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人工湿地技术是一项通过模拟或强化生态系统的结构和功能，利用植物 、微生物及动物等的共同作用进行水污染治理和生态修复的水质净化工程技术，已被广泛应用于地表水的保护以及多种污废水，如生活污水、农业废水、工业废水、酸性矿山排水、城市和公路径流的脱氮处理[1-3]。其中，垂直流人工湿地，由于具有较好的有机物和氨氮去除能力[4-7]，并具有占地面积小的优势，在实际工程中常用于处理含氮量较高的污水[8-9]。目前国家对于农村生活污水的排放标准主要考察COD、氨氮和总氮等指标，没有对硝态氮作出明确要求，所以在使用传统非饱和垂直流人工湿地时也是主要考虑强化其对氨氮的硝化能力，忽略了对其反硝化能力的提升，从而导致其反硝能力普遍较弱[10-13]。
微生物的硝化和反硝化作用是人工湿地脱氮的主要途径，但二者对氧的需求不同[14]。一般来说，参与硝化过程的功能微生物对氧的需求较高，大多数为好氧或兼性好氧微生物，而参与反硝化过程的功能微生物多数为兼性厌氧微生物。因此，当水中溶解氧(dissolved oxygen，DO)<1~2 mg·L−1时硝化作用会减小, DO>0.2 mg·L−1 反硝化作用受到抑制[15-16]。大多数传统垂直流人工湿地系统在运行过程中是处于水不饱和状态，大气复氧能力强，有利于硝化作用进行但不利于反硝化作用进行。因此，为了弥补传统垂直流人工湿地反硝化能力差的问题，本研究对传统垂直流人工湿地系统进行了结构改造，将系统构建成分内、外两层的多氧态垂直流人工湿地，采用内层底部连续进水，在内层形成水上行的饱和状态和厌氧环境，促进生活污水中的高浓度有机化合物进行厌氧降解，使污水中有机氮通过氨化反应转化为氨氮[17]。同时，在外层形成水下行的部分饱和状态，使系统(尤其是系统外层)中DO的分布呈持续的动态变化状态(多氧态)，为硝化和反硝化过程的进行提供适宜的DO环境，在系统外层上部的非饱和区利用硝化反应将氨氮转化为硝态氮，在系统外层下部的饱和区利用反硝化反应将硝态氮转化为氮气，从而实现在同一湿地系统中将污水中的有机氮经氨化降解、再硝化、反硝化彻底去除的目的。此外，本研究对该湿地系统在不同水饱和比、不同水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)条件下的污染物去除效率、基质中微生物群落结构的演变规律以及氮循环功能基因的分布特征进行了分析和比较，可为多氧态垂直流人工湿地系统的推广和应用提供参考。
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本实验采用自行设计的多氧态垂直流人工湿地系统，实验装置设置在桂林理工大学污水处理站内。系统由配水箱、蠕动泵和垂直流人工湿地3部分组成如图1所示。垂直流人工湿地部分由内外两层的PVC圆柱体建成，内层直径为16 cm，外层直径为30 cm；内层高度为0.7 m，填充高度为0.6 m；外层高度0.8 m，填充高度为0.7 m，内外层填充体积比为1:3。进水通过蠕动泵和布水装置均匀的从内层底部自下而上的流过内层床体，出水由与外层底部的出水口相连的软管排出。根据虹吸原理，通过调节出水软管高度来控制外层床体的饱和区水位，以外层饱和区水位高度与总高度比值来表示系统外层水饱和比。
湿地系统的内、外层分别采用粒径8~10 mm的石英砂颗粒和粒径5~8 mm的焦炭颗粒进行填充。内外层主体填料的上下两端各填充厚度为5 cm的鹅卵石，作为进水区和集水区，以截留悬浮物防止堵塞。内外层的填料层上种植的植物为美人蕉。填料中在内层距底部20 cm(a点)和40 cm(b点)处，以及外层距底部25 cm(c点)和55 cm(d点)处分别埋有直径8 mm的4根采样管，便于水样采集。
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实验进水取自桂林理工大学污水站的生活污水，污水中COD、NH4+-N、NO3−-N的平均质量浓度分别为(105.60±17.36)、(51.54±14.35)、(0.78±0.45) mg·L−1。实验正式开始前，系统先在HRT为48 h的条件下连续进水1个月进行预培养，使系统运行达到稳定。
为确保系统外层水位不会影响最佳HRT的确定，正式实验以系统外层水饱和比(既外层水位高度与外层填料高度的比值)为0的条件作为对照，比较HRT 分别为6、12、24、48 h时对污染物(COD和NH4+-N)的净化效果，来确定系统污染物去除的最佳HRT。再在最佳HRT条件下，比较系统外层水饱和比分别为1、3∶4、1∶2、1∶3、0时，对污染物的去除效果，确定最优的系统外层水饱和比；同时，分析该水饱和比条件下湿地系统内部的饱和区和非饱和区DO、ORP分布特征，确定系统的多氧态形成情况。最后，在最佳外层水饱和比和最佳HRT条件下，控制进水C/N为7:1，测定系统对高负荷生活污水的污染物净化效率，分析比较系统填料微生物群落结构、以及反硝化功能基因的丰度变化情况，分析其促进污染物去除的机理。
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1)水样采集与分析。水样采集位点如图1所示为内层20 cm(a点)、内层40 cm(b点)、内部顶层(i70 cm)、外层25 cm(c点)和外层55 cm(d点)，分别标记为内层20、内层40、内层70、外层25、外层55。内、外层填料中不同高度的水样使用洗耳球通过预埋的采样管吸取，i70 cm的水样采用50 mL注射器直接抽取，出水水样直接从排水管口直接收集。每个点水样采集至少150 mL。针对特定条件运行周期，每2 d采集1次，水样采集后立即带回实验室进行分析。分析的指标包括：化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3−-N)。测试方法分别为：重铬酸钾法(GB11914-89)，纳氏试剂分光光度法(GB7479-87)和紫外分光光度法(HJ-T346-2007)。水样采集的同时，以便携式YSI多参数水质分析仪在采样现场测定各采样点的DO、氧化还原电位(oxidation-reduction potential，ORP)。
2)微生物样品采集与分析。实验末期，控制系统外层水饱和比为1:2，进水C/N为7:1，连续运行两周。期间除了水样采集，在实验结束后，再在如图1所示的a点、b点、c点和d点4个水样采集点中，各取3个基质样品，将其均匀混合后取10 g作为该采样点的基质微生物样品，其中对b点和d点处样品进行氮循环功能基因定量PCR分析。样品采集后，立即送样至北京奥维森生物科技有限公司进行DNA提取，微生物多样性检测和氮循环功能基因定量PCR分析。其中，DNA 提取方法参照 DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)试剂盒说明书。微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3~V4区，利用 Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序。氮循环功能基因定量PCR分析选择氨氧化作用的三种菌(AOA，AOB与厌氧氨氧化 (Anammox) 菌和反硝化菌)的功能基因进行研究。定性和定量PCR时，AOA与AOB的扩增都采用功能基因氨单加氧酶amoA的引物，Anammox菌的扩增采用Anammox 16s-RNA；硝化检测功能基因nxrA、nxrB；反硝化菌检测功能基因narG、nirS和nirK。所有引物的合成和数据分析处理均由北京奥维森生物科技有限公司完成。
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通过改变可伸缩U型管的出水高度，控制系统外层水饱和比为0，比较不同HRT条件下系统对污染物COD和NH4+-N的净化效果，此阶段进水COD为140.62~219.53 mg·L−1，进水NH4+-N在32.36~65.65 mg·L−1。由图2可以看到，随着HRT从6 h增加到48 h，湿地系统的COD和NH4+-N的去除率逐渐从76.03%和88.28%(6 h)增加到95.76%和98.38%(24 h)，并在48 h时达到96.64%和99.04%。
在HRT为6 h和12 h时，系统对污染物的去除率较低，这可能在于停留时间较短，系统的水力冲刷大，污水在系统填料间的停留时间较短，不能充分被微生物转化、降解。而当HRT增大为24 h和48 h时，系统对污染物的去除率逐渐升高并达到最佳状态，对COD和NH4+-N的去除率可达到90%以上，可见，HRT的变化可显著影响人工湿地的污染物净化效果。分别核算HRT为24 h和48 h时的单位面积氨氮负荷去除量可得，24 h时为8.22 g·(m2·d)−1，48 h时为5.11 g·(m2·d)−1，则系统在24 h时对氨氮的去除效能最好，同时从经济性上考虑，过长的HRT可能会造成系统处理能力的浪费。因此系统HRT采用24 h时长，既可以保证污染物的最好净化效果，又能充分发挥系统的处理能力，因此后续的实验均在HRT为24 h条件下进行。
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1)多氧态湿地系统的最优水饱和比。在HRT为 24 h条件下，通过改变可伸缩U型管的出水高度，控制系统外层水饱和比分别为1、3:4、1:2、1:3、0，比较系统在不同水饱和比条件下对COD和NH4+-N的去除效果，结果如图3(a)和图3(b)所示。
方差分析结果表明，系统外层水饱和比对COD和NH4+-N的去除均有显著性影响(P<0.05)。水饱和比为0时COD的去除效率最高，约为96%；水饱和比为1∶2、1∶3和0时，NH4+-N的去除效率均在98%以上，故分别核算系统外层水饱和比为1、3∶4、1∶2、1∶3和0时的单位面积氨氮负荷去除量为6.78、18.76、21.30、16.71和8.22 g·(m2·d)−1，可得本系统在外层水饱和比为1∶2时对氨氮的去除效能最好。总的来看，系统外层水饱和比为1∶2时，系统对COD和NH4+-N可以达到相对较好的净化效果。
2)多氧态湿地系统的DO及ORP分布特征。DO是影响污水有机物去除效率的重要因素，ORP则可综合DO、有机物质及微生物活性等指标来反映系统中的氧化还原状态[18]。当外层水饱和比为1∶2时，湿地系统DO及ORP 分布特征如图4(a)所示。系统内层饱和区的DO普遍较低(0.2~0.7 mg·L−1)，基本处于厌氧状态，ORP呈由内层底部(20 cm)的−143.04 mV向顶部(70 cm) 提升至−124.1 mV，呈逐渐升高的趋势。系统外层分为水饱和区和非饱和区，但二者的DO和ORP均显著高于内层。其中，外层的DO由底部向顶部同样呈现由低向高的逐渐变化，且表现出好氧、缺氧和厌氧区的区分，其中c点处DO值为0.7~1.7 mg·L−1，处于缺氧状态；d点DO值在2.1~2.5 mg·L−1，处于好氧状态。同时，外层中的ORP随着深度的增加呈下降趋势，−49.10 mV(d点)降到−68.80 mV(c点)。以上结果表明，本研究采用的双层垂直流人工湿地设计，可通过控制系统外层水饱和比的高低，调节系统的饱和区和非饱和区的占比，促使系统尤其是系统外层的DO和ORP分布呈持续的动态变化状态，实现系统多氧态状态的构建。
垂直流人工湿地中有机物的去除主要是通过微生物的氧化，对NH4+-N的净化主要是通过微生物的硝化作用。由图3可见，当外层的水饱和比为0时，有机物的去除效率最高；系统外层水饱和比≤1:2时，NH4+-N的去除效率即可达到98%以上。由图4(b)可以看出，i70 cm处的NH4+-N质量浓度高于进水。这可能是因为系统内层发生的厌氧发酵使得污水中的有机氮在微生物作用下转化生成NH4+-N，同时部分有机物也被降解去除，使COD的去除率接近70%，之后随着外层非饱和区利用大气的复氧作用使得水中DO含量上升，为有机物的进一步氧化分解及NH4+-N的硝化去除创造了条件，表现为出水中NO3−-N质量浓度上升，而COD和NH4+-N质量浓度持续下降。
3)多氧态湿地系统中氨氮的转化。传统垂直流人工湿地中，部分饱和的垂直流人工湿地的反硝化效果明显高于不饱和垂直流人工湿地[19]。因此，在外层水饱和比分别为0和1:2的条件下，对比系统进、出水的NH4+-N和NO3−-N的浓度得到如图5所示结果。可以看出，系统外层水饱和比为0时，进水中的NH4+-N几乎全部转化成NO3−-N，且出水中NH4+-N和NO3−-N的含量与进水中的基本相当，说明此条件下，进水中NH4+-N质量浓度的降低主要是依靠硝化作用，但产生的NO3−-N 在系统中没有进一步的转化。这可能由于此条件下系统由外层底部直接出水，非饱和区占比大，所以NH4+-N的硝化作用彻底，绝大部分均转化成了NO3−-N 。但由于决定NO3−-N 去除的反硝化阶段缺失，因此系统总的脱氮效率较低。而当系统外层的水饱和比为1∶2时，外层形成了一定的饱和区，使其底部呈现缺氧状态，而顶部仍然是好氧状态，整个系统形成厌氧-好氧-缺氧的多氧态，进水中的NH4+-N可以通过硝化作用去除，其生成的NO3−-N 也能够在外层下部饱和区的缺氧环境中发生反硝化作用生成N2去除，所以该条件下出水的NO3−-N 含量更低，同时NH4+-N+NO3−-N的含量也显著下降，仅为系统外层水饱和比为0时的57%，可大大提高系统总的脱氮效率。因此，与传统非饱和垂直流湿地相比，多氧态湿地系统的不仅保留了其原本的硝化能力，还提升了一定的反硝化能力[19–20]。
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控制湿地系统外层水饱和比为1:2，进水C/N为7:1(COD为350.23~381.46 mg·L−1、NH4+-N为50.23~60.57 mg·L−1)，测定系统对COD和NH4+-N的较高有机负荷污水的净化效率。如图6所示，多氧态湿地系统对污水中COD的去除率可达91.92%，而NH4+-N去除率也可达到90.53%。说明本系统具有良好的有机物降解能力，能够去除较高负荷的有机污染物，同时对于高氨氮污水也有较高的处理能力。
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以特定功能基因或特定的16S-RNA片段作为分子标记，采用定量 PCR(Real-time PCR)来测定特定基因片段的相对数量，可以对样品中特定功能微生物数量进行定量分析[21]。本研究选择的分子标记：氨单加氧酶amoA、亚硝酸盐氧化酶nxrA和nxrB、硝酸还原酶narG、亚硝酸还原酶nirS和nirK 是参与自然界氮循环过程的关键催化酶，其分别在氨的好氧氧化、亚硝酸盐氧化、亚硝酸盐还原、硝酸盐还原过程中起到重要作用；Anammox菌介导的厌氧氨氧化过程，可直接在缺氧条件下以NH4+为电子供体，亚硝酸盐为电子受体，产生N2。
由图7(a)可知，多氧态湿地系统amoA功能基因主要来源于AOA，且外层中amoA功能基因的数量显著高于内层，说明系统的好氧氨氧化作用主要发生外层，且主要由好氧氨氧化细菌驱动[22–23]。与之类似, 通过图7(b)可看出，催化亚硝酸盐氧化的重要功能基因nxr在外层中的含量比内层高，也说明系统外层中的硝化作用更强[24]。因此，由图7(a)和图7(b)可以表明外层营造的好氧环境为硝化细菌的生存和繁殖提供了适宜的环境。
此外，系统中还同时存在一定量的Anammox菌，其中内层石英砂的丰度为2.91×109 拷贝数·g−1，外层焦炭中的丰度为7.86×108 拷贝数·g−1，与AOA的数量基本持平，但主要分布在系统内层饱和区，这与Anammox菌对氧的需求适应。Anammox菌能够在厌氧/缺氧的条件下，直接以NH4+为电子供体，NO2−为电子受体，产生N2[25]。虽然这一过程的存在，可能使亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的因为底物竞争而生长受抑，使nxrA、nxrB基因的数量较低(图7(b))，但Anammox过程的存在，可以使NH4+直接转化为N2而去除，对提高系统总氮的去除效率是非常有利的。
narG编码的硝酸盐还原酶参与催化反硝化过程的第1步，促使硝酸盐向亚硝酸盐的转化，而nirK和nirS则是编码反硝化过程第2步中催化亚硝酸盐还原酶的关键功能基因[26–27]。由图7(c)和(d)可知，narG、nirK和nirS在系统内、外层中均有分布，但在系统内层中的含量均比外层中的少。这可能与外层中的NO3−-N含量远大于内层有关，也表明系统多氧态的形成，可以促使反硝化作用在外层进行，提升系统总的氮去除能力，这也与前期的研究结果(图5)相符合。
总的来看，本湿地系统构建形成的“多氧态”状态，可以在保持传统垂直流人工湿地系统水流特点和优势的同时，为对氧具有不同需求的氮循环功能微生物提供适宜的微生态环境，强化其生物转化作用(包括硝化、反硝化以及Anammox作用)，从而提高系统的氮去除效率。
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1)门水平微生物群落结构。对多氧态湿地系统内外层共4个基质样品进行微生物多样性检测分析，并对所有OTU系列进行物种注释，共得到60多种不同的细菌门。如图8所示，微生物数量最多的前3个门依次为Proteobacteria(变形菌门) 、Chloroflexi(绿弯菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)，这3种菌门也被广泛报道存在于水处理反应器中[28-30]。
从门水平看，Proteobacteria在4个样本中均为相对丰度最高的优势种，这与ANSOLA等[31]在人工湿地中的研究结果一致。Proteobacteria属于革兰氏阴性细菌，其物种和遗传多样性极为丰富，是COD去除和脱氮过程的重要贡献者。本研究结果表明，Proteobacteria在系统外层所占的比例(平均55.6%)比内层的(平均25.8%)高(图8)，说明湿地系统多氧态的构建可以促使Proteobacteria大量繁殖，从而可能提升系统的污染物去除能力增加。
此外， 4个样本中Chloroflexi和Bacteroidetes的相对丰度仅次于Proteobacteria，但二者在系统内层所占的比例(平均21.9%)比外层的(平均6.6%)大(图8)，这与Chloroflexi和Bacteroidetes均属于兼性厌氧微生物，对氧的需求较低有关。已有研究表明这两类细菌都是有机物的主要降解者，能够降解复杂的有机物[32]。因此，Chloroflexi和Bacteroidetes在内层的广泛存在，可充分发挥其对复杂有机物的降解能力，有利于系统对有机污染物的去除。同时，多氧态湿地系统中丰度较大的还有Caldiserica、Actinobacteria、Firmicutes、Acidobacteria等，他们在有机物的矿化和氮的固定等方面发挥着重要作用[33]。
2)属水平微生物群落结构。以属为单位对多氧态湿地系统的微生物群落结构进行分析得到图9。系统内层的优势菌属为Caldisericum、Longilinea、Smithella、Leptolinea、Syntrophorhabdus等厌氧菌，他们均与有机物的代谢有关，其中，Longilinea和Leptolinea对多糖具有良好的降解能力[34]，Caldisericum和Syntrophorhabdus是工业废水生物处理系统中常见菌种，有助于有机物的降解，并且Syntrophorhabdus是厌氧生态系统中的丰富细菌主要降解芳香族化合物[35]。他们在样品总丰度中的占比分别为37.74%(内层20)、34.70%(内层40)、1.09%(外层25)、0.14%(外层55)，且在内层的相对丰度远大于在外层的。可以推测，系统的有机物降解过程主要在系统内层发生。
系统的外层优势菌属为Rhodanobacter、Nitrospira等。其中，Rhodanobacter属变形菌门γ-变形菌纲的黄色单胞菌科[36]。该菌在好氧的土壤表层发现并分离，具有反硝化能力[37-40]，它在多氧态湿地系统的外层中大量出现，可促进反硝化反应的进行。而外层的另一优势菌Nitrospira是亚硝酸盐氧化细菌的主要菌属，主要分布在外层上部的好氧区域，丰度达2.94%。作为硝化过程中的关键菌属，它可将水体中的亚硝酸盐氧化成硝酸盐[41]，其在系统外层的优势存在，也很好的解释了为何多氧态湿地系统的外层具有较强的硝化能力。
3)多氧态湿地系统促进氮去除的机理。综上所述，本实验所构建的多氧态垂直流人工湿地，可通过调节外层水饱和比，在保证系统有机物去除效率的同时，提高系统总的脱氮效率，这与其特殊的分层结构有关。首先，多氧态垂直流人工湿地分为内外两层，当外层不饱和比为0时，其内层与传统的多氧态垂直流人工湿地相似，出水中氮主要以NO3−-N为主，NH4+-N 和 NO3−-N的含量与进水相比，降低仅为5%左右。而当外层不饱和比大于0时，系统的外层被由下到上被分成了饱和区和非饱和区，这与内层在完全饱和状态下形成的单一缺氧甚至是厌氧的环境相比，外层由底部向顶部DO和ORP均逐渐上升，形成同时兼备厌氧-缺氧-好氧环境的结构特点， 这使得系统外层中参与反硝化和硝化过程的微生物如Rhodanobacter和Nitrospira等均得到优势生长(图9)，系统的外层硝化和反硝化功能也比内层得到强化(图7)，从而使系统的氮去除能力得到提升(图5)。
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1)通过调节系统外层水饱和比，多氧态湿地系统的内层呈饱和状态，DO比较低，属于缺氧厌氧区；外层上部非饱和区为好氧区，底部饱和区为厌氧/缺氧区，能够形成由厌(缺)氧到好氧的氧化还原分区。
2)多氧态湿地系统对NH4+-N和COD均有较好的去除效果，而当外层水饱和比为1:2，HRT为24 h时，多氧态湿地系统对污染物的净化效果最好。
3)多氧态湿地系统氮循环功能微生物的数量在外层中的分布高于内层，对系统的硝化和反硝化功能均有促进作用，可提升系统总的氮去除效率。
4)多氧态湿地系统内、外层的微生物群落结构组成具有显著差异。在门水平上Proteobacteria、Chloroflexi和Bacteroidetes的相对丰度较大，其中Proteobacteria在系统外层的丰度较大，而Chloroflexi和Bacteroidetes在内层丰度较大。属水平上，系统外层与内层的优势菌属也不同，外层的优势菌属为Rhodanobacter，属于反硝化菌；内层的优势菌属为Caldisericum、Longilinea等厌氧菌，有助于有机物的降解。
多氧态垂直流人工湿地系统的构建及其污染物去除特性
Construction of vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones and its removal characteristics on pollutant
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摘要: 针对传统垂直流人工湿地因缺少厌氧及缺氧环境，反硝化能力较弱的问题，本研究对传统垂直流人工湿地系统进行了结构改造，构建为分内、外两层的多氧态垂直流人工湿地，在不降低其原有硝化能力的同时，通过增加系统的厌氧及缺氧体积，提升其反硝化能力。对该湿地系统在不同水饱和比、不同HRT条件下的污染物去除效率、基质中微生物群落结构演变规律以及氮循环功能基因的分布特征等进行的研究表明：当外层水饱和比为1:2，HRT为24 h时，多氧态垂直流湿地系统对NH4+-N和COD的净化效果最好；系统氮循环功能微生物的数量在外层中的分布高于内层，且对系统的硝化和反硝化功能均有促进作用，可提升系统总的氮去除效率。以上研究结果可以为多氧态垂直流人工湿地系统的推广和应用提供参考。
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关键词:
- 多氧态垂直流人工湿地 /
- 水饱和比 /
- 去除效率 /
- 功能菌 /
- 功能基因
Abstract: Aiming at the problem that the traditional vertical flow constructed wetland has weak nitrogen removal ability due to the lack of anaerobic and anoxic environment, in this study, the structure of the traditional vertical flow constructed wetland system was reconstructed, and a vertical flow constructed wetland system with inner and outer double-layer construction and multi-aerobic and anerobic zones was built. The denitrification ability of this wetland system was strengthened by increasing its anaerobic and anoxic volume, and its original nitrification capacity did not change. At different water saturation ratio and hydraulic residence time, the pollutant removal efficiency, matrix microbial community structure and the distribution characteristics of nitrogen cycling functional genes in the matrix of wetland system the evolution were studied. The results showed that the best removal rates of NH4+-N and COD occurred when the water saturation ratio of the outer layer was 1:2 and the hydraulic residence time was 24 h; the abundance of nitrogen cycling functional microorganisms in the outer layer of the system was higher than that in the inner layer, which could promote both nitrification and denitrification functions of the system and raise the nitrogen removal rate of the system. The results of this study can provide a reference and basis for the popularization and application of vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones. -
化工、制药及个人护肤品等行业产生的一些新兴有机污染物如内分泌干扰物、药物、杀虫剂等通过各种途径进入到了天然水体当中，这些被污染的水体普遍具有毒性大、新型污染物众多和难生物降解等特点[1-2]。双酚A(bisphenol A, BPA)是内分泌干扰物中的一种，分子结构如图1所示。其被广泛用于聚碳酸酯、环氧树脂、抗氧剂、增塑剂、油漆、农药等方面[3]。有研究[4-5]表明，BPA具有雌激素作用，摄取低浓度就能破坏人体的内分泌系统，造成不育、畸胎等，对人体的危害是持续性、累积和不可逆的，对家畜和野生动物的健康也会产生极大的影响。因此，寻求一种经济高效的解决BPA污染的方法具有重大的现实意义。
近年来，对BPA的去除方法主要有物理、生物及高级氧化法。传统的物理去除法如膜技术、离子交换以及活性炭吸附等仅能实现污染物的相转移，需要进一步后续处理[6]。生物法对含有生物毒性的酚类、醛类、酸类降解去除时会表现出很大的局限性[7-9]。高级氧化法如光催化[10]、电催化[11]、Fenton-类芬顿[12]和超声氧化[13]等对BPA的降解去除具有降解彻底、反应速度快、二次污染小等特点。但光、电催化、超声氧化等仍处于实验室阶段，工程应用难度大，Fenton法在水处理中有较多应用，但存在出水水质偏黄、pH局限于3左右、含铁污泥需要进一步处理等缺点[14]。本研究提出了以硫酸铜为催化剂的类芬顿法，主要考察了催化剂、H2O2用量、反应温度、BPA初始浓度和pH对BPA去除效果的影响，以期为处理此类有机废水提供技术参考。
1. 材料与方法
1.1 实验原料与仪器
BPA(C15H16O2、Adamas试剂有限公司)、香豆素(C9H6O2、Adamas试剂有限公司)、7-羟基香豆素(C9H6O3、Acros)、氯化铜(CuCl2·2H2O、广东省化学试剂工程技术研究开发中心)、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、硫酸铁(Fe2(SO4)3)、硫酸锰(MnSO4·H2O)均购自成都市科隆化学品有限公司，硝酸铜(Cu(NO3)2·3H2O)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、二氧化钛(TiO2)购自成都市科龙化工试剂厂，双氧水(H2O2、30%)购自重庆川东化工(集团)有限公司，以上均为分析纯。紫外可见分光光度仪(UV-2550、日本岛津)、恒温水浴振荡器(SHA-C、金坛市易晨仪器制造有限公司)、离心机(TGL20M-Ⅱ、金坛市城西春兰实验仪器厂)、总有机碳(TOC)分析仪(TOC-VCPN、日本岛津)、荧光分光光度仪(F-7100、日本HITACHI)、pH计(FE20、瑞士梅特勒)。
1.2 实验方法
在放置于恒温水浴振荡器的具塞锥形瓶中，进行BPA模拟废水的类芬顿催化氧化去除反应。向锥形瓶中加入一定量的由蒸馏水和BPA配成的模拟BPA废水溶液，然后分别加入一定量的硫酸铜催化剂和质量分数为30%的H2O2，之后在120 r·min−1的转速下反应。取不同反应时间条件下的反应液，经离心分离后，取其上清液分别测定TOC和吸光度值。
1.3 分析方法
BPA的浓度可通过紫外-可见分光光度法建立的BPA浓度标准曲线来计算，其特征吸收波长为276.4 nm，全波长扫描结果见图2。总有机碳由TOC仪测定。H2O2浓度由钛盐光度法[15]测定。反应过程中产生的 · OH由香豆素捕获，通过荧光分光光度仪定量检测反应过程中产生的7-羟基香豆素，从而推算 · OH浓度[16]。
2. 结果与讨论
2.1 催化剂的筛选
为了筛选成本低廉、效果较好的催化剂，主要考察了过渡金属化合物在类芬顿反应体系中对BPA的去除效果，结果如图3所示。图4和图5分别为BPA和H2O2的浓度标准曲线。由图3可知，硫酸铜、氯化铜和硝酸铜3种铜类化合物对BPA的去除效果相差不大，在65 min内，去除率均超过了95%。硫酸锰对BPA的去除效果最差，去除率仅有52.6%。硫酸亚铁和硫酸铁对BPA的去除率分别为85.4%和86.9%，效果相对较差，但反应后水质呈褐黄色、浑浊，在离心分离后，水质依然偏黄，沉淀3 d后水质才较澄清。从实验结果来看，3类含铜化合物的效果较好，由于氯化铜在溶液中含有氯离子，对水质有二次污染，硝酸铜存在硝酸根离子，在酸性条件下有一定的氧化能力，为此，本研究选择硫酸铜作为评价类芬顿催化氧化去除能力的最佳催化剂。
图 3 过渡金属化合物对类芬顿体系去除BPA性能的影响Figure 3. Effects of transition metal compounds on BPA removal by Fenton-like system2.2 催化剂用量对BPA去除效果的影响
分别考察了BPA溶液挥发、单独H2O2氧化和单独催化剂对BPA去除效果的影响。结果表明，在反应2 h后，BPA溶液的挥发、单独H2O2的氧化和单独催化剂对去除率的贡献分别为8.9%、8.5%和8.6%，由图3可知，3种铜类化合物在65 min内对BPA的去除率均超过了95%，这说明催化剂和双氧水的协同作用是类芬顿法去除BPA模拟废水的关键。
催化剂用量对BPA去除效果的影响结果如图6所示。由图6可知：当催化剂用量在0.4 g·L−1以下时，反应15 min后，BPA的去除率约为73.5%；在反应65 min后，达到约90%。当催化剂用量为0.8 g·L−1时，去除效果最好；在反应65 min和95 min后，BPA的去除率分别为95.4%和96.6%，比在其他条件下的BPA去除率均提高了约4%，TOC去除率分别为83.6%和85.9%。当超过最佳催化剂用量时，BPA去除率稍有下降。这可能归因于在较合适催化剂用量条件下，反应体系中产生的 · OH和其消耗达到一个平衡，当催化剂用量继续增大时，其会催化H2O2产生大量的 · OH，导致其自身的消耗反应加速，最终生成H2O、
HO−2 和O2而被消耗掉[17]；另一方面，过量的 · OH与H2O2会反应生成具有抑制 · OH能力的HO−2 ，导致类芬顿体系去除效果降低[18]。
图 6 催化剂用量对类芬顿系统去除BPA性能的影响Figure 6. Effect of catalyst dosage on BPA removal by Fenton-like system2.3 H2O2用量对BPA去除效果的影响
H2O2的理论需求量计算方程如式(1)所示。
C15H16O2+36H2O2→15CO2+44H2O (1) 196 mmol·L−1为H2O2理论需求量的12.4倍。由图7可知，当H2O2用量为78 mmol·L−1时，BPA的去除率最高，在反应65 min后，BPA的去除率为91.8%，H2O2的消耗率为82.1%。随着H2O2用量的增加，BPA的去除率下降，当H2O2用量增加到470 mmol·L−1时，在反应65 min后，BPA的去除率下降到68.8%。这说明H2O2用量对BPA的去除效果具有显著的影响。当H2O2过量时，会导致类芬顿反应对BPA的去除效果大幅下降，这可归因于 · OH与过量的H2O2发生了自身消耗反应[17,19]。
图 7 H2O2用量对类芬顿系统去除BPA的性能影响Figure 7. Effect of H2O2 dosage on BPA removal by Fenton-like system with catalyst2.4 反应温度对BPA去除效果的影响
反应温度对BPA去除效果的影响如图8所示。由图8可知，反应温度对BPA的去除率影响很大，当反应温度从55 ℃升高至85 ℃时，反应15 min后，BPA的去除率从31.3%升高到86.6%，H2O2的消耗率从37%升高到81.4%。当反应65 min后，在55 、65 、75 和85 ℃下，BPA的去除率分别为65.5%、83.1%、91.8%和98.6%，H2O2的消耗率分别为52.3%、67.3%、82.1%和96.9%。由此可知，反应温度对BPA的去除和H2O2的消耗影响较大。通过观察在不同温度下溶液颜色的变化可知：在55 ℃时，溶液呈浅紫红色；在65 ℃时，在前25 min内，溶液先呈浅紫红色，后变为透明；在85 ℃时，溶液呈透明状态。这可归因于随着反应温度的升高，H2O2活化导致 · OH的生成量增加，同时提高了反应物分子间发生有效碰撞的概率，缩短了催化诱导期[20]，加速了反应过程。由于更高的温度，会加速H2O2分解[21]，综合考虑，本研究选择75 ℃为最佳反应温度。
图 8 反应温度对类芬顿系统去除BPA性能的影响Figure 8. Effect of reaction temperatures on BPA removal by Fenton-like system2.5 BPA初始浓度对BPA去除效果的影响
BPA初始浓度对BPA去除效果的影响如图9所示。由图9可知，BPA初始浓度对去除效果影响较大。在反应65 min后，当BPA浓度从40.1 mg·L−1增加到331 mg·L−1时，BPA的去除率从97.4%下降到91.9%，这说明随着BPA浓度的增加，对 · OH的需求也有所增加，导致在相同催化剂、H2O2浓度和反应时间内，产生的强氧化性 · OH不足以氧化足够多的BPA。由图9可知，BPA浓度对H2O2消耗率的影响显著，在反应65 min后，H2O2消耗率从96.7%下降到82.7%，可归因于BPA具有双苯环结构且浓度较高，会导致空间位阻效应增强[22]，阻碍了Cu2+与H2O2的充分接触，导致其分解变慢，体系产生 · OH的速率下降。
图 9 初始浓度对类芬顿系统去除BPA性能影响Figure 9. Effect of initial concentrations on BPA removal by Fenton-like system2.6 初始pH对BPA去除效果的影响
初始pH对BPA去除效果的影响如图10所示。由图10可知，在pH为3.0~7.9，反应一定时间后，BPA的去除率均比较高。在早期反应阶段，BPA的去除率有小幅波动，反应15 min后，分别为70.2%、79.5%、73.7%和73%，H2O2的消耗率差距较大，分别为18%、63.4%、60.2%和70.6%。这说明在早期反应阶段，pH对BPA的去除有一定影响，尤其是在弱酸条件下，可归因于弱酸性条件下H2O2的分解受到一定的抑制[23]。随着反应的进行，体系pH可能升高，H2O2的分解抑制解除；当反应65 min后，除了在pH=3.0的条件下，对应的BPA去除率偏低外，其他条件下对应的BPA去除率均在91%以上，在pH=7.9时，BPA的去除率可达到96.6%，H2O2的消耗率达到最高值98.1%。
图 10 初始pH对类芬顿系统去除BPA性能的影响Figure 10. Effect of pH on BPA removal by Fenton-like system另外考察了在其他pH条件下，BPA在类芬顿反应体系中的去除效果。结果表明，在pH=1.6和pH=2.0的条件下，BPA几乎没有被去除，此时H2O2的消耗率分别仅有4.9%和11.3%，这说明在强酸条件下，不利于H2O2分解为强氧化性 · OH。有研究[24]表明，过渡金属离子在溶液pH发生变化时，其价态可能发生变化，变为水合氧化物沉淀或变为带正电荷的多羟基配合物聚合体，从而易吸附
HO−2 ，降低其活度，抑制H2O2的分解。在pH=10.1时，当反应65 min后，BPA的去除率仍然高达86.6%，H2O2消耗率达到100%；在pH=11.4和pH=12.0的条件下，当反应65 min后，BPA几乎没有去除，但H2O2完全消耗完，且观察到溶液均有红褐色沉淀生成。说明在强碱性条件下，H2O2极不稳定，容易形成HO−2 [18]，而HO−2 是一种亲核试剂，易引发H2O2分解产生游离基，而Cu2+也更容易与OH−发生沉淀反应，故在强碱性条件下不利于类芬顿反应的进行。从pH对BPA去除效果来看，采用硫酸铜作为催化剂的类芬顿法，相比Fenton法一般需要在pH 2~4条件下反应，具有更宽的pH适应范围，故其优势更为显著。2.7 反应过程中pH和羟基自由基浓度的变化
考察反应过程中pH和羟基自由基浓度的变化，可为后续进一步考察降解机理和路径提供依据。另外随着反应的进行，反应体系pH的变化，是否会超出催化剂的pH适应范围，需要进一步分析。对于羟基自由基是否参与反应起到氧化作用，通过考察其浓度变化来反映。 · OH浓度通过荧光法间接测定，经全谱荧光扫描确定：香豆素的最大激发波长为277 nm，最大发射波长为392 nm；7-羟基香豆素的最大激发波长为321 nm，最大发射波长为452.6 nm。图11为7-羟基香豆素的标准滴定曲线。
图12为反应过程中pH和 · OH浓度的变化情况。由图12可知，在硫酸铜类芬顿反应体系中，pH在早期升高后，又有小幅的下降，这可能是因为在此过程中生成了酸性中间产物。当这些中间产物转化为其他物质后，pH又逐渐升高，但升高幅度并不大，体系pH维持在6.7左右，比初始pH稍高。这表明尽管体系pH发生了变化，但催化剂依然在pH适应范围内，同时说明BPA在硫酸铜类芬顿反应体系中的结构受到破坏，可能有弱碱性中间产物生成。此外，在类芬顿反应体系中，随着反应时间的延长，体系中 · OH的浓度呈逐渐下降趋势，这说明大量的 · OH参与了BPA的氧化降解去除反应。
图 12 反应过程中pH和·OH浓度的变化Figure 12. Changes of pH and·OH concentration in Fenton-like system3. 结论
1)在早期反应阶段，提高催化剂用量有利于反应的快速进行，但反应后期，受催化剂用量影响不大；H2O2用量对BPA的去除影响较大，随着H2O2用量的增大，去除率明显降低；随着反应温度的升高BPA的去除率增大；BPA的去除随浓度的增加有一定的下降。反应过程中溶液的pH变化不大。
2)在催化剂用量为0.8 g·L−1、H2O2为78 mmol·L−1、BPA为152 mg·L−1和反应温度为75 ℃的条件下，反应65 min后，BPA和TOC的去除率分别为95.4%和85.9%。
3)以硫酸铜为催化剂，采用类芬顿法对BPA进行催化氧化去除，相比Fenton法一般需要在pH 2~4条件下反应更具优势，其具有更宽的pH适应性，可以在pH=3.0~10.1的条件下反应，无需调节反应液的pH，具有一定的应用前景。
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图 1 多氧态垂直流人工湿地系统及采样位点示意图
Figure 1. Schematic diagram of the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones and sampling sites
图 2 不同HRT条件下多氧态湿地系统对COD和NH4+-N的去除效率
Figure 2. Removal rates of COD and NH4+-N by the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones at different HRT
图 3 不同水饱和比条件下多氧态湿地系统对COD和NH4+-N的去除效率
Figure 3. Removal rates of COD and NH4+-N by vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones at different water saturation ratios
图 4 多氧态湿地系统DO和ORP的分布特征及主要位置污染物质量浓度变化
Figure 4. Distribution characteristics of DO and ORP in vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones and changes in pollutant mass concentrations at major locations
图 5 不同外层水饱和比下湿地系统中氮的转化情况
Figure 5. Nitrogen transformations in wetland systems at different outer water saturation ratios
图 6 进水C/N为7:1时系统对COD和NH4+-N的去除效率
Figure 6. Removal rates of COD and NH4+-N by the system at an inlet C/N of 7:1
图 7 氮循环功能基因在多氧态湿地系统内、外层的丰度
Figure 7. Abundance of functional nitrogen cycling genes in the inner and outer layers of the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones
图 8 多氧态湿地系统4个基质样品中微生物群落丰度图(门水平)
Figure 8. Abundance map of microbial communities in four substrate samples from the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones (at phylum level)
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