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微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述

苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
引用本文: 苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
Citation: SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108

微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述

    通讯作者: Tel:15751868275,E-mail:liuxue20088002@126.com
  • 基金项目:
    国家重点研发计划项目(2018YFC1800504),国家自然科学基金(41867066,41907129),云南省自然科学基金(2019FB032)和云南省高端外国专家项目(YNQR-GDWG-2018-017)资助

Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review

    Corresponding author: LIU Xue, liuxue20088002@126.com
  • Fund Project: the State Key Basic R & D Program of China (2018YFC1800504), National Natural Science Foundation of China (41867066, 41907129), Natural Science Foundation of Yunnan (2019FB032) and Outstanding Foreign Expert of Yunnan (YNQR-GDWG-2018-017)
  • 摘要: 有机磷是土壤磷的主要存在形式,占比40%—90%,是作物磷营养的重要来源和储备库,亦是引起水体富营养化的潜在因子。磷作为植物生长发育的必需大量营养元素,通常以无机磷肥形式施用于土壤,易吸附于土壤表面或与钙、镁、铝、铁等金属阳离子形成难溶性络合物,导致其生物可利用性降低,其中20%—80%磷肥转化为有机磷,不易被植物吸收利用。矿化作用是在土壤微生物作用下,土壤中有机态化合物转化为无机态化合物的总称。土壤中有机磷主要以植酸及其盐类形式存在(占比50%—70%),植酸(盐)可被专一性酶(植酸酶)矿化水解为肌醇和磷酸(盐),并释放出无机磷,以供植物的根系直接吸收和利用。前期研究发现,缺磷胁迫下微生物可大量分泌植酸酶分解植酸,释放磷酸根,促使土壤有机磷水解矿化为无机磷,提高了土壤有机磷的生物可利用率。目前关于微生物植酸酶矿化植酸的研究多集中于谷类作物和动物营养,对土壤植酸矿化与土壤有机磷利用的综述性报道较少。因此,本文主要关注微生物植酸酶对土壤植酸的矿化作用与土壤有机磷利用,重点阐述其过程、机制和效率,包括微生物植酸酶的种类来源、酶学性质、作用机理和实际应用等方面的研究进展,可为提高土壤有机磷的生物利用效率、减少农业磷肥施用量、降低土壤磷流失及水体污染风险提供理论依据和技术支撑,为深入探究植酸酶功能并应用于农业生产实践及保障生态环境安全提供基础信息和参考。
  • 大气扬尘造成的污染,严重影响着人群健康,会导致相关心血管和呼吸道疾病的发生[1-2]。扬尘排放已成为空气中PM2.5的重要来源[3-5]。其中,建筑施工所产生的扬尘是重要原因之一[6-8]。因此,施工扬尘问题亟待解决。

    目前,施工扬尘的主要解决措施有洒水、绿网覆盖及喷洒抑尘剂。喷洒抑尘剂具有抑尘效率高的优点,近年来受到了广泛关注。抑尘剂是一种多组份单相混合物,常根据其主要组分类型和作用特点将抑尘剂分为润湿型、黏结型、复合型等。润湿型抑尘剂中通常含有大量的表面活性剂类物质,以发挥对粉尘的润湿效果;例如,利用C9脂肪醇聚氧乙烯醚和十二烷基苯磺酸钠可制备出抑制煤尘的润湿型抑尘剂[9]。黏结型抑尘剂则常以高分子有机物等具有良好黏结性的物质为主;例如,以木质素磺酸盐作为主要原料,将甲基硅酸钠、四硼酸钠等为辅助剂可制成黏结型抑尘剂[10]

    随着全社会环境和生态意识的提高,抑尘剂的制备越来越重视其综合性能,绿色、安全的复合型、环保型抑尘剂是未来的发展方向。瓜尔胶[11-12]、海藻酸钠[13]等天然高分子都被作为原料来制备抑尘剂。更多研究者践行“以废治废”的理念,利用甘蔗渣[14],秸秆[15],塑料瓶[16]、废纸[17]等固体废弃物制备抑尘剂。城市绿化废弃物的产生量大,是现代城市发展中普遍面临的问题[18]。对其传统处理方式为填埋、焚烧和堆肥[19],一直以来较少有规范、有效的处理方法。本研究中利用典型的绿化废弃物——悬铃木枝条作为原料,探索制备复合型抑尘剂的途径;并阐明抑尘剂各组分对其各方面性能的影响。在以上研究的基础上,还利用TOPSIS法确定复合型抑尘剂各组分的最佳配比,以期为复合型抑尘剂的制备提供参考。

    采集城市绿化树种二球悬铃木(Platanus acerifolia)修剪下来的枝条为原料。实验用土样为自采黄土,采自西安建筑科技大学校园。

    氯化胆碱(C5H14ClNO)、辛癸基葡糖苷(APG0810)、聚乙烯醇([C2H4O]n,PVA)、乙二醇((CH2OH)2)、无水乙醇(CH3CH2OH)、硝酸(HNO3)、氢氧化钠(NaOH)、氯乙酸(C2H3ClO2)、盐酸(HCl)、硫酸铜(CuSO4)均为分析纯。

    1)悬铃木枝条的预处理。将悬铃木枝条置于鼓风干燥箱中100 ℃下干燥,使用分级式连续投料粉碎机(LF-40, 河北本辰科技有限公司)将干燥的枝条粉碎后,过200目筛后获得木粉。称取一定质量的木粉,加入到三口烧瓶中,按20∶1的质量液固比加入低共熔溶剂(deep-eutectic solvents, DES)(氯化胆碱和乙二醇按1∶3的质量比在60 ℃下混合均匀,搅拌30 min制得)。之后,使用加热套(SZCL, 天津工兴实验室仪器有限公司)加热烧瓶内的液体至160 ℃,搅拌维持6 h。最后,加入20 mL无水乙醇终止反应。将三口烧瓶置于冷水中冷却后,离心分离,所得固体残渣用无水乙醇洗涤2~3次,直至滤液无色。

    2)纤维素提取和羧甲基纤维素钠的制备。采用硝酸-乙醇法[20]从上述固体残渣中提取纤维素,即配制体积比为4∶1的硝酸-乙醇混合溶液作为提取溶剂;固体残渣和硝酸-乙醇溶液加热搅拌反应,多次提取直至纤维变白,然后洗涤烘干得到纤维素样品。

    在500 mL烧杯中,加入2.5 g从悬铃木枝条中提取出来的纤维素和100 mL混有4 g NaOH的70%乙醇水溶液,在40 ℃下恒温搅拌反应60 min,制得碱纤维素;向碱纤维素中加入含有6 g氯乙酸的70%乙醇水溶液25 mL,升温到70 ℃反应30 min;再加入含有2 g NaOH的70%乙醇水溶液25 mL作为碱性催化剂,在80 ℃下醚化反应90 min。待反应结束冷却后,用稀盐酸调节pH至中性,进行抽滤,然后将滤饼依次用75%和95%乙醇分别洗涤2次,60 ℃下干燥,即制得羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium, CMC)[21]

    将制得的羧甲基纤维素钠进行初步鉴别[22]:取1 g制得的CMC,加温水50 mL,搅拌混匀,制成悬浊液,冷却后备用;取悬浊液25 mL,加20 g·L−1的CuSO4溶液5 mL,观察是否生成淡蓝色绒毛状沉淀。

    3)复合型抑尘剂的制备和单因素实验的设计。将制得的CMC粉末溶于纯水,充分搅拌混匀,得到CMC溶液。将絮状PVA和纯水混合,加热溶解得到PVA溶液。取APG0810和纯水进行搅拌,混合均匀得到APG0810溶液。按照一定的质量分数将三者进行配比混合,在水浴25 ℃下搅拌混匀,即制得复合型抑尘剂。

    选取黏结性、润湿性、抗风蚀性和生物毒性作为对复合型抑尘剂进行考察的评价指标。分别测定不同浓度CMC、PVA和APG0810溶液的黏度;在此基础上,选定合适的组分质量分数范围,通过单因素实验分别探究各组分用量对复合型抑尘剂的黏结性、润湿性、抗风蚀性、生物毒性的影响。

    1)表征分析。利用傅里叶漫反射红外光谱仪(Nicolet iS5, 美国Thermo Scientific公司)对提取产物和反应产物进行表征和确认。用扫描电子显微镜(JSM-6510LV, 日本电子公司)观察复合型抑尘剂喷洒前后的土样表面的微观形貌。

    2)复合型抑尘剂性能测定。复合型抑尘剂的黏结性决定了对尘土黏结、凝并的效果,以黏度为指标反映复合型抑尘剂的黏结性。用超声波黏度计(LVDV-2-PRO, 美国Brookfield公司)测量复合型抑尘剂黏度。

    润湿性可反映复合型抑尘剂渗入土层内部的能力,采用沉降时间和接触角可反映复合型抑尘剂的润湿性。在比色管中加入50 mL复合型抑尘剂,然后取1 g干燥的土粉碎至200目,将土沿漏斗倒入比色管中,准确记录土从接触抑尘剂至沉底所用的时间,即为沉降时间[12]。采用接触角测定仪(SL200A, 美国科诺公司)测量抑尘剂液滴的接触角。

    抗风蚀性可直接反映复合型抑尘剂的抑尘效果。以粉尘被吹蚀后的质量损失率为指标来反映复合型抑尘剂的抗风蚀性。称取25 g过200目烘干的土样于直径9 cm的培养皿中,堆成小土堆,向上面均匀喷洒10 mL复合型抑尘剂(满足喷洒量≥1.5 L·m−2的要求[23])。自然晾干8 h,土样表面形成固化层,进行称重。使用吹风机模拟自然风,进行风蚀实验。用风速仪(MS6252B, 杭州HYELEC公司)测定土样表面的风速为5.6 m·s−1(相当于四级风,可吹起沙粒和纸张),风蚀5 min后再次称重,按式(1)计算质量损失率[14, 24]

    质量损失率=m1m2m1×100% (1)

    式中:m1为吹蚀前土样和培养皿的总质量,g;m2为吹蚀后土样和培养皿的总质量,g。

    生物毒性可反映复合型抑尘剂对土壤中生物的毒性,本实验中以种子发芽率为指标来反映复合型抑尘剂的生物毒性。使用饱满、无霉的小麦种子,用纯水冲洗后过夜浸泡备用。在培养皿内放入1张滤纸作发芽床。每个发芽床上放置10粒种子,加入10 mL抑尘剂。将培养皿放入28 ℃恒温培养箱中进行培养,48 h后观察结果,按式(2)计算种子发芽率。

    种子发芽率=X1X2×100% (2)

    式中:X1为发芽的种子数量,个;X2为实验种子数量,个。

    3)TOPSIS法分析。TOPSIS法是一种逼近理想解的排序法,常用于多目标决策分析。若方案最靠近最优解,同时又最远离最劣解,则为最好。利用该方法对复合型抑尘剂的黏结性、润湿性、抗风蚀性和生物毒性进行综合性能分析,以确定各组分的最优配比。

    黏度和种子发芽率属于极大型指标,沉降时间和质量损失率属于极小型指标。将极小型指标数据按式(3)进行正向化;为了消除数据量纲的影响,按式(4)分别进行标准化。

    ¯xl=1xi (3)
    Zi=xini=1x2i (4)

    经过正向化和标准化之后的黏度、沉降时间、质量损失率和种子发芽率指标分别记为Z1Z2Z3Z4,对应权重分别为0.2、0.2、0.4和0.2。

    最优配比分析:指标到最优解的距离记为D+,按式(5)计算;指标到最劣解的距离记为D,按式(6)计算;综合性能指标为C,按式(7)计算。C越接近于1,就说明该方案更优。

    D+=0.2(Z1iZ1max)2+0.2(Z2iZ2max)2+0.4(Z3iZ3max)2+0.2(Z4iZ4max)2 (5)
    D=0.2(Z1iZ1min)2+0.2(Z2iZ2min)2+0.4(Z3iZ3min)2+0.2(Z4iZ4min)2 (6)
    C=DD++D (7)

    悬铃木枝条经预处理后得到黑褐色的固体残渣,从中提取产物则呈米白色;进一步碱化和醚化反应的产物为白色粉末,如图1(a)所示。白色粉末可溶于水形成淡黄色溶液,加入CuSO4后有蓝色絮状物生成,见图1(b)。这初步证明,利用悬铃木枝条制得的白色粉末为CMC。

    图 1  悬铃木枝条的提取产物和反应产物形态
    Figure 1.  Morphology of extracted products and reaction products from the Platanus branches

    自悬铃木提取的米白色产物红外吸收光谱见图2(a)。其中,3 400~3 600 cm−1(3 425 cm−1)为羟基(—OH)的伸缩振动吸收峰;2 911 cm−1为亚甲基—CH2伸缩振动吸收峰;1 000~1 200 cm−1(1066 cm−1)为纤维素分子链中—C—O—C—伸缩振动吸收峰;899 cm−1处为纤维素分子中葡萄糖单元之间 β-糖苷键的吸收峰。

    图 2  悬铃木枝条提取产物和反应产物的红外吸收光谱
    Figure 2.  FTIR of extracted products and reaction products from the Platanus branches

    白色反应产物的红外吸收光谱见图2(b)。可以看出,在1 600 cm−1左右出现的强烈吸收峰为CMC的特征峰;1 427 cm−1、1 327 cm−1分别为—CH2、—OH的弯曲振动吸收峰;1 266 cm−1处小峰为羧酸基团中 C—O 伸缩振动吸收峰;1 020~1 160 cm−1(1 067 cm−1)处为纤维素结构中—C—O—C—的对称与不对称振动吸收。

    以上结果证明,从悬铃木枝条中提取出的米白色物质为纤维素,该纤维素制品经过碱化和醚化反应后可制得CMC。

    我国现有的技术标准[23]对抑尘剂的黏度要求为:25 ℃温度条件下,抑尘剂黏度需大于5 mPa·s。通过前期预实验发现,当CMC的质量分数为0.20%时,其溶液黏度为7.32 mPa·s;如果进一步增大CMC的质量分数,溶液中会产生较多不溶物。PVA溶液质量分数在0.10%~2.00%时,黏度由1.28 mPa·s增大到5.52 mPa·s。APG0810含量较高时,溶液会产生较多泡沫,不易喷洒。因此,本研究选择质量分数分别为0.01%~0.20%、0.10%~2.00%、0.01%~0.30%的CMC、PVA、APG0810来考察各组分对复配抑尘剂各性能指标的影响。在探究某一组分对抑尘剂某一性能的影响时,需要控制其他2种组分的含量,控制的CMC、PVA、APG0810质量分数分别为0.10%、0.50%、0.10%。

    1)各组分含量对复合型抑尘剂黏结性的影响。由图3可以看出,CMC质量分数越大,复合型抑尘剂的黏度亦越大。在CMC的质量分数大于0.10%时,复合型抑尘剂的黏度均在5 mPa·s以上,可满足现行技术标准的要求。复合型抑尘剂的黏度亦随着PVA质量分数的增大而增加,当PVA质量分数在1.00%以上时,复合型抑尘剂的黏度增幅变大。而APG0810的质量分数对复合型抑尘剂黏度无明显影响。由以上结果可知,CMC的用量是决定复合型抑尘剂黏度的最主要因素。这是因为,CMC和PVA是良好的黏结剂,他们混合之后会比单组分的黏度更大,而APG0810是表面活性剂,无黏结性。

    图 3  不同CMC、PVA、APG0810含量条件下复合型抑尘剂的黏度
    Figure 3.  Viscosity of the composite dust suppressant with different CMC, PVA, APG0810 contents

    2)各组分含量对复合型抑尘剂润湿性的影响。图4显示了复合型抑尘剂的沉降时间和接触角随各组分的质量分数的变化情况。沉降时间和接触角均会随着CMC质量分数的增大而增加,这说明复合型抑尘剂的润湿性在逐渐降低。这很大程度上与复合型抑尘剂的黏度有关,CMC用量多,复合型抑尘剂黏度增加,但流动性和渗透性也随之变差,不易润湿尘土。在PVA质量分数小于1.50%时,沉降时间基本不变;但当PVA质量分数大于1.50%时,沉降时间则出现大幅增长。这与复合型抑尘剂黏度随PVA含量变化的规律十分相似。这也进一步说明,过大的黏度会导致抑尘剂润湿性下降。APG0810是表面活性剂,能使溶液表面张力显著下降,其质量分数越大,复合型抑尘剂的接触角和沉降时间越小,润湿性越好。

    图 4  不同CMC、PVA、APG0810含量条件下复合型抑尘剂的沉降时间和接触角
    Figure 4.  Settlement time and contact angle of the composite dust suppressant with different CMC、PVA、APG0810 contents

    3)各组分含量对复合型抑尘剂抗风蚀性的影响。复合型抑尘剂的质量损失率大致随各组分质量分数的增加而减小,但变化程度有差别(图5)。其中,PVA含量对质量损失率影响最大;当PVA含量从0.10%增加到2.00%时,复合型抑尘剂的质量损失率从2.21%降至1.06%。其中,仅在PVA质量分数为0.10%~0.50%时,质量损失率的降幅就高达32%。这说明,PVA对该抑尘剂的抗风蚀性贡献很大。这是因为,PVA具有良好的成膜性和吸湿保水性,使尘土潮湿结壳,不易扬起。CMC能够使粉尘颗粒黏结起来,而APG0810会使抑尘剂更易渗透入粉尘下层。这三者组分各自发挥相应的作用,可协同提高复合型抑尘剂的抗风蚀性。

    图 5  不同CMC、PVA、APG0810含量条件下复合型抑尘剂的质量损失率
    Figure 5.  Mass loss rate of the composite dust suppressant with different CMC, PVA, APG0810 contents

    4)各组分含量对复合型抑尘剂生物毒性的影响。由图6可以看出,CMC和PVA对小麦种子发芽率的影响不明显,而APG0810则表现出明显的抑制作用。当APG0810质量分数在0.10%以下时,种子发芽率基本维持在70%~85%;而当APG0810质量分数增至0.15%时,种子发芽率就骤降至30%;待APG0810含量进一步升高后,种子发芽率均为0。这说明,表面活性剂类物质是造成抑尘剂生物毒性的主要成分。

    图 6  不同CMC、PVA、APG0810含量条件下复合型抑尘剂的小麦发芽率
    Figure 6.  Wheat germination rate of the composite dust suppressant with different CMC, PVA, APG0810 contents

    5)土样表面喷洒抑尘剂前后的微观形貌。喷洒抑尘剂前后土样表面的微观形貌见图7,通过观察可发现,原本的土样表面有很多分散、细小的颗粒,粒径大都在20 μm以下。而当在土样表层喷洒复合型抑尘剂之后,原本的细小颗粒黏聚成团,其粒径至少增大了数10倍。由此可知,喷洒抑尘剂后,尘土颗粒黏结、凝并的效果较好。

    图 7  复合型抑尘剂喷洒前后土样表面的微观形貌
    Figure 7.  Surface micromorphology of soil samples before and after the composite dust suppressant spraying

    利用TOPSIS法计算出CMC、PVA和APG0810不同用量时的复合型抑尘剂综合性能指标C(表1)。如表1所示,随着各组分在复合型抑尘剂中的质量分数的增大,综合性能指标C并非呈现单纯的递增或递减趋势。这表明,黏结性、润湿性、抗风蚀性和生物毒性之间存在交互作用。当C最接近1时,该组分质量分数下获得的复合型抑尘剂综合性能最好。由表1还可以看出,在这3种主要组分的用量范围内,对应的最优综合性能指标C值分别为0.698 4、0.704 1和0.646 3。因此,具有最佳综合性能的复合型抑尘剂中CMC、PVA和APG0810的质量分数分别为0.20%、2.00%和0.10%。按此组分配比制得的抑尘剂在25 ℃下,黏度为41.97 mPa·s、沉降时间为68.62 s、质量损失率为0.57%、小麦种子发芽率为70%。

    表 1  各组分不同用量时的复合型抑尘剂综合性能指标C
    Table 1.  Comprehensive performance index C of the composite dust suppressant with different dosages of each component
    复配组分D+D-C
    名称质量分数/%
    CMC0.010.297 10.160 60.351 0
    0.0250.287 40.130 70.312 6
    0.050.265 00.111 20.295 6
    0.0750.238 90.116 00.326 9
    0.100.228 80.119 30.342 7
    0.150.136 00.224 80.622 9
    0.200.131 10.303 60.698 4
    PVA0.100.199 40.146 10.422 9
    0.250.181 50.127 90.413 4
    0.500.181 50.111 50.380 6
    0.750.161 80.122 00.429 8
    1.000.114 10.147 50.564 0
    1.500.103 90.168 30.618 5
    2.000.091 60.218 00.704 1
    APG08100.010.179 20.273 60.604 3
    0.050.152 70.258 50.628 7
    0.100.127 60.233 10.646 3
    0.150.193 70.139 80.419 1
    0.200.279 80.119 20.298 8
    0.250.274 80.149 80.352 8
    0.300.273 60.179 10.395 7
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    1)悬铃木枝条经氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂法预处理后,再通过硝酸-乙醇法可提取出纤维素;之后,再通过碱性的醚化反应可制备出CMC。

    2)悬铃木来源的CMC与PVA、APG0810复配制得复合型抑尘剂,该抑尘剂的黏结性与抗风蚀性紧密联系,CMC和PVA对其有主要贡献;而APG0810则是影响抑尘剂润湿性和生物毒性的主要组分。

    3)通过TOPSIS法优化出的最佳综合性能复合型抑尘剂具有良好的黏结性,可以较好地润湿土壤,抗风蚀性良好,生物毒性较低。

  • 图 1  植酸分子结构式、植酸酶蛋白结构式(A)[12]及植酸循环过程(B)

    Figure 1.  Phytic acid molecular structure and phytase protein structure (A)[12] and the cycle of phytate (B)

    图 2  微生物植酸酶矿化植酸途径[112]

    Figure 2.  The pathway of phytate mineralization by microbial phytase[112]

    表 1  微生物植酸酶种类及其植酸矿化机制

    Table 1.  Microbial phytase species and phytate mineralization mechanisms

    分类方式Classification methods植酸酶种类Phytase species结构特征Structural properties植酸矿化机制Phytate mineralization mechanisms微生物Microbes参考文献References
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)[40]
    淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus[41]
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii[42]
    光岗菌(Mitsuokella multiacidusMitsuokella jalaludinii[42-43]
    6–植酸酶(EC 3.1.3.26)含有共同的活性位点保守序列RHGXRXP从肌醇6-C位启动脱磷酸化大肠杆菌(Escherichia coil[19]
    催化机制组氨酸酸性磷酸酶(HAP)N-末端基元:RHGXRXPC-末端基元:HDN-末端基元RHGXRXP中组氨酸(H)残基亲核攻击磷酸基团形成一个共价磷酸-组氨酸中间体,然后C-末端基元HD中天冬氨酸(D)残基向即将断裂的磷酸单酯键的氧原子提供质子,磷酸-组氨酸中间体水解消耗一分子水游离出磷酸基团,反应过程无需金属离子参与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae[44]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena[48]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus[50]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans[51]
    普氏菌属(Prevotella sp.)[52]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae[53]
    草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi[54]
    密螺旋菌体属(Treponema sp.[52]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia[55]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii[56]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger[58]
    β螺旋植酸酶(BPP)主要由β-折叠片组成,形状类似6叶β螺旋桨BPP具有2个不对称磷酸基团结合部位,“切割部位”(Cleavage site,CS)和“亲和部位”(Affinity site,AS),AS促进植酸分子结合,而CS负责水解磷酸基团解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloquefaciens[59]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis[60]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis[61]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[62]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii[63]
    半胱氨酸植酸酶(CP)包含活性部位基元HCXXGXXR(T/S)活性部位形成一个含保守半胱氨基酸(C241)的磷酸基团结合环(Phosphate-binding loop,P-loop),其中C241的不可逆氧化使P-loop由非活性的开放构象转变为活性的闭合构象,P-loop充当特异底物的结合环,其深度决定底物的特异性。CP有一个较深的P-loop,能适应植酸分子充分磷酸化而呈负电性的肌醇环,有利的静电环境促进底物植酸分子分解反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium[64]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[65]
    催化机制紫色酸性磷酸酶(PAP)包含特有的7个金属配合氨基酸残基,7个残基(D、D、Y、N、H、H、H)包含在5个保守基元中(DXG/GDXXY/GNH(ED)/VXXH/GHXH)PAP包括具有植酸酶活性的蛋白AtPAP15能够降低植酸含量伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)[66]
    分类方式Classification methods植酸酶种类Phytase species结构特征Structural properties植酸矿化机制Phytate mineralization mechanisms微生物Microbes参考文献References
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)[40]
    淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus[41]
    植酸发生水解脱磷酸化的位置3–植酸酶(EC 3.1.3.8)存在1个开放阅读框(ORF);2个外显子被1个真菌内含子隔开;内含子均有相同特征保守序列:供体序列GTRNGC;索套序列RCTRAC;受体序列YAG从肌醇3-C位催化水解酯键,依次释放其他碳位的磷埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii[42]
    光岗菌(Mitsuokella multiacidusMitsuokella jalaludinii[42-43]
    6–植酸酶(EC 3.1.3.26)含有共同的活性位点保守序列RHGXRXP从肌醇6-C位启动脱磷酸化大肠杆菌(Escherichia coil[19]
    催化机制组氨酸酸性磷酸酶(HAP)N-末端基元:RHGXRXPC-末端基元:HDN-末端基元RHGXRXP中组氨酸(H)残基亲核攻击磷酸基团形成一个共价磷酸-组氨酸中间体,然后C-末端基元HD中天冬氨酸(D)残基向即将断裂的磷酸单酯键的氧原子提供质子,磷酸-组氨酸中间体水解消耗一分子水游离出磷酸基团,反应过程无需金属离子参与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae[44]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena[48]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus[50]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans[51]
    普氏菌属(Prevotella sp.)[52]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae[53]
    草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi[54]
    密螺旋菌体属(Treponema sp.[52]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia[55]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii[56]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger[58]
    β螺旋植酸酶(BPP)主要由β-折叠片组成,形状类似6叶β螺旋桨BPP具有2个不对称磷酸基团结合部位,“切割部位”(Cleavage site,CS)和“亲和部位”(Affinity site,AS),AS促进植酸分子结合,而CS负责水解磷酸基团解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloquefaciens[59]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis[60]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis[61]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[62]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii[63]
    半胱氨酸植酸酶(CP)包含活性部位基元HCXXGXXR(T/S)活性部位形成一个含保守半胱氨基酸(C241)的磷酸基团结合环(Phosphate-binding loop,P-loop),其中C241的不可逆氧化使P-loop由非活性的开放构象转变为活性的闭合构象,P-loop充当特异底物的结合环,其深度决定底物的特异性。CP有一个较深的P-loop,能适应植酸分子充分磷酸化而呈负电性的肌醇环,有利的静电环境促进底物植酸分子分解反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium[64]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[65]
    催化机制紫色酸性磷酸酶(PAP)包含特有的7个金属配合氨基酸残基,7个残基(D、D、Y、N、H、H、H)包含在5个保守基元中(DXG/GDXXY/GNH(ED)/VXXH/GHXH)PAP包括具有植酸酶活性的蛋白AtPAP15能够降低植酸含量伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)[66]
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    表 2  微生物植酸酶的酶学性质

    Table 2.  The enzymatic properties of microbial phytase

    微生物Microbes最适温度/℃Temperature optimum最适pHpH optimum分子量/(KDa)Molecular weightKm/(μmol)特异性酶活性/(U·mg−1)Specific activity参考文献References
    细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens7042[67]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis606—6.536—385008.7[68]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis55, 654.5—644, 47[69]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)7074455020[70]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii504474601122[63]
    大肠杆菌(Escherichia coli604.542130811[71]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)507—7.5700[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes10—13[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae504[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena58540300205[72]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca555–6[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus40–454.945340310[56]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans604.542340140[73]
    构巢裸壳孢菌(Emericella nidulans6.56629–33[62]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae405.5453802.514[53]
    左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus707–841–4612.69[74]
    戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus50569[75]
    植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum655.5520.463[76]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)5, 7[27]
    绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa505–8[27]
    反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium50–554–5.5460.6[77]
    克雷伯菌属(Klebsiella sp.)37610–13200062.5[78]
    蜡孔菌属(Ceriporia sp.)40–605–659700 ± 80[79]
    绒毛拴菌(Trametes pubescens40–605–6621210 ± 30[79]
    弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii522.7, 5[80]
    无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus6413[81]
    细菌疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus75652110[82]
    嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila625.5[83]
    嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus128[83]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia554.5453960[55]
    克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristeensenii554.5[84]
    香蕉狄克氏菌(Dickeya paradisiaca554.5, 5.5[85]
    旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis454[86]
    真菌曲霉菌属(Aspergillus sp.)70[8]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum632.568271.1[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger65584100103[58]
    炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius534.7[87]
    土曲霉菌(Aspergillus terrus704.56011142[62]
    烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus60643[88]
    产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum2.86[89]
    简青霉菌(Penicillium simplicissimum603.5–5.3653.8[90]
    草酸青霉菌(Penicillium oxalicum554.562.5370307[91]
    枝孢霉菌属(Cladosporium sp.)403.532.615.2910[92]
    米根霉菌(Rhizopus oryzae554.5[93]
    少孢根霉菌(Rhizopus oligosporus554.51509.47[94]
    微小根毛霉菌(Rhizomucor pusillus705.4[95]
    嗜热侧孢霉菌(Sporotrichum thermophile585[96]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii50–554–4.5721001080 ± 110[56]
    米曲霉菌(Aspergillus oryzae505.51203300.35[97]
    酵母菌克鲁斯假丝酵母(Candida krusei402.5, 5.5330301210[98]
    毕赤酵母菌(Pichia pastoris602.5, 5.59525–65[99]
    异常毕赤酵母菌(Pichia anomala60464200[100]
    斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae602.595[25]
    西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis704.570380[25]
    酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae55–602–2.5, 5–5.51204[101]
    芽殖酵母菌(Saccharomyces castellii774.44900.3–8[102]
    酵母白囊杆菌(Arxula adeninivorans754.5230[31]
    微生物Microbes最适温度/℃Temperature optimum最适pHpH optimum分子量/(KDa)Molecular weightKm/(μmol)特异性酶活性/(U·mg−1)Specific activity参考文献References
    细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens7042[67]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis606—6.536—385008.7[68]
    地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis55, 654.5—644, 47[69]
    芽孢杆菌属(Bacillus sp.)7074455020[70]
    布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii504474601122[63]
    大肠杆菌(Escherichia coli604.542130811[71]
    肠杆菌属(Enterobacter sp.)507—7.5700[45]
    产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes10—13[46]
    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae504[47]
    土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena58540300205[72]
    产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca555–6[49]
    变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus40–454.945340310[56]
    成团泛生菌(Pantoea agglomerans604.542340140[73]
    构巢裸壳孢菌(Emericella nidulans6.56629–33[62]
    丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae405.5453802.514[53]
    左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus707–841–4612.69[74]
    戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus50569[75]
    植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum655.5520.463[76]
    假单胞菌属(Pseudomonas sp.)5, 7[27]
    绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa505–8[27]
    反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium50–554–5.5460.6[77]
    克雷伯菌属(Klebsiella sp.)37610–13200062.5[78]
    蜡孔菌属(Ceriporia sp.)40–605–659700 ± 80[79]
    绒毛拴菌(Trametes pubescens40–605–6621210 ± 30[79]
    弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii522.7, 5[80]
    无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus6413[81]
    细菌疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus75652110[82]
    嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila625.5[83]
    嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus128[83]
    中间耶尔森菌(Yersinia intermedia554.5453960[55]
    克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristeensenii554.5[84]
    香蕉狄克氏菌(Dickeya paradisiaca554.5, 5.5[85]
    旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis454[86]
    真菌曲霉菌属(Aspergillus sp.)70[8]
    无花果曲霉菌(Aspergillus ficuum632.568271.1[57]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger65584100103[58]
    炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius534.7[87]
    土曲霉菌(Aspergillus terrus704.56011142[62]
    烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus60643[88]
    产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum2.86[89]
    简青霉菌(Penicillium simplicissimum603.5–5.3653.8[90]
    草酸青霉菌(Penicillium oxalicum554.562.5370307[91]
    枝孢霉菌属(Cladosporium sp.)403.532.615.2910[92]
    米根霉菌(Rhizopus oryzae554.5[93]
    少孢根霉菌(Rhizopus oligosporus554.51509.47[94]
    微小根毛霉菌(Rhizomucor pusillus705.4[95]
    嗜热侧孢霉菌(Sporotrichum thermophile585[96]
    隔孢伏革菌(Peniophora lycii50–554–4.5721001080 ± 110[56]
    米曲霉菌(Aspergillus oryzae505.51203300.35[97]
    酵母菌克鲁斯假丝酵母(Candida krusei402.5, 5.5330301210[98]
    毕赤酵母菌(Pichia pastoris602.5, 5.59525–65[99]
    异常毕赤酵母菌(Pichia anomala60464200[100]
    斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae602.595[25]
    西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis704.570380[25]
    酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae55–602–2.5, 5–5.51204[101]
    芽殖酵母菌(Saccharomyces castellii774.44900.3–8[102]
    酵母白囊杆菌(Arxula adeninivorans754.5230[31]
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-10
  • 录用日期:  2022-02-09
  • 刊出日期:  2023-04-27
苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
引用本文: 苏奇倩, 丁豪杰, 李晓锋, 李林, RENSING Christopher, 刘雪. 微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108
Citation: SU Qiqian, DING Haojie, LI Xiaofeng, LI Lin, RENSING Christopher, LIU Xue. Microbial phytase and its role in phytate mineralization in soils: A review[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1366-1380. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021110108

微生物植酸酶及其对土壤植酸的矿化作用综述

    通讯作者: Tel:15751868275,E-mail:liuxue20088002@126.com
  • 1. 西南林业大学生态与环境学院,昆明,650224
  • 2. 福建农林大学资源与环境学院,福州,350002
基金项目:
国家重点研发计划项目(2018YFC1800504),国家自然科学基金(41867066,41907129),云南省自然科学基金(2019FB032)和云南省高端外国专家项目(YNQR-GDWG-2018-017)资助

摘要: 有机磷是土壤磷的主要存在形式,占比40%—90%,是作物磷营养的重要来源和储备库,亦是引起水体富营养化的潜在因子。磷作为植物生长发育的必需大量营养元素,通常以无机磷肥形式施用于土壤,易吸附于土壤表面或与钙、镁、铝、铁等金属阳离子形成难溶性络合物,导致其生物可利用性降低,其中20%—80%磷肥转化为有机磷,不易被植物吸收利用。矿化作用是在土壤微生物作用下,土壤中有机态化合物转化为无机态化合物的总称。土壤中有机磷主要以植酸及其盐类形式存在(占比50%—70%),植酸(盐)可被专一性酶(植酸酶)矿化水解为肌醇和磷酸(盐),并释放出无机磷,以供植物的根系直接吸收和利用。前期研究发现,缺磷胁迫下微生物可大量分泌植酸酶分解植酸,释放磷酸根,促使土壤有机磷水解矿化为无机磷,提高了土壤有机磷的生物可利用率。目前关于微生物植酸酶矿化植酸的研究多集中于谷类作物和动物营养,对土壤植酸矿化与土壤有机磷利用的综述性报道较少。因此,本文主要关注微生物植酸酶对土壤植酸的矿化作用与土壤有机磷利用,重点阐述其过程、机制和效率,包括微生物植酸酶的种类来源、酶学性质、作用机理和实际应用等方面的研究进展,可为提高土壤有机磷的生物利用效率、减少农业磷肥施用量、降低土壤磷流失及水体污染风险提供理论依据和技术支撑,为深入探究植酸酶功能并应用于农业生产实践及保障生态环境安全提供基础信息和参考。

English Abstract

  • 磷作为植物生长及发育必需大量营养元素,通常以无机磷肥形式施用于土壤[1]。无机磷肥进入土壤后,极易被土壤固相吸附或与钙镁等金属阳离子形成难溶性络合物,导致其植物可利用性降低。此外,20%—80%磷肥转化为有机磷,占土壤全磷的40%—90%,仅约0.1%可被植物直接吸收利用[2]。因此,为保障农作物营养和产量,常施用过量磷肥,造成严重且广泛的环境污染问题[3]。磷肥的大量施用导致土壤酸化和植物营养失衡,且易在土壤中富集,造成土壤磷污染,并通过地表/地下水进入到水体中,引起水体的富营养化[4]。据此,提高土壤有机磷的植物利用率可优化农作物生产、降低磷肥施用量、降低磷流失及水体污染风险。

    矿化作用是在土壤微生物作用下,土壤中有机态化合物转化为无机态化合物的总称。植酸(肌醇六磷酸)是土壤有机磷的主要存在形态(50%—70%)[5]。然而,植物根系难以直接吸收植酸,通常植酸需被专一性酶(植酸酶)水解生成植物能够吸收利用的正磷酸盐(磷酸氢根、磷酸二氢根)[6]。植酸酶(肌醇六磷酸水解酶)属于一类特殊的酸性磷酸单酯水解酶,能有效催化植酸及其盐类水解并产生肌醇衍生物和磷酸盐,可由土壤微生物分泌至植物根际环境中发挥作用[7]。植酸酶基因(phyA)由Richardson等[8]在黑曲霉(Aspergillus niger)中发现,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliaha),转基因拟南芥相较于野生型拟南芥的植酸酶活性由3.9—14.3 U·mg−1提高至224—14980 U·mg−1,其生长和磷营养得到显著改善,表明转基因植物可通过表达微生物植酸酶基因,高效分泌植酸酶进而有效利用植酸。Nelson等[9]首次证实饲料中的植酸可经过微生物植酸酶水解,释放出磷元素,极大推动微生物植酸酶的研究进展。随后一系列关于植酸酶提高植酸磷生物利用率的研究证实,微生物植酸酶基因可以显著促进植酸酶分泌,进而提高基质中植酸的分解效率,可为植物提供充足的磷营养[10]。因此,微生物是驱使土壤植酸矿化的关键因子,可高效分解难利用态有机磷,补偿植物根际有效/活性磷,是植物生长的重要磷源[11]

    近年来,伴随着对微生物植酸酶的研究逐步深入,关于其在农业领域的应用已引起广泛关注。目前,研究多集中于各类微生物植酸酶对谷类作物植酸矿化和在家禽动物营养中的作用,关于其对土壤植酸矿化与土壤有机磷利用的系统性综述报道较少。由此,本文主要关注微生物植酸酶对土壤植酸的矿化作用,重点阐述其过程、机制和效率,包括微生物植酸酶的种类来源、酶学性质、作用机理和实际应用等方面的研究进展。该综述可为提高土壤有机磷的生物利用率、减少农业磷肥施用、降低土壤磷流失及水体污染风险提供理论依据和技术支撑,为深入探究植酸酶功能并应用于农业生产实践及保障生态环境安全提供参考。

    • 植酸是一种有机磷化合物,属维生素B族的一类环己六醇磷酸酯,为饱和环状酸,易溶于水、甘油和丙二醇等,不溶于苯、氯仿和乙烷等。植酸的分子式是C6H18O24P6,分子量660,化学名称为环已六醇–1, 2, 3, 4, 5, 6–六磷酸二氢酯,其化学构造由1分子肌醇和6分子磷酸结合而形成,即肌醇的6个碳原子上羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物(图1A[12]。在植物中植酸主要存在于种子里,其中以豆科、谷物、油籽和坚果作物种子的含量最丰富,其含量达1%—3%,占植物体内总磷含量的40%—90%,是植物种子/谷类作物中肌醇和磷酸的重要储备库[13]

      植酸的结构稳定,高温(>120 ℃)可分解,其中6个磷酸基团拥有比较强的螯合能力,可与金属阳离子(如Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等)形成极稳定的螯合物,降低营养元素的生物有效性,降低植物和家禽等动物对矿质元素的吸收,因而被称为抗营养因子[14]。此外,植酸可与蛋白质进行络合反应,其作用形式与蛋白质的等电点有关,比蛋白质等电点低时,植酸和蛋白质分子上的碱性基团发生反应,形成很稳定的蛋白质络合物,影响动物体内的蛋白酶活性(如胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉蛋白酶等);较蛋白质等电点高时,植酸通过Ca2+、Mg2+等金属阳离子连接形成“植酸–金属离子–蛋白质”复合物,同样可以降低蛋白酶活性[15]。植酸的络合能力与乙二胺四乙酸(EDTA)相似,但因其独特性质(稳定护色、抗氧化性、耐腐蚀性等),相较于EDTA应用更为广泛,主要应用于食品工业中作为果蔬及水产的护色剂和保鲜剂、医药领域中作为止渴剂、生物学领域中作为发酵促进剂促进微生物代谢、金属加工领域中作为防锈剂和防蚀剂等[16]

    • 植酸酶,属磷酸单酯水解酶,能催化植酸及其盐类水解为肌醇和磷酸盐,具有特殊空间结构(图1A),可使植酸脱磷酸化,并释放无机磷酸盐[17]。植酸酶主要存在于微生物以及动植物中,由于微生物分布的广泛性及其植酸酶具有易分离提纯、稳定性强、活性高等动植物植酸酶不具备的特点,目前对微生物(细菌、真菌、酵母菌等)植酸酶的研究最为广泛[18]

    • 美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)的蛋白质数据库里细菌植酸酶数量远多于真菌植酸酶。目前已报道的产植酸酶细菌主要包括淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、链球菌(Streptococcus sp.)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)等。细菌植酸酶具有较高的热稳定性(如芽孢杆菌(Bacillus sp.)植酸酶)—70 ℃温浴10 min后仍具有100%的酶活性,以及高蛋白水解稳定性(如大肠杆菌(Escherichia coli)植酸酶)—植酸酶蛋白质浓度可达菌体总蛋白的47%,在植酸水解和有机磷利用等方面有着良好应用前景[19]。例如,表达植酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)具有繁殖快、表达量高、成本低的特点[20]。但糖基化是细菌表达载体生产植酸酶的主要问题,由于蛋白质产物在大量表达时极易产生错误的折叠致使酶活性丧失,因此糖基化的不同程度对于细菌植酸酶的热稳定性有着重要影响[13]

      在微生物中,真菌植酸酶的活性最强,而且真菌植酸酶通常为便于分离纯化的胞外酶,所以真菌多用于工业化生产植酸酶[21]。产植酸酶真菌主要包括无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉菌(Penicillium)等[22]。研究已证明黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶活性较高,其植酸酶基因phyA已在多种真菌中成功表达,而其他真菌植酸酶活性较低,且曲霉(Aspergillus sp.)植酸酶生产安全性较好,因此是目前工业化生产应用较多的真菌[23]

      酵母菌的致病性比较低,是植酸酶产生菌理想的研究对象,但当前对酵母菌植酸酶的研究较少,尚缺少工业化生产。已知主要的产植酸酶酵母菌分别有热带假丝酵母(Candida tropicalis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等[24]。在众多产植酸酶的酵母菌中,斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae)植酸酶的活性最高[25]。酵母菌的遗传信息较为全面,而且便于操作,来自细菌和真菌的异源植酸酶基因已在酵母菌中成功表达,由于外源蛋白表达时容易出现过度糖基化,阻碍合成蛋白的分泌和运输,故目前可作为表达载体的酵母菌种类较少,主要为毕赤酵母(Pichia pastoris[26]

    • 为分离具有胞外植酸酶活性的细菌、真菌和酵母菌,已开展较多关于产植酸酶微生物筛选的研究。Richardson和Hadobas[27]使用含植酸钠的筛选培养基,从土壤中分离出238种产植酸酶细菌,其中,4株假单胞菌(Pseudomonas spp.)植酸酶活性较高,分别是荧光假单胞菌(fluorescent Pseudomonas)—恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCAR53和CCAR59、非荧光假单胞菌(nonfluorescent Pseudomonas)—门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)CCAR31和CCAR60,其植酸酶活性分别是13.4×10−3、13.3×10−3、7.3×10−3、6.9×10−3 U·mg−1,分别从植酸钠释放出57%和54%无机磷。1994年,Volfová等[28]筛选得到132种产植酸酶微生物,其中胞外活性植酸酶主要来自真菌。随后,Gargova等[29]通过两步筛选(合成植酸酶琼脂培养基初步筛选和玉米淀粉液体培养基二次筛选)得到203种产植酸酶真菌。Lambrechts等[30]首次发现酵母菌Schwanniomyces castellii分泌物具有极高的植酸酶活性(237 U·mg−1),是其他菌株植酸酶活性的2.8倍。Sano等[31]筛选得到约1200株酵母菌株,以植酸作为唯一磷源进行培养,发现除酵母白囊杆菌(Arxula adeninivorans)外,大多数微生物无法生长,表明该微生物具有分泌植酸酶和降解植酸的能力。

      Bae等[32]建立了一种定性分析微生物植酸酶活性的方法,即用特异性琼脂培养基中沉淀态植酸钙/植酸钠的减少作为具有酶活指示。Engelen等[33]建立了简便快捷的定量分析微生物植酸酶活性的方法,即测定pH 5.5时,植酸钠分解释放无机磷含量。然而,仍有大量的产植酸酶微生物有待鉴定。目前,通过NCBI的蛋白质数据库和基因组数据库中同源序列鉴定,发现许多可以在自然环境下分泌胞外植酸酶的微生物。

      分离筛选的微生物可用液态深层发酵技术(submerged fermentation,SmF)及固态发酵技术(solid state fermentation,SSF)生产植酸酶[34]。其中,SmF作为主要的生产技术已被广泛使用,其特点是发酵的周期短、劳动的强度低与生产率高等,特别适用于细菌和酵母菌的植酸酶生产[35]。SSF是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方法,近年来,作为“高产量低成本”的生产技术,SSF在微生物植酸酶生产方面表现出极大优势,如微生物易生长、酶活性高、酶系丰富,发酵过程中无需严格的无菌条件,设备构造及后续处理简单、且易操作、能耗低、投资少、污染小等[36]。真菌植酸酶生产可通过SmF或SSF[37]。培养条件、菌种类型、底物性质和养分有效性是影响微生物植酸酶产量的关键因素。Han等[38]采用半固体底物发酵的方式生产植酸酶,发现固态发酵产生植酸酶含量比液态发酵高2—20倍。Papagianni等[39]研究SmF和SSF中培养基组成、黑曲霉形态和植酸酶产量之间的相关性关系,发现培养基组成和真菌形态对SmF生产方式中植酸酶的产生影响较大,随后添加有机磷酸盐,均可促进SmF及SSF中黑曲霉生长与植酸酶产生,其植酸酶活性分别由6770 U·mg−1和162 U·mg−1提高至8090 U·mg−1和1800 U·mg−1。这些研究表明在选择特定生产技术时,应当考虑培养的条件、菌种的类型、底物的性质和养分有效性等重要因素的影响。

    • 微生物植酸酶的种类繁多,其结构各不相同,催化机制也各有不同,目前各种微生物的植酸酶种类与酶学性质(最适温度/pH、分子量、米氏常数Km值、特异性酶活性)分别见表12

      依据植酸发生水解脱磷酸化的位置,微生物植酸酶可以分成3类:3–植酸酶(EC 3.1.3.8)、6–植酸酶(EC 3.1.3.26)及5–植酸酶(EC 3.1.3.72),分别是在植酸的第3位、6位及2位碳原子上水解释放磷酸基因[27]。根据其来源,可分为3类:细菌植酸酶、真菌植酸酶、酵母菌植酸酶[103]。根据酶活最适pH,可分成酸性植酸酶(最适pH=5—6)和碱性植酸酶(最适pH=8—10),真菌及多数细菌分泌酸性植酸酶,少数细菌分泌中性(最适pH=7—7.5)或碱性植酸酶[104]。根据催化机制,可分为4类:组氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phosphate,HAP),大多来源于肠杆菌(Enterobacter sp.)及真菌,当前应用较为普遍;β螺旋植酸酶(β–propeller phytase,BPP),多数来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.),具有较强的稳定性;然而半胱氨酸植酸酶(cysteine phytase,CP),只发现存在于瘤胃微生物(rumen microbiome);紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphate,PAP),在真菌以及细菌中分布广泛[52]

      植酸酶来源不相同,其最适pH差异亦较大[105]。细菌、真菌、酵母菌植酸酶最适pH分别为2.7—8.0、2.5—6.0、2.5—5.5,通常微生物植酸酶活性pH值是4.0–7.5,在当pH<3.0或>7.5时,其酶活性急剧下降至失活[106]。微生物植酸酶活性温度为50—70 ℃,细菌、真菌、酵母菌植酸酶最适温度为分别为37—75 ℃、40—70 ℃、40—77 ℃,45—60 ℃活性较为稳定,更高温度(>80 ℃)易失活[107]

    • 谷物饲料中含有大量植酸(盐),家畜难以直接消化利用,故植酸(盐)以未分解形式通过家畜排泄物进入土壤,此外,农业生产过程施用的大量无机磷肥可转化为植酸有机磷,造成土壤植酸积累[103]。微生物通过分泌植酸酶水解土壤植酸,释放无机磷供植物直接吸收(图1B)。Chen等[108]指出,土壤植酸矿化分解与植酸酶数量和活性具有显著相关性。Bünemann[109]指出,>60%土壤有机磷可被磷酸酶水解,其中植酸酶释放的磷高达80%。Tarafdar等[110]发现,微生物植酸酶能有效水解土壤植酸从而释放无机磷酸盐,比动植物植酸酶效率高约50%。以上研究表明,微生物是驱动土壤植酸矿化的关键因子,对提高土壤有机磷的利用率具有重要作用。

      植酸的矿化机制虽在上世纪60年代已被研究,但当前植酸的代谢途径和形成产物仍然是植酸酶研究的重点。随着分离方法的发展,尤其是色谱技术在矿化产物分析中的广泛应用,发现不同来源植酸酶的作用机理存在差别[111],其中,微生物植酸酶矿化植酸的途径为:植酸→DL-1,2,4,5,6–五磷酸肌醇→DL-1,2,5,6-四磷酸肌醇→DL-1,2,5-三磷酸肌醇/DL-1,2,6-三磷酸肌醇/DL-2,5,6-三磷酸肌醇→DL-1,2-二磷酸肌醇/2,5-二磷酸肌醇/DL-2,6-二磷酸肌醇→2-磷酸肌醇(图2[112]

    • 微生物植酸酶活性是植酸矿化效率的主要影响因子(表2),而微生物植酸酶活性受生物和物理化学过程的影响[113],前者引起酶生产速率、同工酶(催化相同反应而分子结构不同的酶)生产和微生物群落组成的变化,后者引起吸附解吸反应、底物扩散速率和酶降解速率的变化[114]。影响酶活性的关键因素包括:

      (1)微生物植酸酶活性由底物种类和数量等几个相互关联的因素共同决定[115]。通常使用添加不同底物的方法来测定微生物的植酸酶活性,包括萘磷酸、6–磷酸葡萄糖、2–甘油磷酸、植酸钠、植酸钙、β–甘油磷酸盐、对硝基苯酚磷酸盐、6–磷酸果糖、一磷酸腺苷(adenosine–5’–monophosphate,AMP)、二磷酸腺苷(adenosine–5’–diphosphate,ADP)、三磷酸腺苷(adenosine–5’–triphosphate,ATP)、三磷酸鸟苷(guanosine–5’–triphosphate,GTP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)等[116]。根据底物的差异,将其分成特异性及非特异性酸性磷酸酶[117]。研究发现,一些微生物植酸酶对植酸具高特异性,如芽孢杆菌(Bacillus sp.)、曲霉菌(Aspergillus sp.)和大肠杆菌(Escherichia coli[118],其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)植酸酶活性随植酸浓度增加而增加,最高活性可达10 mmol[119]

      (2)反应体系的pH对微生物植酸酶活性具有一定影响。微生物植酸酶比植物植酸酶具有更宽泛的pH适宜范围,但其最适pH因微生物种类而存在差异[30]。植酸酶主要分成碱性植酸酶以及酸性植酸酶,其最适pH值范围是5.0–8.0[59]。真菌植酸酶的最适pH值为4.5–6.5,如烟曲霉(Aspergillus fumigatus[120]。丝核菌(Rhizoctonia sp.)和镰刀菌(Fusarium verticillioides)在pH分别为4.0和5.0时分泌植酸酶[121]。而细菌植酸酶在pH值分别为6.0和8.0时活性最强,如芽孢杆菌(Bacillus sp.)[62]。因此,控制适宜反应体系的pH值对保障微生物植酸酶的产量及其活性有利。

      (3)温度是微生物植酸酶活性的重要影响因素,既影响微生物活性(即植酸酶的生成与产量),亦影响酶的活性(即植酸矿化速率)[122]。一般通过计算活化能(Ea)来确定酶对温度的响应,两个过程(生产和降解)的速率本应随着温度的升高而增加,但由于Ea的差异,它们表现出不同的温度敏感性[123]。研究表明,微生物植酸酶的温度敏感性随季节变化,并且在单一环境中存在差异[124]。与温暖气候相比,微生物在寒冷气候中分泌植酸酶的最适温度较低、结构灵活性和改变结构的能力较差[125]。微生物植酸酶的最适温度范围为35—77 ℃,镰刀菌(Fusarium verticillioides)植酸酶最适温度为50 ℃,其稳定性可保持至60 ℃,而克雷伯菌属(Klebsiella sp.)植酸酶在较低温度37 ℃保持最大活性[126]。Johnson等[127]研究指出,产植酸酶微生物的代谢速率随温度升高而加快,平均Ea为0.62 eV。因此,与酶动力学本身相比,温度对微生物植酸酶的代谢速率起着更为重要的作用。

      (4)土壤理化性质的影响,包括全氮含量和土壤质地类型[128]。氮是微生物植酸酶生产中不可缺少的元素,对不同氮源影响微生物植酸酶产量的研究发现,在麦麸培养基和桔皮粉培养基中添加0.1%磷酸二氢铵(NH4H2PO4)时微生物植酸酶产量最高,分别达2.41 U·mL−1和3.15 U·mL−1[129]。不同无机氮源对真菌和细菌植酸酶生产具有影响,相较于硝酸铵(NH4NO3)和其他天然氮源(酵母浸出物、蛋白胨、豆粉等),尿素(CH4N2O)和硫酸铵((NH4)2SO4)更有利于无花果曲霉(Aspergillus ficuum)生产植酸酶(20 IU·g−1 vs. 25 IU·g−1[130]。微生物植酸酶的活性在很大程度上受土壤类型的影响,土壤中各成分对植酸酶活性的影响各不相同[131]。与砂土相比,粘土中微生物植酸酶活性显著降低35%[132]。Rao等[133]指出,黏土中Al3+氧化物可降低20%的微生物植酸酶活性。George等[129]发现,微生物植酸酶在砂土中吸附28 d后仍保持40%活性,而在粘土中活性仅为5%。

      综上所述,微生物植酸酶活性的影响因素包括底物的种类和数量、反应体系的pH、温度以及土壤理化性质,这些因素影响微生物植酸酶生产速率、底物扩散速率与酶降解速率等,进而影响土壤植酸的矿化速率。

    • 土壤中的有机磷由于生物可利用性较低,成为农作物的主要营养限制因子,合理开发利用土壤中的有机磷资源对可持续农业发展具有重要意义。植酸是土壤有机磷的主要成分,可在微生物植酸酶的矿化作用下水解为无机磷供植物吸收利用,微生物植酸酶可提高土壤植酸的生物利用率,降低磷肥的施加和投入,亦可减少土壤磷残留量,降低地表/地下水体的磷污染风险。

      利用产植酸酶功能微生物进行对土壤植酸的降解,有耗能低、投资少、操作简单和二次污染小等优势。然而,现阶段对于充分发挥微生物植酸酶在土壤植酸水解中优势的实际应用仍显不足,鉴于此,今后可加强以下几方面的研究:(1)深入研究微生物植酸酶的空间结构,进一步阐明微生物植酸酶结构及其功能间的关系;(2)筛选酶活性高、热稳定性好的产植酸酶微生物,并采用基因重组技术生产微生物植酸酶;(3)研发经济、快速的微生物植酸酶分离提纯方法,提高纯化精度与速率,以提高微生物植酸酶产量;(4)使用固定化技术解决在微生物植酸酶生产、运输、使用及储存时保持其酶活性的问题;(5)通过蛋白质工程和基因工程改造微生物植酸酶基因,以降低生产成本、提高其产量。磷为不可再生资源,深入研究微生物植酸酶对土壤重要有机磷–植酸的矿化作用过程机制及矿化速率关键影响因素,对实现土壤有机磷的高效利用,降低外源磷肥施用及农业生产成本,且控制过量磷肥施用存在的潜在面源污染及水体富营养化风险具有重要的现实意义。

    参考文献 (133)

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