纳米氧化铈对无脊椎动物的毒性效应

孔祥云; 陆浩; 徐冰洁; 程俊; 亓菲; 秦粉菊; 张文超; 刘恒蔚; 袁红霞

doi:10.7524/j.issn.0254-6108.2022111004

纳米氧化铈对无脊椎动物的毒性效应

苏州科技大学，苏州，215009

通讯作者: E-mail：yuanhx@mail.usts.edu.cn

基金项目:
国家自然科学基金（22006110，81773463）, 江苏省自然科学基金（BK20200987）和江苏省住房和城乡建设厅科技计划项目（2020ZD12）资助.
中图分类号: X-1；O6

Toxic effects of cerium oxide nanoparticles in invertebrates: A review

Suzhou University of Science and Technology, Suzhou, 215009, China

Corresponding author: YUAN Hongxia, yuanhx@mail.usts.edu.cn

Fund Project: the National Natural Science Foundation of China (22006110，81773463), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China (BK20200987) and the Science and Technology Planning Project of the Ministry of Housing and Urban-Rural Development of Jiangsu province (2020ZD12).

摘要: 近年来，纳米氧化铈（CeO₂NPs）独特的理化性质使其生产规模和应用范围逐渐扩大，但CeO₂NPs在生产、运输和商品化过程中不可避免地被释放到环境中，具有环境污染的潜在风险，其生物安全性受到越来越多的关注. 无脊椎动物是生物类群的重要组成，本文研究了国内外近十年的科学文献，综述了CeO₂NPs在生物累积、行为反应、组织损伤、生长发育毒性、免疫毒性、生殖毒性、遗传毒性等方面对无脊椎动物的影响以及CeO₂NPs毒性效应影响因素，总结了CeO₂NPs对无脊椎动物的毒性机制，最后对未来研究方向进行了展望，以期为CeO₂NPs的毒性评价、安全生产与应用提供参考.
- 纳米氧化铈 /
- 无脊椎动物 /
- 毒性效应 /
- 影响因素.
Abstract: In recent years, due to the unique physicochemical properties of cerium oxide nanoparticles (CeO₂NPs), the production scale and application range of these particles have gradually expanded. However, CeO₂NPs are inevitably released into the environment during production, transportation, and commercialization, which can cause environmental pollution, and their biosafety has received increasing attention. Invertebrates are an important component of biological taxa. In this review, studies performed in China and other countries and published in the past 10 years are studied. The effects of CeO₂NPs on invertebrates in terms of bioaccumulation, behavioral response, tissue damage, growth and development toxicity, immunotoxicity, reproductive toxicity, genotoxicity, and the influencing factors of CeO₂NPs toxicity are reviewed. Furthermore, the toxicity mechanism of CeO₂NPs in invertebrates is discussed. Finally, new research direction are proposed to study the toxicity, safe production, and application of CeO₂NPs in the future.
- cerium oxide nanoparticles /
- invertebrate /
- toxic effect /
- influencing factor.

减少废水中的氮化合物是改善水环境和水质的重要措施之一^[1]。与传统硝化/反硝化工艺相比，短程硝化/厌氧氨氧化(partial nitrification/anaerobic ammonia oxidation, PN/A)工艺可以将脱氮需氧量降低50%，有机碳需求量降低100%，污泥产量降低90%^[2-3]。因此，PN/A工艺被认为是最经济、最有前景的脱氮工艺^[4]。

反应器内生物质的保留能力对厌氧氨氧化(Anammox)工艺的启动周期有着重要影响^[5]。据报道，颗粒和生物膜污泥都具备良好的生物质截留能力^[6-7]，但已知这两种污泥形式分别单独运行时都会存在较长的启动时间^[8-9]。生物膜系统形成周期短，但长期运行后载体上太厚的生物膜会导致生物质脱落并被水流冲刷^[7]。Anammox颗粒污泥的形成是一个漫长的过程，但可以有效地拦截污泥流失并保持较高的生物量^[10]。因此，生物膜和颗粒污泥的组合应用可能最大程度上保留反应器内生物质，从而实现PN/A的快速启动和功能菌的高效富集。然而，将好氧生物膜和厌氧颗粒相结合来启动PN/A工艺目前尚未见报道。。

不同于传统的单阶段和两阶段PN/A反应器，在多级PN/A反应器中，交替的缺氧室和好氧室不仅为 (anaerobic ammonia oxidizing bacteria(AnAOB)和ammonia oxidizing bacteria(AOB)这2种功能细菌的同时生长和富集提供了空间条件，而且在缺氧区亚硝酸盐氮(NO₂⁻-N)和氨氮(NH₄⁺-N)共存的环境有利于厌氧氨氧化菌的自然富集^[7-8]。此外，实现PN/A工艺的关键不仅需要同时富集AOB和AnAOB，还必须尽可能抑制亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB)活性^[11]。据报道，间歇曝气和pH控制等策略可以有效控制PN/A工艺中不同菌群的活性(富集AnAOB和AOB，抑制NOB)^[12]。然而，具有间歇曝气、pH控制、多级反应器和生物膜/颗粒污泥系统等优点的组合PN/A反应器的运行策略仍需要研究。

本研究构建了由3个好氧反应柱和3个厌氧反应柱组成的新型多级好氧生物膜/厌氧颗粒反应器(multistage aerobic-biofilm/anaerobic-granular sludge reacto, MOBAPR)，以同时促进AnAOB和AOB的富集。本研究的主要目的为：拟通过MOBAPR实现PN/A工艺的快速启动和高效运行；考察MOBAPR各反应柱的氮转化过程；探索不同MOBAPR柱中功能菌丰度的变化和微生物群落结构的差异；通过优化气液比(gas/liquid ratio, G/L)，进一步提高PN/A工艺的脱氮效率(nitrogen removal efficiency, NRE)。

1. 材料与方法

1.1 进水水质与接种污泥

接种物取自中国江西省赣州市白塔生活污水处理厂的剩余污泥(普通活性污泥)。在第1天分别向每个反应柱加入100 mL接种物，其活性污泥浓度(MLSS)大约为5 100 mg·L⁻¹。

本研究采用模拟废水(含150 mg·L⁻¹ NH₄⁺-N)，其改编自前人研究^[13]。主要成分包括0.708 g·L⁻¹ (NH₄)₂SO₄，1.05 g·L⁻¹ NaHCO₃, 0.02 g·L⁻¹ KH₂PO₄, 0.022 g·L⁻¹ MgSO₄，0.008 g·L⁻¹ CaCl₂，1.25 mg·L⁻¹营养液I(5 g·L⁻¹ EDTA、0.00625 g·L⁻¹ FeSO₄)和营养液II(15 g·L⁻¹ EDTA、0.43 g·L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、0.25 g·L⁻¹ CuSO₄·5H₂O、0.19 g·L⁻¹ NiCl₂·6H₂O、0.99 g·L⁻¹ MnCl₂·4H₂O、0.24 g·L⁻¹ CoCl₂·6H₂O、0.22 g·L⁻¹ NaMoO₄·2H₂O、0.014 g·L⁻¹ H₃BO₄)。

1.2 实验装置

MOBAPR的示意图如图1所示。该反应器由6个高30 cm、直径4.5 cm的有机玻璃柱相互串联构成，总有效容积为2.5 L。从进水到出水的6个反应柱(reaction column, Rc)分别标记为 Rc1、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6(隔室数量可根据出水水质增减)。在好氧反应柱(Rc1、Rc3和Rc5)中添加无纺布作为填料，并采用间歇曝气。厌氧隔室(Rc2、Rc4和Rc6)采用低速搅拌装置。当PN工艺成功启动后停止搅拌。曝气量由玻璃转子流量计调节，并采用自动断电定时器电路实现间歇曝气。根据之前的报道^[14]，由蠕动泵(Langer，BT101L，UK)、pH 控制器(WEIPRO，pH-2010B，China)和NaOH溶液组成的pH控制系统将MOBAPR中的pH保持在8.2~8.5。在每次曝气15 min后开始检测DO(dissolved oxygen)质量浓度。

图 1 实验室规模的MOBAPR示意图

Figure 1. Schematic diagram of MOBAPR at lab-scale

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1.3 运行条件

本研究在MOBAPR中依次启动PN和PN/A工艺。第I阶段(1~7 d)，为快速恢复硝化细菌(AOB和NOB)的活性，在好氧区((Rc1、Rc3和Rc5)中连续曝气，并在厌氧区(Rc2、Rc4和Rc6)连续搅拌。此外，此阶段由于污泥处于悬浮状态，会随着进水流动，因此，启动污泥回流以保证反应器内充足的生物质含量。第II阶段(8~15 d)为抑制NOB，在好氧区中使用间歇曝气。第III阶段(16~60 d)好氧区微生物已成功挂膜生长，基本没有污泥流失，停止回流。此外，为进一步抑制NOB，第29天水力停留时间(hydraulic residence time, HRT)降低至8 h(16~28 d的HRT为12 h)。第IV阶段(61~86 d)为避免搅拌影响厌氧区AnAOB富集，厌氧区停止搅拌。第V阶段(87~110 d)，调整曝气量以保证反应器内充足的NO₂⁻-N。各阶段运行参数详见表1。在第VI阶段(111~162 d)，在进水NH₄⁺-N为150 mg·L⁻¹和好氧/厌氧时间为90 min/30 min条件下，分别调节曝气量和HRT来探讨不同G/L对NRE的影响。

表 1 实验条件及操作参数

Table 1. Experimental conditions and operating parameters

时期	阶段	时间/d	HRT/h	曝气量/(L·min⁻¹)	好氧(厌氧)时间/min	好氧区DO/(mg·L⁻¹)	回流比/%
适应期	I	1~7	24	0.02	好氧	—	200
PN 启动期	II	8~15	12	0.05	80/40	0.5±0.2	100
PN运行期	III	16~60	12/8	0.05	80/40	0.5±0.2	0
PN/A 启动期	IV	61~86	8	0.08	90/30	0.0±0.2	0
PN/A运行期	V	87~110	6	0.10	90/30	0.0±0.1	0
气液调控期	VI	111~162	—	—	90/30	—	0
注：表中曝气量和DO值均为好氧区(Rc1、Rc3和Rc5)的平均值；“—”表示无法检测。

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1.4 分析方法

实验中反应器内NH₄⁺-N、NO₂⁻-N、NO₃⁻-N的检测分析均根据《水和废水检验标准方法》中制定的方案，使用实验室规模的紫外/可见分光光度计(SQ2800，意大利UNICO)进行测定，包括纳氏试剂分光光度法(NH₄⁺-N)(1-萘基)-乙二胺分光光度法(NO₂⁻-N)和氨基磺酸紫外分光光度法(NO₃⁻-N)。此外，为了更好地揭示MOBAPR中PN/A过程的氮转化机理，每天对各反应柱的氮质量浓度进行检测，并分析其亚硝酸盐积累率(nitrite accumulation rate, NAR)、氨氮去除率(ammonia nitrogen removal rate, ANR)、氮去除率(NRE)、氮负荷率(nitrogen load rate, NLR)和氮去除负荷(nitrogen removal load rate, NRR)^[13-14]。

1.5 16S rRNA基因测序与微生物菌群分析

为探索MOBAPR中不同阶段微生物群落的演变，阐明连续多阶段PN/A过程中所涉及的生物学机制，分别对接种物、第56天(阶段III)和第110天(阶段V)的泥样进行微生物功能菌群分析。接种物命名为A0，第III阶段在Rc1~Rc6收集的污泥样品分别命名为A1、A2、A3、A4、A5和A6，第V阶段分别命名为B1、B2、B3、B4、B5和B6。这些样本保存在−20 ℃，直到提取DNA结束。

在成功提取样本内微生物的DNA后，使用16S rRNA基因的通用扩增引物进行PCR扩增，并且PCR产物使用 AxyPrep™ DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences，Union City，USA)按照制造商的说明进行纯化。然后通过Illumina MiSeq测序平台(PE300)对样品高通量测序，并得到原始测序序列。为了解样本测序结果中的菌种、菌属、物种功能等信息，将在Miseq测序得到的原始序列数据利用cutadapt(version 1.18)和PRINSEQ(version 0.20.4)软件进行去除引物接头序列、拼接、识别的处理以得到各样本的有效数据。然后利用Usearch(version 11.0.667)按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类。然后利用RDP classifier(version 2.12)等软件进行OTU物种分类，并根据得到的OTU序列进行微生物菌群分析与功能预测。

1.6 优化MOBAPR操作

由于在第V阶段DO值较低，MOBAPR的性能无法通过DO来进行控制。因此，在第VI(111~162 d)，阶段，为了代替DO控制(当DO低至无法控制)，本研究提出了一种新型控制参数—气液比(式(1))。分别在2、4、6和8 h的HRT条件下调控曝气量(0.05、0.1、0.15和0.2 L·min⁻¹)，从而得到G/L比为2.4、4.8、7.2、9.6、4.4、19.2、21.6、28.8和38.4。并且在每次操作条件调整后，MOBAPR连续运行3~4 d。此外，利用高斯模型预测了G/L与NRE之间的相关性(式(1))。

$q=\frac{60tv}{V}$

$(1)$

式中：q为G/L值；t为HRT，h；v为曝气速率，L·min⁻¹；V为MOBAPR的总有效容积，L。

2. 结果与讨论

2.1 MOBAPR中PN/A工艺的脱氮性能

1)接种物驯化。阶段I(1~7 d)在进水NH₄⁺-N为150 mg·L⁻¹、曝气速率为0.02 L·min⁻¹、DO为2~4 mg·L⁻¹和HRT 24 h的条件下运行MOBAPR。如图2所示，出水NO₃⁻-N由64.03 mg·L⁻¹增加到122.71 mg·L⁻¹。这说明在被重新接种后，硝化细菌(AOB和NOB)的活性在高DO水平下得到了快速恢复。此外，在阶段I中NRE大多低于零(图2(c))。这可能是一些细菌(主要是异养菌)不能适应无碳源下的MOBAPR，细菌死亡后细胞溶解释放出额外的氮源到反应器内。

图 2 MOBAPR中的氮的变化

Figure 2. Variation of nitrogen in MOBAPR in MOBAPR

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2) PN工艺的启动。在阶段II(8~15 d)，MOBAPR的pH为8.3，好氧区平均溶解氧为0.5 mg·L⁻¹，间歇曝气(好氧/厌氧时间为80 min /40 min)。结果表明，NO₂⁻-N由0 mg·L⁻¹增加到106.89 mg·L⁻¹(图2(b))，NO₃⁻-N由122.71 mg·L⁻¹减少到20.92 mg·L⁻¹(图2(d))，这表明NOB被有效抑制的同时AOB成功富集。因此，此阶段PN工艺在MOBAPR成功启动。此外，PN工艺中的NO₂⁻-N稳定供应是实现Anammox工艺的前提^[15]，其关键是高效稳定地抑制反应器中的NOB 活性^[14]。有研究表明，控制pH和间歇曝气是抑制NOB活性的重要手段^[13]。因此，将以上2种抑制策略的结合是实现PN过程快速启动的关键。

在阶段III(16~60 d)，出水NO₃⁻-N逐渐增加，第16~28天处于较高水平(30~46 mg·L⁻¹)。因此，要实现PN过程的稳定运行，需要对控制条件进行调整。在第17天好氧区在已经形成稳定生物膜结构后，MOBAPR停止回流。结果NAR短暂升至81%，然后逐渐下降(图2(b))。在第20~28天，出水NO₃⁻-N相对稳定(30~41 mg·L⁻¹)，说明综合控制策略仍能有效抑制NOB活性。第29天，HRT由12 h缩短到8 h，出水NO₃⁻-N由29.2mg·L⁻¹逐渐降至16.7 mg·L⁻¹，NAR也增加到90%。因此，HRT是影响PN工艺稳定性的重要参数，HRT过长会产生额外的NO₃⁻-N。

随着PN过程成功启动和AOB被富集积累^[16-17]，反应器中DO被AOB大量消耗，这导致厌氧区室中的DO质量浓度降低至0.2 mg·L⁻¹左右，从而为厌氧菌提供了适宜的生长环境。由图2(c)可知，NRE由5.51%逐渐增加到25.52%。这表明AnAOB可能在此阶段自然富集。有研究表明，AOB是从微需氧甚至厌氧的祖先进化而来的，在亚硝酸氧化还原酶(NXR)和其他反射蛋白的形式上与AnAOB高度相似^[18]。MIAO等的研究结果同样表明接种硝化污泥可以缩短Anammox的启动时间^[19]。因此，基于PN工艺，AnAOB可能更容易富集。此外，高通量测序结果表明阶段III中AnAOB的增加。

3)PN/A工艺的启动与运行。有研究^[20]表明，较大污泥絮凝物中的AnAOB具有更高的活性。厌氧区中污泥絮体的生长可能会受到搅拌的限制，从而抑制AnAOB的活性^[20]。因此，在阶段IV(61~86 d)停止搅拌以增加AnAOB的活性。并且有研究表明，NO₂⁻-N质量浓度越高越有利于Anammox的积累^[21]。因此，延长好氧区的相对曝气时间以进一步增加反应器中NO₂⁻-N质量浓度。在第IV阶段，厌氧区中停止搅拌，并且好氧区中好氧/厌氧时间从80 min/40 min变为90 min/30 min。在第61天后，MOBAPR的TN质量浓度逐渐下降，由126.96 mg·L⁻¹(第61天)降低至(32.79±6.21) mg·L⁻¹(77~86 d)，NRE也从21.5%迅速增加到(78.86±4.6)%(图2(c))。这表明在本研究采用的操作策略下，61 d内成功实现PN/A工艺的快速启动。

此外，随着AnAOB成功富集，MOBAPR中脱氮速率增加，导致进水中大部分的NH₄⁺-N在Rc1~Rc4中已经被去除，而Rc5和Rc6中功能微生物缺乏营养物质。因此，有必要适当缩短HRT以保证MOBAPR中功能微生物的进一步富集。在阶段V(87~110 d)，HRT由8 h缩短至6 h。此阶段反应稳定后(102~110 d)，出水NO₂⁻-N、NO₃⁻-N和NH₄⁺-N质量浓度分别为(0.63±0.50)、(16.72±1.78)和(8.29±6.65) mg·L⁻¹。其中，出水NO₃⁻-N质量浓度(NO₃⁻-N产生/NH₄⁺-N去除=0.12)与Anammox的NO₃⁻-N理论产生值(NO₃⁻-N产生/NH₄⁺-N去除=0.11)接近，这表明NOB被稳定抑制^[21]。此外，PN/A工艺的NRE、ANR和NRR分别为(83.41±2.45)%、(97±3.61)%和(0.41±0.09) kg·(m³·d)⁻¹(图2)。这表明该操作策略可用于MOBAPR，以实现PN/A过程的长期高效稳定运行。

有趣的是，在第IV和第V阶段(曝气量分别为0.08 L·min⁻¹和0.10 L·min⁻¹)，所测得DO质量浓度接近0。有研究^[14]表明，当AOB的耗氧速率高于曝气效率，反应器曝气后的DO质量浓度仍会保持在较低水平。因此，在MOBAPR中非曝气后，好氧区的曝气会被AOB等好氧细菌及时转化，从而维持反应器内低DO水平。此外，在MOBAPR中，AOB的富集是AnAOB快速启动的关键。AOB不仅可以为AnAOB创造环境，还提供营养物质。然而AOB主要在好氧区活性较高。因此，在整个启动期间，基本不对厌氧区进行直接调控(搅拌停止后)。

2.2 各阶段微生物群落演替分析

为了探索MOBAPR中微生物群落的变化规律，对接种物、第56天(第III阶段末期)和第110天(第V阶段)末期采集的污泥样品进行微生物群落进行分析。其中PA1为接种物A0，PA2为第III阶段各反应柱(A1、A2、A3、A4、A5和A6)内微生物丰度的平均值，PA3为第V阶段(B1、B2、B3、B4、B5和B6)微生物丰度的平均值。高通量测序得到的优质细菌序列被划分为不同的分类类别(门和属)，结果如图3(a)和图3(b)所示。Proteobacteria包括具有硝化反硝化功能的细菌^[16]，是门水平上的主要细菌(图3(a))。Proteobacteria在接种物中的丰度为68.15%，而在阶段III和阶段V后分别下降到44.68%和40.39%(图3(a))。这表明在变形菌门中许多异养硝化或反硝化细菌由于有机物的缺乏而被淘汰。有研究表明，Planctomycete门中不仅拥有一些专性好氧菌，还包含了所有已知的AnAOB^[2]。接种物(PA1)中的Planctomycete相对丰度接近第III阶段(PA2)，分别为4.07%和3.71%。而到了第V阶段(PA3)，Planctomycete丰度达到10.85%，这表明Planctomycete主要在第III阶段后被富集。此外，在属水平上PA1的Candidatus Kuenenia的相对丰度极低，约0.05%(图3(b))。这表明在接种物中几乎不含AnAOB。与接种物(PA1)相比，PA2和PA3中Armmonadetes和Chloroflexi的丰度显著增加(图3(a))。有研究表明，在Armarmadetes和Chloroflexi中的许多细菌含有与氮代谢相关的功能基因(Nar、NirK或Nos)^[22]。因此，Armatimonadetes和Chloroflexi可能含有多种AOB和AnAOB协同细菌，为PN/A工艺的启动和运行做出了贡献。

图 3 第I、第III和第V阶段微生物群落系统发育分析

Figure 3. Phylogenetic analysis of the microbial community at stage I, stage III and stage V

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图3(b)反映了PN/A工艺中所有样品在属水平上的微生物群落。在第III阶段Nitrosomonas的丰度由1.49%增加到28.20%(图3(b))，证实了该操作策略可以成功富集AOB。并且，16s结果表明Candidatus Kuenenia是MOBAPR中主要的AnAOB，其由接种物PA1(0.05%)增长到2.97%。这表明随着PN工艺的长期运行，此阶段(第56天)AnAOB开始富集。在第V阶段，PN/A工艺启动成功并长期运行后，Nitrosomonas (27.09%)和Candidatus Kuenenia(9.99%)的丰度得到了较高程度富集，这表明AOB和AnAOB在MOBAPR中可以同时富集。因此，通过第IV和第V阶段的综合运行策略，AOB和AnAOB作为优势菌被富集，并形成细菌协同关系完成脱氮。此外，NOB的主要菌属Nitrobacter、Nitrospira和Nitrospina等可能由于含量太低(<0.1)，均未被检测到。

2.3 不同阶段各反应柱内的氮转化途径

1)氮转化途径分析。为了更深入地了解MOBAPR各反应柱内PN/A工艺的氮转化过程，对PN (阶段III)和PN/A 工艺(阶段V)长期运行阶段分别进行测试分析，结果如图4所示。在第III阶段，出水NO₂⁻-N质量浓度从Rc1到Rc6逐渐增加，NH₄⁺-N相应降低(图4(a))。这表明各反应柱内均参与到氨氧化过程中。每个反应柱内都含有NH₄⁺-N和NO₂⁻-N (图4(a))，这为AnAOB的富集提供了必要条件。并且由于氨氧化过程需要氧气参与，好氧区(Rc1、Rc3和Rc5)内的ANR显著高于厌氧区(Rc2、Rc4和Rc6)(图4(c))。此外，NO₃⁻-N浓度一直处于较低水平(<10 mg·L⁻¹)(图4(a))，这表明通过本研究采用的操作策略，NOB活性长期受到有效抑制。在这一阶段，MOBAPR的平均氮损失约为30 mg·L⁻¹(图4(a))，证实了反硝化细菌或AnAOB的增加。特别是Rc1、Rc3和Rc5中NRE的增加也显著高于Rc2、Rc4和Rc6(图4(e))，说明好氧区内氮损失主要是反硝化细菌或AnAOB造成的。

图 4 PN工艺(阶段III)和PN/A过程(阶段V)各反应柱内的氮转化途径

Figure 4. The nitrogen conversion pathways in the reactor after the PN process (stage III) and PN/A process (stage V)

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在第V阶段，由于进水中的氨(150 mg·L⁻¹)通过前4个反应柱被PN/A完全转化，最后2个反应柱(Rc5和Rc6)在此阶段被废弃。模拟废水在流经Rc4后被排出。如图4(b)所示，在此阶段出水NH₄⁺-N降至较低水平。这表明经过长期运行，PN/A工艺的NRE有所提高。此外，由图4(d)可以看出，大部分氨氧化过程基本在Rc1完成，而在Rc4之后脱氮量达到最高(图4(f))。此外，在第V阶段各反应柱内NO₂⁻-N含量低于阶段III(图4(a))，这表明由AOB产生的NO₂⁻-N被AnAOB快速利用，即AnAOB与AOB之间形成了良好的协同脱氮效果。Rc1和Rc3中NRE和ANR均显著增加(图4(f))，因此，PN和Anammox过程主要在好氧室中进行。这是由于在好氧区内形成了内层为AnAOB和外层AOB的微生物生物膜协同脱氮系统。依赖于外部的AOB提供的NO₂⁻-N，内部的厌氧微生物将剩余的氨转化为氮。其中，由图4(f)可知，厌氧区(Rc2和Rc4)中NRE的增加远低于好氧区(Rc1和Rc3)，并且厌氧区的出水NO₂⁻-N几乎为0(图4(b))。因此，NO₂⁻-N的缺乏可能限制了厌氧区的NRE。此外，在MOBAPR的好氧室中添加填料形成生物膜系统，不仅有效避免了DO对AnAOB的抑制，而且还有利于AnAOB的富集。在此阶段稳定的生物膜和颗粒污泥系统分别在好氧区和厌氧区形成。一方面，在好氧区的生物膜系统中形成了分层分布的好氧外层和厌氧内层。AnAOB在厌氧环境的生物膜内层得到富集，并与外层AOB协同脱氮。另一方面，AOB产生的大部分NO₂⁻-N被生物膜内层的AnAOB利用，剩余少量NO₂⁻-N流出并被位于厌氧区的AnAOB颗粒污泥消耗。此阶段在好氧区的脱氮方式与单阶段PN/A工艺相似，而厌氧区脱氮方式与两阶段PN/A工艺相似。因此，生物膜和颗粒污泥结构成功将单阶段与两阶段PN/A工艺的优势结合在一起，不仅具备两阶段PN/A更快的启动速度，还具备单阶段PN/A的更高效的反应速率。

2)各反应柱中AOB和AnAOB的动态分析。为了探究在PN工艺和PN/A工艺长期运行过程中，MOBAPR中不同反应柱内微生物群落的差异，对接种污泥、阶段III和阶段V获得的污泥样品进行高通量测序。其中，接种污泥样品命名为A0，在第56天(阶段III)Rc1、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6采集的样品分别命名为A1、A2、A3、A4、A5和A6，在第110天(阶段V)采集的样品命名为B1、B2、B3、B4、B5和B6。高通量测序得到的相关参数如表2所示。厌氧区中的Simpson指数明显低于好氧区(表2)，这说明好氧区的物种富集程度是高于厌氧区的，Shannon指数也得到了类似的结论。每个污泥样品的覆盖率超过99.70%(表2)，说明高通量测序基本代表了污泥样品的实际微生物群落结构。

表 2 微生物多样性分析

Table 2. Microbial diversity analysis

阶段	样品	序列数	丰富度		OTU数	多样性		覆盖率/%
阶段	样品	序列数	Ace指数	Chao1指数	OTU数	Simpson指数	Shannon指数	覆盖率/%
I	A0	52 844	913.5	933.6	841	0.07	4.27	99.8
III	A1	57 036	886	863	724	0.11	3.48	99.7
	A2	64 451	1 006.4	1 024.1	877	0.05	4.13	99.7
	A3	70 746	891	932.1	751	0.16	3.05	99.7
	A4	54 252	949.5	953.5	801	0.08	3.78	99.7
	A5	59 513	899.5	902.3	786	0.18	3.13	99.7
	A6	52 884	962.5	1 003.1	842	0.07	3.99	99.7
V	B1	61 553	844.7	837.2	666	0.12	3.21	99.7
	B2	64 627	892.2	896.5	742	0.09	3.57	99.7
	B3	75 032	845.7	863.1	692	0.11	3.2	99.8
	B4	62 284	900.8	909.7	764	0.06	3.86	99.7
	B5	62 838	853.3	852	703	0.21	2.84	99.7
	B6	59 777	984.9	1 014.6	851	0.13	3.64	99.7
注：A1、A3、A5、B1、B3和B5是来自好氧区的污泥样品；A2、A4、A6、B2、B4和B6是来自厌氧区的污泥样品。

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为深入了解好氧生物膜/厌氧颗粒污泥的微生物分布情况，在阶段III和阶段V，从MOBAPR中的6个反应柱中获得的污泥样品进行了微生物群落分析。PN工艺启动并长期运行后，A1、A3和A5中亚硝基单胞菌(Nitrosomonas)的相对丰度分别从1.49%提高到30.99%、39.77%和40.74%，A2、A4和A6中亚硝基单胞菌的相对丰度分别从1.49%提高到11.42%、22.25%和22.15%(图5(c))，这证实了AOB在每个隔间中都被富集。厌氧区中AOB的富集与好氧区出水的DO有关。因此，厌氧区的AOB丰度明显低于好氧区(图5(c))。此外，在A1、A2、A3、A4、A5和A6中，AnAOB(Candidatus Kuenenia)的丰度分别由0.05%提高到0.16%、5.25%、0.56%、5.87%、0.39%和5.06%(图5(c))，这表明AnAOB已经开始富集。AOB不仅通过消耗溶解氧为AnAOB创造厌氧环境还为AnAOB提供必需的基质(NO₂⁻-N)。因此，此阶段Nitrosomonas富集可能为Anammox的启动奠定了基础。

图 5 PN和PN/A(阶段III和阶段V)稳定运行后各反应柱内微生物群落结构

Figure 5. The microbial community structure in each reaction column of PN and PN/A (Stage III and Stage V) under stable operation conditions

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在PN/A工艺成功启动和运行后(第V阶段)，B1、B2、B3和B4中Candidatus Kuenenia的丰度分别增加到12.67%、19.07%、12.41%和11.43%(图5(a))。由于Rc5和Rc6中NO₂⁻-N的缺乏，B5和B6中Candidatus Kuenenia的丰度较低(分别为0.24%和2.29%)。在各反应柱中，Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia都得到了较高水平的积累(图5(b))。这证实了微生物之间协同脱氮系统的存在。有趣的是，Candidatus Kuenenia不仅被富集在厌氧区，而且在好氧区中也有较高的丰度，这表明好氧区已形成分层分布的生物膜系统。此外，在PN/A工艺的长期运行阶段，未分类菌数量较多(图5(c))。有研究表明，PN/A工艺微生物群落由各种功能菌和协作菌共同组成的^[14]。因此，在演替过程中会出现一些未分类协作菌以促进功能菌更好的富集。

2.4 G/L对NRE的影响

在第V阶段，MOBAPR中的DO值接近于零。一方面，不能通过控制DO值来进一步优化反应器性能；另一方面，不能人为直接调控DO值，即只能通过曝气量或流量等来间接调控DO值。因此，在PN/A工艺在运行过程中，DO控制会存在一定的滞后性。此外，在此阶段发现曝气速率越高，厌氧菌活性会降低；而曝气速率越低，厌氧菌的氮转化性能同样会将低。因此，在MOBAPR中提供合适的曝气量非常重要。

第2.1节和2.2节中的结果表明可通过缩短HRT将MOBAPR的NRE进一步提高，但好氧区中AOB的需氧量随着进水氨氮浓度的增加而增加。因此，本研究通过控制G/L，一方面可以为MOBAPR中的功能微生物提供稳定适宜的NO₂⁻-N/NH₄⁺-N，从而促进MOBAPR的总氮去除率；另一方面，直接调控反应器参数(代替DO控制)，从而简化操作。为探讨G/L对总氮去除率的影响，通过调节曝气量和HRT，在进水NH₄⁺-N为150 mg·L⁻¹，好氧/厌氧时间为90 min/30 min条件下，G/L参数分别设置为2.4、4.8、7.2、9.6、14.4、19.2、21.6、28.8和38.4。用高斯模型对得到的NRE和相应的G/L进行拟合(极点拟合)以得出最适G/L，拟合结果如图6所示。可以看出，PN/A工艺的NRE在G/L为0~19.2时增大，而在G/L为21.6~38.4时减小。高斯模型的相关系数(R²)为0.992 2(图6(b))，说明该模型较好地描述了NRE与G/L之间的关系。模型拟合结果表明，当G/L比值参数为20~30时，NRE可达到较高水平。

图 6 G/L对MOBAPR氮去除和氮转化的影响

Figure 6. Effect of G/L on nitrogen removal and nitrogen conversion in MOBAPR

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3. 结论

1)本研究构建了厌氧和好氧区共存、悬浮污泥系统与生物膜系统相结合的MOBAPR。

2)在MOBAPR中15天内成功启动PN工艺，PN/A工艺在61天内成功启动。在运行阶段，PN工艺的NAR为(87.35±2.7)%，PN/A工艺的NRE为(83.41±2.45)%。

3)高通量测序结果表明，Nitrosomonas(27.09%)和Candidatus Kuenenia(9.99%)在厌氧区和好氧区被同时富集。在长期运行阶段，PN工艺的NAR为(87.35±2.7)%，PN/A工艺的NRE为(83.41±2.45)%。

4)在DO低至无法控制时，G/L可能是一种可以代替DO控制的重要策略，并且高斯模型拟合结果表明，当G/L比值参数为20~30时，NRE可达到较高水平。

图 1 CeO₂NPs对无脊椎动物毒性的主要影响因素（改编自文献[11]）

Figure 1. Main influencing factors of CeO₂NPs toxicity in invertebrates（adapted from Reference[11]）

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图 2 CeO₂NPs对无脊椎动物毒性机制

Figure 2. Toxicity mechanisms of CeO₂NPs in invertebrates

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表 1 CeO₂NPs在无脊椎动物中的生物累积

Table 1. Bioaccumulation of CeO₂NPs in invertebrates

受试生物Tested organism	粒径/nmSize	暴露时长Exposure duration	暴露途径Exposure pathway	浓度Concentration	生物累积量Bioaccumulation	参考文献Reference
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	<25	14 d	表皮	50 mg·kg⁻¹	2.3 mg·kg⁻¹	[15]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	20—200	28 d	表皮	1000 mg·kg⁻¹和2000 mg·kg⁻¹	BC-350：1.36—36.02 mg·kg⁻¹；BC-600：4.87—100.28 mg·kg⁻¹	[16]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	50—105	28 d	表皮	346.6 mg·kg⁻¹	（1.5±0.0036）mg·g⁻¹	[17]
粉正蚓（Lumbricus rubellus）	—	7 d	表皮	5000 mg·kg⁻¹	5.3 µg·g⁻¹	[18]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	5、50	28 d	水体	100 μg·L⁻¹	Ce Naked：（0.25±0.113）µg·g⁻¹；Ce@Chitosan：（0.26±0.029）µg·g⁻¹；Ce@Alginate：（0.21±0.030）µg·g⁻¹	[19]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	231±16	4 d	水体	10 mg·L⁻¹	62 µg·g⁻¹	[20]
斑马贻贝（Dreissena polymorpha）	3—4	21 d	水体	1 mg·L⁻¹	ba-CeO₂：（10.2±1.3）μg·g⁻¹；ci-CeO₂：（29.1±10.3）µg·g⁻¹	[21]
斑马贻贝（Dreissena polymorpha）	8	4 d	水体	100 μg·L⁻¹	15 µg·g⁻¹	[22]
钩虾（Gammarus roeseli）	8	4 d	水体	100 μg·L⁻¹	59 µg·g⁻¹	[22]
静水椎实螺（Lymnaea stagnalis）	3.8、185	270 d	摄食	5 mg·L⁻¹	3.8 nm：（44±18）ng；185 nm：（2.6±0.4）ng	[23]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	5—80	28 d、56 d	表皮	256 mg·kg⁻¹	NM-213 CeO₂：4.82 mg·g⁻¹；NM-212 CeO₂：4.41 mg·g⁻¹；NM-211 CeO₂：4.56 mg·g⁻¹	[24]
蟋蟀（Acheta domesticus）	<10	14 d	摄食	707 ng·g⁻¹	33.6 ng·g⁻¹	[25]
墨西哥豆甲虫（Epilacha vanvestis）	8±1	36 d	摄食	2000 mg·kg⁻¹	21.40 mg·kg⁻¹	[26]
摇蚊（Chironomus riparius）	2—5	28 d	摄食	1 mg·L⁻¹	柠檬酸涂层：606 mg·kg⁻¹；裸露：282 mg·kg⁻¹	[27]
注：BC-350和BC-600代表由核桃壳在350 ℃和600 ℃裂解产生的生物炭；NM-213、NM-212、NM-211为CeO₂NPs特定代码，分别为CeO₂（100—300 nm）、CeO₂（10—80 nm）、CeO₂（10—50 nm）；Ce Naked代表裸露CeO₂NPs、Ce@Chitosan代表海藻酸包覆的CeO₂NPs、Ce@Alginate代表壳聚糖包覆的CeO₂NPs；ci-CeO₂代表柠檬酸包覆的CeO₂NPs、ba-CeO₂代表裸露的CeO₂NPs；表中暴露浓度仅适用于受试生物的生物累积.　　Note: BC-350 and BC-600 refers to biochar produced by cracking walnut shells at 350 ℃ and 600 ℃; NM-213, NM-212, and NM-211 are CeO₂NPs specific codes for CeO₂ （100—300 nm）, CeO₂ （10—80 nm）, and CeO₂ （10—50 nm）, respectively; Ce Naked refers to naked CeO₂NPs, Ce@Chitosan refers to alginate-coated CeO₂NPs, Ce@Alginate refers to chitosan-coated CeO₂NPs; ci-CeO₂ refers to citric acid-coated CeO₂NPs, ba-CeO₂ refers to naked CeO₂NPs; The exposure concentration in the table apply only to the bioaccumulation of the tested organisms.

受试生物Tested organism	粒径/nmSize	暴露时长Exposure duration	暴露途径Exposure pathway	浓度Concentration	生物累积量Bioaccumulation	参考文献Reference
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	<25	14 d	表皮	50 mg·kg⁻¹	2.3 mg·kg⁻¹	[15]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	20—200	28 d	表皮	1000 mg·kg⁻¹和2000 mg·kg⁻¹	BC-350：1.36—36.02 mg·kg⁻¹；BC-600：4.87—100.28 mg·kg⁻¹	[16]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	50—105	28 d	表皮	346.6 mg·kg⁻¹	（1.5±0.0036）mg·g⁻¹	[17]
粉正蚓（Lumbricus rubellus）	—	7 d	表皮	5000 mg·kg⁻¹	5.3 µg·g⁻¹	[18]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	5、50	28 d	水体	100 μg·L⁻¹	Ce Naked：（0.25±0.113）µg·g⁻¹；Ce@Chitosan：（0.26±0.029）µg·g⁻¹；Ce@Alginate：（0.21±0.030）µg·g⁻¹	[19]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	231±16	4 d	水体	10 mg·L⁻¹	62 µg·g⁻¹	[20]
斑马贻贝（Dreissena polymorpha）	3—4	21 d	水体	1 mg·L⁻¹	ba-CeO₂：（10.2±1.3）μg·g⁻¹；ci-CeO₂：（29.1±10.3）µg·g⁻¹	[21]
斑马贻贝（Dreissena polymorpha）	8	4 d	水体	100 μg·L⁻¹	15 µg·g⁻¹	[22]
钩虾（Gammarus roeseli）	8	4 d	水体	100 μg·L⁻¹	59 µg·g⁻¹	[22]
静水椎实螺（Lymnaea stagnalis）	3.8、185	270 d	摄食	5 mg·L⁻¹	3.8 nm：（44±18）ng；185 nm：（2.6±0.4）ng	[23]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	5—80	28 d、56 d	表皮	256 mg·kg⁻¹	NM-213 CeO₂：4.82 mg·g⁻¹；NM-212 CeO₂：4.41 mg·g⁻¹；NM-211 CeO₂：4.56 mg·g⁻¹	[24]
蟋蟀（Acheta domesticus）	<10	14 d	摄食	707 ng·g⁻¹	33.6 ng·g⁻¹	[25]
墨西哥豆甲虫（Epilacha vanvestis）	8±1	36 d	摄食	2000 mg·kg⁻¹	21.40 mg·kg⁻¹	[26]
摇蚊（Chironomus riparius）	2—5	28 d	摄食	1 mg·L⁻¹	柠檬酸涂层：606 mg·kg⁻¹；裸露：282 mg·kg⁻¹	[27]
注：BC-350和BC-600代表由核桃壳在350 ℃和600 ℃裂解产生的生物炭；NM-213、NM-212、NM-211为CeO₂NPs特定代码，分别为CeO₂（100—300 nm）、CeO₂（10—80 nm）、CeO₂（10—50 nm）；Ce Naked代表裸露CeO₂NPs、Ce@Chitosan代表海藻酸包覆的CeO₂NPs、Ce@Alginate代表壳聚糖包覆的CeO₂NPs；ci-CeO₂代表柠檬酸包覆的CeO₂NPs、ba-CeO₂代表裸露的CeO₂NPs；表中暴露浓度仅适用于受试生物的生物累积.　　Note: BC-350 and BC-600 refers to biochar produced by cracking walnut shells at 350 ℃ and 600 ℃; NM-213, NM-212, and NM-211 are CeO₂NPs specific codes for CeO₂ （100—300 nm）, CeO₂ （10—80 nm）, and CeO₂ （10—50 nm）, respectively; Ce Naked refers to naked CeO₂NPs, Ce@Chitosan refers to alginate-coated CeO₂NPs, Ce@Alginate refers to chitosan-coated CeO₂NPs; ci-CeO₂ refers to citric acid-coated CeO₂NPs, ba-CeO₂ refers to naked CeO₂NPs; The exposure concentration in the table apply only to the bioaccumulation of the tested organisms.

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表 2 CeO₂NPs对无脊椎动物的EC₅₀/LC₅₀

Table 2. EC₅₀/LC₅₀ of CeO₂NPs in invertebrates

受试生物Tested organism	粒径/nmSize	暴露时长Exposure duration	EC₅₀/LC₅₀	参考文献Reference
蚯蚓（Eisenia hortensis）	22	48 h	LC₅₀：80 μg·mL⁻¹	[34]
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）	4	48 h	L1期 LC₅₀：15.5 mg·L⁻¹；L3期 LC₅₀：272 mg·L⁻¹	[35]
大型溞（Daphnia magna）	8	48 h	LC₅₀：0.012 mg·mL⁻¹（0.011—0.015）	[36]
大型溞（Daphnia magna）	50	48 h	EC₅₀：20.08 mg·L⁻¹	[37]
大型溞（Daphnia magna）	6.44±0.42	24 h	EC₅₀ ：430.2 mg·L⁻¹（239.8—587.4）	[28]
大型溞（Daphnia magna）	6.44±0.42	48 h	EC₅₀ ：142.7 mg·L⁻¹（85.7—210.9）	[28]
卤虫（Artemia salina）	15±3.5	48 h	LC₅₀：30.8 mg·L⁻¹（27.32—52.85）	[38]
大型溞（Daphnia magna）	14 nm	21 d	EC₅₀：40.7 mg·L⁻¹（33.6—49.3）	[39]
大型溞（Daphnia magna）	20 nm	21 d	EC₅₀：36.9 mg·L⁻¹（27.6—49.3）	[39]
大型溞（Daphnia magna）	29 nm	21 d	EC₅₀：71.1 mg·L⁻¹（61.0—82.8）	[39]
同形溞（Daphnia similis）	8	48 h	EC₅₀：0.26 mg·L⁻¹	[40]
蚤状溞（Daphnia pulex）	8	48 h	EC₅₀：91.79 mg·L⁻¹	[40]
蚤状溞（Daphnia pulex）	8	72 h	EC₅₀ ：0.94 mg·L⁻¹	[40]
蚤状溞（Daphnia pulex）	8	96 h	EC₅₀ ：0.78 mg·L⁻¹	[40]
注：EC₅₀/LC₅₀括号中数字代表95%置信区间. Numbers in parentheses refers to 95% confidence intervals.

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表 3 CeO₂NPs对无脊椎动物毒性的主要影响因素

Table 3. Main influencing factors of CeO₂NPs toxicity in invertebrates

受试生物Tested organism	影响因素Influencing factor	结果Result	参考文献Reference
大型溞（Daphnia magna）	粒径	毒性：14 nm>29 nm	[39]
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）	粒径	毒性：15 nm>45 nm	[59]
静水椎实螺（Lymnaea stagnalis）	粒径	生物利用率：3.8 nm>185 nm	[23]
摇蚊（Chironomus riparius）	粒径、涂层	毒性：NP2（无包覆2—5 nm）>NP3（无包覆20—60 nm）>NP1（三柠檬酸铵包覆）	[32]
斑马贻贝（Dreissena polymorpha）	涂层	毒性：Alginate（海藻酸）>Chit（壳聚糖）	[69]
斑马贻贝（Dreissena polymorpha）	涂层	生物累积量：柠檬酸>裸露	[21]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	涂层	毒性：Alginate（海藻酸）>Chit（壳聚糖）	[19]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	表面电荷	毒性：负电荷>正电荷	[70]
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）	表面电荷	毒性：正电荷>中性、负电荷	[35]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	暴露介质	毒性：人工土壤>矿区土壤	[71]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	暴露介质	Ce累积：农业土壤>生物炭改良土壤	[16]
赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）	暴露介质	氧化损伤：砂质土>粘土	[15]
河蚬（Corbicula fluminea）	盐度	基因表达：低盐度（1.5 psu）>高盐度（15 psu）	[67]
卡尼鄂拉蜜蜂（Apis mellifera carnica）	温度	生物酶活性：夏季>冬季	[68]
紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）	暴露途径	清除率：饮食暴露>直接暴露	[72]
夹杂带丝蚓（Lumbriculus variegatus）	暴露途径	累积：摄食>经皮吸收	[30]

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1. 材料与方法
1.1 进水水质与接种污泥
1.2 实验装置
1.3 运行条件
1.4 分析方法
1.5 16S rRNA基因测序与微生物菌群分析
1.6 优化MOBAPR操作
2. 结果与讨论
2.1 MOBAPR中PN/A工艺的脱氮性能
2.2 各阶段微生物群落演替分析
2.3 不同阶段各反应柱内的氮转化途径
2.4 G/L对NRE的影响
3. 结论

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纳米氧化铈（CeO₂NPs）是一种重要的纳米稀土化合物，具有较强的静电吸引力、较高的氧亲和力和氧化还原电位等独特的理化性质，被广泛用于抛光材料、吸附剂、汽车尾气催化剂、氧传感器等^{[1 − 4]}. 此外，CeO₂NPs在氧化应激相关疾病的药物治疗上具有较好的应用前景，如神经退行性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病和癌症^[5]. CeO₂NPs是生产最多的纳米颗粒之一，全球年产量约10000 t^[6]. CeO₂NPs及其相关产品的大规模生产和使用，必然会导致越来越多CeO₂NPs通过各种途径进入大气、土壤和水等环境介质及生物体中. 由于纳米颗粒的特殊性质（如粒径为1—100 nm），目前的分离和分析技术还很难检测环境中CeO₂NPs的真实背景浓度. Giese等^[6]结合科学模型和经济模型，评估了2017—2050年自然介质中CeO₂NPs的浓度，预计2050年大气、地表水、沉积物和土壤中的CeO₂NPs浓度分别为0.60—30.93 ng·m⁻³、4.49—148.93 ng·L⁻¹、2.35—1844.20 μg·kg⁻¹、680.81—17792.55 ng·kg⁻¹.

无脊椎动物是生物类群的重要组成，其中大多数物种是低营养级动物. 相较脊椎动物具有易富集污染物、对环境变化更敏感、不占用空间便于大量饲养、个体较小便于操作、生活史短等特点^[7]. 具有较多的生态、环境和动物毒理实验用模式动物，如线虫、蚯蚓、水溞、果蝇等. 近年来，越来越多的学者以无脊椎动物为研究材料开展了一系列CeO₂NPs生物毒性研究. 但关于CeO₂NPs对无脊椎动物影响综述性内容非常有限，现有的资料也仅局限于各类纳米颗粒对土壤或海洋无脊椎动物的影响，且侧重于CeO₂NPs理化性质对生物体的影响^{[8 − 13]}.

本文从生物累积、行为反应、组织损伤、生长发育毒性、免疫毒性、生殖毒性和遗传毒性等方面综述了CeO₂NPs对无脊椎动物的影响以及CeO₂NPs毒性效应的影响因素，总结了CeO₂NPs对无脊椎动物的毒性机制，最后基于目前研究不足提出CeO₂NPs对无脊椎动物毒性研究建议，以期为CeO₂NPs的毒性评价、安全生产、排放和商品化等提供参考.

1. CeO₂NPs对无脊椎动物的影响（Effects of CeO₂NPs in invertebrates）

1.1. 生物累积

研究表明，纳米材料的生物累积与毒性效应之间存在相关性，是前期毒性研究基础^[14]. CeO₂NPs可以通过无脊椎动物的表皮接触和摄食等途径在动物体内积累（表1），并可通过生物链逐级传递.

一般来说，消化道是无脊椎动物累积CeO₂NPs最高的部位. 王婧坤等^[28]研究发现，大型溞（Daphnia magna）暴露于1—1000 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 24 h可以明显观察到体内纳米颗粒的累积，且随时间延长，大型溞对CeO₂NPs的摄入量显著增加，充满整个消化道. 滤食性动物斑马贻贝（Dreissena polymorpha）可以利用覆盖在鳃上的纤毛捕获CeO₂NPs，然后经口到胃，最终在消化腺累积^[29]. 此外，Cross等^[30]研究发现，Ce³⁺比CeO₂NPs更容易在夹杂带丝蚓（Lumbriculus variegatus）的皮肤上累积. Lahive等^[24]对比了Ce盐及不同粒径的CeO₂NPs（5—80 nm和300 nm）对蚯蚓的毒性作用. 结果发现，蚯蚓体内的Ce含量均随暴露浓度增加而显著增加，且暴露于CeO₂NPs的蚯蚓体内Ce累积量显著高于暴露于离子态Ce的蚯蚓.

Hawthorne等^[25]研究发现，用1228 μg·g⁻¹ CeO₂NPs处理过的叶片喂食蟋蟀（Acheta domesticus），14 d后再将其喂食狼蛛（Family lycosidae），在蟋蟀和狼蛛体内均发现不同程度Ce累积. Majumdarm等使用种植在1000—2000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs污染土壤中的芸豆喂食墨西哥豆甲虫（Epilachna varivestis），再将其喂食刺肩蝽（Podisus maculiventris），Ce的含量从植物到甲虫再到刺肩蝽被生物放大了5.3倍，但未观察到毒性效应^[26]. 这表明CeO₂NPs会通过食物链进行营养转移，且不同物种的摄食习惯可能是导致Ce累积差异的主要原因，但现有资料并不表明CeO₂NPs通过食物链在生物体内累积会导致毒性效应. 此外，CeO₂NPs一旦进入水体会迅速沉降，导致底栖无脊椎动物吸收和累积^[31]. Bour等^[32]将摇蚊（Chironomus riparius）幼虫暴露于1 mg·L⁻¹ CeO₂NPs，发现体内有大量Ce累积，但对其存活率无显著影响. 进一步研究表明，摇蚊体内累积的大量CeO₂NPs，可能成为两栖动物幼体的污染载体，导致遗传毒性^[27]. Jacinto-Maldonado等^[33]对一条可能受到交通污染的河流中携带螨虫（Hannemania）的两栖动物进行了采样，结果表明，螨虫体内存在CeO₂累积，对两栖动物有潜在毒性，螨虫可能是两栖动物接触污染物的途径. 上述研究表明无脊椎动物确实能通过体外暴露和食物链传递蓄积CeO₂NPs，在水生和陆生动物体中都存在生物富集现象. 在探究CeO₂NPs毒性过程中，应考虑CeO₂NPs的靶向性和其在无脊椎动物体内的累积状况.

1.2. 毒性效应

半数效应浓度（Medium effective concentration，EC₅₀）和半数致死浓度（50% lethal concentration，LC₅₀）是CeO₂NPs对无脊椎动物急性毒性的基本指标（表2）. 研究表明EC₅₀和LC₅₀因CeO₂NPs物化性质和物种差异而不同^{[41 − 42]}. Van Hoecke等^[39]将大型溞暴露于14、20、29 nm CeO₂NPs悬液21 d，发现对于2种较小粒径CeO₂NPs的LC₅₀为40 mg·L⁻¹，而29 nm的LC₅₀为71 mg·L⁻¹. 相较于蚤状溞（Daphnia pulex），同形溞（Daphnia similis）对CeO₂NPs具有更强的毒性耐受力. 蚤状溞和同形溞同时暴露1 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 48 h，同形溞LC₅₀值是蚤状溞的350倍^[40].

陆生无脊椎动物受到CeO₂NPs胁迫时其敏感性低于水生无脊椎动物. 研究发现，CeO₂NPs对一些典型的陆生无脊椎动物存活无显著影响，如赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）^[24]、白符䖴（Folsomia candida）^[43]和多霜腊鼠妇（Porcellionides pruinosus）^[43]等. Lahive等^[24]将赤子爱胜蚓暴露在41—10000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs土壤中28 d，发现CeO₂NPs对赤子爱胜蚓的死亡率没有影响.

1.2.1. 行为反应

行为终点是评估污染物毒性的一个重要研究指标. 其中，游泳行为被证实是评估水生无脊椎动物生态毒性合适和准确的终点^[44]. 研究表明CeO₂NPs对水生无脊椎动物的游泳性能会产生显著影响^{[28, 40, 45]}. 大型溞暴露于1—1000 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 48 h在其体表上观察到大量纳米颗粒，尤其在触角上吸附的纳米颗粒较多，显著抑制了大型溞的游泳速度^[28]. Artells等^[40]研究发现，相同浓度CeO₂NPs暴露下，不同溞类品种表现出的游泳性能会有明显差异. 蚤状溞和同形溞分别暴露于1 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 48 h，其游泳速度分别较对照组显著下降了30%和40%. 研究认为CeO₂NPs导致水溞游泳能力降低的原因可能是摄食减少和蜕皮的影响^[46].

在CeO₂NPs污染土壤中，利用动物趋利避害的本能，通过测定CeO₂NPs对无脊椎动物个体行为的影响程度来判定其毒性大小^{[8, 47]}. Zidar等^[47]在土壤中添加（203.6±4.03）nm 100—2000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs，观察鼠妇对CeO₂NPs的回避行为. 结果表明在1000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs处理组下，鼠妇的摄食率下降，鼠妇对CeO₂NPs处理组食物的回避行为并不明显. 而在Malev等^[48]类似实验中，鼠妇食用15 nm 1000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs处理的榛树叶摄食率较对照组显著增加，食用2000—5000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs处理的榛树叶鼠妇摄食率较对照组显著下降. 这表明不同粒径的CeO₂NPs对鼠妇的行为反应具有一定差异，粒径越小，毒性越大. 土壤无脊椎动物对污染物的行为反应可能是污染物使土壤中微生物群发生变化，导致动物适口性的改变，土壤无脊椎动物特有的化学和机械感受器使它们主动避开有害环境；也可能是污染物进入到土壤无脊椎动物体内，引起动物体不适而产生回避反应.

1.2.2. 组织损伤

CeO₂NPs对无脊椎动物组织损伤的研究较少. CeO₂NPs可以通过体壁接触或肠壁运输等方式进入无脊椎动物的体腔，引起组织损伤. Lahive等^[24]研究发现，赤子爱胜蚓暴露于41—10000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs 28 d，会导致蚯蚓体壁角质层缺失和肠道上皮细胞完整性遭到破坏. 与之相似，Chen等^[15]研究表明CeO₂NPs会对蚯蚓消化道产生不良影响. 蚯蚓通过被动的表皮渗透和主动的肠道吸收等方式在其体内积累CeO₂NPs，导致体腔组织和肠道上皮损伤. 经1000 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs处理后蚯蚓肠粘膜上皮细胞结构模糊有空洞，细胞器自溶和扩散. Rossbach等^[49]研究发现，0.5—34.96 mg·L⁻¹ CeO₂NPs会导致线虫咽部严重畸形，尤其是食道球以及咽瓣后方出现肿胀，但是并不损害线虫咽功能和摄食能力. 可能是线虫摄入CeO₂NPs时导致咽部角质层的机械损伤. 由于CeO₂NPs的独特性质，能够躲避无脊椎动物的防御机制，可能会通过在体内累积而对器官产生影响. 目前CeO₂NPs对无脊椎动物组织损伤方面的影响还需进一步研究.

1.2.3. 生长发育毒性

在无脊椎动物早期发育阶段，CeO₂NPs暴露会导致幼体生长率改变、发育异常等. Arnold等^[50]研究发现，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）暴露于5 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 3 d后，生长率显著降低90.6%. Stowers等^[51]进一步研究表明，不同浓度CeO₂NPs对秀丽隐杆线虫的生长情况具有不同影响，100 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs会促进秀丽隐杆线虫生长，而500 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs则抑制秀丽隐杆线虫生长. 蜕皮是无脊椎动物体型增长和发育成熟的一种正常生理过程. 水溞暴露于10 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 21 d后，其幼虫体型明显缩小，蜕皮频率显著下降^[52]. Auffan等^[53]进一步研究发现，水溞蜕皮是控制CeO₂NPs释放的关键因素，这在很大程度上降低了向其捕食者转移CeO₂NPs的可能性. 此外，有研究表明，CeO₂NPs会显著抑制水溞的体长. Van Hoecke等^[39]将大型溞暴露于100 mg·L⁻¹不同粒径的CeO₂NPs 7 d后，大型溞平均体长与对照组相比均显著下降50%以上. 但是Bour等^[46]研究发现，摇蚊幼虫暴露在0.01—100 mg·L⁻¹ CeO₂NPs 48 h后，其发育历期、羽化率、口部畸形等生长发育特性无显著变化. 这可能是由于摇蚊幼虫摄食纳米颗粒后会分泌粘液，导致颗粒聚集，进而降低了CeO₂NPs的毒性效应. 总体来说，CeO₂NPs暴露对无脊椎动物生长发育的影响通常可直接观察.

1.2.4. 免疫毒性

免疫系统是机体抵御外源物质侵扰的首道防线，相比其他系统具有更高的反应性和灵敏性，也是CeO₂NPs的敏感靶点^[54]. 不同于脊椎动物抗体介导的获得性免疫系统，无脊椎动物的免疫系统是非特异性的，外源污染物入侵后会激活血细胞的吞噬作用和细胞毒性反应介导的免疫行为^{[55 − 56]}. Garaud等^[22]评估了紫贻贝暴露于CeO₂NPs对其免疫功能的影响. 结果显示，10 mg·mL⁻¹ CeO₂NPs显著诱导紫贻贝血细胞中溶菌酶、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和NO生成，同时抑制吞噬活性，这表明CeO₂NPs使紫贻贝产生炎症和免疫抑制作用. 另一方面，CeO₂NPs可以通过鳃直接进入贻贝的循环系统并激活血细胞，通过释放溶酶菌、上调免疫和抗氧化基因等多种防御机制作出反应^[57]. 这表明CeO₂NPs在生物不同组织水平上具有免疫调节和抗氧化作用.

1.2.5. 生殖毒性

CeO₂NPs对无脊椎动物生殖细胞的活力、数量和受精率等产生不利影响，从而诱导生殖毒性. Castro等^[58]用含1—100 mg·L⁻¹ CeO₂NPs饲料喂食甜菜夜蛾（Spodoptera frugiperda），CeO₂NPs会显著影响雌性甜菜夜蛾的生殖能力，其中10 mg·L⁻¹ CeO₂NPs导致甜菜夜蛾卵子活力下降60%. 将秀丽隐杆线虫分别暴露于15 nm和45 nm CeO₂NPs，秀丽隐杆线虫卵子数量较对照组分别下降了28%和11%，CeO₂NPs显著降低秀丽隐杆线虫的生殖能力^[59]. 可能是CeO₂NPs诱导了代谢酶基因cyp35a2的表达，cyp35a2对线虫的生殖能力具有负面影响，线虫通过降低生殖能力作为一种防御机制以代偿CeO₂NPs引起的毒性. Oral等^[60]将受精5 h后的海胆胚胎暴露于10⁻⁸—10⁻⁵ mol·L⁻¹ CeO₂NPs，CeO₂NPs会抑制海胆的有丝分裂，诱导有丝分裂畸变，多极纺锤体显著增多，受精率显著下降，10⁻⁵ mol·L⁻¹ CeO₂NPs导致胚胎全部死亡.

1.2.6. 遗传毒性

遗传毒性是化学毒性测试和风险评估中重要的毒性终点之一^{[61 − 62]}. CeO₂NPs主要通过诱导无脊椎动物DNA损伤而产生遗传毒性. Savić‐Zdravković等^[63]研究发现，CeO₂NPs对摇蚊具有显著的遗传毒性，且有浓度梯度效应. 彗星实验结果表明暴露于2500 mg·kg⁻¹ CeO₂NPs的摇蚊四龄幼虫，DNA损伤较低浓度组显著增加. 与之相似，Koehlé-Divo等^[64]通过彗星实验探究了低浓度CeO₂NPs暴露下河蚬（Corbicula fluminea）的遗传毒性. 河蚬暴露于10 μg·L⁻¹ CeO₂NPs已表现出DNA损伤，且随暴露时间和浓度的增加DNA损伤加剧. CeO₂NPs可以通过直接的物理相互作用以及间接的ROS生成两种途径损害遗传物质^[65]，即使组织内CeO₂NPs和ROS含量很低，也可能引起遗传毒性. CeO₂NPs作为一种潜在的纳米污染物正受到越来越多的关注，但关于其对无脊椎动物遗传影响的报道较少，潜在的毒性机制仍需进一步探究.

总体来说，CeO₂NPs对无脊椎动物毒性效应存在种间差异性，同时受物种的不同发育阶段、不同的毒性终点影响. 值得注意的是，目前在CeO₂NPs的生物累积和毒性效应研究中，实验室暴露浓度多是μmol·L⁻¹—mmol·L⁻¹不等，远高于环境浓度，差异很大. 表明研究结果可能不代表在现实环境中的毒性影响. 据我们所知，Zhang等^[66]首次在环境相关浓度（1—100 nmol·L⁻¹）下，评估了CeO₂NPs（8.5 nm）自然暴露模式下对秀丽杆线虫的影响. 结果表明，CeO₂NPs可诱导线虫ROS积累和氧化损伤，最终导致寿命缩短. 在1 nmol·L⁻¹的暴露水平下，线虫的平均寿命已显著降低了12%. 因此为了避免关于CeO₂NPs对无脊椎动物毒性的误导性解读，CeO₂NPs的毒理研究今后应在与环境相关的模式下使用适当的浓度和自然暴露途径会更有生态指导性.

2. CeO₂NPs对无脊椎动物毒性效应的影响因素（Influencing factors of CeO₂NPs toxicity in invertebrates）

3. CeO₂NPs对无脊椎动物毒性的主要机制（Main mechanism of CeO₂NPs toxicity in invertebrates）

4. 总结与展望（Conclusions and prospects）

随着CeO₂NPs产量和终端产品快速增长，其在环境中的风险和生物毒性引起学者越来越多的关注. 迄今为止，国内外已开展了较多CeO₂NPs对无脊椎动物的毒性调查，但相关研究结果并不一致甚至相反，深度和广度都有待提高. 本文结合文献中的相关研究结果，系统综述了CeO₂NPs对无脊椎动物的影响及对其毒性影响因素. CeO₂NPs在环境和食物链中迁移转化，可在无脊椎动物体内累积，引起急性或亚慢性毒性，影响无脊椎动物的生长发育、破坏组织结构并损害其系统功能. CeO₂NPs诱导细胞氧化应激，造成无脊椎动物DNA损伤、线粒体损坏、染色体畸变以及细胞凋亡. 此外，理化性质和环境等因素都会影响CeO₂NPs对无脊椎动物的毒性. 最后基于目前的研究提出一些展望，为CeO₂NPs对无脊椎动物毒性的研究提供新的思路.

（1）关于CeO₂NPs毒性效应的研究中，更多表现为对无脊椎动物的长期毒性影响，且CeO₂NPs的暴露浓度远高于实际环境浓度值. 因此，未来需要在更接近真实环境条件下，开展无脊椎动物长期接触和多途径（如皮肤、摄食、呼吸等）暴露CeO₂NPs的毒理研究.

（2）因CeO₂NPs对无脊椎动物毒性效应涉及到较多的因素，如不同粒径、形貌的CeO₂NPs在环境介质中溶解、释放进入生物体后迁移转化及毒性效应不尽相同，这就导致不同研究中的差异性结果很难得到合理的解释和明确结论. 为了获得可重复和比较的实验结果，有必要建立一个标准方法来评价CeO₂NPs毒性，比如在标准中考虑到CeO₂NPs的理化特性、实验设计和毒性评价方法等. 以完善CeO₂NPs的生态毒性安全评价系统，便于政府规范CeO₂NPs的生产和使用.

（3）自然环境中污染物并不是单独存在的，往往是多种污染物共存，其之间可能会发生相互作用. 目前，CeO₂NPs对无脊椎动物毒性效应研究中很少涉及到复合污染，具体的毒性机制尚未明确. 因此，为客观揭示环境中污染物的行为，深入探究CeO₂NPs与其他化学物复合污染的无脊椎动物毒性具有重要意义.

参考文献 (91)

纳米氧化铈对无脊椎动物的毒性效应

通讯作者: E-mail：yuanhx@mail.usts.edu.cn

Toxic effects of cerium oxide nanoparticles in invertebrates: A review

Corresponding author: YUAN Hongxia, yuanhx@mail.usts.edu.cn

1. 材料与方法

1.1 进水水质与接种污泥

1.2 实验装置

1.3 运行条件

1.4 分析方法

1.5 16S rRNA基因测序与微生物菌群分析

1.6 优化MOBAPR操作

2. 结果与讨论

2.1 MOBAPR中PN/A工艺的脱氮性能

2.2 各阶段微生物群落演替分析

2.3 不同阶段各反应柱内的氮转化途径

2.4 G/L对NRE的影响

3. 结论

期刊类型引用(1)

其他类型引用(1)

计量

出版历程

纳米氧化铈对无脊椎动物的毒性效应

通讯作者: E-mail：yuanhx@mail.usts.edu.cn

English Abstract

Toxic effects of cerium oxide nanoparticles in invertebrates: A review

Corresponding author: YUAN Hongxia, yuanhx@mail.usts.edu.cn

全文HTML

1.1. 生物累积

1.2. 毒性效应

1.2.1. 行为反应

1.2.2. 组织损伤

1.2.3. 生长发育毒性

1.2.4. 免疫毒性

1.2.5. 生殖毒性

1.2.6. 遗传毒性

2.1. 理化性质

2.1.1. 粒径

2.1.2. 表面电荷

2.2. 涂层

2.3. 环境因素

2.4. 暴露途径

3.1. 细胞膜损伤

3.2. 氧化损伤

3.3. 诱导细胞凋亡

3.4. Ca2+调节

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1.1. 生物累积

1.2. 毒性效应

1.2.1. 行为反应

1.2.2. 组织损伤

1.2.3. 生长发育毒性

1.2.4. 免疫毒性

1.2.5. 生殖毒性

1.2.6. 遗传毒性

2.1. 理化性质

2.1.1. 粒径

2.1.2. 表面电荷

2.2. 涂层

2.3. 环境因素

2.4. 暴露途径

3.1. 细胞膜损伤

3.2. 氧化损伤

3.3. 诱导细胞凋亡

3.4. Ca2+调节

3.4. Ca²⁺调节

3.4. Ca²⁺调节