1 — 荧光法 环境水样 手持可视化荧光仪 [31]
    氨苄青霉素 适配体 Cas12a 0.01 nmol·L−1 30 min 荧光法 鲜奶、生蛋清、生蜂蜜 荧光仪 [32]
    氨苄青霉素 适配体 Cas14a 2.06 nmol·L−1 45 min 同位素法 江河水样 ICP-MS [33]
    持久性有机污染物 苯并[a]芘 抗体 Cas12a 4.971 fg·mL−1 — 荧光法 湖水、大豆油 智能手机 [34]
    对羟基苯甲酸 变构转录因子 Cas12a 1.8 nmol·L−1 — 荧光法 — 荧光仪 [35]
    农药 对氧磷、敌敌畏、内吸磷 DNAzyme（8-17E变体） Cas12a 270、406、218 pg·mL−1 — 荧光法 柑橘类水果、卷心菜 — [36]
    啶虫脒 适配体 Cas12a 2.7 pmol·L−1 — 电化学发光 生菜 肉眼观察 [37]
    真菌毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 抗体 Cas12a 0.061 ng·mL−1 30 min 粒子计数 玉米、水 粒子计数器 [38]
    黄曲霉毒素 抗体 Cas12a 0.00257 fg·mL−1 — 荧光法 花生、面粉 智能手机 [34]
    黄曲霉毒素 适配体 Cas12a 0.8 ng·mL−1 20 min 比色法 红酒、啤酒、牛奶 荧光板读取仪 [39]
    胶霉毒素 适配体 Cas12a 2.4 fmol·L−1 55 min 电化学 苹果、胡萝卜、红薯、马铃薯、玉米 手持式电化学分析仪 [40]
    赭曲霉毒素 适配体 Cas12a 0.83 ng/mL 60 min 荧光法 玉米粉 荧光仪 [41]
    细菌 沙门氏菌 适配体 Cas12a 20 CFU·mL−1 — 电化学 牛奶 电化学工作站 [42]
    大肠杆菌 DNAzyme（EC1） Cas12a 102 CFU·mL−1 107 min 荧光法 尿液 荧光仪 [43]
    肺炎球菌 DNAzyme（KP6） Cas12a 102 CFU·mL−1 — 荧光法 — 荧光仪 [43]
    　　“—”，文献缺乏相应信息. “—”, Lack of information.
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  • [1] ISHINO Y, SHINAGAWA H, MAKINO K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J]. Journal of Bacteriology, 1987, 169(12): 5429-5433. doi: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987
    [2] MOJICA F J, DIEZ-VILLASENOR C, GARCIA-MARTINEZ J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal Of Molecular Evolution, 2005, 60(2): 174-182. doi: 10.1007/s00239-004-0046-3
    [3] MOJICA F J, DIEZ-VILLASENOR C, SORIA E, et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J]. Molecular Microbiology, 2000, 36(1): 244-246. doi: 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x
    [4] JANSEN R, EMBDEN J D, GAASTRA W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575. doi: 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x
    [5] QIN J J, WANG W, GAO L Q, et al. Emerging biosensing and transducing techniques for potential applications in point-of-care diagnostics[J]. Chemical Science, 2022, 13(10): 2857-2876. doi: 10.1039/D1SC06269G
    [6] KIM S, JI S, KOH H R. CRISPR as a Diagnostic Tool[J]. Biomolecules, 2021, 11(8): 1162. doi: 10.3390/biom11081162
    [7] YUE H H, HUANG M Q, TIAN T, et al. Advances in clustered, regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-based diagnostic assays assisted by micro/nanotechnologies[J]. ACS Nano, 2021, 15(5): 7848-7859. doi: 10.1021/acsnano.1c02372
    [8] GOOTENBERG J S, ABUDAYYEH O O, LEE J W, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science, 2017, 356(6336): 438-442. doi: 10.1126/science.aam9321
    [9] CHEN J S, MA E, HARRINGTON L B, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity[J]. Science, 2018, 360(6387): 436-439. doi: 10.1126/science.aar6245
    [10] BROUGHTON J P, DENG X D, YU G X, et al. CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2[J]. Nature Biotechnology, 2020, 38(7): 870-874. doi: 10.1038/s41587-020-0513-4
    [11] SELVAM K, NAJIB M A, KHALID M F, et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-Based SARS-CoV-2 Detection Methods[J]. Diagnostics, 2021, 11(9): 1646. doi: 10.3390/diagnostics11091646
    [12] LIANG Y H, LIN H Q, ZOU L R, et al. CRISPR-Cas12a-Based Detection for the Major SARS-CoV-2 Variants of Concern[J]. Microbiology Spectrum, 2021, 9(3): e0101721. doi: 10.1128/Spectrum.01017-21
    [13] RANJBARIAN F, SHARMA S, FALAPPA G, et al. Isocratic HPLC analysis for the simultaneous determination of dNTPs, rNTPs and ADP in biological samples[J]. Nucleic Acids Research, 2022, 50(3): e18. doi: 10.1093/nar/gkab1117
    [14] ZHANG S M, WANG H B, ZHU M J. A sensitive GC/MS detection method for analyzing microbial metabolites short chain fatty acids in fecal and serum samples[J]. Talanta, 2019, 196: 249-254. doi: 10.1016/j.talanta.2018.12.049
    [15] ALBERTI D, VAN'T ERVE M, STEFANIA R, et al. A quantitative relaxometric version of the ELISA test for the measurement of cell surface biomarkers[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53(13): 3488-3491. doi: 10.1002/anie.201310959
    [16] LI J J, YANG S S, ZUO C, et al. Applying CRISPR-Cas12a as a Signal Amplifier to Construct Biosensors for Non-DNA Targets in Ultralow Concentrations[J]. ACS Sensors, 2020, 5(4): 970-977. doi: 10.1021/acssensors.9b02305
    [17] LI Y Y, LI H D, FANG W K, et al. Amplification of the Fluorescence Signal with Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas12a Based on Au Nanoparticle-DNAzyme Probe and On-Site Detection of Pb2+ Via the Photonic Crystal Chip[J]. ACS Sensors, 2022, 7(5): 1572-1580. doi: 10.1021/acssensors.2c00516
    [18] XU S Q, WANG S T, GUO L, et al. Nanozyme-catalysed CRISPR-Cas12a system for the preamplification-free colorimetric detection of lead ion[J]. Analytica Chimica Acta, 2023, 1243: 340827. doi: 10.1016/j.aca.2023.340827
    [19] YUE Y Y, WANG S T, JIN Q, et al. A triple amplification strategy using GR-5 DNAzyme as a signal medium for ultrasensitive detection of trace Pb2+ based on CRISPR/Cas12a empowered electrochemical biosensor[J]. Analytica Chimica Acta, 2023, 1263: 341241. doi: 10.1016/j.aca.2023.341241
    [20] CHEN Y J, WU H, QIAN S W J, et al. Applying CRISPR/Cas system as a signal enhancer for DNAzyme-based lead ion detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2022, 1192: 339356. doi: 10.1016/j.aca.2021.339356
    [21] MA X C, SUO T Y, ZHAO F R, et al. Integrating CRISPR/Cas12a with strand displacement amplification for the ultrasensitive aptasensing of cadmium(II)[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2023, 415(12): 2281-2289. doi: 10.1007/s00216-023-04650-6
    [22] IWASAKI R S, BATEY R T. SPRINT: a Cas13a-based platform for detection of small molecules[J]. Nucleic Acids Research, 2020, 48(17): e101. doi: 10.1093/nar/gkaa673
    [23] MA Y, MOU Q B, YAN P, et al. A highly sensitive and selective fluoride sensor based on a riboswitch-regulated transcription coupled with CRISPR-Cas13a tandem reaction[J]. Chemical Science, 2021, 12(35): 11740-11747. doi: 10.1039/D1SC03508H
    [24] ZHAO Y Q, ZHU L, DING Y X, et al. Simple and cheap CRISPR/Cas12a biosensor based on plug-and-play of DNA aptamers for the detection of endocrine-disrupting compounds[J]. Talanta, 2023, 263: 124761. doi: 10.1016/j.talanta.2023.124761
    [25] WANG Y, PENG Y, LI S, et al. The development of a fluorescence/colorimetric biosensor based on the cleavage activity of CRISPR-Cas12a for the detection of non-nucleic acid targets[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 449: 131044. doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.131044
    [26] LI Q, LI X B, ZHOU P X, et al. Split aptamer regulated CRISPR/Cas12a biosensor for 17beta-estradiol through a gap-enhanced Raman tags based lateral flow strategy[J]. Biosensors and Bioelectrons, 2022, 215: 114548. doi: 10.1016/j.bios.2022.114548
    [27] HU J Y, SONG H J, ZHOU J, et al. Metal-Tagged CRISPR/Cas12a Bioassay Enables Ultrasensitive and Highly Selective Evaluation of Kanamycin Bioaccumulation in Fish Samples[J]. Analytical Chemistry, 2021, 93(42): 14214-14222. doi: 10.1021/acs.analchem.1c03094
    [28] CHEN J H, SHI G, YAN C. Portable biosensor for on-site detection of kanamycin in water samples based on CRISPR-Cas12a and an off-the-shelf glucometer[J]. Science of The Total Environment, 2023, 872: 162279. doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162279
    [29] LI X P, CHEN X J, MAO M X, et al. Accelerated CRISPR/Cas12a-based small molecule detection using bivalent aptamer[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2022, 217: 114725. doi: 10.1016/j.bios.2022.114725
    [30] LI D W, LING S, WU H S, et al. CRISPR/Cas12a-based biosensors for ultrasensitive tobramycin detection with single- and double-stranded DNA activators[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2022, 355: 131329. doi: 10.1016/j.snb.2021.131329
    [31] MAHAS A, WANG Q C, MARSIC T, et al. Development of Cas12a-Based Cell-Free Small-Molecule Biosensors via Allosteric Regulation of CRISPR Array Expression[J]. Analytical Chemistry, 2022, 94(11): 4617-4626. doi: 10.1021/acs.analchem.1c04332
    [32] YEE B J, SHAFIQAH N F, MOHD-NAIM N F, et al. A CRISPR/Cas12a-based fluorescence aptasensor for the rapid and sensitive detection of ampicillin[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2023, 242(Pt 4): 125211.
    [33] HU J Y, ZHOU J, LIU R, et al. Element probe based CRISPR/Cas14 bioassay for non-nucleic-acid targets[J]. Chemical Communications, 2021, 57(80): 10423-10426. doi: 10.1039/D1CC03992J
    [34] ZHAO Y, WU W Q, TANG X Q, et al. A universal CRISPR/Cas12a-powered intelligent point-of-care testing platform for multiple small molecules in the healthcare, environment, and food[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2023, 225: 115102. doi: 10.1016/j.bios.2023.115102
    [35] LIANG M D, LI Z L, WANG W S, et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 3672. doi: 10.1038/s41467-019-11648-1
    [36] FU R J, WANG Y W, LIU Y L, et al. CRISPR-Cas12a based fluorescence assay for organophosphorus pesticides in agricultural products[J]. Food Chemistry, 2022, 387: 132919. doi: 10.1016/j.foodchem.2022.132919
    [37] LI Y, YANG F, YUAN R, et al. Electrochemiluminescence covalent organic framework coupling with CRISPR/Cas12a-mediated biosensor for pesticide residue detection[J]. Food Chemistry, 2022, 389: 133049. doi: 10.1016/j.foodchem.2022.133049
    [38] LI L T, HONG F, PAN S X, et al. "Lollipop" particle counting immunoassay based on antigen-powered CRISPR-Cas12a dual signal amplification for the sensitive detection of deoxynivalenol in the environment and food samples[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 455: 131573. doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.131573
    [39] NIU C Q, XING X H, ZHANG C. A novel strategy for analyzing aptamer dominated sites and detecting AFB1 based on CRISPR–Cas12a[J]. Sensors & Diagnostics, 2023, 2(1): 155-162.
    [40] MA X, ZHANG Y, QIAO X J, et al. Target-Induced AIE Effect Coupled with CRISPR/Cas12a System Dual-Signal Biosensing for the Ultrasensitive Detection of Gliotoxin[J]. Analytical Chemistry, 2023, 95(31): 11723-11731. doi: 10.1021/acs.analchem.3c01760
    [41] MAO Z F, WANG X J, CHEN R P, et al. Upconversion-mediated CRISPR-Cas12a biosensing for sensitive detection of ochratoxin A[J]. Talanta, 2022, 242: 123232. doi: 10.1016/j.talanta.2022.123232
    [42] LIU X, BU S J, FENG J Q, et al. Electrochemical biosensor for detecting pathogenic bacteria based on a hybridization chain reaction and CRISPR-Cas12a[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2022, 414(2): 1073-1080. doi: 10.1007/s00216-021-03733-6
    [43] WU Y P, CHANG D R, CHANG Y Y, et al. Nucleic Acid Enzyme-Activated CRISPR-Cas12a With Circular CRISPR RNA for Biosensing[J]. Small, 2023, 19(41): e2303007. doi: 10.1002/smll.202303007
    [44] SANTORO S W, JOYCE G F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997, 94(9): 4262-4266.
    [45] LI J, ZHENG W, KWON A H, et al. In vitro selection and characterization of a highly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleaving deoxyribozyme[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(2): 481-488. doi: 10.1093/nar/28.2.481
    [46] GAO P, LIU B, PAN W, et al. A Spherical Nucleic Acid Probe Based on the Au–Se Bond[J]. Analytical Chemistry, 2020, 92(12): 8459-8463. doi: 10.1021/acs.analchem.0c01204
    [47] CUTLER J I, AUYEUNG E, MIRKIN C A. Spherical Nucleic Acids[J]. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(3): 1376-1391. doi: 10.1021/ja209351u
    [48] CHEN Y, CHEN L, OU Y, et al. DNAzyme-based biosensor for Cu2+ ion by combining hybridization chain reaction with fluorescence resonance energy transfer technique[J]. Talanta, 2016, 155: 245-249. doi: 10.1016/j.talanta.2016.04.057
    [49] SARAN R, LIU J W. A Silver DNAzyme[J]. Analytical Chemistry, 2016, 88(7): 4014-4020. doi: 10.1021/acs.analchem.6b00327
    [50] ZHOU W H, VAZIN M, YU T M, et al. In vitro selection of chromium-dependent DNAzymes for sensing chromium(III) and chromium(VI)[J]. Chemistry, 2016, 22(28): 9835-9840. doi: 10.1002/chem.201601426
    [51] Wu Y T, Torabi S F, Lake R J, et al. Simultaneous Fe2+/Fe3+ imaging shows Fe3+ over Fe2+ enrichment in Alzheimer's disease mouse brain[J]. Science Advances, 2023, 9(16): eade7622. doi: 10.1126/sciadv.ade7622
    [52] 郑星, 马明, 崔力, 等. 应用于环境分析的切割RNA的脱氧核酶研究进展[J]. 化学通报, 2022, 85(7): 770-780.

    ZHENG X, MA M, CUI L, et al. Advances in RNA-Cleaving DNAzymes for environmental analysis[J]. Chemistry, 2022, 85(7): 770-780 (in Chinese).

    [53] RAJENDRAN M, ELLINGTON A D. Selection of fluorescent aptamer beacons that light up in the presence of zinc[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 390(4): 1067-1075. doi: 10.1007/s00216-007-1735-8
    [54] WANG H Y, CHENG H, WANG J N, et al. Selection and characterization of DNA aptamers for the development of light-up biosensor to detect Cd(II)[J]. Talanta, 2016, 154: 498-503. doi: 10.1016/j.talanta.2016.04.005
    [55] WU Y G, ZHAN S S, WANG L M, et al. Selection of a DNA aptamer for cadmium detection based on cationic polymer mediated aggregation of gold nanoparticles[J]. Analyst, 2014, 139(6): 1550-1561. doi: 10.1039/C3AN02117C
    [56] CHEN Y, LI H H, GAO T, et al. Selection of DNA aptamers for the development of light-up biosensor to detect Pb(II)[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2018, 254: 214-221. doi: 10.1016/j.snb.2017.07.068
    [57] WRZESINSKI J, CIESIOLKA J. Characterization of structure and metal ions specificity of Co2+-binding RNA aptamers[J]. Biochemistry, 2005, 44(16): 6257-6268. doi: 10.1021/bi047397u
    [58] QU H, CSORDAS A T, WANG J P, et al. Rapid and Label-Free Strategy to Isolate Aptamers for Metal Ions[J]. ACS Nano, 2016, 10(8): 7558-7565. doi: 10.1021/acsnano.6b02558
    [59] 王斌, 邓述波, 黄俊, 等. 我国新兴污染物环境风险评价与控制研究进展[J]. 环境化学, 2013, 32(7): 1129-1136. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2013.07.003

    WANG B, DENG S B, HUANG J, et al. Environmental risk assessment and control of emerging contaminants in china[J]. Environmental Chemistry, 2013, 32(7): 1129-1136 (in Chinese). doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2013.07.003

    [60] ZHUO Z J, YU Y Y, WANG M L, et al. Recent Advances in SELEX technology and aptamer applications in biomedicine[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(10): 2142. doi: 10.3390/ijms18102142
    [61] 陈慧甜, 孙清, 时国庆, 等. 核酸适配体在环境分析中的应用[J]. 环境化学, 2015, 34(1): 89-96. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2015.01.2014101401

    CHEN H T, SUN Q, SHI G Q, et al. Application of aptamers to environmental analysis[J]. Environmental Chemistry, 2015, 34(1): 89-96 (in Chinese). doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2015.01.2014101401

    [62] 孟雪洁, 张瑜, 刘京华, 等. 纳米金-适配体电化学传感器用于环境水样中双酚A检测[J]. 环境化学, 2023, 42(2): 379-387. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102403

    MENG X J, ZHANG Y, LIU J H, et al. Gold nanoparticles-aptamer electrochemical sensor for detection of bisphenol A in environmental waters[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(2): 379-387 (in Chinese). doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102403

    [63] LIU H M, LU A X, FU H L, et al. Affinity capture of aflatoxin B(1) and B(2) by aptamer-functionalized magnetic agarose microspheres prior to their determination by HPLC[J]. Mikrochimica Acta, 2018, 185(7): 326. doi: 10.1007/s00604-018-2849-8
    [64] CAI S D, YAN J H, XIONG H J, et al. Investigations on the interface of nucleic acid aptamers and binding targets[J]. Analyst, 2018, 143(22): 5317-5338. doi: 10.1039/C8AN01467A
    [65] LEI Z, LEI P, GUO J F, et al. Recent advances in nanomaterials-based optical and electrochemical aptasensors for detection of cyanotoxins[J]. Talanta, 2022, 248: 123607. doi: 10.1016/j.talanta.2022.123607
    [66] MONDAL B, RAMLAL S, LAVU P S R, et al. A combinatorial systematic evolution of ligands by exponential enrichment method for selection of aptamer against protein targets[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(22): 9791-9803. doi: 10.1007/s00253-015-6858-9
    [67] PARK J Y, YANG K A, CHOI Y J, et al. Novel ssDNA aptamer-based fluorescence sensor for perfluorooctanoic acid detection in water[J]. Environment International, 2022, 158: 107000. doi: 10.1016/j.envint.2021.107000
    [68] CHEN J H, SHI G, YAN C. Visual test paper for on-site polychlorinated biphenyls detection and its logic gate applications[J]. Analytical Chemistry, 2021, 93(46): 15438-15444. doi: 10.1021/acs.analchem.1c03309
    [69] CHEN Y Q, WANG Z M, LIU S Y, et al. A highly sensitive and group-targeting aptasensor for total phthalate determination in the environment[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 412: 125174. doi: 10.1016/j.jhazmat.2021.125174
    [70] 高羽菲, 甄建辉, 赵杰, 等. 比色法适配体传感器在抗生素检测中的研究进展 [J]. 分析实验室, 2023, 1-18.

    GAO Y F, ZHEN J H, ZHAO J, et al. Advances in antibiotics detection based on colorimetric aptasensors[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2023, 1-18 (in Chinese).

    [71] XU G H, WANG C, YU H, et al. Structural basis for high-affinity recognition of aflatoxin B1 by a DNA aptamer[J]. Nucleic Acids Research, 2023, 51(14): 7666-7674. doi: 10.1093/nar/gkad541
    [72] MCCONNELL E M, NGUYEN J, LI Y F. Aptamer-based biosensors for environmental monitoring[J]. Frontiers in Chemistry, 2020, 8: 434. doi: 10.3389/fchem.2020.00434
    [73] CHANG T J, HE S S, AMINI R, et al. Functional nucleic acids under unusual conditions[J]. ChemBioChem, 2021, 22(14): 2368-2383. doi: 10.1002/cbic.202100087
    [74] ACKERMAN C M, MYHRVOLD C, THAKKU S G, et al. Massively multiplexed nucleic acid detection with Cas13[J]. Nature, 2020, 582(7811): 277-282. doi: 10.1038/s41586-020-2279-8
    [75] ALI M M, WOLFE M, TRAM K, et al. A DNAzyme‐Based colorimetric paper sensor for helicobacter pylori[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2019, 58(29): 9907-9911. doi: 10.1002/anie.201901873
    [76] ROTHENBROKER M, MCCONNELL E M, GU J, et al. Selection and Characterization of an RNA-Cleaving DNAzyme Activated by Legionella pneumophila[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2021, 60(9): 4782-4788. doi: 10.1002/anie.202012444
    [77] ZHOU Q B, ZHANG G X, WU Y P, et al. In Vitro selection of M2+-independent, fast-responding acidic deoxyribozymes for bacterial detection[J]. Journal of the American Chemical Society, 2023, 145(39): 21370-21377. doi: 10.1021/jacs.3c06155
    [78] CHANG T J, LI G P, CHANG D R, et al. An RNA‐Cleaving DNAzyme that requires an organic solvent to function[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2023, 62(42): e202310941. doi: 10.1002/anie.202310941
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-11-02
  • 录用日期:  2024-02-01
  • 刊出日期:  2025-03-27
张毅波, 马明, 王明仕, 常天俊. 基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展[J]. 环境化学, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
引用本文: 张毅波, 马明, 王明仕, 常天俊. 基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展[J]. 环境化学, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
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ZHANG Yibo, MA Ming, WANG Mingshi, CHANG Tianjun. Advances in CRISPR/Cas-based biosensors for environmental analysis applications[J]. Environmental Chemistry, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
Citation: ZHANG Yibo, MA Ming, WANG Mingshi, CHANG Tianjun. Advances in CRISPR/Cas-based biosensors for environmental analysis applications[J]. Environmental Chemistry, 2025, 44(3): 805-819. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023110205
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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展

    通讯作者: E-mail：changtj@hpu.edu.cn
  • 1. 河南理工大学资源环境学院，焦作，454003
  • 2. 宁波海关技术中心，宁波，315012
  • 收稿日期:  2023-11-02
  • 录用日期:  2024-02-01
  • 网络出版日期:  2025-03-27
基金项目:
国家自然科学基金（U1704241）资助.

摘要: CRISPR/Cas可改造为靶核酸刺激-响应的传感系统，可视为集“分子识别与信号输出”一体的生物传感器，目前在核酸即时诊断中已得到广泛应用. 鉴于该系统具有成熟、可靠和可扩展的优点，研究人员尝试将其用于环境分析领域的非核酸分析物检测，已开发了一系列具有应用前景的便携式设备. 然而，如何将非核酸靶标信息转换为核酸信息仍存在挑战，这限制了CRISPR/Cas系统在环境分析中的应用推广. 为此，本文综述了CRISPR/Cas系统在重金属离子和阴离子、新污染物、农药与真菌毒素以及有害细菌等非核酸靶标检测中的应用进展，重点介绍了构筑非核酸靶标信息转换元件的策略，以期为推进该系统在环境分析中的应用提供支持.

English Abstract

    全文HTML

  • 规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas）系统是古细菌和大多数细菌在生物进化过程中抵御病毒入侵而形成的一种适应性免疫防御系统. 1987年Nakata等[1]首次报道了它的特殊结构，crRNA（CRISPR RNA）包含间隔序列与重复序列[2]，间隔序列来源于噬菌体和共轭质粒等外源基因，用于识别目标核酸，重复序列则用于结合Cas蛋白并指引其发挥作用. 随后科学家们在超过40%的细菌和90%的古生菌中发现了类似结构的序列[3]，命名为CRISPR/Cas[4]. 对Cas蛋白的研究发现Cas12a和Cas13a不仅可以特异性顺式切割目标双链DNA（dsDNA）、单链DNA/RNA（ssDNA/RNA），还具有非特异性切割溶液中的游离核酸的“反式切割”[5 − 7]. 由于CRISPR/Cas系统具有特异性识别目标核酸、非特异性切割游离核酸及可编程性等优点，无需专业设备即可提供价格低廉、快速、准确的即时检测，被用来开发快速、高效、低成本和高灵敏度的分子传感器，例如SHERLOCK[8]和DETECTR[9]等，在新型冠状病毒检测中发挥了重要作用[10 − 12].

    近年来，除重金属离子外，抗生素、内分泌干扰物、持久性难降解有机物等新型污染物越来越受人们关注，已成为环境分析的重要靶物. 传统上，这些非核酸靶标的检测依靠高效液相色谱（HPLC）[13]、气相色谱/质谱（GC/MS）[14]或酶联免疫吸附测定（ELISA）[15]等方法. 然而，这些方法通常耗时长、成本高，或需要昂贵的仪器和专业操作人员，不利于现场即时检测或快速筛查. 鉴于CRISPR/Cas系统的成熟可靠和可扩展性，研究人员尝试将其应用于环境/食品安全领域的非核酸靶标检测中，开发出了一系列高灵敏度、高特异性的便携式检测设备. 然而，相对于核酸检测应用，CRISPR/Cas系统在非核酸靶标的检测研究相对滞后. 这主要因为Cas的活化依赖于核酸底物，而构筑高灵敏度、高特异性和通用性的元件将非核酸靶标信息转换为核酸信息仍然面临挑战. 为此，本文综述了基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境监测领域中非核酸靶标检测的应用进展，包括了重金属离子、阴离子、新污染物、农药、真菌毒素以及有害细菌等目标物，重点讨论了将非核酸靶标的信息转换为核酸信息的策略，并对不同的信号输出方式和检测能力进行分析比较（信息汇总于表1），最后对该领域研究存在的问题和可能的发展方向进行探讨.

    • 1.   重金属离子和阴离子（Heavy metal ions and anions）

      1.1.   重金属离子

    • 重金属离子对环境的污染可直接或间接对人体造成严重危害. 传统的重金属检测依赖于大型检测仪器，成本高且耗时长，因此建立一种方便、高效、灵敏的检测方法很有必要. 借助于可特异性识别重金属离子的RNA-cleaving DNAzyme（RCD）、适配体以及变构转录因子等作为信息转换元件，CRISPR系统已被用来构建快速检测重金属离子的生物传感器. 这些方法具有很高的灵敏度、操作简便、成本低以及可扩展等优点，具有应用前景. 本节重点介绍利用以上信息转换元件和CRISPR系统构筑Pb2+[16 − 20]、Cd2+[21]、Zn2+[22]等几种重金属离子的生物传感器以及应用潜力，并对存在的问题进行探讨.

      RCD是通过体外筛选技术（in vitro selection）得到的具有催化功能的DNA序列，可以在特定辅因子的作用下切割对应RNA底物. 目前，已有不少针对特定金属离子的RCD被公开报道[44 − 45]. RCD切割底物释放的片段可被CRISPR/Cas系统识别，从而使CRISPR/Cas的核酸切割活性被激活，该过程可将对金属离子的识别转换为核酸切割信号. 该策略仅需在RCD的底物一端设计可被crRNA特异性识别的DNA序列，在特定重金属离子作用下RCD将底物切割为两段；将可被crRNA识别的片段转移到CRISPR/Cas系统中，从而激活Cas蛋白切割报告分子. 上述CRISPR/Cas系统还可与第二个RCD组合，通过切割报告分子产生的片段再激活此RCD，形成多酶串联的信号放大系统，可以方便地通过荧光、比色、电化学等方式进行输出. 基于上述原理，科学家构建了基于RCD-CRISPR/Cas系统的检测Pb2+的生物传感器[16]. 首先在底物的5’端设计可被crRNA特异性识别的目标链，并在底物3’端标记生物素使其被固定在链霉亲和素磁珠上. 当Pb2+存在时，RCD将底物切割为两段，磁吸移除带有生物素的一段产物，然后将含目标链的产物转移到CISPR/Cas系统，与crRNA识别激活Cas蛋白. 最后，Cas蛋白切割标记有荧光和猝灭基团报告分子，从而产生信号. 经过优化研究，发现底物长度增加到20-nt时，切割效率最佳，检出限（LOD）达到0.053 nmol·L−1，远低于饮用水中铅的浓度限值（72 nmol·L−1）. 然而，由于RCD的底物常含有rA碱基，在检测实际样品如血清样品时，存在被核酸酶降解产生较高背景信号的问题. 有研究报道在高盐条件下，寡核苷酸在纳米颗粒上密集排列成三维球形，具有很强的稳定性和抗降解能力[46 − 47]. 因此，采取将RCD的底物固定在金纳米颗粒（AuNP）形成球形核酸的方法，有助于提高其稳定性，降低背景信号. 该策略组合CRISPR/Cas12a来检测Pb2+（图1a）[17]，最低检测限可以达到fmol·L−1级别，并且在实际样本如血清、空气颗粒和土壤中也有很好的检测性能. 该系统还可与芯片检测设备整合，用智能手机显示检测结果，提高现场检测的实用性.

      利用荧光报告分子可以快速、准确地显示结果，但荧光修饰的报告分子价格昂贵，而且依赖荧光检测设备. 为降低成本，开发了基于CRISPR/Cas12a-RCD的比色传感器[18]. 在该平台中，将报告分子设计为MnO2NRs（氧化锰纳米棒）-DNA-MB（磁珠）复合材料，当存在目标分析物时，报告分子断裂，携带MnO2NRs的产物片段氧化TMB产生肉眼可见的颜色变化. 该系统被用于酒和食用油等样本中Pb2+的检测，回收率达到97%—104%，LOD达到0.54 nmol·L−1. 虽然其灵敏度相比荧光法有所下降，但可视化的信号输出方式使其在实验室外的检测更为便捷.

      环境中重金属离子的浓度通常较低，对传感器的灵敏度的要求高. 基于CRISPR/Cas的传感器检测核酸分析物时，可将目标核酸进行预扩增处理，如滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）、链置换扩增技术（Strand Displacement Amplification, SDA）、催化发夹自组装（Catalytic Hairpin Assembly, CHA）及杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction, HCR）等，以提升灵敏度. 这些放大策略同样也可和CRISPR/Cas整合来检测Pb2+[19]. 首先目标分析物激活RCD切割底物，随后掉落的产物底物片段启动SDA扩增，产生可被crRNA识别的DNA，进而引导Cas蛋白切割报告分子. 该平台的信号输出采用电化学设备，将报告分子ssDNA-Fc（二茂铁）在ZrO2/CeO/PAH的帮助下固定在玻璃碳电极上，根据报告分子断裂引起电流的变化来判断是否存在目标物. 该方法对Pb2+的检测限达到0.02 pmol·L−1，可检测酒、油、大米等样本中的Pb2+.

      适配体（aptamer）和变构转录因子（allosteric transcription factor, aTF）也被用作CRISPR/Cas系统的信息转换元件. 研究人员在CRISPR/Cas12a中引入了Cd2+的适配体，构建了可检测Cd2+的生物传感器（图1b）[21]. 在SDA的引物P设计了Cd2+的适配体序列，当样品中没有Cd2+时，引物与模板结合后在DNA聚合酶的作用下产生dsDNA. 随后，Nt.BbvCI切口酶在引物延伸区域生成聚合酶的识别位点，启动二次延伸，同时产生大量的ssDNA被crRNA特异性识别并引导Cas蛋白切割荧光报告分子. 当存在Cd2+时，Cd2+与适配体结合，阻止引物P与模板T的结合，使SDA的效率降低，荧光信号变弱. 该方法检测Cd2+的LOD可达到60 pmol·L−1，远低于美国环保署饮用水中Cd2+的限量标准（44.5 nmol·L−1），回收率为97.59%—104.94%，具有很好的实际应用潜力. 研究人员还利用响应Zn2+的aTF作为信息转换元件构建了检测Zn2+的CRISPR/Ca13a生物传感器[22]. 目标分析物的存在使aTF与DNA的亲和力减弱，从而转录出可被crRNA特异性识别的激活剂，引导Cas蛋白酶对底物进行反式切割，产生可被检测的荧光信号. 在市政水样中，Zn2+浓度为1 μmol·L−1时可以利用手持式荧光检测设备观察到荧光信号.

      总的来说，在重金属离子检测中，RCD仍然是CRISPR/Cas系统的主要信息转换元件. 目前，依赖Cu2+、Ag+、Cr3+、Uo2+以及镧系金属离子Lu3+等具有生态环境风险的重金属离子发挥作用的RCD已经被报道[48 − 50]，这些进展为CRISPR/Cas系统在环境分析中的应用提供了新机遇. 然而，不少RCD对金属离子的专一性较差[44]，因此仍有必要优化筛选条件，获得更具选择性的识别工具. 另外，高特异性区分Fe2+和Fe3+的RCD已经被筛选出来[51]，启示如果能够筛选依赖不同价态（如Cr3+和Cr6+）或不同形态（如有机汞和无机汞）的RCD可能具有实际应用价值. 目前已报道的RCD的催化转化速率大多低于蛋白质酶（目前公认活性最高的RCD为10-23 DNAzyme，kcat ≈ 10 min−1）[44]，而且实际应用中RCD的催化活性易受如pH、温度、有机溶剂等条件的影响[52]. 因此，开发能够耐受多种环境条件、催化活性更高的RCD，将有助于RCD和CRISPR/Cas系统整合的生物传感器的实际应用. 除RCD以外，能够专一性识别某些重金属离子如Zn2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Hg2+和Cu2+的适配体也被陆续报道[53 − 58]，这为基于CRISPR的金属离子传感器的信息转换元件提供了更多选择.

      • 1.2.   阴离子

    • 水体中富含诸多无机阴离子，如F−、Cl−、NO2−、Br−、NO3−、PO43−、SO32−、SO42−等，当其含量超过一定阈值，可能具有潜在的生态风险. 响应氟离子（F−）的核糖开关作为转导元件与CRISPR/Cas系统整合，在大肠杆菌内构建了F−传感器（图1c）[22]. 在该系统中，RNA聚合酶的识别位点被F−核糖开关占据. 当F−与核糖开关结合时，RNA聚合酶可执行转录产生RNA，然后被crRNA特异性识别，引导Cas蛋白酶反式切割报告分子，产生荧光信号. 该系统对F−的LOD可达1 μmol·L−1. 然而，由于大肠杆菌的RNA对氟化物极为敏感，F−浓度超过100 μmol·L−1时抑制Cas的蛋白活性，从而限制了其线性范围. 为了准确的定量氟化物的浓度，研究人员将细胞内的转录过程移到体外，构建了无细胞的F−传感器，获得了更宽的线性响应范围[23]. 在该系统中，DNA模板包含启动子、间隔序列、核糖开关以及靶向crRNA的序列. 当F−存在时，F−核糖开关直接触发转录产生RNA，被crRNA特异性识别激活Cas蛋白切割报告分子，该方法使F−的检测上限提高到800 μmol·L−1，并且LOD为1.7 μmol·L−1，可检测瓶装水、自来水和湖水中的F−. 然而，除F−外，对于Br−、NO3−、SO42−等众多可溶于水的阴离子，仍缺乏特异性强、亲和力高的信息转换元件，限制了CRISPR/Cas系统在阴离子检测中的应用.

    2.   新污染物（Emerging contaminants）

    • 新污染物如持久性有机污染物、内分泌干扰物、药品和个人护理品等对于生态环境和人体健康构成潜在威胁，已经成为国际上高度关注的环境问题[59]. 目前，新污染物的检测主要依赖于可精确分析多种污染物分子的大型仪器，对于污染物类型的环境调查或非靶向监测具有重要作用. 然而，对于具有重要风险的污染物的靶向监测，可能更需要能在现场应用的快速检测工具，而这些大型仪器则难以适应.

      核酸适配体是指通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的一段寡核苷酸序列. 核酸适体可折叠形成特定三维结构，以高亲和力和特异性结合靶标，其靶标范围涵盖金属离子、小分子、蛋白质到细胞等多种类型[60]. 相较于抗体，适配体易合成、易修饰、稳定性强、靶分子范围广，因此在环境分析领域也有诸多应用[61 − 62]. 理论上，适配体与靶分子结合引起的构象变化[63 − 65]，可产生被CRISPR/Cas系统识别的核酸激活剂. 得益于筛选技术的快速发展，研究人员已经获得了不少对新污染物类分子具有高亲和力和选择性的适配体，使得适配体作为CRISPR/Cas系统检测这些化合物的信息转换元件具有应用潜力[60,66]. 此外，小分子的抗体也可作为CRISPR/Cas系统的信息转换元件，研究人员通常将抗体与可被crRNA识别的DNA以生物素和链霉亲和素连接，进而通过抗体-抗原的特异性识别将非核酸靶转换为核酸信号.

      • 2.1.   内分泌干扰物

    • 内分泌干扰物也被称为环境激素，是一大类具有内分泌干扰毒性的物质. 常见的内分泌干扰物有在塑料中大量使用的双酚A（BPA）、邻苯二甲酸酯类化合物以及天然和人工合成的类固醇激素等化合物. 这些物质在自然环境和人类生活中无处不在，对动物和人类的生殖、发育等产生持久性危害，导致多种与内分泌相关的疾病，严重威胁生态系统和人类健康. 雌二醇（E2）和BPA是广受关注的内分泌干扰物，二者的适配体作为信息转换元件被整合进CRISPR/Cas系统，构建了生物传感器[24]. 作者首先通过适配体链将DNA激活剂锁住，当目标分析物存在时，与适配体结合引起其构象变化，释放激活剂DNA片段，从而被crRNA识别激活Cas蛋白. 该方法对E2和BPA检测限分别为0.08 nmol·L−1和0.06 nmol·L−1，并且在污水和尿液中仍具有很好的分辨能力. 为了拓宽E2检测的应用场景，可视化的信号输出方式被引入适配体-CRISPR/Cas12a的生物传感器[25]. 该策略通过适配体将非核酸靶标转化为核酸信号，并通过CHA来放大信号，扩增产物被crRNA识别并引导Cas蛋白将DNA水凝胶包被的金属有机框架（MOF）裂解，催化TMB与 H2O2反应产生颜色变化（图2a）. 该系统采用上转换材料替代荧光团，有效地提高了信噪比和荧光稳定性，并通过CHA将信号进一步放大，提高了检测的灵敏度. 并通过牛奶、猪肉等样品验证了其实际应用能力，与荧光法相比，该方法的灵敏度略低（LOD = 0.015 ng·mL−1）.

      与传统的信号输出方式相比，侧向层析测定（Lateral flow assay, LFA）因其操作简便、分析时间短、价格低廉备受关注. Li团队[26]将LFA用于信号输出，开发了一种检测E2的CRISPR/Cas-适配体生物传感器. 该平台主要由三部分组成（图2b）：报告分子为Biotin-ssDNA-抗地高辛抗体复合物，LFA的测试区涂抹链霉亲和素，控制区涂抹抗小鼠IgG抗体，以及用于信号显示的地高辛抗体-Au@BDT@Au复合物. E2与适配体结合可使Cas蛋白失去活性，不切割报告分子；测试区的链霉亲和素捕获Biotin标记的抗地高辛抗体以及用于信号输出的地高辛抗体-Au@BDT@Au，产生信号，剩余样品流至控制区. 相反，不存在E2时，适配体序列被crRNA特异性识别，引导Cas蛋白切割报告分子，导致地高辛抗体-Au@BDT@Au不能被捕获在测试区，因而测试区域信号降低或没有信号. 该方法结合了CRISPR/Cas12a的信号放大能力和间隙增强拉曼标签（Au@BDT@Au）的高灵敏度，较传统的LFA灵敏度有很大提升（LOD = 180 fmol·L−1），可用于实际样品包括血清、尿液、牛奶和自来水中的E2检测.

      • 2.2.   抗生素

    • 抗生素广泛用于人类医学和畜牧业，然而抗生素的滥用及其在水环境和土壤中的累积间接地危害人类健康，在临床中常用的抗生素包括磺胺、喹诺酮、β内酰胺、四环素、大环内酯、氨基糖苷等六大类. 目前，已报道了基于CRISPR系统开发的卡那霉素[27 − 29]、妥布霉素[30]、四环素[31]、氨苄青霉素[32 − 33]等的生物传感器，在抗生素的快速现场检测中具有应用前景. 基于适配体-CRISPR/Cas检测非核酸靶的策略大多通过一条适配体链将激活链锁住，这种方法可能会产生较高的背景值. 为降低背景信号，研究人员使用两段卡那霉素的适配体序列将激活剂锁定[27]. 该系统的报告分子铥（Tm）-Rep-DNA-Bio（生物素）被裂解后，携带生物素的部分被链霉亲和素磁珠分离，带有Tm-Rep的一段可以通过同位素法监测. 该方法可以在30 min内检测卡那霉素，LOD低至4.06 pmol·L−1. 该方法使用镧系元素Tm，虽然在生物和环境中的干扰极低，但应用成本高，对仪器设备要求高. 为此，研究人员开发了成本更低、灵敏度更高的适配体-CRISPR/Cas12a系统[28]. 该系统仍采用适配体与DNA链互锁的方式，通过加入靶分子诱导适配体构象变化，使被其锁住的DNA链释放，启动HCR，生成被crRNA特异性识别的dsDNA，引导Cas蛋白切割报告分子. 报告分子ssDNA两端分别标记磁珠和葡萄糖转化酶，被切断后，分离带有转化酶的片段，催化蔗糖水解成葡萄糖，最后用便携式血糖仪定量葡萄糖来评估卡那霉素的浓度（图2c）. 该方法对卡那霉素的LOD达到了1 pmol·L−1. 此外，适配体-CRISPR/Cas系统的信号也可被LFA输出[29]，检测卡那霉素的LOD达到了14.8 nmol·L−1，该系统用于牛奶中卡那霉素检测的效果与市售试纸条相当.

      Li等[30]在CRISPR/Cas系统中引入适配体构建了两种用于妥布霉素检测的生物传感器sensor-ss和sensor-ds. 在sensor-ss中，采用ssDNA作为激活剂并经过SDA扩增以提高传感器的灵敏度. 当目标分析物存在时，适配体结构发生变化使得激活剂被释放并启动SDA，扩增产物被crRNA识别引导Cas蛋白切割荧光报告分子（图2d）. 而sensor-ds的激活剂则是使用含有原间隔序列邻近基序位点（PAM）的dsDNA，未采用核酸扩增技术放大信号. 结果显示sensor-ss（LOD = 1.542 pmol·L−1）比sensor-ds（LOD = 3.719 pmol·L−1）具有更高的灵敏度，但由于经过扩增导致反应过快达到检测平台其检测线性范围较窄（前者5—30 pmol·L−1，后者10—300 pmol·L−1）.

      • 2.3.   持久性有机污染物

    • 持久性有机污染物的种类很多，具有环境持久性、生物累积性、远距离迁移性和高毒性等特点. 此类污染物分子苯环多，如多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯醚等，分子结构相似且水溶性很差，筛选核酸适体或制备抗体的难度大，限制了CRISPR系统的应用. 目前开发的基于CRISPR/Cas的工具仅用于少数分子的检测. 研究人员利用抗体-抗原的特异性识别实现信息转换，与CRISPR/Cas系统整合（称为“iPOCT”）用于苯并[a]芘（Benzo （a） pyrene, BaP）的检测[34]. 该检测体系包括：固定在微孔板由小分子偶联牛血清白蛋白（BSA）构建的抗原，生物素化的抗体，链霉亲和素标记的dsDNA—用来结合crRNA并激活Cas蛋白，标记荧光和淬灭基团的ssDNA报告分子（图2e）. 当待测样品中没有目标分子时，固定化的抗原与生物素化的抗体结合，然后捕获链霉亲和素标记的dsDNA；洗去未结合的dsDNA，再向微孔板内加入CRISPR/Cas系统，保留在孔内的dsDNA结合crRNA，激活Cas蛋白切割报告分子产生荧光增强的信号. 待测样品中含有目标分子，则游离的待测分子与生物素化的抗体结合，导致抗体与固定化的抗原的结合受到抑制，从而使微孔捕获的dsDNA含量减少，进而减少了CRISPR/Cas切割底物的荧光增强信号. 除了BaP，该策略也成功用于其他小分子化合物的检测，说明该策略具有一定的通用性，而且还可通过酶标仪进行高通量检测多个目标化合物. 优化后的传感器对目标分子的LOD达到4.971 fg·mL−1，在湖水等实际样品中也有很好的检测能力. 然而，该策略检测目标分子时输出的信号低于非目标物对照的信号，属于信号减小的响应模式. 此外，基于CRISPR生物传感器也被用来检测与持久性有机污染物类似的对羟基苯甲酸分子 [35].

      虽然基于CRISPR系统的生物传感器在新污染物检测中展示了应用前景，但受限于信息转换元件的可及性，此类生物传感器尚未得到普遍应用. 以抗体作为靶分子识别与信息转换元件的CRISPR系统在新污染物检测中的应用较少，主要在于新污染物大多为分子量小于1000Da的小分子，没有免疫原性，很难制备相应的抗体. 适配体因其广泛的分子识别能力，作为CRISPR的信息转换元件更有优势. 目前已有一些新污染物分子，如全氟辛酸（PFOA）[67]、多氯联苯（PCB77）[68]、邻苯二甲酸酯（PAEs）[69]、四环素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯类、氯霉素类、喹诺酮类等抗生素[70]的适配体被筛选出，为基于CRISPR的检测技术开发奠定了基础. 然而，新污染物的种类很多，很多分子具有相似的结构且水溶性差，缺少活性位点，使得通过靶分子固定的方法筛选适配体挑战性很大，所得适配体对结构非常相似的分子的选择性不高. 以上因素制约了适配体作为CRISPR的信息转换元件在新污染物检测中的实际应用. 发展新的筛选技术，获得亲和力更高、选择性更好、能够适应实际检测环境的适配体，将有助于推动CRISPR系统在新污染物检测中的实际应用.

    3.   农药与真菌毒素（Pesticides and mycotoxins）

      3.1.   农药

    • 虽然RCD是基于CRISPR/Cas系统的生物传感器的理想信号转换元件，但目前尚未有专门响应某一农药分子的RCD被开发出来，限制了该元件在农药分子检测的直接使用. 为此，研究人员设计了乙酰胆碱酯酶-RCD-CRISPR/Cas三酶级联的策略来检测有机磷农药（图3a）[36]. 首先，有机磷农药的加入使乙酰胆碱酯酶水解乙酰硫代胆碱产生硫代胆碱，硫代胆碱将MnO2纳米片还原成Mn2+，激活依赖Mn2+的RCD将底物切断释放激活剂，最后激活剂被crRNA特异性识别并引导Cas蛋白切割报告分子，产生荧光信号. 该策略成功检测了实际样品柑橘类水果、卷心菜中的对氧磷、敌敌畏和内吸磷的3种农药，LOD分别达到了270、406、218 pg·mL−1，远低于农药使用标准中的最低残留量. 然而，有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的活性影响没有特异性，应用该方法不能区分具体的农药分子，在实际应用中仅可用于该类农药的初筛. 为实现特异性检测某一农药成分，研究人员将适配体引入CRISPR/Cas系统构建了检测啶虫脒的传感器[37]. 首先将啶虫脒适配体组装成球形核酸，将对啶虫脒的识别信号转换为核酸信号，进而激活Cas蛋白的活性，可在生菜中检测该农药残留检测（LOD = 2.7 pmol·L−1），为农药残留监测提供了更加精准、便捷的方法.

      • 3.2.   真菌毒素

    • 真菌毒素是真菌在农作物、食品中产生的次级代谢产物，可在人体中累积对人体健康造成危害. 常见的真菌毒素有黄曲毒素类、赭曲毒素A及镰孢菌毒素类，此类毒素具有很强的毒性以及致癌性，是环境监测真菌毒素中的重点关注对象. 利用抗体作为CRISPR/Cas系统的信号转换元件的策略被用来开发脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）的传感器[38]. 作者首先制作了DON抗体用以捕获目标分析物，其次通过ssDNA将PS微球与磁性纳米颗粒（MNPs）连接构建信号探针，最后是将DON通过牛血清白蛋白（BSA）与激活crRNA的DNA链偶联. DON的存在会使抗体捕获DON-激活剂，从而被crRNA特异性识别引导Cas蛋白切割报告分子PS-ssDNA-MNP，然后通过磁吸将PS微球分离出去，通过粒子计数器测量PS微球的数量用于DON的定量分析. 该方法对DON的LOD 达到了0.061 ng·mL−1，与传统的ELISA和HPLC相比表现出更宽的线性范围和更高的灵敏度. 此策略也用于黄曲霉毒素B1（AFB1）检测[34]. 然而，这些毒素的分子量小于1000 kD，没有免疫原性，通常需要将它们制成半抗原偶联到蛋白质分子如BSA上，再进行免疫反应制备抗体，不仅流程繁琐而且难以保证选择性；另外抗体稳定性较差，保存困难. 适配体被称为化学抗体，针对小分子的核酸适体可通过SELEX技术筛选得到. 目前科学家已经分离了不少特异性结合AFB1的适配体，其结构也得到了详细表征[71]，为开发基于适配体的AFB1检测工具打下坚实基础. 研究人员将AFB1的适配体与CRISPR/Cas系统联用构建检测AFBI的平台（图3b）[39]，利用crRNA锁住适配体，当靶标存在时引起适配体构象变化，抑制其与crRNA的结合，降低Cas蛋白的切割能力. 该方法在酒、牛奶样品中实现了AFB1的高灵敏度检测（LOD = 0.8 ng·mL−1）. 该系统的关键在于crRNA要与适配体-靶标结合的区域互补配对，这样靶标的加入才会对crRNA和适配体杂交产生很大影响，为此作者设计了28种crRNA用来优化与适配体杂交的位点. 该研究提示如果适配体与靶分子相互作用的机制明确，将对设计适配体-CRRISPR/Cas的分子传感器很有帮助.

      鉴于单一信号输出方式常常限制了检测范围或LOD，因此提出了基于CRISPR/Cas-适配体的双信号生物传感器[40]. 首先将报告分子ssDNA-Fc固定在金电极表面，ssDNA-Fc通过碱基互补将适配体固定，而适配体通过与激活剂1的结合互相锁定. 加入胶霉毒素时，诱导适配体构象变化，释放激活剂1，使其与H4ETTC-ssDNA结合产生聚集诱导发光；H4ETTC-ssDNA锁定的激活剂2则被释放，与crRNA识别，引导Cas切割ssDNA-Fc产生电化学信号（图3c）. 传感器通过电化学、荧光双信号输出，具有很高的灵敏度（LOD = 2.4 fmol·L−1），作者应用该系统对苹果、玉米等食物样品中胶霉毒素残留进行检测. 借鉴上转换材料相较于荧光探针的优势，有研究人员利用其构建了CRISPR生物传感器用于赭曲霉毒素的监测[41].

      农药和真菌毒素的残留监测对于环境/食品安全具有重要意义，目前科学家已开发出了多个针对农药和真菌毒素的适配体[72 − 73]，这为基于CRISPR/Cas检测农药、真菌毒素研究提供了强有力的支持. 然而，利用适配体作为信息转换元件常常需要靶分子诱导其发生构象变化，因此需要研究人员更系统地研究适配体与靶分子的相互作用机制，以提高分子设计的成功率.

    4.   有害细菌（Harmful bacteria）

    • 有害细菌的快速检测也是环境监测和食品安全检测的重要任务. 与细菌培养、抗体分析和核酸分析相比，CRISPR/Cas系统为病原菌的灵敏检测提供了一种简单便捷的方法. 研究人员将适配体引入CRISPR/Cas系统，并结合HCR设计了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器[42]（图4a）. 当靶标存在时，竞争结合适配体以启动HCR，HCR的产物可以被crRNA特异性识别并引导Cas蛋白切割报告分子. 通过HCR扩增，显著增强了反式切割活性，从而实现了灵敏检测（LOD = 20 CFU·mL−1），并可用于牛奶样品中的鼠伤寒沙门氏菌检测，提高了在临床诊断的应用潜力.

      目前基于CRISPR/Cas的检测方法都使用线性crRNA（LcrRNA）作为引导RNA. 然而，在自然界中存在一种共价闭合环状RNA，可以通过化学或酶连接的方法制备，目前很少被用于CRISPR生物传感系统. 鉴于此，Wu等[43]将crRNA设计成环状引导RNA的形式（CcrRNA），证实了环化会使crRNA失去引导作用，无法激活正常的Cas蛋白的切割反应. 随后，研究团队使用大肠杆菌依赖性DNAzyme和肺炎克雷伯菌依赖的RCD作为信息转换元件，用于识别大肠杆菌和肺炎球菌. 当目标分析物存在时，DNAzyme活性被激活，切割CcrRNA形成LcrRNA（如图4b）. 这样就使得crRNA获得引导作用，引导Cas蛋白切割报告分子. 经过优化，使得大肠杆菌和肺炎球菌的LOD达到了102 CFU·mL−1，并使用该系统对尿路感染的患者进行诊断，灵敏度和特异性分别达到100%、90%. 该方法将环化RNA设计进CRISPR-Cas系统，使CRISPR Cas系统摆脱线性crRNA的束缚，极大降低了背景值的同时，还灵活应用了细菌特异性的RCD（也称为适配体酶）切割RNA的特性. 此外利用RCD切割环化crRNA可以在同一管内实现信号转换和Cas蛋白的激活，避免了繁琐的实验步骤. 这也是首次通过控制crRNA的结构变化来调节CRISPR反应活性，为后续开发RCD耦联CRISPR/Cas系统用于非核酸靶标检测提供了新思路.

    5.   结论和展望（Conclusion and perspective）

    • 基于CRISPR/Cas的生物传感系统具有高特异性、可编程性及高催化活性，在快速、灵敏、特异的核酸检测中极具应用前景. 然而，在非核酸靶标的研究方面，该系统尚处于起步阶段. 由于Cas蛋白的活化依赖于核酸底物，因此将非核酸识别信息转换为核酸信息是其应用的关键. 目前的信息转换策略中，以DNAzyme和适配体作为信息转换元件较为普遍. 这些策略在非核酸靶标的检测上取得了良好的开端，但其进一步应用仍面临着诸多挑战.

      基于CRISPR/Cas系统的非核酸靶标检测依赖于信号转导元件. 虽然已有研究通过逻辑门的方法实现了多目标分析物的检测，然而受信息转换元件的限制，其应用范围有限，尚未见类似SHERLOCK[8]这样通用的平台被开发出来. 近期科学家开发了一种将小型化和自组装的微阵列系统与基于CRISPR的特异性核酸检测相结合的方法[74]，建立了一种可扩展的多重检测平台，这为基于CRISPR/Cas系统的非核酸靶标的高通量检测提供了思路.

      相对于环境监测的目标物而言，已开发并实际应用的转换元件仍然很少. 而且，现有的转换元件，如针对金属离子的DNAzyme，针对小分子的适配体，还存在特异性不够强的问题. 因此筛选更多、特异性更好的分子识别工具，是未来对环境分析样品实现即时现场快速检测的重要内容. 再者，适配体用于分子识别一般不能直接输出信号，大多经过复杂的分子设计实现构象转换等来释放信号，除了设计非常复杂，还可能导致亲和力下降. 这些因素制约了适配体与CRISPR/Cas系统的整合应用. Li课题组[75 − 76]以及Liu课题组[77]筛选得到的特异性识别有害细菌的DNAzyme，在进行分子识别的同时输出信号，是典型的智能分子. 这种系统可以方便地与CRISPR/Cas整合，这对推动CRISPR/Cas系统在环境分析中的应用有重要价值.

      在环境分析中，目标分析物通常以较低浓度存在，这对传感器的灵敏度提出了挑战. 基于电化学法的信号输出具有很高的灵敏度，然而其抗干扰能力可能较差，应用于复杂环境中的分析物监测存在挑战. 开发抗污的电化学分析材料或设备，对于应用该系统进行环境分析有重要价值.

      CRISPR/Cas系统的大多数识别或信息转换元件都涉及核酸，这些分子多在水溶液中开发. 然而，实际的环境分析对象，如新污染物，大多难溶于水，需要有机溶剂提取和溶解，因此开发适用于含有机溶剂的体系的分子识别/信息转换工具箱具有应用价值. 我们团队首先在含35% DMSO的缓冲溶液体系中筛选鉴定了一种高度依赖该条件的DNAzyme[78]，并构建了一种能在35% DMSO体系中对靶分子进行识别并产生核酸切割信号的适配体酶系统，证明了可以在含高浓度有机溶剂的环境中筛选出高活性的DNAzyme. 为开发难溶于水且需要有机溶剂溶解的有害物质的快速检测工具提供了新思路，也提示有必要在真实的环境样品或应用场景中筛选出具有专一性强的DNAzyme、适配体或具有定向进化适应能力强的CRISPR/Cas系统，以提升生物传感器在环境分析的实际应用价值.

    参考文献 (78)

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