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湖泊是水生生态系统的重要组成部分，也是重要的生物多样性储存库[1]. 研究发现，湖泊在调节河川径流，繁衍水生生物和改善区域生态环境等方面发挥着重要作用[2 − 4]. 事实上，湖泊的许多生态功能都是由水生生物（包括植物和鱼类）、沉积物及其微生物协助完成的. 微生物影响水中有机质分解和养分循环，促进植物生长[5]. 水体和沉积物中的微生物群落对污水中的氮磷硫的去除有着直接影响[6]. 同时，微生物对水体污染物响应敏感，在水体质量和污染检测中常作为指示指标[7 − 8]. 随着湖泊富营养化和水体污染问题的日益严重，污染物对水体和沉积物微生物群落影响及其生态功能危害受到学者的广泛关注[9 − 11].
砷是环境中广泛存在的天然有毒类金属元素. 进入工业时代以来，由于金属冶炼、化石燃烧等工业活动，以及农业中使用含砷农药，大量含砷化合物排放到环境中，最终造成湖泊水体中砷污染问题[12]. 进入水体中的砷不断累积，并引起水体和沉积物微生物群落结构和生态功能的紊乱，从而威胁湖泊水体健康[13 − 14]. 同时，砷由水体进入动植物体内，通过食物链富集传递进入人体，对人类健康构成危害[15]. 目前，湖泊等水体砷污染问题已经得到了全球范围内的大量报道[16 − 17]. 鱼类是湖泊系统中的重要生物资源，鱼类活动能够影响湖泊生物群落结构、营养物质的构成等[18 − 19]. 然而，关于鱼类扰动对湖泊水体和沉积物中微生物的影响却极少报道. 因此，认识砷污染和鱼类活动对湖泊水体和沉积物微生物的影响，对全面理解湖泊生态系统中砷的毒性效应和生态风险具有重要意义.
鉴于此，本研究通过室内模拟湖泊生态系统，通过高通量测序技术探究鱼类活动和砷污染下湖泊水体和沉积物细菌群落的响应机制. 这将有助于提升人们对湖泊水体和沉积物细菌群落的认识，也有助于了解鱼类活动和污染物共同作用下对水生生态系统的潜在影响.
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将采自当地湖泊的沉积物带回实验室，置于阴凉通风处风干后，捡出砾石、落叶和垃圾等杂物，研磨后过2 mm筛，备用. 供试鱼类为湖泊常见的麦穗鱼（Pseudorasbora parva），购自本地养殖场，实验所用鱼饲料购自本地水族市场. 实验前，选择相似长度和体重的鱼若干条，将其放入实验室采集的去离子水中进行两周的本地驯化. 本次实验选用十二水砷酸钠（Na3AsO4·12H2O）作为砷污染源，其他试剂若无特殊说明，均为分析级纯度，购自国药控股化学试剂有限公司.
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本研究共设置4个处理组，分别为仅有沉积物的对照组（C），添加了鱼的处理组（C-F），添加了砷的处理组（As），添加了鱼和砷的复合处理组（As-F）. 具体为，实验所用水体为城市自来水，静置1—2 d后，备用. 添加10 L水样到聚乙烯塑料收纳盒中（长×宽×高，40 cm × 30 cm × 30 cm），在底层均匀铺满5 cm厚度的沉积物，取适量的含砷试剂充分溶于水中，然后将溶液倒入贴有标签As和As-F的实验组中，用玻璃棒缓慢搅动，使其均匀分布在水体中，放在实验室避光处老化14 d. 在C-F和As-F的实验组中各加入10条长度体重相似的鱼. 每个处理组设3个重复，最后共有12个实验培养盒. 培养条件设置为：14 h光照，10 h黑暗，温度控制在（24 ± 2）℃，每3—5 d对鱼进行1次定点喂食. 实验期间，定期向收纳盒中加入超纯水，保证水量为10 L.
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试验28 d后，采集水体、沉积物和鱼组织样品. 使用无菌手套将鱼从水体中捞出，放入装有无水乙醇的离心管中杀死封存，在无菌超纯水漂洗5次，从而去除鱼体表层微生物对实验结果的影响。在无菌操作台上用无菌镊子和无菌剪刀对鱼进行解剖，提取组织物. 所有水样用0.22 μm滤膜进行过滤，滤膜剪碎后使用土壤试剂盒FastDNA®Spin Kit（MP Biomedical, California, USA），依照其提供的操作流程提取水体微生物DNA. 称取沉积物0.5 g左右，使用与水体相同的土壤试剂盒提取沉积物微生物DNA. 鱼组织使用组织试剂盒DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN, 中国）提取其微生物DNA. 随后紫外分光光度计ND-1000（Nano-Drop，美国）测样品DNA浓度，最后将DNA样品储存于-20 ℃冰箱，备用.
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本研究使用Illumina Hiseq 2500 平台高通量测序技术进行分析，扩增细菌16S rRNA基因的V4区（上下游引物分别为515F: 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），下游引物加上barcode用来区别不同样品. PCR扩增反应体系及其加热循环条件参照文献[20]. PCR产物经纯化回收、浓度测定并混库，送测序公司（诺禾，中国）进行测序. 测序原始序列使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology （QIIME）进行分析[21]. 首先去除所有barcode、低质量及模糊序列，得到高质量目标区域序列，在97%的相似度水平上完成操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTU）[22]. 细菌Alpha多样性通过OUT、Chao1指数和 Shannon多样性指数表示每个样品内在多样性. Beta多样性采用基于Bray−Curtis距离的主坐标轴法分析. 测序数据已上传到美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（SRP111095）.
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水体和沉积物pH值采用pH仪（Fisher Scientific，美国）进行测定. 沉积物总氮（TN）和总碳（TC）使用C/N分析仪（Vario MAX C/N，德国）燃烧法完成. 水样过滤后准确量取9 mL于微波消解管中，加入1 mL硝酸后充分混合，使用微波消解仪（CEM Microwave，英国）进行消解，沉积物和鱼中重金属则使用硝酸-氢氟酸体系在微波消解仪内进行. 消解完成后溶液定容并过滤，待上机测定. 所有样品中As含量由电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，美国）测定. 每批消解样品设置3个空白对照，及两个技术平行，样品间平行重复的偏差控制在10%以内. 同时，使用标准物质大虾GBW10050和黄棕壤GBW07403进行校准验证，样品回收率均在91.7%—108.1%之间，符合要求.
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数据基本分析（均值，标准差，标准误等）采用Excel 2010 （Microsoft，美国）. 样品间显著性分析采用SPSS V 20.0完成（IBM，美国），其中单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）比较数据在0.05水平上的显著性，显著性检验的方法使用Tukey HSD检验. 其他数据绘图均由Origin Pro 8.5 （OriginLab，美国） 完成. 微生物数据分析主要基于R（version 3.4.3）绘制，如R中工具包vegan 2.3-1进行主坐标分析，Adonis test算法显示样品间细菌群落的差异.
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本次实验沉积物，水体与鱼组织的理化性质如表1所示. 本实验的沉积物pH均值在7.84左右，呈弱碱性，且在各个处理组之间不存在显著差异（P > 0.05）. 对照处理组的水体pH（9.19）显著低于C-F处理组内水体pH（10.1；P < 0.05）. 同时，As处理组内水体pH为9.31，也显著低于As-F处理组内水体pH（10.2；P < 0.05）. 此外，砷的加入使沉积物、水体和鱼组织内的砷含量显著升高，如As-F处理组内鱼体内砷含量（0.34 mg·kg−1）是C-F处理组鱼体内砷含量（0.19 mg·kg−1）的1.8倍（P < 0.05）. 同时加砷后，水体砷浓度（2.22 μg·kg−1）显著提升到30.3 μg·kg−1（P < 0.05），其浓度也高于我国包装饮用水砷限量（10 μg·kg−1，GB 2762—2022）.
本实验中砷的添加显著增加了水体、沉积物及鱼组织内砷的含量，在陆地或水体生态系统已有大量相关报道，且与本研究结果一致[23 − 25]. 进入水体的砷，通过自然沉降、生物化学吸附等反应，形态发生转化，并不断蓄积在水体底部即沉积物中，鱼等生物体则通过接触、取食等途径，不断富集砷等污染物. 特别是本研究周期仅28 d，鱼组织内富集砷的浓度提高了近一倍. 值得注意的是，虽然少量的砷污染对鱼群体无直接毒害作用，但对其微生物影响不容忽视. 同时，鱼是水体生态系统中食物链的重要组成部分，可通过食用等途径，对人体产生潜在危害，因此仍值得长期关注.
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通过对沉积物、水体和鱼等样品进行高通量测序，一共获得950276条高质量序列. 样本序列数值范围从45232条到67135条不等，每个样品的平均序列数为58638. 此外，根据序列97%的相似度进行判定后，共得到17437个OTUs，其中沉积物、水体和鱼细菌群落之间大约有11.9%的共享OTUs. 同时，发现沉积物、水体和鱼组织样品的细菌群落之间基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析显示，沉积物、水体和鱼等3种类型细菌群落沿着第一坐标轴和第二坐标轴彼此之间互相分离（Adonis test，P = 0.001；图1a），且第一和第二轴分别能够解释30.8%和19.8%的变异量. 另外，通过计算样品细菌的Shannon多样性可知，沉积物细菌多样性显著高于水体和鱼细菌多样性（P < 0.001；图1b），而水体和鱼样品之间的Shannon多样性指数差异不大（P = 0.2）.
沉积物、水体、鱼三者之间的细菌群落显著不同，这与三者自身组成及周围所处环境不同有关. 鱼从周围水体或沉积物环境中取食，其肠道特殊生境会对微生物进行筛选同化，使得鱼体内细菌多样性低于周围环境，类似的现象在陆地生态系统蚯蚓肠道也有发现[26 − 27]. 本研究模拟水体为城市自来水，城市管道水体经过混凝工艺、杀菌等处理，水体微生物多样性较低，且水体生物量较少，进一步抑制了水体细菌的生长. 而沉积物来源湖泊，富含有机质，且生物多样性较高. 这可能是沉积物细菌多样性高于水体的主要原因，类似的结果也出现在自然水体报道中[28 − 29].
从细菌群落的组成来看，沉积物和水体的细菌群落在门水平（phylum）上相似，优势菌群均为变形菌门（Proteobacteria，占比分别为50.2%和58.3%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，分别为8.75%和16.7%）和放线菌门（Actinobacteria，分别为8.37%和7.90%）. 鱼中的优势菌群主要是变形菌门（Proteobacteria，73.1%）、厚壁菌门（Firmicutes，9.94%）和拟杆菌门 （Bacteroidetes, 5.26%；图2a）. 其中，沉积物和水体放线菌门的相对丰度接近，全部显著高于鱼组织内该菌丰度（0.93%；ANOVA，P < 0.01）. 厚壁菌门的相对丰度在沉积物（7.90%）和鱼（9.94%）中差异不大，其丰度分别是水体中该菌丰度的2.6倍和3.3倍 （P < 0.01）. 另外，在科（family）水平上沉积物、水体和鱼组织中存在一些显著性差异的细菌群落（图2b）. 鱼中丰度最高的是气单胞菌科（Aeromonadaceae，22.2%），且鱼类丰度均显著高于沉积物和水体中该细菌丰度（分别为0.03%和0.04%；P < 0.01）. 此类细菌属革兰氏阴性菌，生长在厌氧环境，气单胞菌可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，有助于鱼对营养物质的消化吸收[30 − 31]. 鱼中着色菌科（Chromatiaceae，11.3%）丰度也显著高于沉积物和水体中对应细菌丰度（分别为0.12%和0.13%；P < 0.01）. 丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）在沉积物和水体内的丰度最高，均为7.70%，丰度是鱼内细菌丰度的3.6倍（P < 0.01）.
沉积物、水体和鱼细菌群落之间大约有11.9%的共享OTUs，这说明三者生境之间存在一定联系. 在湖泊生态系统中，水体和沉积物可通过直接接触或经进食进入鱼体内，鱼肠道独特生境对其进入细菌进行一系列选择适应过程,最终附着在鱼的排泄物中,细菌再次进入水体和沉积物中,从而形成一个微生境物质循环系统[32 − 33]. 总的来说, 沉积物、水体、鱼三者间存在一定差异，但它们通过物质和细菌转化建立起密切关系,共同维持湖泊生态系统的生物多样性.
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砷和鱼活动可以影响水体和沉积物中细菌群落的多样性，如鱼活动能显著增加沉积物细菌群落的物种丰富度指数（Observed OUT；P < 0.05；图3a），同样也增加了沉积物细菌群落的Chao1指数（图3b）. 但在砷和鱼交互活动的作用下，沉积物细菌群落多样性无显著变化（P > 0.05；图3a、3b）. 另一方面，鱼或砷单独作用下对水体细菌多样性影响不大，而鱼和砷交互作用可显著降低其群落多样性（P < 0.05；图3a、3b）. 此外，通过对水体和沉积物中细菌群落结构的PCoA分析，发现As处理和对照下水体细菌群落聚在一起，差异不大. 而鱼活动的介入使得水体细菌沿第一坐标轴显著分离（Adonis test，P = 0.001；图3c），该坐标轴解释了53.1%的变量. 同样的，砷的加入未能显著改变沉积物细菌群落结构，而鱼活动使得沉积物中细菌群落沿PCo1轴显著分离（P = 0.003；图3d），此坐标轴解释了32.9%的变异量.
沉积物中细菌多样性的增高可能与鱼类活动有关，如鱼类觅食活动会引起表层沉积物的再悬浮与营养盐类释放，从而提高沉积物整体养分生产力[34]. 同时鱼类排泄、游弋活动加速水体与表层沉积物之间的物质交换，改变水体和沉积物的理化性质，从而影响细菌群落结构与组成. 这也与国内外水库中鱼类活动的结果类似[35 − 36]. 而砷和鱼联合作用显著降低水体细菌多样性，砷作为有毒类金属元素，对水体细菌直接产生选择压力，降低细菌代谢等活动[37]. 同时鱼类活动直接取食水体细菌，降低其营养成分，这些可能是水体生物多样性降低的主要因素.
砷的添加和鱼的活动均能引起水体和沉积物中细菌组成的变化（图4）. 与对照相比，鱼活动使水体中黄杆菌属（Flavobacterium）和噬氢菌属（hydrogenophaga）的丰度显著增加（P < 0.05；图4a）.
砷和鱼的共同作用下，水体中黄杆菌属和红杆菌属（Rhodobacter）的丰度分别显著降低到0.16%和0.54%（P < 0.05）. 在沉积物细菌群落组成中，砷和鱼活动对黄色土源菌（Flavisolibacter）和溶杆菌属（Lysobacter）影响较小，其丰度均无明显变化（P > 0.05；图4b）. 鱼活动使得沉积物中浮丝藻属（Planktothrix）的丰度显著增高到2.08%，但砷的加入则显著降低该菌的丰度（0.41%，P < 0.05）. 砷和鱼活动的共同介入使得地杆菌属（Geobacter）和硫杆菌属（Thiobacillus）的丰度较对照显著增加（P < 0.05）.
鱼类活动对水体和沉积物中细菌群落差异性和组成的影响大于砷含量变化所产生的影响. 可能的因素如下，首先低浓度砷污染对周围环境细菌的抑制作用不明显，有报道称低浓度砷甚至能促进土壤微生物多样性的增高[38]. 已有研究报道，浓度高达74 mg·kg−1污染的砷对水环境下土壤细菌多样性影响不大，且作用显著低于pH[39]. 这些研究表明，低浓度砷对水体及沉积物细菌群落施加选择性压力较小，即对其细菌多样性影响有限. 其次，鱼类在活动过程中通过进食、排泄等活动影响周围环境，这在上文中已得到证实. 当然本研究所选收纳盒较小，鱼类活动范围有限，可能存在进一步夸大鱼类活动影响力的结果，需要在后续研究进一步验证.
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（1）模拟湖泊生态系统中，沉积物、水体、鱼组织细菌群落存在显著差异，且沉积物细菌多样性显著高于水体和鱼组织. 沉积物和水体优势菌群为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门.
（2）砷和鱼活动显著改变水体和沉积物细菌群落组成，同时可显著降低沉积物细菌多样性，这可为开展基于生物和化学联合扰动下湖泊水生态系统响应工作提供科学参考.
鱼和砷对湖泊水体和沉积物细菌群落的影响
Effects of fish and arsenic on bacterial communities in lake water and sediment
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摘要: 湖泊是水体生物多样性的一个重要存储库，湖泊砷污染问题在全球范围内被广泛关注，然而鱼扰动和砷污染的联合作用对水体和沉积物微生物影响研究却很少报道. 鉴于此，本研究通过室内模拟湖泊生态系统，并采用高通量测序技术以探究鱼类活动和砷污染下湖泊水体和沉积物细菌群落的响应机制. 研究结果表明，沉积物细菌多样性显著高于水体和鱼组织中细菌多样性. 鱼和砷均能引起水体和沉积物细菌群落的改变，鱼和砷的共同作用可使沉积物细菌多样性显著降低，同时可导致水体中黄杆菌属（Flavobacterium）和红杆菌属（Rhodobacter）的含量显著降低. 这些结果有利于深入了解湖泊水体和沉积物细菌群落，为开展污染物和生物扰动联合作用下的生态风险研究提供科学依据.Abstract: Lake ecosystems are thought as an important reservoir of aquatic biodiversity, lake arsenic contamination is a growing concern for global safety and health. However, the combined effect of arsenic and fish disturbance on microbial communities in water and sediments are rarely reported. Herein, a microcosm experiment was used to explore the alteration of bacterial communities of lake water and sediment under fish activity and/or arsenic using Illumina sequencing analysis. The results showed that bacterial diversity in sediments was significantly higher than that in water and fish. Both fish and arsenic could cause changes in bacterial communities in water and sediments. In addition, co-exposure to arsenic and fish decreased significantly the bacterial diversity in sediments, also reduce observably the relative abundance of Flavobacterium and Rhodobacter in water. Our findings broaden the current scientific knowledge of the microbial communities in lake and sediment ecosystems, and provide scientific basis for ecological risk study under the combined effects of pollutants and biological disturbance.
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Key words:
- lake /
- sediment /
- fish disturbance /
- arsenic pollution /
- bacterial diversity.
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制定水质标准的科学依据是水质基准[1]，但目前的研究中，很少有针对我国水域的水质基准研究报道[2]，我国现行水质标准的确定主要是依据国外的水质基准数值[3-4]，但不同的生物区系与水质状况各不相同，这会导致水质基准产生明显差异[5-6]. 因此，基于我国水环境管理的迫切需求，应依据我国国情开展水质基准研究[7].
荧蒽（fluoranthene，FLU），是多环芳烃中4环芳烃的代表性化合物[8]，也是水体中多环芳烃污染物的一个主要成分[9]. 然而，目前我国尚缺乏有关本土水生生物荧蒽的生态毒性数据，因此通过实验开展荧蒽的水生生物基准阈值研究工作，获得有关数据是十分必要的，同时对荧蒽在我国的水生生物基准的建立以及水环境相关工作等具有一定的现实意义与科学意义. 本研究进行了急性与慢性毒理学试验，参考美国的水质基准“指南”要求（“三门八科”最低毒性数据），以及对我国淡水生物区系特征和影响因素等具体分析，最终选取了符合物种筛选规定的9种具有典型代表性的中国本土水生生物进行试验. 根据实验结果得出荧蒽本土水生生物基准阈值，同时，本文分析比较了本土物种与美国物种毒性敏感度是否一致，其中美国物种毒性敏感度基于美国水生生物毒性数据，分析结果可表明在进行我国本土水生生物基准研究时，是否可以直接采用非本土水生生物毒性数据.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 实验材料
一般来说，复杂水生态系统的功能、基本结构特征可通过鱼类、底栖动物、浮游生物和植物所表征[10-11]. 在推导我国水质基准时，试验生物的确定可依据美国水质基准“指南”中的规定，即“三门八科”最低毒性数据要求，同时参考《中国脊椎动物大全》[12]和《中国生物多样性国情研究报告》[13]等文献资料，试验生物必须包括鲤科鱼类；另外鉴于我国鲤科种类丰富、数量庞大[14]，因此本文选用两种鲤科鱼. 如上所述，物种选择应具体分析中国淡水生物群的特点，同时根据源自欧盟和美国水质基准的物种选择原则，本次荧蒽基准研究初步选择了9个本地水生生物物种作为受试物种，它们分别是锦鲤、麦穗鱼、泥鳅、泽蛙蝌蚪，大型溞、青虾、摇蚊幼虫，霍甫水丝蚓，水螅属. 其中锦鲤和麦穗鱼为脊索动物门鲤科，其余依次为鳅科、蛙科、节肢动物门溞科、虾科、摇蚊科、环节动物门颤蚓科和腔肠动物门水螅虫科，共“四门八科”. 另外对照毒性数据筛选原则[15]，本研究在搜集荧蒽的水生植物毒性数据数据的过程中，发现所得结果很少能够满足上述筛选原则.
在“朝来春及大森林水产市场”购入试验所需的9种本土水生动物（既包括淡水，也包括海水），正式试验前均在实验室驯养至少7 d；在中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室可获得试验所需的大型溞（Daphnia magna），其龄期在24 h之内[15]. 水生生物培养条件为：pH 8.0±0.2，DO （8.3±0.3） mg·L−1，温度（22±2）℃，试验类型采用换水式，每24 h进行一次换水，急性试验不喂食，慢性试验按照0.1%生物重量一天喂食2次；溞类光照周期为12 h:12 h.
在筛选受试物种时，不同种类的受试生物对其龄期有着不同的要求，其中对于水溞或其他水溞类动物要求为24 h内，蚊类，要求为第二代、三代幼虫，对于鱼类或其他物种，要求为至少先于性腺发育前60 d的幼龄阶段生物[15].
在“美国Sigma Aldrich化学品公司”购入实验所用荧蒽，其化学式为C16H10，纯度≥98%（HPLC）为色谱纯；其他试剂均为分析纯. 为了确保浓度配置的准确性，在第一次实验之前，通过中国计量学院校准了用于制备蒽溶液的移液枪，对每个浓度组进行了气相色谱测试. 为了避免试验过程中的任何干扰，实验者严格遵循操作规范，在气相色谱分析之前，所有未使用的玻璃器皿都用高价的酸溶液进行冲洗. 在3组空白实验中加入内标荧蒽-d10，96 h后测定其回收率，结果显示，荧蒽-d10的回收率为74.3%—89.6%. US EPA[15]公布的回收率为70%—130%，试验结果满足其要求，证明了本实验结果的可靠性和准确性.
1.2 实验方法
根据美国材料与试验协会[16]标准方法[17-18]进行急性实验，设空白对照组、助溶剂（二甲基亚砜, DMSO）对照组、浓度组，每组3个重复. 急性实验的时间设置为：溞类48 h，其余水生生物96 h. 具体实验信息如表1所示.
表 1 FLU 9种本土水生生物急性毒性实验信息Table 1. Acute toxicity tests information of FLU to nine resident aquatic organisms分类Classification 生物科Families 物种Species 生长阶段Growth phase 体重/gWeight 体长/cmLength 实验时间/hTime 浓度设置/ （mg·L−1）Concentration 脊索动物门 鲤科 锦鲤（Rhodens sinensis） 幼龄期（<30 d） 0.25 ± 0.05 3.0 ± 0.5 96 0.00, 2.40, 3.10, 4.00, 5.20, 6.80, 8.80, 11.40 麦穗（Pseudorasbora parva） 幼龄期（<30 d） 0.25 ± 0.02 2.5 ± 0.2 96 0.00, 2.40, 3.10, 4.00, 5.20, 6.80, 8.80, 11.40 鳅科 泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus） 幼龄期（<30 d） 0.70 ± 0.05 6.0 ± 0.5 96 0.00, 0.96, 1.16, 1.39, 1.67, 2.00, 2.40, 2.88 蛙科 泽蛙蝌蚪（Rana limnocharis） 幼龄期（<10 d） 0.20 ± 0.02 1.6 ± 0.2 96 0.00, 3.50, 4.60, 5.50, 7.80, 10.10, 13.20, 17.10 节肢动物门 溞科 大型溞（Daphnia magna） <24 h — — 48 0.00, 2.70, 3.60, 4.70, 6.20, 8.00, 10.40, 13.50 虾科 青虾（Macrobrachium nipponense） 幼龄期（<10 d） 0.25 ± 0.05 3.0 ± 0.2 96 0.00, 2.40, 3.10, 4.00, 5.20, 6.80, 8.80, 11.40 摇蚊科 摇蚊幼虫（Chironomus plumosus） 第3代（幼虫） 0.03 ± 0.01 1.0 ± 0.2 96 0.00, 2.70, 3.60, 4.70, 6.20, 8.00, 10.40, 13.50 环节动物门 颤蚓科 霍甫水丝蚓（Limnodrilus hoffmeisteri） 幼龄期（<10 d） 0.05 ± 0.01 1.5 ± 0.2 96 0.00, 3.40, 4.40, 5.70, 7.40, 9.60, 12.50, 16.20 腔肠动物门 水螅虫科 水螅属（Hydra sp.） 幼龄期（<10 d） 0.03 ± 0.01 1.0 ± 0.2 96 0.00, 1.39, 1.67, 2.00, 2.40, 2.88, 3.74, 4.87 | Show Table
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在急性毒性实验结束后，参考荧蒽对麦穗、泥鳅和大型溞的急性实验结果开展慢性实验，设空白对照组、助溶剂（二甲基亚砜, DMSO）对照组、浓度组，每组3个重复. 慢性实验的组次中，其最高浓度不得高于急性毒性LC50值. 受试液和喂食的频率为1 d，采用静态更新试液法. 慢性毒理学实验时间设置为：溞类不得少于21 d，麦穗、泥鳅不得少于8 d. 具体实验浓度设置如下：麦穗为0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22、1.59 mg·L−1 FLU；泥鳅为0.00、0.35、0.46、0.60、0.78、1.01、1.32 mg·L−1 FLU；大型溞为0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22、1.59 mg·L−1 FLU. 试验中需要记录的内容如下：大型溞的产卵数量、时间（第一窝及总数）、麦穗和泥鳅的生长指标（体重、体长等），以上数据每天记录一次.
1.3 数据搜集与分析
数据选自ELSEVIER数据库（http://www.sciencedirect.com）、US EPA ECOTOX 毒性数据库（http://cfpub.epa.gov/ecotox/）、和CNKI数据库（http://www.cnki.net）等. 在进行筛选数据时应满足以下要求：①数据无法使用的情况有：使用受权限、信息保密、测试信息不完全、由于其他因素而无法传播、试验缺少对照组、试验生物受污染、试验设计不科学等；②可以使用具有不稳定性质（易挥发、易水解、易降解）的物质进行试验，但一般仅可采用流水式试验的结果；③若慢性NOEC和LOEC值均出现在测试终点中，NOEC值的选取具有优先权[19]. 另外，对于水生植物，前人研究发现FLU对淡水藻[20]（Scenedesmus subspicatus）的96-h EC50为7.447 mg·L−1，本文选用此数据.
另外，实验数据的正态分布检验方法有如下两种：K-S检验、T检验. 本文选用前者检验表2中数据是否符合正态分布，检验结果表明美国水生生物毒性数据对FLU毒性敏感的总体分布情况是大致吻合的，符合正态分布（P =0.08＞0.05）.
表 2 FLU美国水生生物急性毒性数据Table 2. Acute toxicity data of FLU to American aquatic organisms排序 Rank 物种 Species （LC50/EC50）/（mg·L−1） t/h 1 美洲海螯虾 0.6 96 2 浅绛单孔蚓 0.7 96 3 俄勒冈虾 0.8 96 4 蓝鳃太阳鱼 20.9 96 5 斑点叉尾鮰 36.0 96 6 端足虫 44.0 96 7 非洲爪蟾 52.0 96 8 隐居蜾嬴蜚 54.0 96 9 沙蟹 74.0 96 10 虹鳟 91.0 96 11 呆头鲦鱼 118.3 96 12 宽纹北箭蜓 139.9 96 13 伸展摇蚊 250.0 96 | Show TableDownLoad:
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EC/LCx可通过概率单位直线回归法和95%置信区间来计算，按照测试标准所规定的浓度规定，若实测浓度与名义浓度的差值在20%以内，即可采用名义浓度，x值分别取50（急性毒性实验）和10（慢性毒性实验），通过在试验开始的前后，对溶液中的FLU浓度进行检测，对比检测结果后计算实测和名义浓度的比率，结果为90.03%—99.15%，满足要求[21]，因此本文在计算EC/LCx时，浓度采用名义浓度.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 急性毒性实验
表3显示了9种本土水生生物的急性毒性试验结果，其中空白对照组和助溶剂对照组在试验期间中没有出现死亡现象. 窗体顶端结果表明泥鳅对FLU暴露最为敏感，其96-h LC50为1.887 mg·L−1， 其次是水螅属、青虾、麦穗鱼、大型溞、锦鲤、霍甫水丝蚓和摇蚊幼虫，对FLU最不敏感的是泽蛙蝌蚪，其96-h LC50为8.695 mg·L−1.
表 3 FLU本土水生生物急性试验结果Table 3. Results of acute toxicity tests of FLU to resident aquatic organisms物种 Species 暴露时间/h Exposure time 公式 Formula R2 P LC50/（mg·L−1） 锦鲤 96 y = 3.4458x + 2.2589 0.9268 ＜0.01 6.251 （5.748—6.443） 泥鳅 96 y = 1.4976x + 4.5875 0.9436 ＜0.01 1.887 （1.594—2.258） 大型溞 48 y = 3.8675x –2.0147 0.9850 ＜0.01 5.487 （5.012—5.897） 青虾 96 y = 2.5612x + 3.7744 0.9089 ＜0.01 3.011 （2.412—3.647） 霍甫水丝蚓 96 y = 1.5825x + 3.7347 0.9065 ＜0.01 6.313 （5.688—6.578） 麦穗 96 y = 1.6443x + 3.8262 0.854 ＜0.01 5.177 （4.231—5.593） 摇蚊幼虫 96 y = 2.3053x + 2.9664 0.9243 ＜0.01 7.628 （7.390—8.159） 水螅属 96 y = 1.3879x + 1.9976 0.9017 ＜0.01 2.032 （1.785—3.074） 泽蛙蝌蚪 96 y = 1.9267x + 3.1911 0.9044 ＜0.01 8.695（8.393—90.145） | Show TableDownLoad:
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2.2 慢性毒性数据
在慢性毒性实验中各试验浓度组均未出现死亡现象. 对于慢性毒性数据（表4），Barata等[22]研究表明大型溞的存活率21-d NOEC为0.937 mg·L−1，这一结果与本试验中大型溞总繁殖数量的21-d EC10为0.881 mg·L−1十分接近. 根据表4，对于大型溞，对FLU暴露的产卵总数量试验终点相比于其存活率，表现出更为敏感的趋势. 在慢性毒性试验中，3种水生生物中对FLU暴露的敏感性最低的为大型溞，最高的为泥鳅. 结果表明泥鳅在急性与慢性实验中，对FLU暴露都表现出最高的敏感性.
表 4 FLU本土水生生物慢性试验结果Table 4. Results of chronic toxicity tests of FLU to resident aquatic organisms.物种 Species 暴露时间/d Exposure time 终点 Endpoint 公式 Formula R2 P EC10/（ mg·L−1） 锦鲤 28 生长（t/d） y = 4.5521x +2.8004 0.9930 ＜0.01 0.798 泥鳅 28 生长（t/d） y = 5.3131x –1.989 0.9743 ＜0.01 0.269 大型溞 28 生长（t/d） y = 4.7745x+ 1.667 0.8971 ＜0.05 1.187 第一窝时间 （t/d） y = 2.8499x+ 1.525 0.9572 ＜0.01 1.243 第一窝数量 （n） y = 3.8261x+ 0.657 0.9315 ＜0.01 0.987 总数量 （n） y= 3.7966x+ 1.0801 0.9203 ＜0.01 0.881 总窝数 （n） y= 3.7450x+ 1.4623 0.9364 ＜0.01 1.471 | Show TableDownLoad:
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2.3 基于本土与美国生物毒性数据拟合SSD曲线比较
Davies等提出“灵活使用毒性数据”的设想[23]，即在某一地区进行生态风险评估时，可使用其他地区的生物毒性数据. 但由于不同地区的水中溶解氧浓度、水温差别较大，且不同种类生物对于相同有害物质的敏感程度也各不相同[24]，因此这一设想在提出后受到多方面质疑. 本研究将本地（表2）和美国（表3）的生物毒性数据进行SSD曲线拟合，并进行比较讨论，探讨 "灵活使用毒性数据 "这一概念的可行性. 受限于相对缺少慢性数据，本研究仅采用急性毒性数据. 本研究以本土、美国、本土+美国的FLU毒性数据为基础，共得出3条SSD拟合曲线（图1）. 在对FLU暴露的敏感性方面，图中本土数据（黑）、总体数据（蓝）与美国数据（红）从左到右存在显著的位移分布，意味着美国生物比本土生物表现出更加敏感的趋势. 经过计算，总体数据、本土数据及非本土数据三条曲线的HC5值分别是1.527、1.869、2.142 mg·L−1.
图 1 FLU本土、美国及全部生物毒性数据SSD曲线拟合比较Figure 1. Species sensitivity distribution of native, American and all species toxicity data for FLUTwo-sample Kolmogorov-Smirnov（K-S test）检验常用于数学统计中，可用于对两样本总体分布差异性的检验[24]. 利用此方法，研究美国毒性数据和本土毒性数据是否存在较为明显的不同具有十分重要的学术和科学意义：若二者差异明显，则在本土进行相关的基准阈值研究时，应选取本土水生生物；若二者较为一致，那么证明美国水生生物毒性数据可用于本土基准阈值的推导过程，从而降低受试生物的消耗以及节省资源的投入. K-S结果如下：（ks = 1.342, n1 = 9, n2 = 13, P = 0.01）. P= 0.0114<0.05，按a=0.05水准，结果表明两组数据在FLU毒性敏感的总体分布上并为呈现较高的一致性，两组数据之间存在的差异十分显著（图1）. 另外，由于浮游类不被包含在非本土生物毒性数据中，因此在本土生物数据中浮游类大型溞的毒性数据暂时去除之后，对数据再次进行K-S检验，两者之间仍然存在较为显著的差异（ks= 0.830, n1 = 8, n2= 13, P = 0.0183）. 因此我们可以初步判断本土对FLU的敏感性与非本土生物有着较大差别，需要进一步开展针对本土化的相关研究工作（图1）.
2.4 FLU水生生物水质基准阈值推导
以实测数据为基础，在计算FLU水生生物基准阈值时，本文采用了USEPA“指南”推荐的SSR方法[15]，9种本土物种的SMAV值和GMAV值及其排序如表5所示，CMC（FLU的急性基准阈值）=FAV/评价因子，其中FAV取1.141 mg·L−1，评价因子通常取值为2，最后计算出我国FLU的急性基准阈值结果为0.570 mg·L-1[25-26]. 鉴于我国FLU慢性毒性数据较少，FCV值可通过“指南”所推荐的方法计算，即FCV=FAV/FACR，FACR的值是3种水生生物SACR的几何平均值（如表所示，3种水生生物的SAVR值分别为：大型溞6.23、麦穗6.49、泥鳅7.01），最终计算得出FACR值为6.57，FCV值为0.174 mg·L−1，已知淡水藻的FLU植物毒性值为7.447 mg·L−1，远远大于计算所得的FCV值，因此对植物的保护作用得到验证[27]. CCC的确定按“指南”所指出的方法，即由FPV、FCV和FRV三者中最小的值所确定[28]. 相比于动物，植物的敏感性要低得多，且我国缺少相应的BCF和MPC值，因而CCC可直接通过FCV值计算，在很多情况下FRV则不被考虑，最后计算出我国FLU的慢性基准阈值CCC为0.174 mg·L−1.
表 5 FLU水生生物种平均值及急慢性比Table 5. Ranked GMAVs with SACRs.排序 Rank 物种 Species SMAVs/（mg·L−1） GMAVs/（mg·L−1） SACRs 来源 Source 1 泥鳅 1.887 1.887 7.01 本研究 2 水螅属 2.032 2.032 本研究 3 青虾 3.011 3.011 本研究 4 麦穗 5.177 5.177 6.49 本研究 5 大型溞 5.487 5.487 6.23 本研究 6 锦鲤 6.251 6.251 本研究 7 霍甫水丝蚓 6.313 6.313 本研究 8 摇蚊幼虫 7.628 7.628 本研究 9 泽蛙蝌蚪 8.695 8.695 本研究 植物 淡水藻 7.447 7.447 [20] | Show TableDownLoad:
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另外，本文也对比了FLU对美国水生生物的毒性. 例如，本研究中本土代表性鱼类敏感性相对较高，泥鳅、麦穗鱼和锦鲤的96-h LC50分别为1.887、5.177、6.251 mg·L−1 FLU，而作为非本土鱼类的蓝鳃太阳鱼[29]、斑点叉尾鮰[30]、虹鳟[31]和呆头鲦鱼[32]的96-h LC50分别为20.90、36.00、91.00、118.3 mg·L−1 FLU，数值不在一个数量级，本土鱼类更加敏感；已经报道的非本土两栖类动物非洲爪蟾[33]的96-h LC50为52.00 mg·L−1FLU，远远高于本土两栖类泽蛙蝌蚪的实测值（8.695 mg·L−1 FLU）；本土底栖动物节肢动物门的摇蚊幼虫96-h LC50为7.628 mg·L−1 FLU，而已报道的非本土昆虫类生物是端足虫[30]和伸展摇蚊[34]，96-h LC50分别为44.00 mg·L−1和250.00 mg·L−1 FLU，差异较为明显，本土节肢动物门相对敏感. 综上所述，可以确定本土水生生物中鱼类、两栖类对FLU和底栖节肢动物门比非本土同类生物更加敏感.
本土底栖动物中环节动物门受试生物为霍甫水丝蚓，96-h LC50为6.313 mg·L−1 FLU，非本土浅绛单孔蚓[30]96-h LC50为0.700 mg·L−1 FLU，此外还有底栖甲壳类生物差异较大，本土青虾96-h LC50为3.011 mg·L−1FLU，而非本土底栖甲壳类动物美洲海螯虾[35]和俄勒冈虾[35]96-h LC50相对较低，为0.600 mg·L−1及0.800 mg·L−1 FLU. 因此可以确定非本土水生生物中底栖环节动物及甲壳类动物对FLU比本土生物更加敏感.
另外，借助荷兰RIVM公布的ETX2.0软件及逻辑斯蒂SSD曲线求出HC5值，分别是1.657 mg·L−1和1.869 mg·L−1. 因此当评价因子取值为2时，CMC在这两种SSD曲线下，计算的结果分别为0.829 mg·L−1和0.935 mg·L−1，上文采用US EPA“指南”中推荐的SSR法计算的CMC值为0.570 mg·L−1，由此可见，计算结果都同在一个数量级.
3. 结论（Conclusion）
（1） 基于US EPA“指南”推荐的方法，荧蒽本土水生生物急性基准阈值（CMC）为0.570 mg·L−1，慢性基准阈值（CCC）为0.174 mg·L−1；另外，通过荷兰RIVM公布的ETX2.0软件及欧盟推荐的SSD方法所得的基准阈值与本文所得结果（SSR方法得出）在数量级上一致，本文结果得到验证.
（2） 在敏感性方面，通过比较分析本土与美国物种的一致性较低，说明在进行我国荧蒽水生生物基准阈值的推导时，可利用美国水生生物毒性数据的概率很小.
致谢：感谢中国环境科学研究院刘征涛研究员在文章修改中给予的帮助.
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图 1 沉积物、水体和鱼细菌群落多样性分析
Figure 1. Analysis of bacterial diversity in sediment, water and fish
图 2 沉积物、水体和鱼细菌群落组成间的差异
Figure 2. Differences of bacterial community composition in sediment, water and fish
图 3 砷和鱼对水体和沉积物细菌多样性的影响
Figure 3. Effects of arsenic and fish on bacterial diversity in water and sediment samples
图 4 砷和鱼活动对水体和沉积物细菌组成的影响
Figure 4. Effects of arsenic and fish on bacterial community composition in water and sediment（Heatmap, a. water, b. sediment）
表 1 本实验体系的基本理化性质
Table 1. The basic physicochemical properties in this experimental system
体系Systems 指标Index C C-F As As-F 沉积物 pHN/%C/%As/ （mg·kg−1） 7.85 ± 0.0 a 7.87 ± 0.0 a 7.78 ± 0.0 a 7.86 ± 0.0 a 0.12 ± 0.1 a 0.13 ± 0.0 a 0.13 ± 0.01 a 0.13 ± 0.0 a 1.58 ± 0.0 a 1.56 ± 0.0 a 1.59 ± 0.0 a 1.60 ± 0.1 a 12.5 ± 0.2 b 12.6 ± 0.1 b 18.0 ± 0.2 a 17.5 ± 0.5 a 水体 pHAs/（μg·kg−1） 9.19 ± 0.0 b 10.1 ± 0.0 a 9.31 ± 0.1 b 10.2 ± 0.1 a 2.16 ± 0.1 b 2.27 ± 0.1 b 31.1 ± 1.2 a 29.6 ± 0.5 a 鱼 As/（mg·kg−1） — 0.19 ± 0.02 b — 0.34 ± 0.02 a 注：C表示空白对照组；C-F表示添加鱼的无污染组；As表示添加砷的无鱼处理组；As-F表示添加砷和鱼的处理组. 所有数据均以“均值 ± 标准差”表示，不同字母（ab）表示数据在四个处理间在0.05水平上存在显著差异. “—”表示无数据. Note: C represents the control treatment; C-F represents the control group with fish added; As represents the fish-free treatment with arsenic added; As-F represents the treatment with arsenic and fish added. All data are presented as “mean ± standard deviation”, and different letters （ab） indicate significant differences at the 0.05 level among the four treatments. “—” indicates no data.
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