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随着全球气候变暖，大气中CO2体积分数持续升高，氮磷等营养物质大量输入，水体富营养化愈发严重，有害藻华频发[1-2]。致密的水华会消耗水中氧气，与水生生物竞争养分，破坏水产资源，导致水生态失衡[3-4]。此外，有些水华还会产生多种毒素或生物活性化合物，影响食品质量安全，危害人群健康[5]。水华已成为淡水湖泊面临的生态灾难，亦会对生态、环境和健康构成威胁[6]。因此，亟需寻找高效环保的方法来控制有害藻华。
在水生态环境中，藻细胞并不是独立存在的，其与微生物之间存在着物质交换与信息交流[7]。近年来，已有研究发现部分细菌及其分泌物具有强而特异的抑藻活性，这些细菌来源于藻际环境，在调节微藻的群落结构组成及生物量方面发挥着重要作用。因此，利用藻际细菌控制藻类水华成为研究者关注热点[8]。一些溶藻细菌在淡水水华爆发和消退过程中发挥了决定性作用[9]，而部分溶藻细菌和相应的溶藻物质已被证实能有效控制有害藻华[10-11]，且部分微生物的群体感应作用也能影响并调控菌藻的共生关系[12-13]。群体感应 (quorum sensing，QS) 是微生物化学信号传导的一种常见形式，主要通过释放一定量的胞外信号分子使个体获得有关邻近群落的细胞密度和物种组成信息，并相应地调整基因表达谱，实现个体无法进行的某些生理活动或者调节机制，如毒力因子产生、胞外聚合物合成、生物膜形成等[14-16]。在水华爆发过程中，溶藻细菌会跟随藻细胞的数量增长而增加，随水华的消亡而逐渐减少，但溶藻细菌在增殖初期并不表现出溶藻特性，只有数量达到一个阈值才能溶解藻细胞。因此，微生物的溶藻作用很可能受到QS的调控[17]。QS也参与溶藻物质代谢的调控。从太湖分离出一株气单胞菌GLY-2107，该菌能分泌3-甲基吲哚和3-苄基哌嗪-2,5-二酮两种溶藻活性物质，且证实该溶藻化合物的产生由AHL介导的QS调控，C4-HSL是溶藻功能菌溶藻活性的关键QS信号[11]。
扩散信号因子 (diffusible signaling factor，DSF) 家族群体感应是常见的群体感应系统之一，广泛存在于革兰氏阴性细菌中，可调节细菌种间与种内的多种与环境适应性相关的生物学功能[18]。DSF-QS信号的产生和响应主要由rpf基因簇完成。其中，rpfF基因负责合成DSF信号分子；rpfC/rpfG基因负责DSF信号识别与传导；rpfB基因负责降解DSF信号分子[19-20]。目前，DSF信号分子的生物化学功能调控机制基本上得以阐明，同时发现部分分泌DSF信号分子的微生物具有溶藻特性。周素等[21]用铜绿假单胞菌及其发酵液作用于铜绿微囊藻，发现用48 h的铜绿假单胞菌发酵液处理铜绿微囊藻7 d后，其溶藻率达到83.83%，对藻毒素的降解率达到71.35%。阴盼晴等[22]从赤潮中分离出一株能高效抑制锥状斯氏藻的嗜麦芽寡养单胞菌，该菌株能抑制藻细胞光合磷酸化电子传递过程，显著降低锥状斯氏藻的生物量。但这些报道中均未提及DSF-QS介导的群体感应对菌藻关系的影响机理，DSF-QS在微生物抑藻机制中的作用亦尚不清楚。
嗜根寡养单胞菌 (Stenotrophomonas rhizophila) 是一株革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水体中，已有研究证实嗜根寡养单胞菌具有潜在抑藻能力[23-24]，且其基因组中具有产生和响应DSF信号的rpf基因簇[19]。目前，嗜根寡养单胞菌的溶藻机制还不明晰，故S. rhizophila可作为DSF-QS调控溶藻作用和效果的模式菌株进行研究。基于此，本课题组以有害水华常见优势藻铜绿微囊藻为研究对象，以溶藻菌S. rhizophila野生型菌株 (WT) 和DSF合成酶基因-rpfF基因敲除株 (ΔrpfF) 为实验菌株，通过溶藻实验及基于光谱学手段，探讨DSF-QS存在或缺失条件下S. rhizophila 的溶藻作用及溶藻物质特性的差异，以期为DSF-QS调控的微生物溶藻机制提供科学依据，亦为微生物技术治理有害水华提供菌种资源及技术参考。
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1) 菌种培养及无菌滤液的制备。实验所用菌株S. rhizophila WT购于美国典型微生物菌种保藏中心 (ATCC) ，保藏编号：ATCC BAA-473T。菌株S. rhizophila DSF信号合成酶基因缺陷突变体ΔrpfF是由本实验室前期敲除S. rhizophila WT中的rpfF基因得到。实验菌株均用NB液体培养基 (牛肉膏1.5 g·L−1，蛋白胨5 g·L−1，NaCl 2.5 g·L−1) 在30 ℃、150 r·min−1条件下震荡培养。在培养到特定时间段后，取OD600为1.0的菌液，于8 000 r·min−1条件下离心5 min后，收集上清液，过0.22 μm滤膜制备无菌滤液。
2) 藻种来源与培养方法。实验所用藻种铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa，FACHB-905) 、凯氏拟小球藻 (Parachlorella kessleri，FACHB-729) 、斜生四链藻 (Tetradesmus obliquus，FACHB-416) 均购买自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库 (FACHB) 。所有藻株均用BG11培养基并放于人工气候培养箱培养，培养温度为25 ℃，光照条件为2 000 Lux，光照周期为12 h/12 h (白/黑) 。藻液在培养7 d后，取OD680为0.4的藻液进行后续实验。
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1) 溶藻方式。在实验菌株培养的第48 h取样，于8 000 r·min−1条件下离心5 min后分别收集上清液和菌体沉淀。所得上清液过0.22 μm滤膜制备无菌滤液，菌体沉淀用0.01 mol·L−1 无菌PBS洗涤3遍后加BG11培养液重悬。将所得菌液、重悬菌液、无菌滤液以体积分数10%比例添加到藻液中混匀培养，于培养第7 天取样测铜绿微囊藻叶绿素a (Chla) 质量浓度。
2) 不同培养时间对菌溶藻效果的影响。实验菌株S. rhizophila WT和ΔrpfF在1.1所述的培养条件下培养，分别在第12 h、24 h、48 h取菌液，制备无菌滤液，并以体积分数10%比例添加到藻液中混匀培养，于培养第7天取样测铜绿微囊藻Chla质量浓度。
3) 不同投加量对菌溶藻效果的影响。在实验菌株培养的第48 h取样离心，制备无菌滤液。将所得无菌滤液分别以体积分数5%、10%、15%比例添加到藻液中混匀培养，并于培养第7天取样测铜绿微囊藻Chla质量浓度。
4) 溶藻特异性。将48 h无菌滤液以体积分数10%添加到铜绿微囊藻、凯氏拟小球藻、斜生四链藻液中混匀培养，于第7天取样测铜绿微囊藻Chla质量浓度，评估S. rhizophila的溶藻特异性。
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1) S. rhizophila溶藻物质热稳定性。取48 h无菌滤液于5个离心管中，分别在- 40 ℃、40 ℃、80 ℃、100 ℃水浴处理2 h，并用高压蒸汽灭菌锅121 ℃处理20 min，冷却至室温后将各处理组上清液按体积分数10%加入藻液中进行溶藻实验，并于7 d后取样测铜绿微囊藻Chla质量浓度。
2) S. rhizophila溶藻物质酸碱稳定性。取48 h无菌滤液，用2 mol·L−1 的NaOH及2 mol·L−1 的HCl溶液分别调节pH至3和12，室温处理2 h后，再回调至初始pH，以未处理的无菌上清液作为实验对照，各处理组的上清以体积分数10%的比例加入藻液中进行溶藻实验，并于培养第7天取样测铜绿微囊藻Chla质量浓度。
3) S. rhizophila溶藻物质乙醇沉淀。取48 h无菌滤液，加入3倍体积的无水乙醇，混匀震荡10 min，4 ℃静置2 h后，于8 000 r·min−1条件下离心5 min，分别收集上清和沉淀。上清用氮吹仪吹干后，用同体积的无菌水复溶残留物和沉淀，并以体积分数10%的比例加入藻液中进行溶藻实验，于培养第7天取样测铜绿微囊藻Chla质量浓度。
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1) 叶绿素a提取方法。取10 mL藻液在4 000 r·min−1条件下离心5 min，然后弃上清，加入90%丙酮，涡旋10 s，放在4 ℃黑暗环境下萃取24 h，然后于4 000 r·min−1条件下离心20 min，上清转移至10 mL比色管中，用90%丙酮固定体积至10 mL，摇匀。最后，将上清液分光光度计比色皿置于1 cm光程下，用90%丙酮调零，分别读取750、663、645和630 nm波长的吸光度。Chla质量浓度计算公式如 (1) 所示[25]，并通过计算溶藻率来评估菌的溶藻效率，计算公式如 (2) 所示。
式中：Ct为某个时间点处理组Chla质量浓度，mg·L−1；C为该时间点空白对照组Chla质量浓度，mg·L−1。
2) 无菌滤液光谱解析。紫外-可见光光谱分析：取48 h的无菌滤液，用紫外分光光度计扫描波长190~600 nm的紫外光谱图，其中以去离子水作为空白参照。三维荧光光谱分析：取48 h的无菌滤液，使用荧光光谱仪 (FluoroMax-4，美国HORIBA公司) 进行三维荧光光谱扫描。激发波长 (λex) 扫描范围为240~450 nm，发射波长 (λem) 扫描范围为290~500 nm，步长为5 nm，狭缝为1 nm。傅里叶红外光谱分析：取48 h的无菌滤液，使用真空冷冻干燥仪 (BIOBASE，山东科博生物产业有限公司) 冻干去除样品中的水分，然后研磨成细粉，用傅里叶变换显微红外光谱仪 (Nicolet iN10MX，美国赛默飞公司) 采集4 000~400 cm−1波段内样品的红外光谱信息，共扫描64次，取平均值。
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本研究采用单因素方差分析对实验结果进行统计分析。其中，以不添加菌液的作为空白对照组，以添加NB培养基的作为实验对照组，而所有添加了无菌滤液的统一作为实验处理组，每个实验组均设置3个重复。统计分析软件为SPSS statistic 20.0，p < 0.05表示实验数据有显著性差异。
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S. rhizophila的菌体特征和生长曲线如图1所示。图1 (a) 为菌体形态。在30 ℃、150 r/min的培养条件下，WT菌体短小，两端大多呈钝圆形，菌长为1~2 μm；ΔrpfF形态呈直杆状，菌体细长，菌长2~4 μm。在培养的72 h以内，每隔一段时间用紫外分光光度计测其OD600，估计菌的生长状况。在培养初期，WT增长速率较快，而ΔrpfF具有一段延滞期；在培养至10 h后，ΔrpfF的生物量显著高于WT (p < 0.05) ，在48 h后ΔrpfF进入衰亡期，而WT依旧处于稳定期。因此，DSF-QS缺失的嗜根寡养单胞菌菌体形态与野生株不同，而敲除株在进入稳定期后会生成更多的生物量，但会更快进入衰亡期。
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微生物的溶藻方式主要分为2种：一种是通过微生物接触攻击藻细胞或吞噬藻细胞达到溶藻目的[26]；另一种是通过营养竞争限制藻细胞必需的营养物质或者分泌具有溶藻活性的代谢产物进行间接溶藻，在现已发现的溶藻功能菌中约70%的微生物都是通过间接方式来溶藻[27]。为探究S. rhizophila对铜绿微囊藻的作用方式，分别取WT和ΔrpfF的重悬菌体和无菌滤液进行溶藻实验，结果如图2所示。在连续培养7 d后，WT重悬菌体处理组Chla质量浓度为 (6.134±0.091) mg·L−1，菌液处理组Chla质量浓度为 (3.063±0.267) mg·L−1，无菌滤液处理组Chla质量浓度仅为 (3.469±0.101) mg·L−1，菌体处理组几乎没有溶藻活性，无菌滤液的溶藻效果与菌液处理组无明显差异；而ΔrpfF重悬菌体处理组7 d后Chla质量浓度为 (6.274±0.169) mg·L−1，菌液处理组Chla质量浓度为 (1.819±0.158) mg·L−1，无菌滤液处理组Chla质量浓度仅为 (1.515±0.009) mg·L−1，ΔrpfF的重悬菌体与无菌滤液的溶藻效果呈现出与WT一样的趋势。上述结果表明，WT和ΔrpfF无菌滤液的溶藻活性并没有因为菌体的去除而降低。这说明WT和ΔrpfF主要通过分泌具有溶藻活性的代谢产物进行溶藻，属于间接溶藻方式。
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微生物在不同的生长阶段生物活性及代谢产物会存在差异，进而可能会影响到溶藻效果[28]。分别取12 h、24 h和48 h的无菌滤液进行溶藻实验，结果如图3所示。培养7 d后，WT的12 h、24 h和48 h无菌滤液处理组的Chla质量浓度分别为 (3.330±0.103) mg·L−1、 (3.318±0.093) mg·L−1、(3.469±0.101) mg·L−1，溶藻率分别为48%、48%、46%，WT在3个时期的无菌滤液溶藻效果相近，无明显差异；而ΔrpfF的12 h、24 h和48 h无菌滤液处理组的Chla质量浓度分别为 (3.482±0.147) mg·L−1、 (1.674±0.189) mg·L−1、 (1.515±0.009) mg·L−1，溶藻率分别为50%、76%、78%，12 h无菌滤液处理组的溶藻率显著低于24 h和48 h处理组 (p < 0.05) 。从整体上来看，WT和ΔrpfF的48 h无菌滤液溶藻效果最佳，故后续研究将选择48 h的无菌滤液进行验证。
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不同投加量对菌溶藻效果具有较大的影响，选取合适的投加量对评估菌的溶藻特性十分重要。本实验选取3种不同的投加量 (即体积分数分别为5%、10%、15%) 进行溶藻实验，结果如图4所示。对于WT来说，处理7 d后投加量为5%、10%、15%处理组中Chla质量浓度分别为 (5.453±0.178) mg·L−1、 (3.469±0.101) mg·L−1、 (2.244±0.095) mg·L−1，溶藻率分别为15%、46%、65%，溶藻效果随投加量的增加而增大。而在ΔrpfF处理组中，到实验第7天投加量为5%、10%和15%处理组的Chla质量浓度分别为 (1.721±0.031) mg·L−1、 (1.515±0.009) mg·L−1、 (1.561±0.037) mg·L−1，溶藻率分别为75%、78%、78%，溶藻效果趋于稳定。基于上述结果及可行性分析，后续研究将选择体积分数10%的投加量进行验证。
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基于微藻种类多样性及生理生化结构的不同，菌的溶藻作用也可能表现出不一样的效果[29-30]。为研究S. rhizophila对不同藻株的溶藻作用，选取了水华常见藻中的凯氏拟小球藻和斜生四链藻作为对照测试藻株，结果如图5所示。WT与ΔrpfF的无菌滤液与凯氏拟小球藻共培养7 d后，Chla质量浓度分别增至(11.886±0.168) mg·L−1、(12.091±0.074) mg·L−1。S. rhizophila对小球藻并没有表现出显著的溶藻作用；WT与ΔrpfF的无菌滤液与斜生四链藻共培养7 d后，Chla质量浓度分别增至 (11.507±0.134) mg·L−1、 (11.753±0.102) mg·L−1。S. rhizophila同样对斜生四链藻没有表现出显著的溶藻作用。相反，实验菌株对铜绿微囊藻的溶藻作用显著 (p < 0.001) ，在共培养的第7天，WT处理组的Chla质量浓度降至 (2.928±0.135) mg·L−1，而ΔrpfF处理组的Chla质量浓度降至 (0.951±0.025) mg·L−1。综上所述，S. rhizophila具有针对铜绿微囊藻的溶藻特异性，而不是普适性溶藻功能菌。
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为探究S. rhizophila溶藻物质的热稳定性，在不同温度梯度下处理了无菌滤液并进行溶藻实验。由图6 (a) 可知，WT无菌滤液未处理组的7 d溶藻率为65.65%，在低温−40 ℃处理2 h后，溶藻率为46.74%，与未处理组相比下降了28%；而在高温处理下，溶藻率保持在55%~65%。由图6 (b) 可知，ΔrpfF无菌滤液未处理组的溶藻率为88.43%，在各处理温度作用后，溶藻率仍保持约88%，几乎未受到任何影响。结果表明，ΔrpfF分泌的溶藻物质不管在低温还是高温处理后仍能保持较好的溶藻率，热稳定性较好，而WT的溶藻物质活性易受温度影响，稳定性相对ΔrpfF较差。
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部分溶藻物质在强酸强碱的条件下也容易失活变性[31]。为探究S. rhizophila溶藻物质酸碱稳定性，在强酸 (pH = 3) 强碱 (pH = 9) 条件下处理无菌滤液并进行溶藻实验，结果如图7所示。WT未经过任何处理的无菌滤液处理组7 d后Chla质量浓度为 (3.242±0.248) mg·L−1，溶藻率为56.6%；而经过强酸强碱处理过后的无菌滤液处理组Chla质量浓度分别为 (3.019±0.077) mg·L−1、 (3.237±0.225) mg·L−1，溶藻率分别为59.6%和56.7%；而ΔrpfF的未经过任何处理的无菌滤液7 d后Chla质量浓度为 (0.861±0.040) mg·L−1，溶藻率为88.5%；经过强酸强碱处理过后，无菌滤液处理组Chla质量浓度分别为 (1.066±0.027) mg·L−1、(0.997±0.025) g·L−1，溶藻率分别为85.7%和86.6%。因此，对照组与处理组之间无显著性差异，这说明S. rhizophila分泌的溶藻物质具有较好的酸碱稳定性，在强酸强碱处理后依然能保持较好的溶藻作用。
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乙醇是渗透性很强的有机溶剂，能与氨基酸、核酸、蛋白等物质反应生成絮凝沉淀[32]，故利用乙醇沉淀无菌滤液并进行溶藻实验可确认S. rhizophila分泌的溶藻成分中这些物质的存在。图8表明，WT的无菌滤液经乙醇沉淀后，沉淀部分处理组7 d后Chla质量浓度为 (5.47±0.215) mg·L−1，溶藻率仅为17%，而上清液处理组Chla质量浓度为 (3.97±0.114) mg·L−1，溶藻效率为40%；ΔrpfF的无菌滤液经乙醇沉淀后，沉淀部分处理组7 d后Chla质量浓度为 (5.18±0.326) mg·L−1，溶藻率仅为22%，而上清液处理组Chla质量浓度为 (1.34±0.048) mg·L−1，溶藻效率仍保持在约79.8%。以上结果表明，WT和ΔrpfF的的主要溶藻物质存在上清液，在乙醇作用下仍表现出较好的溶藻活性，溶藻物质的稳定性较好；但同时，乙醇沉淀部分仍具有较弱的溶藻作用，故不排除部分溶藻物质为氨基酸、蛋白、核酸等物质。
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三维荧光光谱 (3D-EEMs) 是一种强有力的荧光基团分析方法，可表征产物中的荧光有机物。根据荧光区域积分，荧光光谱可表征以下几类物质：类色氨酸物质、类酪氨酸物质、类富里酸物质、类腐殖酸物质[33]。图9表明，在WT和ΔrpfF的无菌滤液中均检测到激发和发射 (λex/λem) 中心位置为360 nm/430 nm的类腐殖酸荧光峰。类腐殖酸物质是微生物对大分子有机物的代谢产物，且这类物质不能被二次代谢[34]。同时，从图谱中可看出，ΔrpfF中类腐殖酸荧光峰强度高于WT，这说明ΔrpfF的生物活性高于WT，能在相同时间里在培养液中积累更多的类腐殖酸物质。
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紫外-可见光谱是分子吸收紫外-可见光区域的电磁波而产生的吸收光谱，可反映无菌滤液在芳香族化合物和共轭体系方面的特性，并且吸光度与溶液中物质浓度成正比[35]。图10表明，WT和ΔrpfF的无菌滤液紫外可见光谱图趋势一致，在190~300 nm范围内的吸收峰密集杂乱，整个波段内最大吸收峰分别出现在297 nm和299 nm处。这说明WT和ΔrpfF的无菌滤液都含有丰富的芳香结构[36]，而且在最大吸收峰处ΔrpfF的吸光度要显著高于WT。这说明ΔrpfF芳香族类化合物质量浓度显著高于WT，与三维荧光谱图的结果一致。同时A250/A365的比值一般与样品的腐殖化程度和芳香化程度呈负相关[37]。在本实验中，WT的A250/A365 (0.362) 大于ΔrpfF (0.104) 即说明后者的芳香化程度大于前者，与上述结果一致。
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利用傅里叶转换红外光谱仪对S. rhizophila的无菌滤液进行分析，可表征产物的官能团性质及相对浓度[38]。图11记录了无菌滤液在4 000~500 cm−1的红外光谱吸收曲线，对比分析发现WT和ΔrpfF的无菌滤液红外光谱图趋势一致，官能团属性相似。从特征峰的归属来看，3 200~2 900 cm−1附近出现了酚羟基或醇羟基的伸缩振动；1 629 cm−1 附近出现了芳环骨架 (C == C) 的叠加振动或羧酸类化合物 (COO—) 的伸缩振动；1 400 cm−1附近出现了脂肪烃类中甲基 (—CH3) 的弯曲振动；在1 000 cm−1附近显示的是脂类骨架 (C—C) 的伸缩振动[39-40]。这些峰主要来自无菌滤液中的碳水化合物、脂肪族烷烃、多糖类、核酸等物质[41]。同时，从谱图中还发现，与WT相比，在最大吸收峰处ΔrpfF的红外吸收强度相对较高，这与三维荧光光谱以及紫外可见光光谱的强度变化一致。
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本研究通过生理生化实验及光谱学手段探究DSF-QS系统对S. rhizophila溶藻作用的调控，探明了DSF-QS调控菌体表型及生长代谢情况 (图1) 。DSF-QS缺失的S. rhizophila菌体形态与野生株不同，而敲除株在进入稳定期后会生成更多生物量，但会更快地进入衰亡期。QS信号分子的识别和传导对于细菌生理代谢和适应性至关重要[42]。前期研究表明，WT和ΔrpfF之间的转录调节因子和信号传导相关基因的表达存在较大差异。在DSF-QS缺失的情况下，ΔrpfF的DNA复制相关的基因表达量下调，细胞增殖能力减弱，相对于WT而言会更快进入衰亡期；同时，与细菌趋化性相关基因的表达显著上调，ΔrpfF表现出更强的趋化性和生物膜形成能力[43]。而这些生理代谢的改变可能直接影响了S. rhizophila的溶藻作用。
WT能在较短时间内进入生长稳定期，故WT的3个生长时期的无菌滤液溶藻效果趋于稳定，无明显差异 (图3) 。而ΔrpfF具有一段延滞期，生长前期生物活性较低，细胞代谢较弱，分泌到胞外的溶藻物质质量浓度相对较低，故12 h无菌滤液处理组的溶藻作用弱；而ΔrpfF随着生长进入稳定期，ΔrpfF大量增殖，细胞代谢增强，培养液中积累了大量溶藻物质，溶菌效果随之显著提升；而在24 h和48 h这2个处理组中溶藻效果基本相持平，这说明ΔrpfF的溶藻效果已趋于稳定，细菌进入生长后期细胞代谢减弱，只能依靠前期培养液中累积的溶藻物质来溶藻[44]。此外，不同投加量的无菌滤液对S. rhizophila的溶藻效果也具有较大差异 (图4) 。对于WT来说，处理7 d后投加量为5%、10%、15%处理组的溶藻率分别依次增加，溶藻效果随着投加量的增加而加强，呈现出一定的剂量效应[45]；而在ΔrpfF处理组中，投加量为5%、10%和15%处理组溶藻效果相近。ΔrpfF在稳定期的生物量显著高于WT，这可能导致WT的溶藻活性弱于ΔrpfF，需依靠较高的无菌滤液溶藻物质浓度才能发挥溶藻作用，而ΔrpfF分泌的溶藻物质活性较强，在低浓度下能达到较好的溶藻效果。
从整体上来看，WT和ΔrpfF的溶藻特性较为相似。WT和ΔrpfF都对小球藻和栅藻均未表现出溶藻作用，具有针对铜绿微囊藻的溶藻特异性 (图5) ，推测是由于小球藻和栅藻的细胞壁结构及生理代谢不同于铜绿微囊藻，对溶藻物质具有较强的抗性[46-47]。此外，WT和ΔrpfF的无菌滤液展现出与菌液一样的溶藻效果，溶藻活性并没有因为菌体的去除而降低。这说明WT和ΔrpfF主要通过分泌具有溶藻活性的物质进行溶藻，属于间接溶藻方式 (图2) 。目前，从溶藻菌中分离纯化出来的溶藻物质多为蛋白质、氨基酸、抗生素、多肽、生物碱等物质，部分物质耐高温高压、稳定性好，方便后续提取和保存[48]。本研究结果表明，WT和ΔrpfF的溶藻物质都具有热稳定性 (图6) 、耐强酸强碱 (图7) ，且经乙醇沉淀后上清依旧保持较好的溶藻活性 (图8) 。这表明WT和ΔrpfF的主要溶藻物质并非蛋白、糖类、核酸等易变性物质。此外，WT的溶藻物质受温度影响的波动较大，特别在- 40 ℃处理组中其溶藻率降低了28%，而ΔrpfF并无此现象。这说明WT和ΔrpfF的溶藻物质在种类上可能存在差异。
溶藻菌的溶藻物质在结构和作用方式上复杂多样，故进一步通过光谱学技术对WT和ΔrpfF的溶藻物质进行探究。结合三维荧光光谱 (图9) 、紫外可见光光谱 (图10) 、傅里叶变换红外光谱图 (图11) 结果分析发现，S. rhizophila WT和ΔrpfF的无菌滤液中主要以类腐殖酸物质为主，含有芳香基团，附带羧基、羟基等官能团。类腐殖酸物质是一种具有芳香基团的大分子多聚物，能与铁元素形成络合物，降低其生物利用度[49]。而铁元素参与藻类光合作用中电子传输蛋白的合成以及还原有机化合物，铁耗竭会抑制藻的生长[50]，这为WT和ΔrpfF抑制铜绿微囊藻生长的机制提供了一个合理解释。然而，类腐殖酸物质是一类弱酸性大分子有机物，具有热稳定性但在碱性环境中并不稳定，这与上述酸碱稳定性结果并不符，由此说明类腐殖酸物质络合铁并不是WT和ΔrpfF主要的溶藻方式，可能存在其他溶藻物质。这也表明S. rhizophila并不是代谢某一类单一物质进行溶藻，而是通过分泌多种溶藻物质共同作用的结果[11]。此外，从荧光强度及吸光度看，ΔrpfF无菌滤液中类腐殖酸物质含量和芳香化程度均高于WT，结合WT和ΔrpfF的生长代谢差异分析表明，WT和ΔrpfF的溶藻物质在浓度上也存在差异。
综上所述，DSF-QS与S. rhizophila的溶藻作用密切相关。当DSF-QS缺失后，S. rhizophila的生物量显著增加，代谢活性增强，在相同的生长周期内能代谢出更多的溶藻物质，进而增强了S. rhizophila的溶藻能力。
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1) S. rhizophila是一株溶藻功能菌，不同生长时期的无菌滤液和不同的投加量会对菌的溶藻效果有较大影响。其中，当采用48 h的无菌滤液且投加量为10%时，WT和ΔrpfF的溶藻效果最优，溶藻率分别为53%和78%。2) S. rhizophila WT和ΔrpfF主要通过分泌胞外溶藻物质进行溶藻，且溶藻物质稳定性较好，不易降解和失活，在高温高压及强酸强碱的处理下依然能保持较好的溶藻活性；同时，S. rhizophila产生的溶藻物质并非蛋白质、糖类、核酸等单一物质，不易被乙醇沉淀。3) S. rhizophila WT和ΔrpfF的无菌滤液主要以类腐殖酸物质为主，且该物质含有芳香基团，附带羧基、羟基等官能团，能络合铜绿微囊藻所必需的微量元素，进而限制铜绿微囊藻的生长。从荧光强度及吸光度看，ΔrpfF无菌滤液中类腐殖酸物质的质量浓度高于WT。这说明DSF-QS缺失使菌体能代谢出更多溶藻物质，进而增强了S. rhizophila的溶藻能力。DSF-QS系统对S. rhizophila溶藻作用的调控模式为溶藻菌的应用提供了新思路。
DSF型群体感应系统的缺失导致嗜根寡养单胞菌溶藻作用的增强
Enhancement of algicidal acrivity of Stenotrophomonas rhizophila induced by the absence of DSF quorum-sensing system
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摘要: 水环境中的微藻与藻际微生物之间关系复杂多变，而微生物的群体感应 (QS) 作用会影响并调控菌藻的共生关系。以嗜根寡养单胞菌 (Stenotrophomonas rhizophila) 野生株 (WT) 和QS扩散信号因子 (DSF) 合成酶基因- rpfF基因敲除株 (△rpfF) 为实验菌株，阐明DSF型群体感应是否调控嗜根寡养单胞菌对铜绿微囊藻的溶藻效果。结果表明：嗜根寡养单胞菌野生株和rpfF基因敲除株的溶藻特性相似，均具有针对铜绿微囊藻的溶藻特异性，主要通过分泌溶藻物质间接作用于藻细胞；野生株和敲除株培养48 h后的无菌滤液均有显著的溶藻作用，在投加体积分数10%无菌滤液的条件下，野生株和敲除株7 d溶藻率分别为53%和78%。此外，实验菌株分泌的溶藻活性物质具有热稳定性和酸碱耐受性，且不容易被乙醇沉淀；三维荧光光谱、紫外可见光光谱、傅里叶变换红外光光谱分析表明菌株胞外滤液中主要以类腐殖酸物质为主，芳香化程度较高；通过比较荧光强度和吸光度可知DSF合成酶基因缺失的嗜根寡养单胞菌的无菌滤液中类腐殖酸物质含量显著高于野生株。结果表明，DSF-QS缺失的嗜根寡养单胞菌生物量增多，能分泌更多的溶藻物质，增强了嗜根寡养单胞菌的溶藻作用。本研究拓宽了对菌藻互作的认识，有助于更好地理解溶藻菌对有害藻华的抑制机制，同时为以微生物菌剂治理水华的技术体系提供参考。Abstract: There are complicated and volatile interrelationships between algae and microorganisms in aquatic environments, of which quorum sensing (QS) of microorganisms can influence and regulate the symbiotic relationship between bacteria and algae. In this study, S. rhizophila wild-type (WT) and an incompetent DSF production rpfF-knockout mutant(△rpfF) were used to illustrate whether DSF-QS could regulate the algicidal effects of S. rhizophila on Microcystis aeruginosa. The results showed that S. rhizophila WT and △rpfF had similar algicidal characteristics. Both strains had algicidal specificity for Microcystis aeruginosa, mainly via secreting extracellular algicidal substances indirectly against algae. After 48 h of culture, the sterile filtrate of S. rhizophila WT and △rpfF showed significant algicidal effects. The algicidal rate of wild and knockout strains was 53% and 78% after a 7-day incubation when feeding 10%(v/v) sterile filtrate. The algicidal substances had better thermal stability and acid-base tolerance and were not easy to precipitate using ethanol. Three-dimensional fluorescence spectroscopy, UV-vis absorption spectrum, and Fourier transform infrared spectroscopy showed that the extracellular filtrate of the strain was mainly composed of humic acid-like substances with a high degree of aromatification. Meanwhile, the content of humic acid-like substances in the sterile filtrate of S. rhizophila △rpfF was significantly higher than S. rhizophila WT by comparing fluorescence intensity and absorbance. The above experimental results verified that the S. rhizophila lacking DSF quorum-sensing system had more biomass and could secrete more algicidal substances, which enhanced the algicidal effects of S. rhizophila. In this study, the understanding of bacteria-algal interaction was broadened, thus a better understanding of the inhibition mechanism of algicidal bacteria on harmful algal blooms was chieved. The results of this study can provide a reference for the technical system of bacteriological agents to control blooms.
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再生水正日益成为城市第二水源[1]。2020年北京市供水量为40.6×109 m3，其中再生水为12.0×109 m3，占总量的29.6%[2]。为实现城市水体富营养化防治目标，污水处理出水水质标准相应不断提升[3]。因此，学界与业界提出极限技术 (limit of technology, LOT) ，目标为实现出水总氮 (TN) ＜3 mg·L−1，总磷 (TP) ＜0.1 mg·L−1[4]。目前，国内虽有诸多满足LOT目标要求的处理工艺，但由于各类工艺处于不同研发或应用阶段，其技术完整性、稳定性和应用前景尚缺乏系统性的定量比较与评价。满足城市再生水利用要求的LOT技术及政策选择，仍需科学决策方法的支撑。
技术成熟度 (technology readiness level, TRL) 评价法被用以衡量各项技术对目标工程项目的满足程度[5]。2009年，我国实施《科学技术研究项目评价通则》 (GB/T22900-2009) ，强化了量化管理科学研究和技术成熟度评价的重要性[6-7]。2010年，国防科工局在基础科研“十二五”重大项目立项论证过程中提出：凡是未通过技术成熟度评价或评价等级不达标的项目不得参与立项论证[8]。2017年，《国家技术转移体系建设方案的通知》 (国发〔2017〕44号) 指出“推广技术成熟度评价，促进技术成果规模化应用”[9]。因此，技术成熟度法逐渐在包括环境工程在内的各类科技领域得到应用，并支持了国家水体污染控制与治理科技重大专项 (以下简称“水专项”) 综合技术分析[10]、气浮技术分析[11]、污水处理智控技术分析[12]、洱海入湖河流修复技术分析[13]等相关课题的科学决策。
为兼顾技术在我国研发的前沿性与应用推广前景，本研究从“十一五”、“十二五”和“十三五”水专项已验证项目中，筛选出水水质可基本满足LOT要求的代表性技术组合作为研究对象，进行综合评判的技术成熟度评价，并利用集成成熟度 (integration readiness level, IRL) 对单项技术定性评估结果进行集成系统定量化改良，构建IRL矩阵法改良的系统成熟度 (system readiness level, SRL) ，提升系统技术评价的综合性与全面性，为评估及优选符合减污降碳协同增效的政策背景的，可实现极限脱氮除磷要求的低碳低耗LOT技术提供参考。
1. 矩阵法改良SRL评估方法构建
1.1 TRL等级评估
水处理技术TRL评价准则的建立，通常仿照航天领域TRL细化准则的内涵，按照从立项、研发到应用的顺序构建框架，参考技术原理研究程度、技术市场需求、应用项目数量及尺度级别等特征，最终依据技术发展过程中的原理发现、技术方案、可行性论证、小试至示范工程实验及推广应用等阶段划分，并确定TRL等级值[14]。因此，水处理技术9个TRL等级的评估细则表述如表1所示[15]。TRL等级评估主要是针对离散技术元素的定性赋值评价，即仅限于评估单个系统的关键技术要素 (critical technical elements，CTE) 或某特定系统，而无法致力于多个单项技术的连结与集成[14]。首先，当TRL应用于技术组合的综合定量判别时，难以对技术 (或分系统) 集成到实际运行系统的难度进行精准评判，故使对技术成熟化过程 (由低级TRL向高级TRL演进) 的不确定性做出指导的难度增大。其次，TRL不支持对可能由人为或技术因素引起不确定性的分析，造成其用于定位组合技术成熟水平时误差加剧[16]。同时，因在选择TRL级别时没有引入对比分析法，故当涉及多个技术评估时无法进行比较分析。鉴于TRL本身存在的局限，尽管传统TRL等级评估已广泛应用于单一技术检测且日趋成熟，但单独使用TRL在技术系统层面仍存在不确定和不成熟因素，其单独很难全面描述技术组合的综合成熟水平[17]。
表 1 水处理技术TRL等级评估细则[15]Table 1. Current definitions of TRL for wastewater treatmentTRL等级 等级描述 等级评价标准 成果形式 1 发现基本原理或有基本原理的报告 发现并报告技术的基本原理 需求分析及技术基本原理报告 2 形成技术方案 明确介绍技术概念，提出应用设想，详细说明设计研发的技术路线、确定研究内容、开发策略 技术方案实施方案 3 技术方案通过可行性论证 技术路线、结构设计、关键功能通过可行性验证 论证意见或可行性论证报告等 4 通过小试验证 在实验室环境下验证关键技术、功能 小试研究报告 5 通过中试验证 以小试为基础，在逼真环境下验证关键技术、功能 中试研究报告 6 通过技术示范/工程示范 在示范工程中关键技术、功能得以示范，达到预期目标 技术示范/示范工程报告、专利等 7 通过第三方评估或用户验证认可 通过第三方评估或经用户试用，证明可行，为小批量生产做准备 第三方评估报告，示范工程依托单位应用效益证明 8 通过专业技术评估和成果鉴定 通过专业技术评估和成果鉴定，形成技术指南、规范，建立预生产模型 成果鉴定报告、技术指南、规范 9 得到推广应用 技术体系明确，在其他污染企业或其他流域得到广泛应用 推广应用证明 | Show Table
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1.2 改良SRL等级评估
目前，TRL等级评估在单项技术成熟度评估应用中较为成熟。但随着技术体系逐渐丰富，TRL无法体现技术组合中各个单项技术间相互作用对整体系统效果的影响。TRL的这一局限性催生了许多成熟度指标的后续开发，其中包含集成成熟度 (integration readiness level，IRL) 及系统成熟度 (system readiness level，SRL) 。为更加细致、全面及系统地评价技术组合的成熟度及推广特性[18]，研究者们基于TRL的相关分析，从数学上将组件TRL值与集成IRL结合起来，创建出针对系统技术进展评估的专门度量方法，即SRL。SRL的精确分析建立在TRL充分、准确的分析结果上，由此可见，TRL体系的成熟与完善为SRL的开发与应用提供了理论可行性与技术基础性。目前，常用的SRL计算方法中加权法应用较多，但权重确定受人为主观影响较大，且难以考虑技术间的复合集成关系[19]；模板对比法对系统真实成熟度反映较为客观，但计算过程较为复杂[20]；因子法可表示所研究技术与成熟技术的差距，但难以表现技术目前成熟情况[21]。然而，IRL矩阵法兼顾考虑单项技术本身的TRL与不同单项技术间的集成程度，且计算过程简易、结果客观性高，已在航天、卫星和雷达等领域获得成熟应用[18]。因此，本研究选择IRL矩阵法进行改良SRL计算。
1.2.1 IRL等级评估
IRL体现了不同技术兼容交互接口的系统分析，也体现了集成点 (即TRL) 间一致比较性的系统分析。此外，IRL可描述两项技术之间的集成程度，其中一项为开发中技术，另一项为正在开发或成熟技术。因此，对于精确评价技术的集成准备程度，IRL具有广阔的发展前景[22]。水处理技术中IRL等级的定性赋值评判依据如表2所示[10]。
表 2 IRL等级表[10]Table 2. Current definitions of IRLIRL等级 名称 描述 对应TRL 1 基础技术研究 开展新技术的实验，分析提炼基础原理及应用构想 TRL1，TRL2 2 概念定义 定义初始概念，制定开发策略 TRL2，TRL3，TRL4 3 技术开发 确定合适的技术组合 TRL4，TRL5 4 系统开发、验证 开发系统能力，降低集成技术风险；确保经济可行性；验证系统可靠性、可操作性、安全性与实用性 TRL5，TRL6，TRL7 5 生产 达到满足任务需求的生产能力 TRL7，TRL8 6 使用与保障 日常使用与保障中，具有最优效益 TRL8，TRL9 | Show TableDownLoad:
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1.2.2 IRL矩阵法改良SRL计算
基于IRL等级的矩阵法改良SRL计算具体过程如下。首先评估单项技术的TRL，形成TRL组合向量 (式 (1) ) ，再构建IRL矩阵 (式 (2) ) ，由IRL表示任意2项技术的交互集成程度。水处理集成技术的处理效果往往取决于发展程度较低的技术，因此IRL矩阵元素取值时取对应位置TRL较低技术的数值。SRL矩阵计算式见式 (3) ，其中计算添加权重因子的SRL见式 (4) 。
TRL=[TRL1TRL2⋮TRLn] (1) IRL=[IRL11IRL12⋯IRL1nIRL21IRL22⋯IRL2n⋮⋮⋱⋮IRLn1IRLn2⋯IRLnn] (2) SRL=[SRL1SRL2⋮SRLn]=19(IRL)×19(TRL)=181[IRL11TRL1+IRL12TRL2+⋯+IRL1nTRLnIRL21TRL1+IRL22TRL2+⋯+IRL2nTRLn⋮IRLn1TRL1+IRLn2TRL2+⋯+IRLnnTRLn] (3) SRL=(SRL1n1+SRL2n2+⋯+SRLini)n (4) 式中：
ni 表 3 SRL等级表[23]Table 3. Current definitions of SRLSRL取值范围 成熟阶段 定义 0.90~1.00 操作和维护 在系统生命周期内以应用效益最佳方式运行 0.80~0.89 生产 系统达到预期目标，并成功执行 0.60~0.79 系统发展验证 验证系统的协同性、安全性、有效性 0.40~0.59 技术发展 降低技术风险，确定集成技术的合理性 0.1~0.39 理论凝练 明确技术概念，构建应用设想和开发策略 | Show TableDownLoad:
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1.3 水专项相关LOT备选技术的筛选
通过调研“十一五”、“十二五”和“十三五”期间水专项相关课题及近年来再生水品质污水脱氮除磷的主流技术，综合考虑国内各地再生水标准取值、相关技术的应用程度及发展前景，在现有氮磷去除率高、出水基本满足LOT要求的技术组合中，筛选出12种工作原理、流程组合方式及应用规模不尽相同的LOT备选技术组合，作为主要研究与分析评估对象。表4汇总了各个备选技术组合的技术细节与基本特征。各备选技术组合至少包含2项以上单项技术，且单个组合内单项技术数量不超过4项，均有水专项针对性相关课题的研究内容进行示范支撑，保证了评估的合理性。由于TRL为针对离散技术元素的定性赋值评价，用于评估单个系统的关键技术要素 (CTE) 或某特定系统，展现单项技术的具体成熟度。SRL分析基于TRL的分析结果进行，以全面细致的对组合技术进行评判。因此，通过TRL对技术组合的单项技术成熟度进行定性评价，并基于此通过改良SRL方法来分析技术组合本身的系统集成状况以期对系统成熟度进行评价。进水水质根据示范工程所在点位示范运行期间的年平均值确定，出水水质、各单项技术的TRL取值及其运行成本根据调研课题研究报告及相关发表论文的数据波动范围综合确定，并基于此计算各项技术组合的TN、TP单位质量去除运行成本。整体而言，各个LOT单项技术的TRL值均在5以上，最高TRL值可达到9。
表 4 水专项相关LOT备选技术组合Table 4. Summary of representative LOT systems in China序号 备选技术组合 技术缩写 进水水质 出水水质 依托课题 TRL 单项技术成本/(元·m-3) TN单位去除运行成本/(元·g-1) TP单位去除运行成本/(元·g-1) 1 A2O -悬浮填料-混凝沉淀极限脱氮除磷技术 TN=24.60 mg·L-1,TP=2.42 mg·L-1, TN=1.915 mg·L-1,TP=0.05 mg·L-1,[24] 地下污水厂建设模式创新与生态综合体示范2017ZX07107-003 0.06 0.61 1.1 A2O技术 A2O 9 0.81[25] 1.2 悬浮填料脱氮技术 MBBR (moving-bed biofilm reactor) 9 0.35[24] 1.3 混凝沉淀技术 Coagulation 9 0.29[26] 2 A2O-反硝化深床滤池极限脱氮除磷技术 TN=39.25 mg·L-1,,TP=3.81 mg·L-1,[25] TN=1.38 mg·L-1,,TP=0.089 mg·L-1,[27] 天津城市污水超高标准处理与再生利用技术研究与示范2017ZX07106-005 0.04 0.38 2.1 A2O技术 A2O 9 0.482[25] 2.2 反硝化深床滤池 DBDF (deep-bed denite filters) 9 0.92[28] 3 Phoredox-反硝化深床滤池极限脱氮除磷技术 TN=31.70 mg/L,TP=1.99 mg·L-1[25] TN=2.37 mg·L-1,,TP=0.06 mg·L-1,[29] 白洋淀与大清河流域 (雄安新区) 水生态环境整治与水安全保障关键技术研究与示范2018ZX07110-002 0.04 0.65 3.1 Phoredox技术 Phoredox 9 0.343[30] 3.2 反硝化深床滤池技术 DBDF (deep-bed denite filters) 9 0.92[28] 4 A2O-SDA+BAF极限脱氮除磷技术 TN=35.4 mg·L-1,TP=5.38 mg·L-1[25] TN=3.00 mg·L-1,TP≤0.10 mg·L-1[31] 城区水污染过程控制与水环境综合改善技术集成与示范2012zx07301-001 0.03 0.20 4.1 A2O技术 A2O 9 0.45[25] 4.2 活性自持深度脱氮技术 SADeN (self-active denitrification) 9 0.086[32] 4.3 曝气生物滤池 BAF 9 0.50[33] 5 A2O-复合介质人工快渗系统极限脱氮除磷技术 TN=89.20 mg·L-1,TP=5.79 mg·L-1[25] TN≈3 mg·L-1,TP=0.071 mg·L-1[34] 永定河 (北京段) 河流廊道生态修复技术与示范2018ZX07101-005 0.01 0.15 5.1 A2O技术 A2O 9 0.482[25] 5.2 复合介质人工快渗系统 CRI (constructed rapid infiltration) 7 0.35[34] 6 氧化沟-轻质填料人工湿地-反硝化除磷滤池极限脱氮除磷技术 TN=32.6 mg·L-1，TP=6.31 mg·L-1[25] TN=1.73 mg·L-1TP=0.1 mg·L-1[35-36] 重庆主城重污染河流水污染控制与水质改善技术研究与示范2012ZX07307-002 0.02 0.09 6.1 氧化沟 OD (oxidation ditch) 9 0.3[37] 6.2 轻质填料人工湿地 CW (Constructed Wetland) 6 0.27[38]] 6.3 反硝化除磷滤池 DPRF (denitrifying P removal filter) 6 7 A2O-复合填料生物滞留池极限脱氮除磷技术 TN=31.6 mg·L-1,TP=3.17 mg·L-1[25] TN<1 mg·L-1，TP<0.1 mg·L-1[39] 0.02 0.21 7.1 A2O技术 A2O 9 0.55[25] 7.2 复合填料生物滞留池 BT (bioretention tank) 6 0.1[40] 8 BNR-多级复合流人工湿地极限脱氮除磷技术 TN=50.2 mg·L-1,TP=4.59 mg·L-1[25] TN<1.5 mg·L-1TP<0.1 mg·L-1[41] 天津中心城区景观水体功能恢复与水质改善的技术集成与示范2008ZX07314-004 0.02 0.21 8.1 BNR技术 BNR (biological nutrient removal) 9 0.89[25] 8.2 混凝沉淀技术 Coagulation 9 8.3 人工湿地技术 CW 9 0.05[42] 8.4 人工浮/沉床技术 EFB/ESB (Ecological floating/submerged bed) 8 9 A2O-复合人工湿地-稳定塘极限脱氮除磷技术 TN=48.8 mg·L-1,TP=4.94 mg·L-1[25] TN<1.5 mg·L-1，TP≈0.05 mg·L-1[41] 天津中心城区景观水体功能恢复与水质改善的技术集成与示范2008ZX07314-004 0.01 0.14 9.1 A2O技术 A2O 9 0.64[25] 9.2 复合人工湿地技术 CCW (combined constructed wetland) 6 0.06[41] 9.3 稳定塘技术 SP (stabilization pond) 9 10 A2O-梯级人工湿地系统极限脱氮除磷技术 TN=35.05 mg·L-1,TP=2.22 mg·L-1[25] TN≈0.45 mg·L-1,TP≈0.10 mg·L-1[43] 入淀湿地复合生态系统构建技术研究和工程示范2018ZX07110-004 0.02 0.36 10.1 A2O技术 A2O 9 0.53[25] 10.2 植物沉淀塘技术 PSP (plants sedimentation pond) 6 0.16[44] 10.3 水平潜流人工湿地技术 HCW (horizontal constructed wetland) 9 10.4 生态稳定塘技术 ESP (eco-stabilization pond) 7 0.08[45] 11 Phoredox-植物净化系统极限脱氮除磷技术 TN=68.20 mg·L-1,TP=1.30 mg·L-1[25] TN≈1.94 mg·L-1,TP≈0.078 mg·L-1[46] 白洋淀与大清河流域 (雄安新区) 水生态环境整治与水安全保障关键技术研究与示范项目2018ZX07110-005 0.01 0.35 11.1 Phoredox技术 Phoredox 9 0.343[30] 11.2 植物净化系统 PPS (phyto-purification system) 7 0.1[46] 12 氧化沟-太阳能混合充电-生态浮岛极限脱氮除磷技术 TN=31.6 mg·L-1,TP=2.91 mg·L-1[25] TN=1.24 mg·L-1，TP=0.04 mg·L-1[47] 0.01 0.11 12.1 氧化沟 OD 9 0.33[25] 12.2 太阳能混合充氧-生态浮岛 SO-EFI 6 0[48]] | Show TableDownLoad:
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2. LOT备选技术组合改良SRL评估分析
由于TRL评价方法的局限性，选用通过基于TRL等级分析以构建IRL矩阵评估的改良SRL评价方法来评估“十一五”、“十二五”和“十三五”期间水专项相关课题及近年来再生水品质污水脱氮除磷筛选出来的12项LOT备选技术，以TRL分析来定性评价技术组合中单项技术的技术成熟度等级及分布情况，并基于此构建SRL对12项技术组合的集成情况和系统成熟度进行定量评估，以为污水处理中的先进技术组合发展评估及优化提供新思路。
2.1 单项技术TRL等级评估分析
根据LOT备选技术组合的不同技术阶段和主功能技术类型，对12种LOT备选技术组合的各个单项技术进行系统归纳分类梳理，结果如图1所示。整体而言，LOT备选技术组合的工艺流程可归纳为污水原水-污水厂二级处理-深度处理3个主控功能阶段。污水原水经污水处理厂二级处理系统净化后，出水辅以深度处理的主功能技术而达到LOT的标准要求。而主功能技术以生物类技术为主，表明满足LOT要求的技术组合仍需重点关注污水处理厂人工处理系统与自然处理系统功能的耦合、强化与优化。LOT备选技术组合中，污水厂二级处理阶段的人工处理系统主要使用A2O技术、Phoredox技术、氧化沟技术及BNR技术此4类传统生化强化技术，技术成熟度高且发展时间较长。深度处理阶段是LOT备选技术组合实现极限脱氮除磷关键功能的核心阶段，现有的主功能技术中除混凝沉淀技术为化学手段外，其余均属于生物手段。按照主要技术功能实施方式的不同，主功能技术可进一步归类为反应器类、人工湿地类和混合系统类3大类；而根据主要处理对象的区别，三大类工艺还可更细致地梳理为单独除磷、单独脱氮和同步脱氮除磷3类。反应器类技术和混合系统类技术的TRL值主要分布在7~9，这表明技术水平多数已达到第三方评估认可至推广应用阶段，面向快速应用的前景可观；人工湿地类技术的TRL值以6为主，主要还停留在进一步完善示范工程市场接受度的阶段，需要第三方的鉴定和验证以评估技术的可靠性及稳定性。
图 1 LOT备选技术组合核心技术贡献过程分类及TRL值表观比较Figure 1. Core technology contribution process classification and TRL value apparent comparison of LOT alternative technology portfolio对不同TRL等级单项技术在各LOT备选技术组合中的使用频次和同等级值出现频次进行细化梳理，以获得单项技术TRL值分布的详细信息，结果如图2所示。A2O技术在各技术组合中共出现了7次，是出现频次最高的技术，已被证明技术成熟度以及推广应用程度较高。出现频次第二多的单项技术为氧化沟技术、混凝沉淀技术和Phoredox技术，出现频次均为2次。以上均为污水厂二级处理技术，处于人工处理系统阶段。其余单项技术的出现频次均为1次，且涵盖了所有的LOT主功能技术，这说明LOT的主功能技术尚处于行业发展初期的多方技术竞争市场阶段。对不同TRL等级值的单项技术出现频次进行统计发现，TRL值为8的单项技术有1项，TRL值为6的单项技术共7项，TRL值为7的单项技术共3项，TRL值为9的单项技术共7项。其中，除4项为单独脱氮或除磷的单项技术外，其余单项技术均可实现整体脱氮除磷。整体而言，技术发展水平达到工程示范及以上的单项技术总数可达到22项 (TRL≥6) 。其中，TRL值在6~7的单项技术共10项，大多为新兴的生态/生物类工艺，以生物作用 (植物吸收和微生物利用) 和生态调控作用为脱氮除磷的主要机制；而TRL值≥8的单项技术共12项，已经过第三方评估或用户验证，主要为发展时间较长、应用较为广泛的人工水处理技术和部分生态强化的混合系统类技术。由此可见，这些备选LOT技术组合基本实现了成本优化和低碳低耗的技术运营模式，可满足污水的资源化及生态环境的优化需求。这也表明，以生物脱氮除磷为主的技术已在LOT技术组合中占据重要地位，这也符合减污降碳协同增效的政策背景，具有较高的市场推广及应用价值。
图 2 LOT备选技术组合中各单项技术分类使用频次及TRL值分级频次对比Figure 2. Comparison of TRL value and technical function classification attribute of LOT alternative technology combination2.2 技术组合中单项技术TRL值分布比较分析
对各个LOT备选技术组合内部不同单项技术成熟度等级值的数据分布进行统计分析，结果如图3所示。所有技术组合的单项技术TRL值均在6及6以上，其中技术组合1、2、3、4中的各单项技术TRL值均为9。具体来看，技术组合1、2、3、4、8在采用传统A2O或BNR处理技术的基础上，复合了MBBR、反硝化深床滤池、曝气生物滤池、混凝沉淀、传统人工湿地等整体成熟度较高的技术，TRL值为8~9，平均值与中位值接近或等于9，在天津等地有较成熟的的示范工程[41]，技术规范也较为成熟，已有推广应用基础。技术组合1、3、5、9、10、11通过将悬浮填料、强化深床滤池等反应器强化脱氮技术或具有蓄积、调控功能的生态技术，运用在A2O技术或Phoredox技术的出水深度处理中，借助植物净化[46]、生态浮床[49]、复合强化人工湿地[50]等技术，可充分发挥植物和湿地的功能特点，以实现水体的强化脱氮除磷。这些技术系统平均TRL值接近8，整体较为成熟，在北京[51]、重庆[34]、天津[41]、河北[43, 46]等地都有相关示范工程和第三方效果评估，并具备初步的技术规范。技术组合6、7、12采用了轻质填料人工湿地、复合填料式生物滞留池、太阳能充氧生态浮岛等较为新颖的技术，故平均TRL值约为7，技术成熟度等级达到第三方评估应用认可的水平，在江苏[52]、安徽[36, 53]、西安[47]等地已建成相关课题的示范工程。
图 3 LOT备选技术组合中单项技术成熟度等级统计分布Figure 3. Statistical distribution of individual technology maturity level in LOT alternative technology combination对各项LOT备选技术组合中不同主功能类型单项技术的TRL等级数量占比进行分析，结果如图4所示。在污水处理厂出水阶段，采用的各单项技术TRL值均为9，占比达到100%。污水厂处理工艺主要采用传统的水处理工艺 (A2O、BNR、氧化沟、Phoredox) ，由于其工艺发展时间较长，技术发展成熟，因而基本实现了市场性应用和推广。污水处理厂二级出水后，反应器类主功能技术中单项技术总数共6个，其中66.7%的单项技术TRL值达到9。而TRL值为7的单项技术占16.7%，TRL值为6的单项技术占剩余16.7%。人工湿地类主功能技术的单项技术总数为4个，TRL值为6的单项技术占比最大达50%，TRL值为9的单项技术占比50%。混合系统类主功能技术中，TRL值为6的单项技术总数为4个，占比50%，TRL值为9和8的单项技术各1个，占比均为12.5%，而TRL值为7的单项技术为1个，占比25%。故整体而言反应器类主功能技术大多发展时间较长，单项技术成熟度较高；混合系统类和人工湿地类单项技术具有较多耦合创新，技术成熟度略低。
图 4 LOT备选技术组合中各主功能技术类型不同TRL单项技术数量占比图Figure 4. Figure of the proportion of individual TRL technologies with different main functional technology types in the alternative technology combination of LOT2.3 SRL计算结果评估及系统运行成本分析
LOT备选技术组合经评估矩阵计算后的系统成熟度SRL分析结果如图5所示。各项备选技术组合的SRL值较高，大多技术组合的SRL值为0.6~0.8，处于系统发展验证阶段，相关技术组合正在为真正的市场推广进行产品稳定性提升。技术组合1、2、3、4、8的SRL值为0.8~1.0及0.9~1.0，达到了生产、操作和维护阶段，具备直接生产并面向市场产生较高的应用效益的能力，可在未来的推广应用中占据重要地位。
图 5 LOT备选技术组合SRL评估结果及系统运行成本分布雷达图Figure 5. LOT alternative technology combination SRL evaluation results and system cost distribution radar diagram技术经济性作为衡量推广应用可行性的重要指标，也纳入本研究的成熟度评价中。LOT备选技术组合中单项技术的处理运行成本依据《城市污水处理工程项目建设标准》 (建标[2001]77号) 核算，主要考量技术的动力费、药剂费、材料费、修理费、管理费、折旧费、人工工资等。经调研，我国污水平均处理运行成本为0.50~1.22元·m−3[54] (污水处理全运营成本减去污泥处理成本) 。根据全国平均进出水水质[55]及平均运行成本计算可知：全国平均TN单位质量去除运行成本为0.03元·g−1，TP单位质量去除运行成本为0.19元·g−1。通过整合各单项技术的运行成本及技术组合的进出水水质，计算得出LOT备选技术组合的TN单位质量去除运行成本和TP单位质量去除运行成本，具体结果如表1所示，而各技术组合系统运行成本的对比分析结果如图5所示。
TN单位质量去除运行成本 (0.01~0.06元·g−1) 较TP单位质量去除运行成本 (0.09~0.65元·g−1) 低，且其技术组合的相应脱氮、除磷的单位质量去除运行成本大致趋势相同，除技术组合11外，由于其进水总磷浓度较低导致TP单位质量去除运行成本较高 (0.35元·g−1) 。12项技术组合的TN单位质量去除运行成本和全国平均TN单位质量去除运行成本基本持平，除技术组合1、2、3、4 (分别为0.06元·g−1、0.04元·g−1、0.03元·g−1、0.03元·g−1) 外TN单位质量去除成本均低于全国平均TN单位质量去除运行成本 (0.03元·g−1) 。由于LOT技术出水水质标准高于全国平均污水厂出水水质，说明LOT技术在单位质量去除TN上更具有市场优势，且更符合人们对再生水水质提高的日益需求。12项技术组合的TP单位质量去除运行成本和全国平均TP单位质量去除运行成本相比，除了技术1、2、3、10、11 (分别为0.61元·g−1、0.38元·g−1、0.65元·g−1、0.36元·g−1、0.35元·g−1) 外，各项技术组合的其单位质量去除运行成本相近或低于全国平均值 (0.19元·g−1) 。而LOT出水水质标准高于全国平均污水厂出水水质，说明LOT技术在单位质量去除TP上更具有市场优势，同样更符合人们对再生水水质提高的日益需求。进一步分析，技术组合1、2、3、4的TN、TP单位质量去除运行成本较高，主要受其技术组合中的污水厂二级处理技术和深度处理主功能技术大多为传统的反应器类技术，其系统运行和维护成本较高，但其改良SRL等级值较高，达到了操作和维护阶段，可直接生产并面向市场实现系统生命周期运行的最大效益。而技术组合5、6、7、8、9、10、11、12因各LOT备选技术组合的深度处理主功能技术类型主要通过生物法 (植物、生态系统耦合) 为核心关键工艺，其系统维护和运营成本较低且去除氮、磷能力较强使其TN、TP单位质量去除运行成本较低，但SRL系数等级大多分布在0.6~0.79，处于系统发展验证阶段。相关技术组合正在为真正的市场推广进行产品稳定性提升，有待进一步优化的潜力空间。以上技术组合将同步脱氮除磷的混合系统类技术或具有蓄积、调控功能的生态技术运用在二级出水深度处理工艺中，借助植物净化、生态浮床、复合强化人工湿地、曝气生物滞留池、太阳能混合充氧生态浮岛等一系列生态技术，充分利用植物和湿地等生态技术的特点，既实现了高效的同步脱氮除磷，又降低了工艺本身的运行和维护成本，并挖掘了污水资源化的景观价值，在其运行生命周期中进一步实现了低碳低耗运营模式的优化与发展。各项技术组合中相关生态类单项技术的TRL等级大多处于示范工程或第三方检验阶段，具备技术革新的潜力，更利于整体系统的优化和提升，市场前景可观。
3. 结论
1) 对水专项相关课题进行相关调研和实时跟进并对其和国内外基本满足LOT要求的技术进行梳理，筛选出12项LOT备选技术组合，均为污水厂二级处理技术辅以主功能深度处理技术进而达到LOT要求。主功能深度处理技术以生物类技术为主，可分为反应器类技术、人工湿地类技术和混合系统类技术三类，大部分单项技术TRL等级在7以上，具有较强的应用前景。整体而言，反应器类技术的单项技术成熟度较高，混合系统类和人工湿地类单项技术具有较多耦合创新，技术成熟度略低。
2) LOT备选技术组合的改良SRL值为0.6~0.8，处于系统发展验证阶段，相关技术组合正在为真正的市场推广进行产品稳定性提升。大部分备选技术组合的TN、TP单位质量去除运行成本均低于我国污水处理厂的相应污染物平均单位质量去除运行成本，具有较大市场优势。技术组合1、2、3、4的TN、TP单位质量去除运行成本较高，但其改良SRL等级值较高，达到了操作和维护阶段，可直接生产并面向市场实现系统生命周期运行的最大效益。技术组合5、6、7、9、10、11、12的系统充分利用植物和湿地等生态技术的特点，运行成本相对较低，具有推广潜力。由此可见，这些备选LOT技术组合基本实现了成本优化和低碳低耗的技术运营模式，可满足污水的资源化及生态环境的优化需求。同时，LOT单项技术还应加强物理-化学脱氮除磷、生态处理技术的研发，推进植被搭配优化，使其在运行生命周期中进一步实现低碳低耗运营模式的不断优化和发展。
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图 1 S. rhizophila的表型及生长特性
Figure 1. Phenotype and growth characteristics of S. rhizophila
图 3 S. rhizophila不同生长时间对溶藻效果的影响
Figure 3. The influence of algicidal effect treated with different S. rhizophila growth stages
图 4 S. rhizophila的无菌滤液不同投加量对溶藻效果的影响
Figure 4. The influence of different dosages of sterile filtrate of S. rhizophila on algicidal effect
图 5 S. rhizophila对不同藻类的溶藻效果
Figure 5. The aligicidal infulence of S. rhizophila on different algae
图 6 不同温度处理后S. rhizophila无菌滤液的溶藻效果
Figure 6. The algicidal effect of the sterile filtrate of S. rhizophila treated at different temperatures
图 7 强酸强碱处理后S. rhizophila无菌滤液的溶藻效果
Figure 7. The algiicidal effect of the sterile filtrate of S. rhizophila treated with strong acid and strong base
图 8 乙醇沉淀后S. rhizophila无菌滤液的溶藻效果
Figure 8. The algicidal effect of S. rhizophila sterile filtrate treated with ethanol
图 9 无菌滤液的三维荧光光谱图
Figure 9. Three-dimensional fluorescence spectra of algicidal substances
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