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目前，矿井废水的利用率不断提高，处置后的矿井废水多用于工业用水等，只有少部分能作为居民饮用水回用，其中最主要的制约因素之一就是氟离子含量超标[1]。氟是一种持久性和不可降解的有毒物质，饮用含有过量氟的饮用水，会对人体健康造成威胁[1]。长期饮用高氟水而导致的氟斑牙、氟骨症等蓄积性氟中毒是全球影响最广的地方病之一，氟过量摄入对儿童智商也有明显影响[2-3]。然而，最近的研究[1]表明，人体软组织也会受到氟离子影响，这种类型的氟中毒被称为非骨骼性氟中毒。已经发布的地下水质量标准(GB/T 14848-2017)和污水排放标准(GB 8978-1996)中均明确规定了氟离子和氟化物的排放质量浓度限值，即1.0 mg·L−1和10 mg·L−1。同时，地下水中也发现了各种不同浓度的金属和非金属离子，如铁离子、镁离子、钙离子、钠离子、氯离子、碳酸根离子等，相比于其他离子，氟离子过量被认为具有更大危害[4]。此外，氟甚至可以引起神经系统[5]、内分泌腺[6]、生殖系统、肾脏、肝脏[7]等器官的代谢、结构和功能损伤。氟中毒的数量惊人[1, 8]，全球约有25个国家受到氟中毒的影响。氟化物污染在世界不同地区的地下水中被广泛报道，其中包括非洲、拉丁美洲和亚洲的潮湿热带地区[9]。鉴于氟化物对人体健康的毒性影响，迫切需要找到一种有效且稳健的技术来去除水环境中过量的氟化物[10]。
去除矿井废水中氟离子的主要方法有混凝沉淀法[11-12]，离子交换法[13]、吸附法[14]、膜分离法[15]等。混凝沉淀法因具有效率高、操作简单、投资少等优点而受到普遍认可。混凝沉淀法是向水中投放具有凝聚能力的物质，形成大量胶体，通过沉淀将氟离子从水中去除的过程[16]。常规混凝剂有硫酸铝[17]、氯化铝[18]、硫酸亚铁[19]、硫酸钙[20]等。相对于其他混凝剂，聚合氯化铝(polyaluminum chloride，PAC)具有水解速度快、吸附能力强、巩花大、质密、沉淀快等优点而备受关注[21]。
响应曲面法(response surface methodology，RSM)是一种能够优化工艺参数、减少实验次数以及评估各种影响因素水平及交互作用的有效方法[22-26]。与传统的单因素法和正交实验法相比，RSM优势是，在实验条件优化过程中，可以连续地对实验各个水平进行分析，通过建立影响因素和响应值之间的多元二次回归方程来拟合二者之间的函数关系，克服了单因素法和正交实验法无法解释各因素之间的相互作用，以及无法给出因素和响应值之间的明确回归模型的缺陷[23-24]。
本研究依据RSM中的Box-Behnken Design(BBD)实验设计原理，对铝氟摩尔比(r)、pH和凝聚时间3个影响因素对氟离子的水平影响及其之间的交互作用进行探究，明确去除氟离子的最佳条件参数，旨在为含氟矿井水的处理提供新的技术方案和科学依据。
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实验试剂：氟化钠(NaF)、硝酸钠(NaNO3)购于国药集团化学试剂有限公司；无水柠檬酸钠(C6H5Na3O7)、聚合氯化铝(PAC)均为分析纯并购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验水样来自某煤矿矿井处理工艺出水。
实验仪器：搅拌机(84-1A6S)；氟离子计(PXSJ-216F)；pH计(PB-10)；分光光度计(DR6000)；分析天平(AL104)；Milli-Q超纯水系统。
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除氟实验方法：将1 L的含氟废水放置在六联搅拌机上，将铝氟摩尔比r调整为10~20，将凝聚时间设置为1~3 min，将废水的pH调节为6.0~7.0，用氟离子选择电极测试上清液中氟离子质量浓度。
氟离子分析方法：氟离子质量浓度分析采用《水质 氟化物的测定 离子选择电极法》(GB 7484-1987)中的方法。采用氟离子计测量质量浓度，测量区间0.05~1 900 mg·L−1。将待测溶液置于塑料烧杯内，插入电极并放入转子，慢速搅拌，待数值稳定后，记录示数。
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向1 L氟离子质量浓度为1.63 mg·L−1矿井排放废水中分别投加r为3.4、6.8、10、13.6、17、20的5% PAC，混凝反应结束后，记录氟离子电位，根据氟离子标准曲线计算氟离子质量浓度。实验水样pH维持在6.5左右，实验结果见图1。
由图1可知，随着r的逐渐增加，矿井排放废水中氟离子质量浓度逐渐下降，氟离子的去除率逐渐上升。r由3.4增至20时，矿井排放废水中氟离子质量浓度逐渐减小；r由3.4增至10时，矿井排放废水中氟离子质量浓度低于1 mg·L−1，达到排放标准。然而r不能一直增加，一方面由于投加浓度过高时，沉淀矾花较大且容易造成上翻、余浊高等负面作用；另一方面，投加浓度过高也会造成经济损失和资源浪费[27-29]。因此，响应曲面法中r应为10、15、20。
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pH对混凝效果有较大影响，pH会影响混凝剂的水解速度、水解产物的存在形态以及性能。实验采用矿井排放出口废水，r为20，调节pH为5.0~10.0，沉淀完成之后，记录氟离子电位，根据氟离子标准曲线测定氟离子质量浓度并计算其去除率。实验结果见图2。
由图2可知，PAC去除矿井排放废水中氟离子的pH最佳区间为6.0~7.0，PAC水解效果较好，水解产物对实际水样中氟离子的吸附较充分。pH为6.0~7.0时，氟离子去除率呈现出先升高，后下降的趋势，pH在此区间平均去除率达到最高。溶液的pH会影响PAC的水解程度、水解产物形态，当pH低于4.0时，Al3+不能水解成Al(OH)3，主要以Al3+离子形式存在，混凝效果较差；pH为6.0~7.0时，Al3+水解聚合成聚合程度较大Al(OH)3中性胶体，混凝效果较好；pH大于8.0时，Al3+水解成AlO2−，混凝效果下降，因此，控制混凝过程pH十分必要。
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凝聚时间对混凝效果有一定影响，已有研究[30]表明，正常的凝聚时间持续2 min左右，并且伴随着水体逐渐浑浊。实验从投加PAC后开始计时，每隔10 s观察烧杯实验现象。调节凝聚时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5和3 min，沉淀完成之后，记录氟离子电位，根据氟离子标准曲线测定氟离子质量浓度并计算其去除率。实验结果见图3。
由图3可以看出，在凝聚1 min后，观察到烧杯中出现微细矾花；在凝聚2 min时，矾花达到最密集，氟离子去除率均在40%以上；在凝聚2.5 min后，氟离子去除率基本维持水平；在凝聚3 min后，开始进行絮凝阶段。为节省时间，响应曲面法中凝聚时间应为1、2和3 min。
在凝聚过程中，实验从投加PAC后开始计时，每隔10 s观察烧杯中矾花密集程度。凝聚时间达到1 min，观察到烧杯中出现微细矾花，2 min矾花达到最密集，3 min后开始进行絮凝阶段(图4)。
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根据Box-Behnken设计的原理，选择r(A)、pH(B)、凝聚时间(C) 3个因素作为响应曲面模型设计的考察变量，以氟离子去除率(Y)为指标进行3因素3水平响应曲面分析(表1)。
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将各因素及水平值一次输入系统，则生成实验方案表。按照该方案进行实验，记录每组因素组合的实验结果，并将实验结果填入对应表格。采用Design-Expert软件对实验结果进行分析，首先点击Analysis按钮，对线性函数，2FI模型、二阶模型、三阶模型进行显著性检验，并对模型显著性、失拟项、相关性的数据进行对比，依据对比结果，推荐适合的模型[31]。根据实验结果，推荐采用二阶模型。然后对选择的模型进行方差分析以及显著性检验。使用方差分析对影响二次方程模型的常数项、一次项、二次项、平方项的显著性进行检验。
根据表2的实验结果，使用Design-Expert软件进行模拟分析，得到矿井排放废水氟离子质量浓度与影响因子有关的二次响应回归方程(式(1))。
该模型可以预测自变量与响应变量(Y)之间的关系，并采用Fisher统计检验进行方差分析(ANOVA)，以获得变量与响应之间的交互作用，评估“拟合优度”质量。拟合模型的质量用决定系数R2和调整后的R2表示，在同一程序中采用Fisher的F检验统计显著性[24]。模拟项的选择或拒绝是基于P值(概率)的95%置信水平。对方程进行方差分析和信度分析结果，见表3。
二次响应面回归模型可信度分析结果表明，决定系数为0.994 3，调整后的决定系数为0.984 0，预测决定系数为0.940 8，信噪比为34.043 4，标准差为1.40，变异系数为3.46%。二阶回归方程模型F=96.42(>1)，P<0.000 1，信噪比为34.043 4(>4)，表明模型拟合准确。失拟项P值表示模型与实际实验差异程度，本模型失拟项P值为0.549 7(>0.05)，失拟项差异性不显著[28]。该方程的决定系数R2=0.994 3，变异系数为3.46%(<10%)，表明模拟与实际拟合较好，拟合的可信度和精密度较高。
由图5可以看出，预测值与真实值的偏差较小，得到的实验数据服从正态分布，真实值的残差总体上较小。因此，二次响应回归模型具有较好的拟合度[29]。氟离子质量浓度的真实值基本分布在直线上或靠近两侧，说明真实值与预测值有较高的拟合度。证明了拟合二次响应回归模型的可靠性[29]。
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响应曲面法克服了正交实验不能给出直观图形的缺陷[27, 32]。根据二次方程模型，分别做出实验因素间交互作用的三维立体响应曲面图，考察某个因素固定在中心值不变的情况下，其他2个因素的交互作用对氟离子去除率的影响，结果见图6。由图6(a)可看出，r和pH的交互作用较明显。pH为6.0~7.0时，氟离子去除率呈现出先升高，后下降的趋势，pH在6.5附近去除率达到最高。由图6(b)可以看出，r和凝聚时间的交互作用不明显，整体呈较平缓状态，凝聚时间为1~3 min时，对氟离子去除率影响较小。随着r的增加，氟离子去除率逐渐增加。由图6(c)可以看出，pH和凝聚时间的交互作用不明显。同样，pH为6.0~7.0时，氟离子去除率呈先升高后下降的趋势，pH在6.5左右去除率达到最高。凝聚时间为1~3 min时，曲面平缓，说明凝聚时间对氟离子去除率影响较小。
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模型预测的最佳实验条件：r=19.04，pH为6.5，凝聚时间为2.90 min。根据模型预测进行验证实验，结果见表4。
在模型预测的最佳实验条件下，模拟实验平均去除率为56.44%，而理论去除率预测值为56.46%。由此可知，实验值与预测值的误差为0.02%，表明采用此二次响应曲面预测优化得到的最佳实验条件可靠。
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PAC作为最常用的无机高分子絮凝剂，很多研究者[33-35]对其混凝机理做了探究。通常认为，PAC是一种含有羟基的聚合物，有很强的界面吸附能力，是库仑力、分子间范德华力、憎水斥力以及羟基与表面的键合力等多种因素综合作用的结果。静电库仑力、分子间范德华力、憎水斥力随着聚合物电荷及分子质量的增大而增大，使水中PAC最大限度接近颗粒表面，大大提高了混凝效率。Al3+在溶液中水解，产生羟基多核络合物，水解过程见式(2)。
Al3+的各种水解状态就是铝盐的水解-聚合-沉淀的动力学过程。其形态和结构特征主要取决于水解反应中的2种转化过程：一种是铝盐在水中的自然溶解及水解过程，即自发水解；另一种则是铝盐溶液中加入强碱导致pH升高而强烈水解的过程，即强制水解。2种转化路径[33]见图7。
在PAC絮凝沉淀去除氟离子过程中，PAC投加到水中，利用Al3+与氟离子的络合以及铝盐水解中间产物和最后生成的Al(OH)3(am)矾花，对氟离子进行离子吸附、离子交换、络合作用，从而达到去除水中的氟离子的目的。在离子吸附过程中，一方面，含氟絮体吸附了带负电荷的氟离子，正电荷被部分中和；另一方面，当水中阴离子的浓度较高时，使絮凝过程中形成的Al(OH)3(am)矾花对氟离子的吸附容量显著减少，原因在于，在PAC混凝去除氟离子过程中，生成了具有很大比表面积的Al(OH)3(am)絮体，对氟离子产生氢键吸附，氟离子半径小，电负性强，使得这一吸附方式容易发生，由此说明PAC去除氟离子过程中离子吸附是一重要的作用方式。氟离子与氢氧根离子半径和电荷都较为接近，PAC投加到水中生成的Al12AlO4(OH)247+以及Al(OH)3(am)絮体的氢氧根离子均可以与氟离子发生交换，反应过程见方程式(3)和式(4)。
由此可见，这一过程会使体系的pH升高，说明离子交换也是铝盐除氟的一种重要作用方式。在PAC去除氟离子过程中，络合沉淀也起到一定作用，氟离子能与Al3+形成AlF2+、AlF2+、AlF3、AlF4−、AlF52−、AlF63−6种络合物。在PAC混凝去除氟离子体系中，这些铝氟络合离子在絮凝过程中会形成铝氟络合物或夹杂在新形成的Al(OH)3(am)絮体中沉降下来。
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1) BBD优化法模型预测与实际处理效果基本一致(R2=0.99)。根据模型预测结果，处理含氟离子矿井废水最优处理工艺参数：r为19.04，pH为6.5，凝聚时间为2.90 min，氟离子出水达到排放标准。
2) PAC去除矿井废水中氟离子的影响因素显著性大小顺序为r > pH > 凝聚时间，其中r和pH是主要控制因素。
3)在实际矿井废水中，弱酸条件有利于PAC通过氟离子絮凝、离子交换和络合沉降等多种方式的综合作用去除氟离子。
基于响应曲面法的聚合氯化铝对矿井废水中氟离子混凝去除工艺优化
Optimization of coagulation removal of fluoride ions from mine wastewater by polyaluminum chloride based on response surface methodology
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摘要: 为有效去除矿井废水中氟离子，利用聚合氯化铝(PAC)对某矿井含氟废水进行混凝效果研究，设计单因素实验，研究了铝氟摩尔比(r)、pH和凝聚时间等因素对PAC混凝去除氟离子的影响，依据响应曲面法的Box-Behnken Design(BBD)实验设计原理，探究了r、pH和凝聚时间对混凝效果的影响，并优化工艺参数。结果表明：各因素对混凝效果的影响顺序为r > pH > 凝聚时间；在r=19.04、pH=6.5、凝聚时间为2.9 min的最佳条件下，氟离子的去除率为56.4%，与预测值(56.46%)基本吻合；去除氟离子的机理包括PAC对氟离子絮凝沉淀、离子交换和络合沉降等；pH影响PAC在溶液中的存在状态，凝聚时间则影响矾花在溶液中形成的速度以及密集程度，进而影响混凝沉淀效果。由此可以看出，BBD优化模型预测与实际处理效果基本一致，铝氟摩尔比和pH是去除氟离子的主要控制因素。本研究使用的实验方法具有处理工艺简单、效果稳定、成本低等优点，可为实际矿井废水中氟离子的去除提供参考。
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关键词:
- 聚合氯化铝(PAC) /
- 混凝 /
- 矿井废水 /
- 氟离子
Abstract: In order to effectively remove fluoride ions from mine wastewater, the coagulation effect of polymerized aluminum chloride (PAC) on a mine fluoride wastewater was studied, a single-factor experiment was designed to investigate the effects of aluminum-fluoride molar ratio (r), pH and coagulation time on the removal of fluoride ions by PAC coagulation. Based on the Box-Behnken Design (BBD) experimental design principle of response surface method, the effects of r, pH and coagulation time on the coagulation effect were investigated, and the process parameters were optimized. The results showed that the coagulation effect was orderly influenced by r>pH>coagulation time. Under the optimal conditions of r=19.04, pH=6.5 and coagulation time of 2.9 min, the removal rate of fluoride ions was 56.4%, which was consistent with the predicted value (56.46%). The mechanism of fluoride ions removal included flocculation and precipitation of fluoride ions by PAC, ion exchange and complexation precipitation, etc.. pH affected the speciation of PAC in the solution, and the coagulation time affected the formation rate and compactness of alum flocs in the solution, which further affected the coagulation and precipitation effect. It can be seen that the prediction of BBD optimization model was basically consistent with the actual treatment effect, and the molar ratio of aluminum to fluorine and pH were the main controlling factors for fluoride ions removal. The experimental method used in this study has the advantages of simple treatment process, stable effect and low cost, which can provide a reference for the removal of fluoride ions in actual mine wastewater.-
Key words:
- polymeric aluminum chloride(PAC) /
- coagulation /
- mine wastewater /
- fluoride
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阿特拉津（2-Chloro-4-ethylamino-6-isopropylamino-s-triazine，ATZ）是一种通过阻断叶绿体中质体醌结合蛋白和抑制光合作用来防治阔叶和禾草类杂草的选择性除草剂，土壤对其吸附性较低，因此极易向地表水、深层土壤和地下中迁移[1]. 低浓度的阿特拉津显著降低作物的株高、根长、根干重，高浓度的阿特拉津甚至会导致植物死亡[2]；阿特拉津影响雄性斑马鱼的神经发育和神经功能[3]，已成为一种污染源并对动植物和人类健康造成不可忽视的风险[4-5]. 由于阿特拉津严重的危害及影响，2004年在欧盟被禁止使用，但由于它价格低廉而在世界其他地区被广泛使用，仍是国际上销售的主要除草剂之一.
目前，环境中阿特拉津的去除方法主要有吸附法[6]、光催化法[7]、高级氧化法[8]、植物修复法[9-10]、生物法[11]等，其中基于微生物降解的生物修复法不仅效率高，而且几乎不损害生态环境，并且可将ATZ转化为无毒或低毒的物质.很多研究者已筛选出能将阿特拉津作为唯一氮源或碳源的微生物，如细菌Pseudomonas sp. strain AKN5[12]、Klebsiella sp. FH-1[13]、Citricoccus sp. strain TT3[14]、Arthrobacter sp. 30、Pseudomonas sp. AD39[15]和真菌Pleuroyus ostreatus INCQS 40310[16]等. 这些菌株对阿特拉津具有耐受性并能降解高浓度的阿特拉津，Enterobacter sp.LY-2[17]对浓度为100 mg·kg−1的污染土壤具有修复效果，14 d后阿特拉津浓度降低为9.9 mg·kg−1；产脲节杆菌（Arthrobacter ureafaciens）CS3，培养2 d 可将50 mg·L−1的阿特拉津完全降解[18]. 虽然目前报道的去除阿特拉津的微生物种类较多，但仍然存在停滞期长，降解耗时较长，耐受性差等不足。而且大部分菌株来源于中国北部寒冷地区，东北多为黑土，呈中性或偏碱性、有机质及氮磷含量丰富，而长三角地区雨量充沛、气温较高，土壤通透性差、呈弱酸性、有机质及氮磷含量较低，这些菌株可能不适应长三角的土壤环境，因此有必要寻找适合长三角地区的高效阿特拉津降解微生物资源.
本研究从江苏省5个不同地区的农田土壤中筛选分离能适应长三角地区阿特拉津污染土壤的菌株，研究ATZ初始浓度、温度和pH对菌株繁殖和降解效果的影响，判断菌株的适用环境范围，并采用HPLC-MS测定ATZ的降解产物，推断可能存在的降解转化途径.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 主要试剂
阿特拉津（>97%）（C18H14ClN5，分子量214.69，密度为1.2 g·cm−1、沸点为200 ℃、熔点为174 ℃，难溶于水）、甲醇、乙醇、葡萄糖、C6H9Na3O9、C9H11NO、C6H7NO3S、C10H9N等. 无机盐培养基（MSM）：Mg2SO4·7H2O 0.1 g·L−1、K2HPO4 1 g·L−1、KH2PO4 1 g·L−1、FeSO4·7H2O 0.025 g·L−1、CaCl2 0.025 g·L−1，适量阿特拉津；富集培养基（LB） ：牛肉浸膏5 g·L−1、胰蛋白胨10 g·L−1、NaCl 5 g·L−1，加15 g·L−1琼脂即为固体培养基.
1.2 阿特拉津降解菌的筛选与分离纯化
取江苏省5个长期喷洒阿特拉津的农田表层土壤（0—10 cm）进行降解菌株的驯化. 将土壤样品（5 g）分别加入150 mL MSM培养基中（ATZ浓度为50 mg·L−1），培养条件设置为 30 ℃、150 r·min−1. 驯化7 d后将上清液转至新的MSM培养基中，重复3次适应过程. 最后，将梯度稀释的培养液涂布于LB固体培养基，待菌落长成后，将其进行多次划线分离和纯化，并于无机盐培养基验证降解效果. 最终，筛选出一株能够降解阿特拉津的菌株D2，并采用斜面培养基和甘油保存.
1.3 菌株的鉴定
1.3.1 菌株的形态学观察
将菌株接种于固体培养基，2—3 d后观察长出菌落的形态（形状、色泽、透明程度等）；采用扫描电镜（Quanta FEG 250）观察菌株 D2放大50000倍后的表面形态.
1.3.2 生理生化试验
革兰氏染色试验、水解产酸、柠檬酸盐利用、V-P、过氧化氢酶等指标，具体测定方法依据《污染控制微生物实验》[19]，并参照《常见细菌系统鉴定手册》[20]与类似细菌进行比较.
1.3.3 16S rDNA基因序列分析
将菌株在固体培养基中划线分离，待菌落长成后进行16S rDNA基因鉴定，由上海天霖生物科技有限公司完成. 将D2的 16Sr DNA 基因序列在BLAST系统中与基因库进行比对分析，并使用MEGA 7.0软件绘制系统发育树.
1.4 菌株生长量的测定及生长模型拟合
采用紫外可见分光光度计（INESA-N4）测定菌株生长不同时间段的OD600以推测菌株的生长情况，以原始溶液为空白对照绘制D2的生长曲线，并用 SGompertz模型[21]（式（1））和Slogistic模型[22]（式（3））拟合D2的生长曲线，并得到菌株最大比生长速率（μ1、μ2）：
lgNt1=lgN0+a1×e−e−k1(X−Xc) (1) μ1=a1×k1e (2) 式中，t为时间（h），Nt1为时间t时菌株的数量，N0为初始菌株数量，Xc为达到最大升值速率的时间（h），μ1为菌株的最大比生长速率（h−1），a1为菌株最大生长量.
Nt2=a21+e−k2(X−X0) (3) μ2=a2×k24 (4) 式中，t为时间（h），Nt2为时间t时菌株的数量，X0为达到最大升值速率的时间（h），μ2为菌株的最大比生长速率（h−1），a2为菌株最大生长量.
1.5 菌株D2最佳降解条件的研究
为了探究环境因素对菌株降解阿特拉津的影响，将菌悬液按照体积比为2%的量接种到含阿特拉津的MSM培养基中，研究不同初始浓度（10、20、50、100、150、200 mg·L−1）、不同pH（5.0、7.0、9.0）、不同温度（10、20、30、40 ℃）下菌株对阿特拉津的降解情况，以转速 150 r·min−1 避光培养，溶液经0.22 μm滤膜后测定阿特拉津的浓度.
1.6 阿特拉津及其降解产物的测定
阿特拉津的浓度采用岛津高效液相色谱仪（LC-20AT，Japan）测定. 检测条件：流动相为V（甲醇）：V（水）=60:40，流速为1.0 mL·min−1，波长为220 nm. 降解产物定性分析采用带有高效液相色谱仪UltiMate 3000（Thermo Fisher Scientific，USA）和高分辨质谱仪5600 QTOF（AB SCIEX，Framingham，USA）的超高压液相质谱仪HPLC-MS，色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm ，2.1 mm×100 mm），以水（含有2 mmol·L−1乙酸铵）和乙腈进行梯度洗脱. 条件：轰击能量，30 eV；雾化气压（GS1）：60 Psi，辅助气压，60 Psi；气帘气压，35 Psi；温度，650 ℃；喷雾电压，5000 V（正离子模式）或−4000 V（负离子模式）.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 阿特拉津高效降解菌株的分离与鉴定
采用以阿特拉津（50 mg·L−1）为碳源和氮源的无机盐培养基对5个种植玉米的农田土壤经过驯化、分离，筛选出8株生长良好且菌落形态不同的菌株，最终选择一株降解效能最好的菌株，将其命名为D2.
菌株D2的菌落形态观察如图1（a），菌落较小，边缘整齐，浅黄色；革兰氏染色结果表明，D2为革兰氏阳性菌 （图1b ）. 扫描电镜（×5000）下观察的菌株形态如图1（c）所示，D2呈杆状. 生理生化试验结果显示（表1），硝酸盐还原及过氧化氢酶试验均呈阳性，其余结果均为阴性.
图 1 菌株D2的形态特征Figure 1. Morphological of strain D2（a.在MSM上的菌落形态；b.在光学显微镜下的形态；c.在扫描电镜下的形态）（a. Colony morphology of D2 in the plate medium；b. the image of D2 under the light microscope； c. the image of D2 under scanning electron microscopy）表 1 菌株D2的生理生化特性Table 1. Physiological characteristic of strain D2特征 Characteristic 结果 Results 革兰氏染色 + 淀粉水解 − 吲哚 − 甲基红 − V-P产生 − 柠檬酸盐利用 − 硝酸盐还原 + 过氧化氢酶 + 注：“+”为阳性；“−”为阴性. Note：“+” means positive and “−” means negative. | Show Table
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将PCR扩增后得到的基因片段进行测序，测序结果在 NCBI 上经 BLAST 分析目标序列与同源序列，并绘制系统发育树（图2），对比发现ATZ降解菌株D2与土壤芽孢杆菌（Solibacillus）的核苷酸序列相似率高达99.58%，因此菌株D2经鉴定为土壤芽孢杆菌.
图 2 菌株D2基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Figure 2. Phylogenetic tree of strain D2 based on 16Sr DNA gene sequence2.2 菌株D2的生长曲线及模型拟合
菌株D2的生长曲线见图3. 在LB培养基中，D2经过5 h的适应期后进入菌株代谢旺盛的对数期；12 h后OD600达到1.0，此时的菌株增长速率最快；24 h后达到生长繁殖的峰值，此后OD600不再增长，菌株数量相对趋于稳定.
图 3 菌株D2生长曲线的实验数据与“S”形生长模型拟合结果Figure 3. Experimental and growth states of strain D2 due to S-shaped growth model采用SGompertz模型[23]和Slogistic模型拟合菌株的生长曲线（表2，图3）. 结果显示，两种模型均可较好地拟合D2的生长曲线，拟合度（R2）分别为0.991和0.992，在第10 h左右D2到达最大比生长速率，随后比生长速率逐渐降低.
表 2 菌株生长曲线的SGompertz模型和Slogistic模型拟合参数对比Table 2. Comparative list of bacteria growth due to SGompertz and Slogistic model名称 Name SGompertz model Slogistic model R2 a1 K1 XC/h μ1/h−1 R2 a2 K2 X0/h μ2/h−1 D2 0.991 1.995 0.279 9.647 0.214 0.992 1.958 0.454 10.950 0.222 | Show TableDownLoad:
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2.3 菌株D2对阿特拉津的降解特性研究
2.3.1 初始浓度对菌株降解阿特拉津的影响
污染物浓度对菌株的影响是评价菌株生长及降解能力的标准之一[24]，D2在不同初始浓度下对ATZ的降解效果如图4所示. 当浓度为200 mg·L−1时，D2对ATZ仍具有较高的去除能力，24 h的降解率为77.43%；初始浓度越低，D2的去除效率越高，将初始浓度为150、100、50、20、10 mg·L−1的ATZ完全降解分别需要24、18、8、4、3 h.长三角洲地区农田土壤中ATZ浓度的平均值为5.7 ng·L−1，检出率高达57.7%[25]，菌株D2对ATZ的耐受性远高于环境中的平均浓度，因此它是一株在实际污染环境中具有应用价值的降解菌株.
图 4 不同阿特拉津初始浓度下菌株D2的降解效果Figure 4. Degradation of atrazine by strain D2 under different initial atrazine concentrations2.3.2 温度和pH对菌株降解阿特拉津的影响
温度和pH会通过影响细菌的生长而影响其降解能力[26-28]，不同温度（10、20、30、40 ℃）条件下，D2对初始浓度为100 mg·L−1 ATZ的降解情况见图5a. 当温度为20—30 ℃时，D2在24 h内将ATZ完全降解；但在10 ℃和40 ℃下培养36 h时，D2对ATZ的降解率仅为16.33%和43.48%，说明低温和高温都会抑制菌株的代谢作用，这与菌株的酶活性密切相关[29]. 另外，培养基的酸碱度也会影响细菌酶的合成和催化活性[9]，细菌表面的电荷分布随着pH的改变而改变 [26]. 不同pH条件下，D2对初始浓度为100 mg·L−1（培养温度为30 ℃）ATZ的降解率如图5b所示. 当pH为5.0、7.0和9.0 时，经过24 h，D2对ATZ的降解率分别为到91.42%、100%、100%. 据以往研究报道，pH为5.0和9.0时，阿特拉津降解菌（Enterobacter sp.）的降解率低于70%[27]，菌株L-6 [28] 仅能适应碱性环境，当pH=6时，降解率为45.6%，因此菌株D2对pH具有较高的适应性.
图 5 不同温度和pH条件下菌株的降解效果Figure 5. Degradation effects of atrazine by D2 with different temperatures and pH2.3.3 菌株D2的降解及生长动力学研究
在最佳降解条件下（2%的菌悬液接种量、温度为20 ℃、pH为9.0），将菌株D2接种至初始浓度为100 mg·L−1的ATZ无机盐培养基中，生长及降解动态曲线如图6所示. 菌株D2的生长与ATZ浓度呈较强的负相关（表3，r=−0.983，P＜0.01），随着菌株的生长，阿特拉津的浓度急剧降低. 培养初期D2存在短暂的适应期，OD600从0.046增至0.052；培养4 h后进入对数生长期，OD600达到0.097，此时随着菌株的大量生长ATZ被快速降解；在培养14 h以后菌株进入静止期，此时菌株数量达到最大值，其OD600为0.107，ATZ浓度降为6.41 mg·L−1，降解率达到94.33%，在18 h时ATZ被完全去除. 实验结果表明，阿特拉津浓度的降低与D2的数量密切相关，证明菌株D2具有阿特拉津去除能力.
表 3 浓度与OD600的相关性分析Table 3. Correlation analysis between concentration and OD600平均值 Average value 标准差 Standard deviation 浓度 Concentration OD600 浓度 41.093 44.110 1 OD600 0.080 0.026 −0.983** 1 注：* P<0.05，** P<0.01. | Show TableDownLoad:
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2.4 阿特拉津降解产物与降解途径研究
菌株D2于含ATZ的无机盐培养基进行培养，取12 h时的样品进行分析，采用高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）测定其降解产物，共检测出6种可能的代谢物（图7 b—g），质荷比（m/z）分别为146.00、184.12、198.13、202.08、212.15、188.07，与已知标准化合物和报道的阿特拉津代谢物的比较，这6种代谢物分别被确定为脱乙基脱异丙基阿特拉津（DACT）、羟基西玛津（HDMA）、羟基阿特拉津（HA）、西玛津（DMA）、阿特拉通（Atraton）和脱乙基阿特拉津（DEA）.
图 7 阿特拉津（a）及中间产物（b—g）的质谱图Figure 7. The mass spectrometry of atrazine （a） and its intermediate products （b — g）.根据产物的结构组成和报道过的阿特拉津降解途径提出菌株D2降解阿特拉津的可能途径，结果如图8所示.
图 8 菌株D2降解阿特拉津的途径分析Figure 8. The proposed degradation pathway of atrazine by strain D2 based on HPLC-MS.途径Ⅰ：首先羟基取代氯，形成脱氯羟基化的阿特拉津（HA），然后甲基取代HA的氢生成阿特拉通（Atraton），HA也可能通过脱甲基化反应转化为羟基西玛津（HDMA）.途径Ⅱ：阿特拉津的异丙基脱甲基化生成西玛津（DMA），然后DMA的氯被一个羟基取代，转化为羟基西玛津（HDMA）.途径Ⅲ：阿特拉津经N-脱烷基反应转化为脱乙基阿特拉津（DEA），随后DEA异丙基化为脱乙基脱异丙基阿特拉津（DACT）. Liu等[30]在研究土壤中阿特拉津的降解途径时得到了相似的结果，阿特拉津可通过光解、水解及微生物降解转化为羟基阿特拉津、阿特拉通、扑灭津、脱乙基阿特拉津、羟基西玛津、西玛津、去乙基异丙基化阿特拉津等. 而Zhang 等[31]和郭火生等[32]还发现羟基阿特拉津可以被进一步水解为三聚氰酸.通过以上总结推测，阿特拉津的降解中间产物还会通过脱甲基化、脱烷基化和水解等产生三聚氰胺二酰胺（DEDIA）、去乙基异丙基化阿特拉津（DACT）和三聚氰酸等副产物.
2.5 菌株D2的降解能力
将本研究中的D2与已报道过具有阿特拉津降解能力的菌株进行对比，结果汇总如表4所示. 目前已经筛选出很多能以阿特拉津为唯一碳源或氮源生长的菌株，并适用于阿特拉津浓度范围为8—100 mg·L−1的废水，但本研究中的新菌株D2具有更优异的降解性能. 已研究的菌株Acinetobacter lwoffii DNS32 [32]在 20 ℃和 35 ℃时，对阿特拉津的降解率约为 30%—35%，最佳生长pH为7—8，在酸性及pH高于8的条件下，菌株的生长及降解能力受到抑制；菌株C2[33]在20 ℃、30 ℃、40 ℃下培养5 d后，降解率分别为86.7%、97.6%和21.9%；菌株SB5[34]生长的温度范围是25—37 ℃，在pH=8的条件下完全降解ATZ需36 h. 本研究分离出的菌株D2在20 —30 ℃、pH为5.0 — 9.0的范围内，18 h以内即可将100 mg·L−1的阿特拉津完全降解，远远快于培养时间为24 —264 h的其他菌株，且具有更强的pH和温度的适应性，在40 ℃的高温下仍具有一定的活性，降解率高于40%，在10 ℃的条件下，D2对ATZ的降解率仍有近20%. 另外，已报道的菌株大部分来源于北部寒冷地区，而菌株D2来源于江苏省农田土壤，更能适应夏季高温、有机质及氮磷含量低、弱酸性的土壤环境，可成为长三角地区阿特拉津污染土壤和废水修复的微生物资源.
表 4 已报道菌株对阿特拉津的降解效果的比较Table 4. Comparison of atrazine degradation by strains has been reported菌种 Strains 浓度/（mg·L−1）Concentation 温度/℃Temperature pH 地区Region 降解率/% Degradation 时间/h Time 文献来源Literature sources Klebsiella sp. FH1 50 25 9 吉林 81.5% 264 [13] LY-2 100 25 — 35 6 — 9 哈尔滨 98.7% 48 [17] CS3 50 30 7 河北 100% 48 [18] Arthrobacter sp. ZXY-2 50 30 — 35 8 — 9 哈尔滨 100% 6 [35] Arthrobacter sp. DNS10 100 30 7.5 哈尔滨 99.41% 24 [36] Paenarthrobacter sp. W11 100 30 7 吉林 97.1% 60 [37] Paenarthrobacter sp. W24 100 30 7 吉林 94.2% 72 [38] Arthrobacter sp. C2 100 30 7 — 9 吉林 100% 72 [33] Pseudomonas sp. 20 30 / 巴西 99% 24 [39] Achromobacter sp. 20 30 / 巴西 39% 48 [39] Pencillium sp. yz11-22N2 8 28 7 / 91.2% 120 [40] D2 100 20 — 30 5 — 9 江苏 100% 18 本研究 | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusions）
（1）从江苏省5个不同区域的农田土壤中筛选出一株以阿特拉津为唯一碳源和氮源生长的菌株D2，属于土壤芽孢杆菌（Solibacillus），该菌株能适应长三角地区环境，并有效降解水体和土壤中的阿特拉津.
（2）在pH 5.0—9.0、温度20—30 ℃的条件下，菌株具有良好的降解能力. 最适条件下，D2能在18 h内将100 mg·L−1的ATZ完全降解，具有较高的耐受性及降解效率.
（3）D2主要通过脱氯羟基化、加氢脱烷基化、甲基化、脱烷基化和水解等将ATZ转化为羟基阿特拉津（HA）、阿特拉通（Atraton）、脱乙基阿特拉津（DEA）、西玛津（DMA）、羟基西玛津（HDMA）和脱乙基脱异丙基阿特拉津（DACT）.
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图 1 铝氟摩尔比(r)对氟离子的去除效果图
Figure 1. Effect of the molar ratio of aluminum to fluorine (r) on fluoride ion removal
图 5 残差的正态概率和去除率真实值与预测值的关系
Figure 5. Normal probability of residual error and the relationship between the real and predicted values of the removal rate
图 6 铝氟摩尔比(r)、pH、凝聚时间对去除率影响的响应曲面图
Figure 6. Response curve of aluminum-fluoride molar ratio (r), pH and coagulation time on removal rate
表 1 响应面实验设计
Table 1. Response surface test design
水平 因素 (A)铝氟摩尔比 (B)pH (C)凝聚时间/min −1 10 6 1 0 15 6.5 2 +1 20 7 3
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表 2 响应面实验设计和结果
Table 2. Response surface test design and results
实验号 (A)铝氟摩尔比 (B)pH (C)凝聚时间 去除率/% 1 15 6.0 3 41.10 2 20 7.0 2 41.10 3 20 6.5 3 56.44 4 15 7.0 3 38.95 5 15 6.5 2 49.70 6 15 7.0 1 34.36 7 10 7.0 2 17.18 8 20 6.0 2 47.24 9 15 6.0 1 38.95 910 1520 6.06.5 11 38.9554.60 11 15 6.5 2 47.24 12 10 6.5 3 34.36 13 15 6.5 2 49.70 14 10 6.0 2 23.31 15 10 6.5 1 31.90
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表 3 回归方程的方差分析与回归模型的可信度分析表
Table 3. Analysis of variance of regression equations and credibility of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 1 697.33 9 188.59 96.42 ＜0.000 1 (A)铝氟摩尔比 1 072.54 1 1 072.54 548.37 ＜0.000 1 (B)pH 45.17 1 45.17 23.10 0.004 9 (C)凝聚时间 15.24 1 15.24 7.79 0.038 4 AB 0.000 0 1 0.000 0 0.000 0 0.997 3 AC 0.096 1 1 0.096 1 0.049 1 0.833 3 BC 1.49 1 1.49 0.761 0 0.422 9 A2 105.44 1 105.44 53.91 0.000 7 B2 473.87 1 473.87 242.28 ＜0.000 1 C2 2.30 1 2.30 1.17 0.328 0 残差 9.78 5 1.96 失拟项 5.74 3 1.91 0.949 3 0.549 7 误差 4.03 2 2.02 总离差 1 707.11 14
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表 4 二次响应面回归模型预测值验证
Table 4. Verification of the predicted value of the quadratic response surface regression model
铝氟摩尔比(r) pH 凝聚时间/min 实际去除率/% 19.04 6.50 2.90 56.44 19.04 6.50 2.90 56.44 19.04 6.50 2.90 56.44
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