微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述

苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
引用本文: 苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
Citation: SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108

微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述

    通讯作者: Tel:15751868275,E-mail:liuxue20088002@126.com
  • 基金项目:
    国家重点研发计划项目(2018YFC1800504),国家自然科学基金(41867066,41907129),云南省自然科学基金(2019FB032)和云南省高端外国专家项目(YNQR-GDWG-2018-017)资助

Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review

    Corresponding author: LIU Xue, liuxue20088002@126.com
  • Fund Project: the State Key Basic R & D Program of China (2018YFC1800504), National Natural Science Foundation of China (41867066, 41907129), Natural Science Foundation of Yunnan (2019FB032) and Outstanding Foreign Expert of Yunnan (YNQR-GDWG-2018-017)
  • 摘要: 有机磷是土壤磷的主要存在形式,占比40%—90%,是作物磷营养的重要来源和储备库,亦是引起水体富营养化的潜在因子。磷作为植物生长发育的必需大量营养元素,通常以无机磷肥形式施用于土壤,易吸附于土壤表面或与钙、镁、铝、铁等金属阳离子形成难溶性络合物,导致其生物可利用性降低,其中20%—80%磷肥转化为有机磷,不易被植物吸收利用。矿化作用是在土壤微生物作用下,土壤中有机态化合物转化为无机态化合物的总称。土壤中有机磷主要以植酸及其盐类形式存在(占比50%—70%),植酸(盐)可被专一性酶(植酸酶)矿化水解为肌醇和磷酸(盐),并释放出无机磷,以供植物的根系直接吸收和利用。前期研究发现,缺磷胁迫下微生物可大量分泌植酸酶分解植酸,释放磷酸根,促使土壤有机磷水解矿化为无机磷,提高了土壤有机磷的生物可利用率。目前关于微生物植酸酶矿化植酸的研究多集中于谷类作物和动物营养,对土壤植酸矿化与土壤有机磷利用的综述性报道较少。因此,本文主要关注微生物植酸酶对土壤植酸的矿化作用与土壤有机磷利用,重点阐述其过程、机制和效率,包括微生物植酸酶的种类来源、酶学性质、作用机理和实际应用等方面的研究进展,可为提高土壤有机磷的生物利用效率、减少农业磷肥施用量、降低土壤磷流失及水体污染风险提供理论依据和技术支撑,为深入探究植酸酶功能并应用于农业生产实践及保障生态环境安全提供基础信息和参考。
  • 钴白合金是铜钴矿深加工过程中的副产物,由于钴的存在,使得该合金具有良好的硬度及耐热性[1]。钴白合金的成分基本为钴、铜、铁,其他元素的含量极低[2]。我国可利用的钴矿石资源较少,大部分钴矿石依赖进口[3]。世界上最主要的钴资源是刚果(金)和赞比亚的铜钴矿,一般含钴品位为0.1%~0.5%,高品味的可达到2%~3%。但是,其副产物钴白合金中钴的含量可达10%左右;此外,在钴白合金中,还含有大量的铜、铁等元素,使其具有较高的回收价值[1-5]

    目前,钴白合金的回收处理工艺主要有火法、湿法和微生物浸出等[6]。火法处理的常规工艺为造渣熔炼-浸出工艺[7]。该工艺先通过向钴白合金中掺入碳酸钙等配料,之后再在高温下焙烧,以实现钴、铜与其他杂质金属的分离,最终通过硫酸酸浸得到钴和铜的浸出液。但是,火法处理的能耗较高,操作也相对复杂,而且对有价金属的回收不彻底[8-9]。湿法处理主要有常压氧化酸浸法[10]、加压氧化酸浸法[11]、机械活化-酸浸法[12]、电化学溶解法[13]。相比于火法处理,湿法处理能耗低,但是对于处理设备的要求较高,同时也会产生一定的环境污染。有研究结果表明,使用微生物浸出钴白合金可实现钴、铜的高效回收[14]。胡国宏等[15]使用A.f菌(氧化亚铁硫杆菌)进行钴白合金的浸出,钴和铜的浸出率分别可以达到了99.5%和99.0%,而且浸出率高、成本低。

    本研究通过消解分析钴白合金中各种金属的含量,初步估计其资源化利用的价值;并通过梯度实验探究接触浸出和非接触浸出的最佳固液比,以选出最佳工艺的最佳处理条件;最终,通过接触浸出和非接触浸出实验结果的对比分析,探究这2种方法对钴白合金中钴和铜的浸出机理。

    供试钴白合金来源于河南某有色冶炼厂。盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、高氯酸 (HClO4)、氢氟酸(HF)、硫磺(S)、黄铁矿(FeS2)、硫酸铵((NH4)2SO4)、磷酸二氢钾 (KH2PO4)、无水氯化钙 (CaCl2)、七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)、醋酸(HOAc)、盐酸羟胺(NH2OH·HCl)、双氧水(H2O2)、醋酸铵(NH4OAc)均为分析纯。

    电感耦合等离子发射光谱仪(OPTIMA 8300,珀金埃尔默股份有限公司)用于测定溶液中金属元素的浓度;X射线衍射仪(VG MK II,英国VG公司)用于分析固体样品的晶体结构;扫描电子显微镜SEM(Quanta FEG 250,美国FEI公司)用于观察固体样品的微观形貌;电热恒温鼓风干燥箱(DHP-9032,上海一恒科学仪器有限公司);pH计(DELTA320,梅特勒-托利多仪器有限公司);恒温水浴振荡器(THZ-82,金坛市荣华仪器制造有限公司)用于培养混合菌液。

    将钴白合金置于电热恒温鼓风干燥箱中105 ℃烘干至恒重,粉碎研磨,过100目筛筛分后备用。钴白合金的金属含量测定采用三酸消解法[1, 16],目标金属的赋存形态采用BCR连续萃取法[17-19]

    取若干容积为250 mL的锥形瓶,先分别加入85 mL无机盐培养基[20-23](2.0 g·L−1 (NH4)2SO4、1.0 g·L−1 KH2PO4、0.25 g·L−1 CaCl2、0.5 g·L−1 MgSO4·7H2O)、0.8 g硫磺、0.8 g黄铁矿;之后,接入At、Af、Lf菌液[24-25]各5 mL;透气膜封口后,置于恒温水浴振荡器中,在35 ℃条件下,以135 r·min−1振荡,培养至体系pH下降至0.8,便可用于生物淋滤实验。

    将培养稳定的菌液高速离心后,使菌体和生物酸分离。向pH为0.8的生物酸中直接加入钴白合金样品,并置于恒温水浴振荡器中,在35 ℃、135 r·min−1的条件下反应24 h,此为非接触淋滤实验[26-28]。该浸出过程无细菌参与。设定淋滤的固液比(g∶mL)为1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100,每个梯度做3个平行实验。反应结束后,测定上清液中目标金属浓度。

    按照上述最优淋滤效果对应的固液比,做非接触循环富集实验。浸出完成后,通过抽滤实现固液分离;向上清液中加入之前分离出的菌体,密封;之后,于恒温水浴震荡器中,培养条为35 ℃、135 r·min−1,培养至体系pH下降至0.8;再进行非接触淋滤实验。如此循环淋滤10次,之后测定每次淋滤后上清液中的目标金属浓度。

    向pH已达到0.8的菌液中直接加入钴白合金,置于恒温水浴震荡器中,在35 ℃、135 r·min−1条件下培养,隔天取样测钴、铜的浸出浓度,此为接触淋滤[26-28]。在该过程中,生物酸和细菌同时参与浸出。设定淋滤的固液比(g∶mL)为1∶100、2∶100、3∶100、4∶100。每个梯度做3个平行实验。在反应的第1、3、5、7、9 d取上清液测定目标金属浓度。

    钴白合金样品中的金属种类及含量如表1中所示。其中,钴百合金中含铜量为10.81%、钴为13.66%、铁为20.53%,即有一定的回收价值。但该样品中铁含量过高,在浸出过程中会产生铁钒沉淀,会影响铜、钴的浸出效果。因此,为设计出更加合理的浸出工艺参数,使用BCR连续萃取技术处理钴白合金,以分析其中钴、铜、铁的金属赋存形态[18],所得结果如图1所示。如图1所示,钴白合金中的钴、铜、铁均不存在硫化物及有机结合态。其中,钴的存在形态为酸溶态(46.27%)和氧化物结合态(53.73%);铜的存在形态为酸溶态(7.86%)、氧化物结合态(78.84%)、残渣态(13.3%);铁的存在形态全部为酸溶态。通过BCR实验结果可知,在生物淋滤过程中,样品中的钴通过生物酸中氢离子的作用,基本上可以被完全浸出;铜的浸出除了生物酸的作用外,还需要一定的氧化反应,并可通过菌体的接触实现残渣态铜的浸出。

    表 1  钴白合金中的金属元素种类及含量
    Table 1.  Types and contents of metal elements in cobalt white alloy %
    CuCoFeNiMnZnAs
    10.8113.6020.530.370.370.080.01
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    图 1  钴白合金中铜、钴、铁的赋存形态分析
    Figure 1.  Chemical morphology of Cu, Co and Fe of cobalt white alloy

    钴白合金样品的XRD谱图如图2所示。从图中可以看出,钴白合金在43°和45°有2个非常明显的峰值。通过与标准图谱卡片PDF#50-0795和PDF#85-1326[29]对比可知,钴白合金中所含的晶体成分主要为钴铁的合金态Co7Fe3和单质铜Cu。

    图 2  钴白合金的XRD图谱
    Figure 2.  XRD patterns of cobalt white alloy

    通过SEM能够直接观察钴白合金的形貌特征、颗粒尺寸,由图3可知,钴白合金的形状均为不规则的球体和长方体,粒度较小,分布均匀[30]

    图 3  钴白合金的SEM图
    Figure 3.  SEM micrographs of cobalt white alloy

    采用At、Af、Lf这3种菌株的混合培养体系,在35 ℃下连续培养,菌体数量在培养至11 d时增长至3.42×108 个·mL−1,菌液的pH从2.0降至0.8(图4)。这是因为,At菌将能源底物中的硫磺转化成了硫酸和供自身生长所需的能量[31]。直接向该菌液中加入钴白合金为接触浸出,该过程具有生物酸和菌体的共同作用;将菌液中的菌体通过高速离心去除,留下pH为0.8的生物酸浸出钴白合金为非接触浸出,该过程无菌体作用。

    图 4  细菌生长过程中体系的pH、菌数变化
    Figure 4.  Changes in pH and bacterial count of the system during bacterial growth

    图5中可以看出,随着培养时间的延长,菌液中的Fe3+质量浓度不断升高,Fe2+质量浓度极少。这是因为,Af、Lf氧化分解黄铁矿获取能量生长的过程中,伴随着氧化生成了Fe3+;同时,黄铁矿中分解出的硫被At菌转化成硫酸而进入体系中[32-34]

    图 5  细菌生长过程中体系的Fe3+、Fe2+浓度变化
    Figure 5.  Changes of Fe3+ and Fe2+ concentration in the system during bacterial growth

    经非接触浸出1 d后,测得不同固液比下目标金属铜和钴的浸出率如图6所示。随着固液比的升高,钴和铜的浸出率均逐渐下降。从非接触浸出钴白合金的实验中可以看出,最优固液比为1%,在pH为0.8的生物酸下,钴白合金中的酸溶态和氧化物结合态的钴能够100%浸出,其浸出液质量浓度为1 356.14 mg·L−1;而铜的浸出率为77.42%,浸出液质量浓度为837.19 mg·L−1

    图 6  不同固液比下非接触浸出钴白合金中钴铜的浸出率
    Figure 6.  Target metal leaching rate of non-contact bioleaching of cobalt white alloy at different solid-liquid ratios

    将1%固液比下的浸出渣多次水洗后,分析浸出渣中铜、钴、铁的赋存形态。由图7可以看出,浸出渣中未检测出钴;残留的铜中含有48.84%的氧化物结合态和51.15%的残渣态;铁被浸出后,又生成了铁钒沉淀进入了残渣态。因此,在浸出过程中,可先将样品中的钴优先浸出到溶液中;将铜留存在渣相中,富集后再次浸出,以实现钴白合金浸出过程中的铜、钴分离。

    图 7  固液比1%下钴白合金浸出渣中铜、钴、铁的赋存形态分析
    Figure 7.  Chemical morphology of Cu, Co and Fe of cobalt white alloy leaching slag under 1% solid-to-liquid ratio

    固液比1%下非接触循环第1次到第10次溶液中,铜和钴的质量浓度如图8所示。由图8可知,在循环的过程中,溶液中铜和钴的质量浓度基本呈倍数上升;而且,在实验过程中可以观察到,溶液的颜色有着明显的加深。循环到第10次时,溶液中钴的质量浓度可达12 877.25 mg·L−1,铜的质量浓度可达7 358.67 mg·L−1

    图 8  固液比1%下非接触不同循环次数下钴白合金中钴铜的浸出浓度
    Figure 8.  Concentration of cobalt white alloy target metal leaching with the number of cycles under 1% solid-to-liquid Ratio

    不同固液比下,接触浸出钴白合金中钴和铜的浸出率如图9所示。从不同固液比的接触浸出实验中可以看出,钴白合金中钴的浸出效果要明显优于铜的浸出效果。在接触浸出1 d,随着固液比的升高,铜和钴的浸出率逐渐下降。但浸出7 d,在固液比3%下的接触浸出过程中,钴白合金中的钴和铜依然能够完全浸出。

    图 9  不同固液比下接触浸出钴白合金中钴和铜的浸出率
    Figure 9.  Co and Cu leaching rate of contact bioleaching of cobalt white alloy at different solid-liquid ratios

    在非接触浸出实验中,在固液比1%下,仅生物酸作用,浸出反应1 d,钴100%浸出,铜浸出77.42%。这一结果与接触浸出实验中,在生物酸和细菌的双重作用下,浸出反应1 d的浸出效果基本一直。由于钴白合金的加入,抑制了菌体的生长,菌体数量降至2.41×108个·mL−1。但随着浸出时间的延长,菌体逐渐适应了周围的浸出环境,菌体逐渐生长,在浸出5 d时生长到了3.26×108个·mL−1,基本与接触浸出前的菌数一致(图10(b)),从而代谢出了新的生物酸(图10(a))。从图11接触浸出过程中Fe3+的浓度变化可以看出,随着浸出时间的延长,在固液比1%下,浸出3 d,Fe3+的质量浓度降到最低403.67 mg·L−1,铜达到100%浸出。3 d后,Fe3+的浓度逐渐上升。这是因为,铜的浸出需要Fe3+的参与;同时,在Af和Lf的作用下,将生成的Fe2+氧化生成Fe3+[35]。因此,提高接触浸出的固液比,并在足够的额浸出时间下,当铜的浸出所消耗Fe3+的速度与细菌氧化Fe2+成Fe3+的速度一致时,即浸出完全。

    图 10  接触浸出过程中pH和菌数的变化
    Figure 10.  Changes in pH and bacterial count during contact leaching process
    图 11  接触浸出过程中Fe3+浓度的变化
    Figure 11.  Change of Fe3+ concentration during contact leaching

    通过对比接触浸出和非接触浸出钴白合金的结果,并结合钴白合金中的金属赋存形态以及钴白合金淋滤前后的XRD图谱变化,可以推测出钴白合金中铜和钴的浸出机理。图12为钴白合金淋滤前后的XRD对比图,可见,淋滤前钴白合金XRD衍射图谱中有较为明显的吸收峰;淋滤后钴白合金XRD衍射图谱中几乎没有吸收峰,这表明钴铁合金和单质铜的结构被破坏[14]。此外,经生物淋滤处理后的钴白合金的硬度有着明显的下降,表面也更加疏松,均表明其结构发生了改变。

    图 12  钴白合金淋滤前后的XRD图谱
    Figure 12.  XRD patterns of cobalt white alloy before and after leaching

    在接触浸出1 d后,对不同固液比下的浸出渣中的钴、铜做金属赋存形态(图13)进行了对比分析。由图13(a)可知,随着固液比的升高,钴的浸出率逐渐降低,浸出渣中残余的钴也越来越多。经与原样中钴的对比可以看出,酸溶态的钴被优先浸出到溶液中,而浸出渣中残留的钴均为氧化物结合态。随着浸出时间的延长,体系内的细菌逐渐适应了周围的生存环境,持续代谢出新的生物酸,从而将浸出渣中的钴浸出到溶液中[36]

    图 13  不同固液比下接触浸出第1天残渣中金属赋存形态变化
    Figure 13.  Changes of metal forms in residues on the first day of contact leaching with different solid-to-liquid ratios

    同样,由图13(b)可知,随着固液比的升高,铜的浸出率也在逐渐降低。与原样对比,酸溶态的铜也被率先浸出到溶液中,浸出渣中剩余的铜为氧化物结合态和残渣态,该形态的浸出需要Fe3+的参与,最终生成Cu2+和Fe2+进入溶液中[37]。而随着浸出时间的延长,溶液中的Fe2+被细菌又逐渐氧化成Fe3+,Fe3+继续与固相中的铜发生反应,直至Fe3+的生成速率大于其反应的消耗速率时,整个铜的浸出反应达到完全。

    1)钴白合金中所含有价金属主要为铜、钴和铁,而且含量均很高(均在10%以上),资源化利用潜力巨大。铜和钴大部分以酸溶态和氧化物结合态存在,适宜于生物淋滤处理。

    2)非接触浸出钴白合金的最适固液比为1%,此时钴可100%浸出,铜浸出率为77.42%。非接触循环富集进行10次,最终浸出液中钴的质量浓度可达12 877.25 mg·L−1、铜的质量浓度可达7 358.67 mg·L−1

    3)钴白合金在接触浸出中,随着浸出时间的延长,铜和钴最终均能完全浸出。从浸出渣中钴和铜的赋存形态可以看出,钴浸出仅需生物酸的作用,铜的浸出除了需生物酸作用,还需Fe3+的参与。在菌体的直接作用下,浸出体系内部形成了Fe3+的生成和消耗的循环,以供给铜浸出。

  • 图 1  植酸分子结构式、植酸酶蛋白结构式(A)[12]及植酸循环过程(B)

    Figure 1.  Phytic acid molecular structure and phytase protein structure (A)[12] and the cycle of phytate (B)

    图 2  微生物植酸酶矿化植酸途径[112]

    Figure 2.  The pathway of phytate mineralization by microbial phytase[112]

    表 1  微生物植酸酶种类及其植酸矿化机制

    Table 1.  Microbial phytase species and phytate mineralization mechanisms

    分类方式Classification methods植酸酶种类Phytase species结构特征Structural properties植酸矿化机制Phytate mineralization mechanisms微生物Microbes参考文献References
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)[40]
    淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus[41]
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii[42]
    光岗菌(Mitsuokella multiacidusMitsuokella jalaludinii[42-43]
    6–植酸酶(EC 3.1.3.26)含有共同的活性位点保守序列RHGXRXP从肌醇6-C位启动脱磷酸化大肠杆菌(Escherichia coil[19]
    催化机制组氨酸酸性磷酸酶(HAP)N-末端基元:RHGXRXPC-末端基元:HDN-末端基元RHGXRXP中组氨酸(H)残基亲核攻击磷酸基团形成一个共价磷酸-组氨酸中间体,然后C-末端基元HD中天冬氨酸(D)残基向即将断裂的磷酸单酯键的氧原子提供质子,磷酸-组氨酸中间体水解消耗一分子水游离出磷酸基团,反应过程无需金属离子参与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae[44]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena[48]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus[50]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans[51]
    普氏菌属(Prevotella sp.)[52]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae[53]
    草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi[54]
    密螺旋菌体属(Treponema sp.[52]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia[55]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii[56]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger[58]
    β螺旋植酸酶(BPP)主要由β-折叠片组成,形状类似6叶β螺旋桨BPP具有2个不对称磷酸基团结合部位,“切割部位”(Cleavage site,CS)和“亲和部位”(Affinity site,AS),AS促进植酸分子结合,而CS负责水解磷酸基团解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloquefaciens[59]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis[60]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis[61]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[62]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii[63]
    半胱氨酸植酸酶(CP)包含活性部位基元HCXXGXXR(T/S)活性部位形成一个含保守半胱氨基酸(C241)的磷酸基团结合环(Phosphate-binding loop,P-loop),其中C241的不可逆氧化使P-loop由非活性的开放构象转变为活性的闭合构象,P-loop充当特异底物的结合环,其深度决定底物的特异性。CP有一个较深的P-loop,能适应植酸分子充分磷酸化而呈负电性的肌醇环,有利的静电环境促进底物植酸分子分解反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium[64]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[65]
    催化机制紫色酸性磷酸酶(PAP)包含特有的7个金属配合氨基酸残基,7个残基(D、D、Y、N、H、H、H)包含在5个保守基元中(DXG/GDXXY/GNH(ED)/VXXH/GHXH)PAP包括具有植酸酶活性的蛋白AtPAP15能够降低植酸含量伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)[66]
    分类方式Classification methods植酸酶种类Phytase species结构特征Structural properties植酸矿化机制Phytate mineralization mechanisms微生物Microbes参考文献References
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)[40]
    淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus[41]
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii[42]
    光岗菌(Mitsuokella multiacidusMitsuokella jalaludinii[42-43]
    6–植酸酶(EC 3.1.3.26)含有共同的活性位点保守序列RHGXRXP从肌醇6-C位启动脱磷酸化大肠杆菌(Escherichia coil[19]
    催化机制组氨酸酸性磷酸酶(HAP)N-末端基元:RHGXRXPC-末端基元:HDN-末端基元RHGXRXP中组氨酸(H)残基亲核攻击磷酸基团形成一个共价磷酸-组氨酸中间体,然后C-末端基元HD中天冬氨酸(D)残基向即将断裂的磷酸单酯键的氧原子提供质子,磷酸-组氨酸中间体水解消耗一分子水游离出磷酸基团,反应过程无需金属离子参与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae[44]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena[48]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus[50]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans[51]
    普氏菌属(Prevotella sp.)[52]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae[53]
    草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi[54]
    密螺旋菌体属(Treponema sp.[52]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia[55]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii[56]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger[58]
    β螺旋植酸酶(BPP)主要由β-折叠片组成,形状类似6叶β螺旋桨BPP具有2个不对称磷酸基团结合部位,“切割部位”(Cleavage site,CS)和“亲和部位”(Affinity site,AS),AS促进植酸分子结合,而CS负责水解磷酸基团解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloquefaciens[59]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis[60]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis[61]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[62]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii[63]
    半胱氨酸植酸酶(CP)包含活性部位基元HCXXGXXR(T/S)活性部位形成一个含保守半胱氨基酸(C241)的磷酸基团结合环(Phosphate-binding loop,P-loop),其中C241的不可逆氧化使P-loop由非活性的开放构象转变为活性的闭合构象,P-loop充当特异底物的结合环,其深度决定底物的特异性。CP有一个较深的P-loop,能适应植酸分子充分磷酸化而呈负电性的肌醇环,有利的静电环境促进底物植酸分子分解反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium[64]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[65]
    催化机制紫色酸性磷酸酶(PAP)包含特有的7个金属配合氨基酸残基,7个残基(D、D、Y、N、H、H、H)包含在5个保守基元中(DXG/GDXXY/GNH(ED)/VXXH/GHXH)PAP包括具有植酸酶活性的蛋白AtPAP15能够降低植酸含量伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)[66]
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    表 2  微生物植酸酶的酶学性质

    Table 2.  The enzymatic properties of microbial phytase

    微生物Microbes最适温度/℃Temperature optimum最适pHpH optimum分子量/(KDa)Molecular weightKm/(μmol)特异性酶活性/(U·mg−1)Specific activity参考文献References
    细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens7042[67]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis606—6.536—385008.7[68]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis55, 654.5—644, 47[69]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)7074455020[70]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii504474601122[63]
    大肠杆菌(Escherichia coli604.542130811[71]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)507—7.5700[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes10—13[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae504[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena58540300205[72]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca555–6[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus40–454.945340310[56]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans604.542340140[73]
    构巢裸壳孢菌(Emericella nidulans6.56629–33[62]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae405.5453802.514[53]
    左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus707–841–4612.69[74]
    戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus50569[75]
    植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum655.5520.463[76]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)5, 7[27]
    绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa505–8[27]
    反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium50–554–5.5460.6[77]
    克雷伯菌属(Klebsiella sp.)37610–13200062.5[78]
    蜡孔菌属(Ceriporia sp.)40–605–659700 ± 80[79]
    绒毛拴菌(Trametes pubescens40–605–6621210 ± 30[79]
    弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii522.7, 5[80]
    无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus6413[81]
    细菌疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus75652110[82]
    嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila625.5[83]
    嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus128[83]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia554.5453960[55]
    克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristeensenii554.5[84]
    香蕉狄克氏菌(Dickeya paradisiaca554.5, 5.5[85]
    旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis454[86]
    真菌曲霉菌属(Aspergillus sp.)70[8]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum632.568271.1[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger65584100103[58]
    炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius534.7[87]
    土曲霉菌(Aspergillus terrus704.56011142[62]
    烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus60643[88]
    产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum2.86[89]
    简青霉菌(Penicillium simplicissimum603.5–5.3653.8[90]
    草酸青霉菌(Penicillium oxalicum554.562.5370307[91]
    枝孢霉菌属(Cladosporium sp.)403.532.615.2910[92]
    米根霉菌(Rhizopus oryzae554.5[93]
    少孢根霉菌(Rhizopus oligosporus554.51509.47[94]
    微小根毛霉菌(Rhizomucor pusillus705.4[95]
    嗜热侧孢霉菌(Sporotrichum thermophile585[96]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii50–554–4.5721001080 ± 110[56]
    米曲霉菌(Aspergillus oryzae505.51203300.35[97]
    酵母菌克鲁斯假丝酵母(Candida krusei402.5, 5.5330301210[98]
    毕赤酵母菌(Pichia pastoris602.5, 5.59525–65[99]
    异常毕赤酵母菌(Pichia anomala60464200[100]
    斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae602.595[25]
    西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis704.570380[25]
    酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae55–602–2.5, 5–5.51204[101]
    芽殖酵母菌(Saccharomyces castellii774.44900.3–8[102]
    酵母白囊杆菌(Arxula adeninivorans754.5230[31]
    微生物Microbes最适温度/℃Temperature optimum最适pHpH optimum分子量/(KDa)Molecular weightKm/(μmol)特异性酶活性/(U·mg−1)Specific activity参考文献References
    细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens7042[67]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis606—6.536—385008.7[68]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis55, 654.5—644, 47[69]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)7074455020[70]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii504474601122[63]
    大肠杆菌(Escherichia coli604.542130811[71]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)507—7.5700[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes10—13[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae504[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena58540300205[72]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca555–6[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus40–454.945340310[56]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans604.542340140[73]
    构巢裸壳孢菌(Emericella nidulans6.56629–33[62]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae405.5453802.514[53]
    左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus707–841–4612.69[74]
    戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus50569[75]
    植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum655.5520.463[76]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)5, 7[27]
    绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa505–8[27]
    反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium50–554–5.5460.6[77]
    克雷伯菌属(Klebsiella sp.)37610–13200062.5[78]
    蜡孔菌属(Ceriporia sp.)40–605–659700 ± 80[79]
    绒毛拴菌(Trametes pubescens40–605–6621210 ± 30[79]
    弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii522.7, 5[80]
    无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus6413[81]
    细菌疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus75652110[82]
    嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila625.5[83]
    嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus128[83]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia554.5453960[55]
    克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristeensenii554.5[84]
    香蕉狄克氏菌(Dickeya paradisiaca554.5, 5.5[85]
    旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis454[86]
    真菌曲霉菌属(Aspergillus sp.)70[8]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum632.568271.1[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger65584100103[58]
    炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius534.7[87]
    土曲霉菌(Aspergillus terrus704.56011142[62]
    烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus60643[88]
    产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum2.86[89]
    简青霉菌(Penicillium simplicissimum603.5–5.3653.8[90]
    草酸青霉菌(Penicillium oxalicum554.562.5370307[91]
    枝孢霉菌属(Cladosporium sp.)403.532.615.2910[92]
    米根霉菌(Rhizopus oryzae554.5[93]
    少孢根霉菌(Rhizopus oligosporus554.51509.47[94]
    微小根毛霉菌(Rhizomucor pusillus705.4[95]
    嗜热侧孢霉菌(Sporotrichum thermophile585[96]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii50–554–4.5721001080 ± 110[56]
    米曲霉菌(Aspergillus oryzae505.51203300.35[97]
    酵母菌克鲁斯假丝酵母(Candida krusei402.5, 5.5330301210[98]
    毕赤酵母菌(Pichia pastoris602.5, 5.59525–65[99]
    异常毕赤酵母菌(Pichia anomala60464200[100]
    斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae602.595[25]
    西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis704.570380[25]
    酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae55–602–2.5, 5–5.51204[101]
    芽殖酵母菌(Saccharomyces castellii774.44900.3–8[102]
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-10
  • 录用日期:  2022-02-09
  • 刊出日期:  2023-04-27
苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
引用本文: 苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
Citation: SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108

微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述

    通讯作者: Tel:15751868275,E-mail:liuxue20088002@126.com
  • 1. 西南林业大学生态与环境学院,昆明,650224
  • 2. 福建农林大学资源与环境学院,福州,350002
基金项目:
国家重点研发计划项目(2018YFC1800504),国家自然科学基金(41867066,41907129),云南省自然科学基金(2019FB032)和云南省高端外国专家项目(YNQR-GDWG-2018-017)资助

摘要: 有机磷是土壤磷的主要存在形式,占比40%—90%,是作物磷营养的重要来源和储备库,亦是引起水体富营养化的潜在因子。磷作为植物生长发育的必需大量营养元素,通常以无机磷肥形式施用于土壤,易吸附于土壤表面或与钙、镁、铝、铁等金属阳离子形成难溶性络合物,导致其生物可利用性降低,其中20%—80%磷肥转化为有机磷,不易被植物吸收利用。矿化作用是在土壤微生物作用下,土壤中有机态化合物转化为无机态化合物的总称。土壤中有机磷主要以植酸及其盐类形式存在(占比50%—70%),植酸(盐)可被专一性酶(植酸酶)矿化水解为肌醇和磷酸(盐),并释放出无机磷,以供植物的根系直接吸收和利用。前期研究发现,缺磷胁迫下微生物可大量分泌植酸酶分解植酸,释放磷酸根,促使土壤有机磷水解矿化为无机磷,提高了土壤有机磷的生物可利用率。目前关于微生物植酸酶矿化植酸的研究多集中于谷类作物和动物营养,对土壤植酸矿化与土壤有机磷利用的综述性报道较少。因此,本文主要关注微生物植酸酶对土壤植酸的矿化作用与土壤有机磷利用,重点阐述其过程、机制和效率,包括微生物植酸酶的种类来源、酶学性质、作用机理和实际应用等方面的研究进展,可为提高土壤有机磷的生物利用效率、减少农业磷肥施用量、降低土壤磷流失及水体污染风险提供理论依据和技术支撑,为深入探究植酸酶功能并应用于农业生产实践及保障生态环境安全提供基础信息和参考。

English Abstract

  • 磷作为植物生长及发育必需大量营养元素,通常以无机磷肥形式施用于土壤[1]。无机磷肥进入土壤后,极易被土壤固相吸附或与钙镁等金属阳离子形成难溶性络合物,导致其植物可利用性降低。此外,20%—80%磷肥转化为有机磷,占土壤全磷的40%—90%,仅约0.1%可被植物直接吸收利用[2]。因此,为保障农作物营养和产量,常施用过量磷肥,造成严重且广泛的环境污染问题[3]。磷肥的大量施用导致土壤酸化和植物营养失衡,且易在土壤中富集,造成土壤磷污染,并通过地表/地下水进入到水体中,引起水体的富营养化[4]。据此,提高土壤有机磷的植物利用率可优化农作物生产、降低磷肥施用量、降低磷流失及水体污染风险。

    矿化作用是在土壤微生物作用下,土壤中有机态化合物转化为无机态化合物的总称。植酸(肌醇六磷酸)是土壤有机磷的主要存在形态(50%—70%)[5]。然而,植物根系难以直接吸收植酸,通常植酸需被专一性酶(植酸酶)水解生成植物能够吸收利用的正磷酸盐(磷酸氢根、磷酸二氢根)[6]。植酸酶(肌醇六磷酸水解酶)属于一类特殊的酸性磷酸单酯水解酶,能有效催化植酸及其盐类水解并产生肌醇衍生物和磷酸盐,可由土壤微生物分泌至植物根际环境中发挥作用[7]。植酸酶基因(phyA)由Richardson等[8]在黑曲霉(Aspergillus niger)中发现,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliaha),转基因拟南芥相较于野生型拟南芥的植酸酶活性由3.9—14.3 U·mg−1提高至224—14980 U·mg−1,其生长和磷营养得到显著改善,表明转基因植物可通过表达微生物植酸酶基因,高效分泌植酸酶进而有效利用植酸。Nelson等[9]首次证实饲料中的植酸可经过微生物植酸酶水解,释放出磷元素,极大推动微生物植酸酶的研究进展。随后一系列关于植酸酶提高植酸磷生物利用率的研究证实,微生物植酸酶基因可以显著促进植酸酶分泌,进而提高基质中植酸的分解效率,可为植物提供充足的磷营养[10]。因此,微生物是驱使土壤植酸矿化的关键因子,可高效分解难利用态有机磷,补偿植物根际有效/活性磷,是植物生长的重要磷源[11]

    近年来,伴随着对微生物植酸酶的研究逐步深入,关于其在农业领域的应用已引起广泛关注。目前,研究多集中于各类微生物植酸酶对谷类作物植酸矿化和在家禽动物营养中的作用,关于其对土壤植酸矿化与土壤有机磷利用的系统性综述报道较少。由此,本文主要关注微生物植酸酶对土壤植酸的矿化作用,重点阐述其过程、机制和效率,包括微生物植酸酶的种类来源、酶学性质、作用机理和实际应用等方面的研究进展。该综述可为提高土壤有机磷的生物利用率、减少农业磷肥施用、降低土壤磷流失及水体污染风险提供理论依据和技术支撑,为深入探究植酸酶功能并应用于农业生产实践及保障生态环境安全提供参考。

    • 植酸是一种有机磷化合物,属维生素B族的一类环己六醇磷酸酯,为饱和环状酸,易溶于水、甘油和丙二醇等,不溶于苯、氯仿和乙烷等。植酸的分子式是C6H18O24P6,分子量660,化学名称为环已六醇–1, 2, 3, 4, 5, 6–六磷酸二氢酯,其化学构造由1分子肌醇和6分子磷酸结合而形成,即肌醇的6个碳原子上羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物(图1A[12]。在植物中植酸主要存在于种子里,其中以豆科、谷物、油籽和坚果作物种子的含量最丰富,其含量达1%—3%,占植物体内总磷含量的40%—90%,是植物种子/谷类作物中肌醇和磷酸的重要储备库[13]

      植酸的结构稳定,高温(>120 ℃)可分解,其中6个磷酸基团拥有比较强的螯合能力,可与金属阳离子(如Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等)形成极稳定的螯合物,降低营养元素的生物有效性,降低植物和家禽等动物对矿质元素的吸收,因而被称为抗营养因子[14]。此外,植酸可与蛋白质进行络合反应,其作用形式与蛋白质的等电点有关,比蛋白质等电点低时,植酸和蛋白质分子上的碱性基团发生反应,形成很稳定的蛋白质络合物,影响动物体内的蛋白酶活性(如胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉蛋白酶等);较蛋白质等电点高时,植酸通过Ca2+、Mg2+等金属阳离子连接形成“植酸–金属离子–蛋白质”复合物,同样可以降低蛋白酶活性[15]。植酸的络合能力与乙二胺四乙酸(EDTA)相似,但因其独特性质(稳定护色、抗氧化性、耐腐蚀性等),相较于EDTA应用更为广泛,主要应用于食品工业中作为果蔬及水产的护色剂和保鲜剂、医药领域中作为止渴剂、生物学领域中作为发酵促进剂促进微生物代谢、金属加工领域中作为防锈剂和防蚀剂等[16]

    • 植酸酶,属磷酸单酯水解酶,能催化植酸及其盐类水解为肌醇和磷酸盐,具有特殊空间结构(图1A),可使植酸脱磷酸化,并释放无机磷酸盐[17]。植酸酶主要存在于微生物以及动植物中,由于微生物分布的广泛性及其植酸酶具有易分离提纯、稳定性强、活性高等动植物植酸酶不具备的特点,目前对微生物(细菌、真菌、酵母菌等)植酸酶的研究最为广泛[18]

    • 美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)的蛋白质数据库里细菌植酸酶数量远多于真菌植酸酶。目前已报道的产植酸酶细菌主要包括淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、链球菌(Streptococcus sp.)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)等。细菌植酸酶具有较高的热稳定性(如芽孢杆菌(Bacillus sp.)植酸酶)—70 ℃温浴10 min后仍具有100%的酶活性,以及高蛋白水解稳定性(如大肠杆菌(Escherichia coli)植酸酶)—植酸酶蛋白质浓度可达菌体总蛋白的47%,在植酸水解和有机磷利用等方面有着良好应用前景[19]。例如,表达植酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)具有繁殖快、表达量高、成本低的特点[20]。但糖基化是细菌表达载体生产植酸酶的主要问题,由于蛋白质产物在大量表达时极易产生错误的折叠致使酶活性丧失,因此糖基化的不同程度对于细菌植酸酶的热稳定性有着重要影响[13]

      在微生物中,真菌植酸酶的活性最强,而且真菌植酸酶通常为便于分离纯化的胞外酶,所以真菌多用于工业化生产植酸酶[21]。产植酸酶真菌主要包括无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉菌(Penicillium)等[22]。研究已证明黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶活性较高,其植酸酶基因phyA已在多种真菌中成功表达,而其他真菌植酸酶活性较低,且曲霉(Aspergillus sp.)植酸酶生产安全性较好,因此是目前工业化生产应用较多的真菌[23]

      酵母菌的致病性比较低,是植酸酶产生菌理想的研究对象,但当前对酵母菌植酸酶的研究较少,尚缺少工业化生产。已知主要的产植酸酶酵母菌分别有热带假丝酵母(Candida tropicalis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等[24]。在众多产植酸酶的酵母菌中,斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae)植酸酶的活性最高[25]。酵母菌的遗传信息较为全面,而且便于操作,来自细菌和真菌的异源植酸酶基因已在酵母菌中成功表达,由于外源蛋白表达时容易出现过度糖基化,阻碍合成蛋白的分泌和运输,故目前可作为表达载体的酵母菌种类较少,主要为毕赤酵母(Pichia pastoris[26]

    • 为分离具有胞外植酸酶活性的细菌、真菌和酵母菌,已开展较多关于产植酸酶微生物筛选的研究。Richardson和Hadobas[27]使用含植酸钠的筛选培养基,从土壤中分离出238种产植酸酶细菌,其中,4株假单胞菌(Pseudomonas spp.)植酸酶活性较高,分别是荧光假单胞菌(fluorescent Pseudomonas)—恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCAR53和CCAR59、非荧光假单胞菌(nonfluorescent Pseudomonas)—门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)CCAR31和CCAR60,其植酸酶活性分别是13.4×10−3、13.3×10−3、7.3×10−3、6.9×10−3 U·mg−1,分别从植酸钠释放出57%和54%无机磷。1994年,Volfová等[28]筛选得到132种产植酸酶微生物,其中胞外活性植酸酶主要来自真菌。随后,Gargova等[29]通过两步筛选(合成植酸酶琼脂培养基初步筛选和玉米淀粉液体培养基二次筛选)得到203种产植酸酶真菌。Lambrechts等[30]首次发现酵母菌Schwanniomyces castellii分泌物具有极高的植酸酶活性(237 U·mg−1),是其他菌株植酸酶活性的2.8倍。Sano等[31]筛选得到约1200株酵母菌株,以植酸作为唯一磷源进行培养,发现除酵母白囊杆菌(Arxula adeninivorans)外,大多数微生物无法生长,表明该微生物具有分泌植酸酶和降解植酸的能力。

      Bae等[32]建立了一种定性分析微生物植酸酶活性的方法,即用特异性琼脂培养基中沉淀态植酸钙/植酸钠的减少作为具有酶活指示。Engelen等[33]建立了简便快捷的定量分析微生物植酸酶活性的方法,即测定pH 5.5时,植酸钠分解释放无机磷含量。然而,仍有大量的产植酸酶微生物有待鉴定。目前,通过NCBI的蛋白质数据库和基因组数据库中同源序列鉴定,发现许多可以在自然环境下分泌胞外植酸酶的微生物。

      分离筛选的微生物可用液态深层发酵技术(submerged fermentation,SmF)及固态发酵技术(solid state fermentation,SSF)生产植酸酶[34]。其中,SmF作为主要的生产技术已被广泛使用,其特点是发酵的周期短、劳动的强度低与生产率高等,特别适用于细菌和酵母菌的植酸酶生产[35]。SSF是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方法,近年来,作为“高产量低成本”的生产技术,SSF在微生物植酸酶生产方面表现出极大优势,如微生物易生长、酶活性高、酶系丰富,发酵过程中无需严格的无菌条件,设备构造及后续处理简单、且易操作、能耗低、投资少、污染小等[36]。真菌植酸酶生产可通过SmF或SSF[37]。培养条件、菌种类型、底物性质和养分有效性是影响微生物植酸酶产量的关键因素。Han等[38]采用半固体底物发酵的方式生产植酸酶,发现固态发酵产生植酸酶含量比液态发酵高2—20倍。Papagianni等[39]研究SmF和SSF中培养基组成、黑曲霉形态和植酸酶产量之间的相关性关系,发现培养基组成和真菌形态对SmF生产方式中植酸酶的产生影响较大,随后添加有机磷酸盐,均可促进SmF及SSF中黑曲霉生长与植酸酶产生,其植酸酶活性分别由6770 U·mg−1和162 U·mg−1提高至8090 U·mg−1和1800 U·mg−1。这些研究表明在选择特定生产技术时,应当考虑培养的条件、菌种的类型、底物的性质和养分有效性等重要因素的影响。

    • 微生物植酸酶的种类繁多,其结构各不相同,催化机制也各有不同,目前各种微生物的植酸酶种类与酶学性质(最适温度/pH、分子量、米氏常数Km值、特异性酶活性)分别见表12

      依据植酸发生水解脱磷酸化的位置,微生物植酸酶可以分成3类:3–植酸酶(EC 3.1.3.8)、6–植酸酶(EC 3.1.3.26)及5–植酸酶(EC 3.1.3.72),分别是在植酸的第3位、6位及2位碳原子上水解释放磷酸基因[27]。根据其来源,可分为3类:细菌植酸酶、真菌植酸酶、酵母菌植酸酶[103]。根据酶活最适pH,可分成酸性植酸酶(最适pH=5—6)和碱性植酸酶(最适pH=8—10),真菌及多数细菌分泌酸性植酸酶,少数细菌分泌中性(最适pH=7—7.5)或碱性植酸酶[104]。根据催化机制,可分为4类:组氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phosphate,HAP),大多来源于肠杆菌(Enterobacter sp.)及真菌,当前应用较为普遍;β螺旋植酸酶(β–propeller phytase,BPP),多数来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.),具有较强的稳定性;然而半胱氨酸植酸酶(cysteine phytase,CP),只发现存在于瘤胃微生物(rumen microbiome);紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphate,PAP),在真菌以及细菌中分布广泛[52]

      植酸酶来源不相同,其最适pH差异亦较大[105]。细菌、真菌、酵母菌植酸酶最适pH分别为2.7—8.0、2.5—6.0、2.5—5.5,通常微生物植酸酶活性pH值是4.0–7.5,在当pH<3.0或>7.5时,其酶活性急剧下降至失活[106]。微生物植酸酶活性温度为50—70 ℃,细菌、真菌、酵母菌植酸酶最适温度为分别为37—75 ℃、40—70 ℃、40—77 ℃,45—60 ℃活性较为稳定,更高温度(>80 ℃)易失活[107]

    • 谷物饲料中含有大量植酸(盐),家畜难以直接消化利用,故植酸(盐)以未分解形式通过家畜排泄物进入土壤,此外,农业生产过程施用的大量无机磷肥可转化为植酸有机磷,造成土壤植酸积累[103]。微生物通过分泌植酸酶水解土壤植酸,释放无机磷供植物直接吸收(图1B)。Chen等[108]指出,土壤植酸矿化分解与植酸酶数量和活性具有显著相关性。Bünemann[109]指出,>60%土壤有机磷可被磷酸酶水解,其中植酸酶释放的磷高达80%。Tarafdar等[110]发现,微生物植酸酶能有效水解土壤植酸从而释放无机磷酸盐,比动植物植酸酶效率高约50%。以上研究表明,微生物是驱动土壤植酸矿化的关键因子,对提高土壤有机磷的利用率具有重要作用。

      植酸的矿化机制虽在上世纪60年代已被研究,但当前植酸的代谢途径和形成产物仍然是植酸酶研究的重点。随着分离方法的发展,尤其是色谱技术在矿化产物分析中的广泛应用,发现不同来源植酸酶的作用机理存在差别[111],其中,微生物植酸酶矿化植酸的途径为:植酸→DL-1,2,4,5,6–五磷酸肌醇→DL-1,2,5,6-四磷酸肌醇→DL-1,2,5-三磷酸肌醇/DL-1,2,6-三磷酸肌醇/DL-2,5,6-三磷酸肌醇→DL-1,2-二磷酸肌醇/2,5-二磷酸肌醇/DL-2,6-二磷酸肌醇→2-磷酸肌醇(图2[112]

    • 微生物植酸酶活性是植酸矿化效率的主要影响因子(表2),而微生物植酸酶活性受生物和物理化学过程的影响[113],前者引起酶生产速率、同工酶(催化相同反应而分子结构不同的酶)生产和微生物群落组成的变化,后者引起吸附解吸反应、底物扩散速率和酶降解速率的变化[114]。影响酶活性的关键因素包括:

      (1)微生物植酸酶活性由底物种类和数量等几个相互关联的因素共同决定[115]。通常使用添加不同底物的方法来测定微生物的植酸酶活性,包括萘磷酸、6–磷酸葡萄糖、2–甘油磷酸、植酸钠、植酸钙、β–甘油磷酸盐、对硝基苯酚磷酸盐、6–磷酸果糖、一磷酸腺苷(adenosine–5’–monophosphate,AMP)、二磷酸腺苷(adenosine–5’–diphosphate,ADP)、三磷酸腺苷(adenosine–5’–triphosphate,ATP)、三磷酸鸟苷(guanosine–5’–triphosphate,GTP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)等[116]。根据底物的差异,将其分成特异性及非特异性酸性磷酸酶[117]。研究发现,一些微生物植酸酶对植酸具高特异性,如芽孢杆菌(Bacillus sp.)、曲霉菌(Aspergillus sp.)和大肠杆菌(Escherichia coli[118],其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)植酸酶活性随植酸浓度增加而增加,最高活性可达10 mmol[119]

      (2)反应体系的pH对微生物植酸酶活性具有一定影响。微生物植酸酶比植物植酸酶具有更宽泛的pH适宜范围,但其最适pH因微生物种类而存在差异[30]。植酸酶主要分成碱性植酸酶以及酸性植酸酶,其最适pH值范围是5.0–8.0[59]。真菌植酸酶的最适pH值为4.5–6.5,如烟曲霉(Aspergillus fumigatus[120]。丝核菌(Rhizoctonia sp.)和镰刀菌(Fusarium verticillioides)在pH分别为4.0和5.0时分泌植酸酶[121]。而细菌植酸酶在pH值分别为6.0和8.0时活性最强,如芽孢杆菌(Bacillus sp.)[62]。因此,控制适宜反应体系的pH值对保障微生物植酸酶的产量及其活性有利。

      (3)温度是微生物植酸酶活性的重要影响因素,既影响微生物活性(即植酸酶的生成与产量),亦影响酶的活性(即植酸矿化速率)[122]。一般通过计算活化能(Ea)来确定酶对温度的响应,两个过程(生产和降解)的速率本应随着温度的升高而增加,但由于Ea的差异,它们表现出不同的温度敏感性[123]。研究表明,微生物植酸酶的温度敏感性随季节变化,并且在单一环境中存在差异[124]。与温暖气候相比,微生物在寒冷气候中分泌植酸酶的最适温度较低、结构灵活性和改变结构的能力较差[125]。微生物植酸酶的最适温度范围为35—77 ℃,镰刀菌(Fusarium verticillioides)植酸酶最适温度为50 ℃,其稳定性可保持至60 ℃,而克雷伯菌属(Klebsiella sp.)植酸酶在较低温度37 ℃保持最大活性[126]。Johnson等[127]研究指出,产植酸酶微生物的代谢速率随温度升高而加快,平均Ea为0.62 eV。因此,与酶动力学本身相比,温度对微生物植酸酶的代谢速率起着更为重要的作用。

      (4)土壤理化性质的影响,包括全氮含量和土壤质地类型[128]。氮是微生物植酸酶生产中不可缺少的元素,对不同氮源影响微生物植酸酶产量的研究发现,在麦麸培养基和桔皮粉培养基中添加0.1%磷酸二氢铵(NH4H2PO4)时微生物植酸酶产量最高,分别达2.41 U·mL−1和3.15 U·mL−1[129]。不同无机氮源对真菌和细菌植酸酶生产具有影响,相较于硝酸铵(NH4NO3)和其他天然氮源(酵母浸出物、蛋白胨、豆粉等),尿素(CH4N2O)和硫酸铵((NH4)2SO4)更有利于无花果曲霉(Aspergillus ficuum)生产植酸酶(20 IU·g−1 vs. 25 IU·g−1[130]。微生物植酸酶的活性在很大程度上受土壤类型的影响,土壤中各成分对植酸酶活性的影响各不相同[131]。与砂土相比,粘土中微生物植酸酶活性显著降低35%[132]。Rao等[133]指出,黏土中Al3+氧化物可降低20%的微生物植酸酶活性。George等[129]发现,微生物植酸酶在砂土中吸附28 d后仍保持40%活性,而在粘土中活性仅为5%。

      综上所述,微生物植酸酶活性的影响因素包括底物的种类和数量、反应体系的pH、温度以及土壤理化性质,这些因素影响微生物植酸酶生产速率、底物扩散速率与酶降解速率等,进而影响土壤植酸的矿化速率。

    • 土壤中的有机磷由于生物可利用性较低,成为农作物的主要营养限制因子,合理开发利用土壤中的有机磷资源对可持续农业发展具有重要意义。植酸是土壤有机磷的主要成分,可在微生物植酸酶的矿化作用下水解为无机磷供植物吸收利用,微生物植酸酶可提高土壤植酸的生物利用率,降低磷肥的施加和投入,亦可减少土壤磷残留量,降低地表/地下水体的磷污染风险。

      利用产植酸酶功能微生物进行对土壤植酸的降解,有耗能低、投资少、操作简单和二次污染小等优势。然而,现阶段对于充分发挥微生物植酸酶在土壤植酸水解中优势的实际应用仍显不足,鉴于此,今后可加强以下几方面的研究:(1)深入研究微生物植酸酶的空间结构,进一步阐明微生物植酸酶结构及其功能间的关系;(2)筛选酶活性高、热稳定性好的产植酸酶微生物,并采用基因重组技术生产微生物植酸酶;(3)研发经济、快速的微生物植酸酶分离提纯方法,提高纯化精度与速率,以提高微生物植酸酶产量;(4)使用固定化技术解决在微生物植酸酶生产、运输、使用及储存时保持其酶活性的问题;(5)通过蛋白质工程和基因工程改造微生物植酸酶基因,以降低生产成本、提高其产量。磷为不可再生资源,深入研究微生物植酸酶对土壤重要有机磷–植酸的矿化作用过程机制及矿化速率关键影响因素,对实现土壤有机磷的高效利用,降低外源磷肥施用及农业生产成本,且控制过量磷肥施用存在的潜在面源污染及水体富营养化风险具有重要的现实意义。

    参考文献 (133)

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