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在废水生物处理系统中，微生物是污染物降解的主体。一般而言，活性污泥处理系统中微生物生长繁殖需要的营养物质含量具有一个经验比例，即化学需氧量∶氮∶磷(COD∶N∶P)为100∶5∶1。当处理废水中营养物质含量达不到该比例时，如耗氧有机污染物(以COD计)浓度过低，或者氮、磷浓度比例过低，则该废水被称为贫营养废水。在贫营养水质条件下，系统营养物质比例失调，生物系统中活性污泥微生物由于缺乏某类营养物质而活性降低，甚至大量死亡，导致处理系统失效。WANG等[1]发现，在脱氮除磷系统中，当有机物浓度过低时，微生物细胞内合成和贮存的PHA不足，系统的脱氮除磷效率将大幅降低。PENG等[2]的研究表明，进水底物中缺乏氮或磷会刺激活性污泥中丝状菌的增殖，从而发生丝状污泥膨胀而使系统处理性能降低。为解决贫营养废水处理效率低的难题，目前大多数污水处理厂通常采用投加有机物或氮磷等营养物质的方式调整系统进水营养比例，以满足活性污泥微生物生长需求，保证系统稳定运行。
近年来，随着微生物测序技术的飞速发展，基于16SrRNA高通量测序技术的微生物检测被广泛应用于污水处理厂活性污泥微生物群落结构的分析中，大大提高了人们对污泥微生物群落及其功能的了解。目前，对污水处理系统内主要微生物群落的研究已有大量报道。JIN等[3]的研究表明，在门水平上，活性污泥中的细菌主要集中在变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)4种。ZHANG等[4]对滁州市污水处理系统5个活性污泥微生物群落结构的研究中发现，在所有活性污泥样品中，除了上述4种菌门，绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)也是优势菌。在这些优势菌门中，变形菌门(Proteobacteria)是活性污泥系统中最常见的原生门类，也是传统废水生物处理过程中的关键细菌群[5]。有研究[6]表明，该菌门与污水生物处理过程中的有机物降解和脱氮除磷密切相关，而隶属于该门的Zoogloea属是构成活性污泥菌胶团的重要组成菌属，在多种有机物的降解过程中发挥着重要作用[7]。拟杆菌门(Bacteroidetes)是异养微生物的另一类重要门类，能参与有机碳和蛋白类物质的循环[8]。该门同时也是厌氧消化过程中常见的产酸菌[9]，其部分菌属能降解长链脂肪酸，并可水解发酵多糖类有机化合物[10-11]。有研究[12-13]表明，拟杆菌门中的拟杆菌属(Bacteroidales)能够利用纤维素和多糖，并可将纤维素、二糖、葡萄糖和甘露糖等有机物降解为醋酸酯或琥珀酸。绿弯菌门(Chloroflexi)作为污水处理厂常见的菌群，具有较高的有机负荷承受能力[14]，并且对糖类有较好的降解能力，可产生乙酸[15]。厚壁菌门(Firmicutes)广泛分布在厌氧环境中，包含梭菌纲(Clostridium)、芽孢杆菌纲(Bacillibacteria)等多种功能菌纲，其对有机物的水解和酸化有重要作用[16]。此外，酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)也是污水处理厂厌氧过程中重要的功能菌群，是厌氧消化过程中的主要产酸菌，起水解酸化作用[17-18]。以上这些污水处理厂常见主要菌群的研究结论，大多是基于普通的污水生物处理过程，即微生物生长所需营养物质能够得到满足的条件下得到的结果。然而，当污水处理系统中氮、磷等营养受限时，微生物群落的结构变化和种群分布规律还有待进一步研究。
云南省昆明市某制药厂废水处理系统中，进水耗氧有机污染物(以COD计)和悬浮物浓度高，而氮磷浓度极低，进水营养物质含量比例达不到常规微生物生长需求，COD∶N∶P仅为100∶0.4∶0.07。然而系统长期运行状况表明，在氮磷营养贫乏的条件下，该系统运行稳定，污水处理效果良好，出水水质均达到了国家《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)的一级标准。为此，本研究对该贫营养废水处理系统中关键环节的污染物降解情况进行了监测，并对其活性污泥中微生物进行了高通量测序分析。本研究旨在从系统运行及污泥微生物的角度解释该制药厂贫营养废水处理系统长期稳定运行的原因，为营养不均衡的高浓度有机废水的处理及系统维护提供有益指导。
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云南省昆明市某制药厂污水处理站总处理水量约为1 000 m3·d−1，进水分别来源于生产废水和生活污水。生产废水主要来自车间洗泡蒸煮药材、冲洗、制剂等生产过程，该废水的特点为：废水COD值高、波动范围较大，耗氧有机污染物(以COD计)质量浓度通常在1 000~2 000 mg·L−1波动；废水中氮磷等营养元素含量较低(TN<9 mg·L−1、TP<1 mg·L−1)，加大了生物处理的难度。工艺好氧段曝气池MLSS为3 000~4 000 mg·L−1，MLVSS为1 500~2 000 mg·L−1，SVI为100~150 mL·g−1。废水经污水处理站处理后，部分废水排入市政管网，部分经过深度处理后作为该厂中水进行回用。
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系统处理工艺为A2O工艺，厌氧过程采用IC工艺，好氧过程采用活性污泥完全混合处理工艺。为了适应不同的进水水质，在生化处理工艺的前端分别设置了2组预处理工艺。污染物浓度较高的生产废水(浓废水)，首先经过沉淀作用去除水中部分悬浮物，再进入浓废厌氧池进行部分有机污染物的降解，而后流入调节池调节水质水量。经过这样预处理后，浓废水才能进入后续的主体生化系统进行处理；污染物浓度较低的生活污水(淡废水)，经沉淀后直接流入调节池进行后续的生化处理。混合后的调节池出水从厌氧污泥池底部进入，与堆积在池子底部的污泥混合接触，经污泥中微生物对废水中的有机物进行充分降解后，出水自厌氧池上部出水口流入缺氧池进行反硝化脱氮。缺氧池出水继而流入好氧池，在大量好氧异养菌的作用下，有效地去除剩余有机污染物。好氧池出水经过二沉池泥水分离后，部分出水排入市政管网，剩下的部分废水经过混凝沉淀、曝气生物滤池、消毒等深度处理工艺处理后作为中水回用。系统详细工艺流程图如图1所示。
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分别取调节池和生化处理单元各反应池末端的出水进行水质检测。采用标准方法[19]对COD、氨氮、硝态氮、TN、TP、SS、SVI、MLSS、MLVSS等指标进行测定；DO、pH、水温等用雷磁多参数水质分析仪测定。
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在工艺系统运行过程中，分别收集厌氧池、曝气池的污泥微生物样品。采用CTAB或SDS方法对污泥样品的基因组DNA进行提取，提取样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化，形成测序文库(SMRT Bell)，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用PacBio Sequel进行上机测序。使用USEARCH(10.0版)在相似性97%(默认)的水平上对有效的标签序列进行聚类，默认以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTUs。以silva为参考数据库，使用朴素贝叶斯分类器对OTUs代表序列进行分类学注释，得到物种分类学信息，进而统计各个样品在门、纲、目、科、属和种水平上的群落组成。利用QIIME软件计算各样品在97%相似度水平下的ACE、Chao、Shannon及Simpson指数。将数据批量导入QIIME软件，对OTUs表进行组间差异性分析，生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图。
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系统在近10年的运行过程中，处理效果稳定，出水有机污染物及氮、磷浓度低，达到国家《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)和《污水排入城市下水道水质标准》(CJ 3082-1999)。其中，COD和BOD的去除率均高达90%以上；氮磷去除率也达到70%左右。表1显示了近期系统出水指标的具体监测结果。
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为探查系统在贫营养条件下各阶段的处理性能，本实验对系统进水及各反应器末端出水水质进行了取样检测。系统中各处理构筑物末端出水污染物平均浓度变化如图2所示。水质检测结果表明，贫营养水质并未对系统各处理阶段的处理性能产生明显影响；有机物在系统厌氧、缺氧和好氧过程中都得到了很好的降解，氮、磷在厌氧过程中略有积累，而在缺氧和好氧过程中得到很好的降解。厌氧池的COD去除率为52%左右，好氧池的COD去除率为93%，系统COD总去除率高达98%，这表明系统具有良好的有机物降解效果。TN和氨氮的降解主要在缺氧段和好氧段，缺氧段的去除率为9.61%和16.81%，好氧段为29.37%和95.75%。厌氧过程中氮磷浓度略有上升，这可能与其过长的SRT有关。有研究表明，厌氧条件下氮磷的释放受SRT影响[20]，过长的SRT会导致氮磷的释放量增加[21]。本系统中厌氧池污泥长时间停留在反应器内，其SRT长达78 d左右，有可能导致其氮磷浓度增加。此外，有研究[22]表明，当活性污泥系统同时缺乏氮磷时，部分污泥将发生解体。因此，本研究中由于氮磷缺乏而导致的部分微生物死亡解体，从而释放氮磷，也可能是造成厌氧池氮磷浓度升高的原因。
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在污水生物处理系统中，微生物是污染物去除的主要执行者，系统中微生物的种类、数量及分布等状况，从根本上决定着系统处理性能及效果。为揭示贫营养水质条件对系统优势菌群的影响，本研究对该污水处理系统中的厌氧池和好氧曝气池的污泥样品进行了高通量测序，考察两生化反应池与正常营养水平废水处理系统中微生物群落的差异。
1)高通量测序数据结果表明，该系统中好氧池和厌氧池的有效序列数分别为4 625和4 875；在97%的相似度水平上对有效序列归类OTUs，好氧池和厌氧池的OUTs数量分别为253和78。好氧池的OUT数量较高，表明好氧池具有较多的微生物种类。好氧池的细菌群落具有19门、24纲、55目、62科、70属；厌氧池细菌群落具有18门、27纲、35目、44科、51属。
OUTs稀释曲线能够验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，并间接反映样品中物种的丰富程度。图3所示的OUTs稀释曲线反映了在持续抽样下系统新物种出现的速率。结果表明，在97%的相似度水平上，当好氧池、厌氧池的样品序列数分别在0~1 500和0~1 000时，曲线表现为急剧上升的趋势，表明群落中有大量物种被发现；而当样品序列数分别大于4 500和3 625后，曲线趋于平缓，表明此环境中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多，基本达到饱和。该曲线说明该测序结果能够反映2生化池微生物群落的多样性。
Alpha多样性(Alpha diversity)反映的是单个样品的物种丰度及物种多样性，一般有多种衡量指标，如Chao、ACE、Shannon和Simpson。Chao和ACE指数用于衡量物种丰度即物种数量的多少；Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度(community evenness)的影响。在相同物种丰度的情况下，群落中各物种均匀度越大，群落多样性越高；Shannon和Simpson指数值越大，样品的物种多样性越高。厌氧池、好氧池所取污泥微生物样品的Alpha多样性分析结果如表2所示。
由表2可知，好氧池的OTUs、Chao指数和ACE指数明显高于厌氧池，说明好氧池的细菌群落更加丰富。同时，好氧池的Shannon指数和Simpson指数也略高于厌氧池，表明好氧池比厌氧池具有更高的群落多样性。测序实验还统计了样品覆盖率(coverage指数)，以鉴定测试结果是否代表样品微生物的真实情况。该指数越高，则样本中物种被测出的概率越高。2个反应池的样品覆盖率均大于0.99，说明测序结果能够反映样品微生物的真实情况。
2)好氧池、厌氧池在门水平上的细菌群落分布如图4所示。从门水平上的差异可看出，好氧池的优势菌群为变形菌门(Proteobacteria，65.8%)、绿弯菌门(Chloroflexi，6.26%)、拟杆菌门(Bacteroidota，4.95%)、浮霉菌门(Planctomycetota，4.67%)以及酸杆菌门(Acidobacteriota，3.76%)。这些检测结果与WANG等[23]对中国14个污水处理系统细菌多样性的焦磷酸测序分析结果基本一致。在好氧池还检测到了硝化螺旋菌门(Nitrospirota)，相对丰度占1.76%，表明好氧池具有良好的硝化作用。此外，脱硫杆菌门(Desulfobacterota)和Armatimonadota门分别占1.61%和1.57%。ANTUNES等[24]的研究表明，Armatimonadota门与废水中耗氧有机物(以COD计)、TOC、TDS和SS浓度呈显著的正相关。因此，系统中的高有机浓度有助于Armatimonadota门的生长。此外，在其他研究[3]中常发现占优势的厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)，在本研究中的数量却较少，存在这一差异的原因有待进一步探究。
相比之下，厌氧池丰度最高的优势菌门是污水处理系统中常见的拟杆菌门(Bacteroidetes)，占总群落的39.29%，其次是变形菌门(Proteobacteria，29.05%)和绿弯菌门(Chloroflexi，16.31%)。拟杆菌门在厌氧池中占主导地位，说明厌氧池中发生了良好的水解和酸化作用。另外，Patescibacteria门在厌氧池中占9.61%，厚壁菌门(Firmicutes)占1.98%。除Patescibacteria外，以上几种优势菌门与AHRING[25]所报道的厌氧系统中常见菌门一致。在以往的研究中，关于厌氧系统中Patescibacteria的研究报道还比较少。Patescibacteria门是新定义的超级门，其普遍存在于含水层环境中，如营养物质较少、DO浓度较低的地下水中[26]。由于这一门具有超小的细胞体积，使其具有较高的表容比，能最大限度地利用营养物质[27-28]。由此可推测，该门在本系统厌氧池中的分布与贫营养水体环境的选择作用存在一定的关联。
3)从2生化池细菌群落在纲水平上的分布来看(图5)，好氧池的优势菌纲主要包括γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，40.25%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria，24.71%)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae，6.26%)、拟杆菌纲(Bacteroidia，4.95%)、浮霉菌纲(Planctomycetes，2.68%)以及Vicinamibacteria菌纲(2.53%)。此外，还发现了硝化螺旋菌纲(Nitrospiria，1.76%)以及不常见的Fimbriimonadia菌纲(1.55%)和Blastocatellia菌纲(1.19%)。与通常的研究结果不同[4]，好氧池的优势菌纲中出现了厌氧绳菌纲(Anaerolineae)，该菌纲是发酵分解糖类的厌氧细菌纲[29]。其能够在好氧池中富集的原因可能是Anaerolineae纲的一些菌种是半共营养型微生物[30]，可与氢营养型产甲烷菌等细菌协同降解糖类[31]。另外，隶属于酸杆菌门(Acidobacteriota，3.76%)的Vicinamibacteria菌纲和Blastocatellia菌纲相对丰度之和为3.72%，表明二者是酸杆菌门的主要贡献者。Vicinamibacteria为好氧有机异养菌，能耐受广泛的pH范围，对不同的糖类、复杂的蛋白质化合物具有良好的代谢效果[32]；而Blastocatellia菌纲的细菌偏好缺乏营养的生长条件[33]，能够在干旱和营养限制的条件下生存[34]。Fimbriimonadia是一类严格需氧的非运动性杆状细菌，这类细菌大多生长在低营养介质中，绝大部分有机底物都不能作为碳源而被其利用[35]。
厌氧池的优势菌纲则主要为拟杆菌纲(Bacteroidia)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)以及厌氧绳菌纲(Anaerolineae)，相对丰度分别为38.72%、28.21%和16.25%。其次，Microgenomatia菌纲占比为6.41%、梭状芽孢杆菌纲(Clostridia)为1.90%，最后是WS6_Dojkabacteria菌纲和Saccharimonadia菌纲，相对丰度分别为1.53%和1.37%。大多数厌氧绳菌纲(Anaerolineae)的物种都能进行发酵代谢，有助于在厌氧条件下糖类和蛋白质的降解，是厌氧系统中一个重要的发酵种群[15]。与AHRING[25]的研究结果不同，本系统的厌氧池中出现了2种不常见的菌群，即Microgenomatia和Saccharimonadia。Microgenomatia和Saccharimonadia均属于Patescibacteria门，他们不仅能够在厌氧条件下进行广泛的有机底物代谢，而且能够在营养物质匮乏的贫营养水体中生长[36]。Microgenomatia菌纲能水解发酵纤维素，Saccharimonadia菌纲中的一些菌属被发现有助于降解烃类物质[37-38]。
4)图6所示的百分比柱状堆积图反映了好氧池和厌氧池的微生物群落分别在属水平上的分布情况。微生物群落作为生物反应器的主体，决定了生物反应器的性能，而在一个污水生物处理过程中，微生物群落的形成又受当地气候条件、工艺类型和被处理废水的性质等因素的影响。本研究中，高有机物浓度、低氮磷的贫营养条件无疑是一个最重要的影响因素，此条件极有可能为系统中微生物的生长施加选择压。实际结果也表明，本系统的好氧池微生物菌属与常规的好氧活性污泥系统菌属有很大差别。在一般的生活污水处理厂中，活性污泥优势菌属主要为动胶菌属(Zoogloea)、不动杆菌属(Acinetobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和黄杆菌属(Flavobacterium)以及硝化螺旋菌属(Nitrospira)等[39]；而在本研究中，好氧池的优势菌属包括Amaricoccus(8.03%)、Methylibium(6.50%)、Reyranella(3.1%)、Plasticicumulans(3.06%)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium，2.91%)、Vicinamibacter(2.46%)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas，2.31%)、甲基暖菌属(Methylocaldum，2.17%)、Ideonella(1.97%)和Sphingopyxis(1.78%)。其中，丰度最高的属Amaricoccus是一种贫营养(氮、磷营养不足)增殖的好氧细菌，属于变形菌门(Proteobacteria)，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)，革兰氏阴性，能以多糖为底物降解多糖[40]。在氮、磷等营养元素受限制的情况下，他们能大量地储存胞内PHB，并合成胞外荚膜物质[41]，因此，能在N、P受限制的条件下增殖[42]。Plasticicumulans属是专性好氧异养菌，能够利用多种有机化合物作为碳源和能源，如醋酸盐、乙醇和乳酸盐等[43]。该属能在超过85%的细胞干重中积累92%的PHB，并利用氨、硝酸盐和复合有机氮作为氮源[44]。通常认为，PHB是微生物在营养不均衡的条件下，如碳源过剩、而其他如氮、磷、硫等营养限制，积累在体内作为其营养和能量储存物质，并参与细胞代谢的天然产物[45]。Plasticicumulans积累PHB的性质使其得以在该系统的贫营养环境中生长。以上这些菌属在好氧池中占主导地位，表明在好氧池中出现了适应贫营养条件的优势菌属，这些菌属能够有效地降解含有大量生物难降解有机物并缺乏氮磷营养物质的中药废水，达到良好的去除效果，以此来保证系统稳定运行。
厌氧池的优势菌属主要集中在地杆菌属(Geobacter，26.62%)、帕卢迪杆菌属(Paludibacter，20.98%)、uncultured_bacterium_f_Bacteroidetes_vadinHA17(14%)、未培养的厌氧菌属(uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae，10.82%)等4种。此外，还发现了uncultured_bacterium_o_Candidatus_Shapirobacteria(6.41%)、uncultured_bacterium_f_Prolixibacteraceae(2.51%)和纤绳菌属(Leptolinea，2.49%)。最后是uncultured_bacterium_o_Saccharimonadales和互营单胞菌属(Syntrophomonas)，相对丰度分别占1.37%和1.31%。
地杆菌属(Geobacter)在厌氧池丰度最高，占26.62%。地杆菌属(Geobacter)为变形菌门、δ-变形菌纲；革兰氏阴性、杆状、严格厌氧[46]。这类菌群显著的代谢特征是能将有机物的氧化与Fe(Ⅲ)的还原结合起来，在厌氧条件下以乙酸盐、芳香烃、有机氯化物等多种有机污染物作为电子供体和碳源，还原可溶性或不溶性的Fe(Ⅲ)[47-48]。地杆菌属(Geobacter)对生长环境的适应能力比较强，因而在被石油污染的含水层、被垃圾渗滤液污染的地下水、生活污水和各种废水等环境中均能发现其存在[49]。据以往的研究，地杆菌属(Geobacter)在参与厌氧消化方面有很大的潜力，可以广泛地利用有机物作为底物，如挥发性脂肪酸(VFAs)、醇、酚和苯等[50]。不仅如此，地杆菌属(Geobacter)还可以与其他物种(如产甲烷菌等)建立直接电子连接，即直接种间电子转移，例如，金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)可与甲烷丝菌属(Methanosaeta)或甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)等产甲烷菌共培养[51-52]。地杆菌属(Geobacter)在本废水处理系统厌氧池占主导地位，说明厌氧池发生了良好的水解酸化作用，同时也有利于厌氧消化中的产甲烷过程。同时，其它的优势菌属，如帕卢迪杆菌属(Paludibacter)是β-拟杆菌纲(Betabacteroidetes)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)下的一种严格厌氧菌，该菌能发酵多种单糖和二糖产生乙酸、丙酸和少量丁酸，是一种产酸菌[53-54]。
纤绳菌属(Leptolinea)在厌氧条件下能将多糖等有机物降解转化为有机酸和脂肪酸[55]，有利于糖类等有机物的水解酸化。值得注意的是，纤绳菌属(Leptolinea)属于营养匮乏的绿弯菌亚门I(Chloroflexi subphylum I)中的厌氧菌纲，需要与其他微生物结合才能有效生长[30]。uncultured_bacterium_o_Saccharimonadales(1.37%)系超级门Patescibacteria门，具有非常小的基因组和细胞大小，通常与其他微生物共存、依赖共代谢生长[56]；一些该细菌被证明能够吸收油酸并具有脂肪酶和其他外酶活性[57]；可在发酵途径中将丙酮酸转化为乳酸。互营单胞菌属(Syntrophomonas)是厌氧发酵中常见的微生物，可以降解丁酸，是厌氧活性污泥的功能菌属之一[58]。Syntrophomonas可与氢化产甲烷菌共同消耗长链和短链脂肪酸，是厌氧消化中重要的共营养细菌，具有产生氢或甲酸作为甲烷菌电子载体的功能[59]。Syntrophomonas属在厌氧反应池中的富集，可能也有助于提高COD去除率和产甲烷量。
由上述分析可知，贫营养进水条件下，厌氧池中出现了适应该环境条件并能降解各种复杂有机物的优势菌属Gobacter和Paludibacter，Gobacter主要参与厌氧过程的水解发酵，Paludibacter参与产酸过程。其次，氮磷营养元素的限制为起水解酸化作用的贫营养菌属Leptolinea的生长提供了有利条件。以Leptolinea和Syntrophomonas为代表的优势菌属与其他功能菌属的共代谢生长有利于厌氧消化过程的顺利进行。其中，Syntrophomonas与产甲烷菌的共营养生长不仅促进了产氢产乙酸过程，还有利于厌氧产甲烷。总之，以上这些优势菌属在厌氧池的稳定生长及分工合作是厌氧池能够长期稳定运行的有力保障。
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1)该贫营养系统运行状况表明，系统能在TN、TP分别低至约10 mg·L−1和1 mg·L−1的条件下长期稳定运行，且系统处理效果良好。
2)中药废水的特殊性质(高COD、低N、P营养)对微生物群落的生长施加了选择压，即大量有机物的存在为具有高有机物降解能力的异养菌提供了微生物选择。其中，厌氧池中表现为Geobacter(26.62%)，好氧池中表现为Amaricoccus(8.03%)。
3)贫营养环境和工艺运行条件促进了贫营养需求菌的优势增长，如厌氧池中的纤绳菌属(Leptolinea)、好氧池中的Amaricoccus属和Plasticicumulans属，这些优势菌本身具有很强的有机物降解能力，并在处理统系统中各个阶段分工合作，使系统能够长期稳定运行，达到良好的处理效果。
4)一些优势菌与其他菌种的共营养生存，使系统在污染物降解的各个阶段能够有序地进行，保障了该系统在长期处理过程中的稳定运行。其中厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、地杆菌属(Geobacter)、纤绳菌属(Leptolinea)及互营单胞菌属(Syntrophomonas)是典型的代表。
贫营养中药废水处理系统稳定性析因
Cause analysis of the stability of a Chinese medicine wastewater treatment system with deficient nutrition
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摘要: 云南某制药厂生产废水有机物浓度高、氮磷含量低(贫营养)，但废水处理系统长期运行稳定，且处理效果好，COD和BOD的去除率均能达到90%以上。为揭示该贫营养污水处理系统长期高效稳定运行原因，分别从工艺运行和微生物学角度对该系统进行了全面分析。结果表明，该系统厌氧和好氧段氮磷含量低，TN、TP的质量浓度分别为9.68 mg·L−1、1.17 mg·L−1和6.18 mg·L−1、0.25 mg·L−1；该系统好氧池和厌氧池中均发现了以降解有机物为主的优势菌属，好氧池比厌氧池具有更高的微生物丰富度和多样性。好氧池中主要菌属为Amaricoccus、Methylibium、Reyranella和Plasticicumulans4种。其中，丰度最高的Amaricoccus占比为8.03%，该菌属能在氮、磷营养受限的环境中增殖。厌氧池中的优势菌属为Geobacter、Paludibacter、Leptolinea和Syntrophomonas。其中，占比2.49%的Leptolinea为贫营养菌属。贫营养环境条件对微生物群落的生长施加了选择压，促进了贫营养菌的优势增长。这些优势菌在废水处理系统降解污染物的各个阶段分工合作，保障了该系统的稳定运行和良好的处理效果。Abstract: The wastewater discharged from a pharmaceutical factory in Yunnan Province is characterized by high organic concentration and extremely low nitrogen and phosphorus content (deficient nutrition). However, the wastewater treatment system has stably run for the long-term with over 90% of COD and BOD removal. In order to elucidate the mechanisms behind, a comprehensive investigation of the system was conducted from both the operational and microbiological aspects. The results showed that the contents of nitrogen and phosphorus in the anaerobic and aerobic phases were very low, and the corresponding TN and TP concentrations were 9.68 mg·L−1, 1.17 mg·L−1 and 6.18 mg·L−1,0.25 mg·L−1, respectively. The microbial colonies in the aerobic phase presented a higher richness and diversity than those in the anaerobic phase, and the dominant genera in both phases were highly efficient organics-degrading ones. In aerobic phases, the dominant bacteria were Amaricoccus, Methylibium, Reyranella and Plasticicumulans, of which Amaricoccus was the most abundant genus with 8.03% of richness, and could grow in nitrogen and phosphorus deficient environment. In anaerobic phases, the dominant bacteria were Geobacter, Paludibacter, Leptolinea and Syntrophomonas, of which Leptolinea was a type of nutrient-deficiency tolerant species with 2.49% of richness. The nutrient-deficient wastewater environment exerted selective pressure for the microbial colonies, and promoted the dominance of low nutrient demanding bacteria. These dominant bacteria cooperated at each stages of the system to degrade pollutants, which guaranteed high removal efficiency and long-term stability of the system.
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好氧颗粒污泥(aerobic granular sludge, AGS)是微生物细胞在一定选择压下自凝聚形成的一种规则而紧密的颗粒状污泥[1]。与普通活性污泥相比，AGS具有结构紧密、沉降性优良、微生物量高、同步脱氮除磷、耐有机负荷等优点[2-3]，AGS形成机制日益成为污水处理领域的研究热点。污泥中的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是微生物在一定环境条件下分泌的高分子物质，其主要成分是蛋白质(protein, PN)和多糖(polysaccharides, PS)，还有少量的腐殖酸、脂质、核酸以及富里酸类物质[4]。EPS作为细胞菌胶团的重要组分，其含量变化可改变微生物细胞表面特性，影响细胞间的相互凝聚能力[5]，促进AGS形成和维持其颗粒状立体结构[6]，对好氧污泥颗粒化具有重要作用。
目前，有关AGS的EPS成分的研究结果具有较大差异。OLIVERIRA等[7]认为，在好氧污泥颗粒化过程中PN是EPS的主要成分，而LIN等[8]则发现EPS中PS含量最高。TAY等[9]认为，EPS中的PS可提高微生物细胞间的凝聚力，具有强化AGS结构稳定性的功能。WANG等[10]和ADAV等[11]也证明 PS作为AGS的核心并构成内部骨架以支撑整个颗粒状立体结构。但Liu等[12]和MCSWAIN等[13]声明PN是AGS的核心，CHEN等[14]亦发现PN是维持AGS结构稳定的关键物质。因此，在EPS对好氧污泥颗粒化的影响研究方面仍存在分歧。
本研究考察了污泥EPS中PN含量和污泥表面特性的相关性，采用三维荧光光谱(three-dimensional fluorescence spectrum, 3D-EEM)和傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)等技术对接种污泥和AGS EPS组分和官能团进行了比较，明确接种污泥和好氧颗粒污泥中EPS组成成分的差异，同时使用激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)确定AGS EPS的分布情况，进一步了解EPS中PN对好氧污泥颗粒化的影响，以期为AGS形成机理研究及其技术发展提供参考。
1. 材料与方法
1.1 接种污泥和实验用水
实验所用的接种污泥取自广州市猎德污水处理厂四期二沉池的回流污泥，接种污泥的理化特性为：接种污泥为絮状，污泥浓度为7 588 mg·L−1，污泥沉降比为84%，污泥容积指数为110.7 mL·g−1，污泥沉降速度为12.36 m·h−1。接种前淘洗掉污泥中的杂质，并对其进行曝气24 h。接种污泥的体积为3.7 L，约占序批式反应器(sequencing batch reactor, SBR)有效容积的1/2。
实验用水采用人工配制的模拟废水，以C6H12O6和CH3COONa为混合碳源，NH4Cl为氮源，KH2PO4为磷源，用NaHCO3调节进水pH至7.5左右，并向进水中添加1 mL·L−1的微量元素溶液。人工配置的模拟废水水质组成如表1所示。
表 1 模拟废水质组成Table 1. Water quality of simulated wastewater成分 质量浓度/(mg·L−1) 成分 质量浓度/(mg·L−1) C6H12O6 500~1 200 FeCl3·6H2O 500 CH3COONa 300~600 CuCl2·2H2O 30 NH4Cl 40~90 MnCl2·4H2O 120 KH2PO4 8~18 ZnCl2·6H2O 120 [CH2N(CH2COOH)2]2 100 H3BO3 150 MgSO4·7H2O 30 KI 30 FeSO4·7H2O 30 Na2MoO4·2H2O 60 EDTA 20 CoCl2·6H2O 150 表1右列成分为微量元素溶液组成。 | Show Table
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1.2 实验装置及其运行方式
1)实验装置。在SBR中培养AGS，反应器主体为有机玻璃制成的圆柱体，其内径为9.8 cm，总高度为100 cm，有效高度为98 cm，有效高径比为10，反应器有效容积为 7.39 L。装置如图1所示。
2)运行方式。在好氧污泥颗粒化过程中，SBR运行过程包括进水、曝气、沉淀、排水和闲置5个阶段，运行周期为6 h，包括进水4 min，曝气338~351 min，沉淀2~15 min，排水1 min，闲置2 min。反应器液体表面上升气速为0.86~4.64 cm·s−1，进水有机物浓度(以COD计)为800~1 800 mg·L−1，容积交换率为50%，通过水浴加热使SBR温度维持在25 ℃。采用调控COD、表面上升气速和污泥沉降时间以培养AGS。SBR运行的具体参数见表2。
表 2 SBR运行参数Table 2. Operating parameters of SBR运行时间/d 进水/min 曝气/min 沉淀/min 排水/min 闲置/min 表面上升气速/(cm·s−1) COD/(mg·L−1) 1~13 4 338 15 1 2 0.86 800 14~28 4 341 12 1 2 1.25 1 000 29~43 4 343 10 1 2 1.86 1 200 44~57 4 345 8 1 2 2.65 1 600 58~75 4 348 5 1 2 3.87 1 600 76~110 4 351 2 1 2 4.64 1 800 | Show TableDownLoad:
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1.3 分析方法
1)常规指标分析。采用热提取法[15]提取EPS，EPS含量由PN和PS总含量表示；PS含量采用苯酚-硫酸法[16]测定；PN含量采用BCA(bicinchoninic acid)分光光度法[17]测定，其中EPS、PN和PS含量均以MLSS计；污泥Zeta 电位采用Zeta 电位分析仪(Zetasizer Nano ZS, Malvern)测定。
以RH表征污泥表面相对疏水性。RH的具体测定过程如下：取泥水混合液10 mL，用 pH为7的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液清洗2次；置于冰水浴中，用超声波细胞破碎仪(JY92-IIN, SCIENTZ)在 48 W 条件下超声 2 min；将超声后的悬浮液与10 mL正十六烷在分液漏斗中混合、摇匀 5min；静置 30 min后测定相关污泥浓度，污泥浓度采用国家标准方法[18]进行测定。RH根据式(1) [19]进行计算。
RH=(1−Q1Q0)×100% (1) 式中：Q0为原污泥浓度，mg·L−1；Q1为分液后水相中的污泥浓度，mg·L−1。
2) 3D-EEM分析。采用荧光光谱仪(FluoroMax-4, HORIBA Jobin Yvon)对EPS进行分析。激发波长(excitation wavelength，Ex)和发射波长(emission wavelength, Em)分别为220~400 nm和290~500 nm，增量均为 5 nm，激发和发射狭缝宽度为3.6 nm，扫描速度为1 200 nm·min−1，响应时间为0.1 s。采用origin 8.0软件进行数据处理。
3) FTIR分析。采用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet IS50, Thermofisher)对EPS溶液进行官能团测定。操作过程如下：将提取的EPS溶液置于−80 ℃的冷冻干燥机(Virtis 4K, VIRTIS)内冷冻干燥至无水；将干燥后的EPS和溴化钾以质量比为1∶100的比例研磨并混合均匀，混合粉末压片成型后用红外光谱仪以分辨率为4 cm−1，扫描次数为32次，在4 000~500 cm−1内进行扫描，用origin 8.0软件进行数据处理。
4)荧光染色和CLSM分析。用荧光染料对AGS进行染色，以观察AGS样品中PN、PS、活细胞和死细胞的分布，选用的荧光染料如表2[20-21]所示。染色后的AGS样品使用激光共聚焦显微镜(LSM 800 with Airyscan, Carl Zeiss)进行观察。
2. 结果和讨论
2.1 AGS形成过程
污泥在SBR不同运行阶段的外观变化如图2所示。接种污泥为灰褐色、絮状，结构松散。当SBR运行到第30 天时出现少量细小的污泥颗粒，但絮状污泥占主体；在第50天，初期AGS形成，粒径较小。随着SBR持续运行，沉降性能较差的颗粒状污泥进一步被筛选出反应器，第70 天时AGS呈淡黄色，表面有一层绒毛，颗粒粒径主要集中在1.0~1.5 mm。第110 天时AGS培养成功，其外观为橙黄色，表面光滑，整体呈球状或椭球状的立体结构，颗粒粒径集中分布在1.43~2.26 mm。
2.2 EPS、PN和PS含量以及PN/PS变化
好氧污泥颗粒化过程中EPS、PN和PS含量以及PN/PS变化情况如图3所示，接种污泥的EPS、PN和PS含量分别为29.86、13.98、15.88 mg·g−1，PN/PS为0.88。在SBR运行初期，EPS、PN和PS含量均逐渐增加，PS含量略高于PN含量，这是因为污泥中的微生物在选择压的刺激下需分泌大量PS来维持正常的生命活动[22]。随后因选择压加强，干扰了微生物细胞间的信息交流和信号分子传递，打破了污泥中微生物生理活动的平衡，导致微生物新陈代谢活动受到抑制，因此，EPS、PN和PS含量从第45 天起均呈下降趋势，PN/PS出现明显波动。从第65 天起，可能是因为SBR中有大量细小颗粒污泥，微生物量较大且活性较高；另一方面，因为SBR长期运行，污泥中的部分微生物细胞自溶，所以EPS中的PN和PS含量增加。但微生物的代谢活动可消耗EPS中的PS，而PS含量的增加可能与其消耗近似处于平衡状态，所以PN/PS值随着PN含量的增加而增大[23]。第110 天时AGS培养成功，AGS的EPS、PN和PS的含量分别为68.60、41.86和26.74 mg·g−1，PN/PS为1.57，约是SBR启动时的2倍。在整个好氧污泥颗粒化过程中，EPS和PN含量及PN/PS变化整体均呈增大趋势，而PS维持在15.88~26.74 mg·g−1，说明AGS EPS成分以PN占主导，这与CHEN等[20]研究结果相同。
图 3 EPS、PN和PS含量以及PN/PS随时间的变化Figure 3. Changes of EPS, PN, PS contents and PN/PS with time2.3 PN含量和污泥Zeta电位的相关性
污泥Zeta电位变化及PN含量与Zeta电位之间的关系如图4所示。由图4(a)可知，接种污泥的Zeta电位为−27.64 mV，在SBR运行前30 d内，因接种污泥要适应新的环境，其生长状态不稳定，所以污泥Zeta电位有一定波动。随后污泥Zeta电位开始下降，在第100天，污泥Zeta电位下降到−18.27 mV。在第110天时AGS培养成功，其Zeta电位为−18.31 mV。如图4(b)所示，PN含量和污泥Zeta电位呈负相关，相关系数(r)为0.950。由于PN可与水中的金属离子发生离子键作用，压缩双电层，降低污泥Zeta电位[24]。此外，PN中带有正电荷的氨基类物质能够中和部分羟基和磷酸根基团中的负电荷，进一步降低污泥Zeta电位[25]。因此，污泥Zeta电位的降低可促进微生物间的相互凝聚，最终形成AGS。在本次实验过程中，PN含量基本处于增加趋势，而污泥Zeta电位趋于下降趋势，这说明EPS中PN含量增加，污泥Zeta电位降低。
图 4 污泥Zeta电位变化及PN含量与Zeta电位的关系Figure 4. Change of Zeta potential of sludge and the relationship between PN content and Zeta potential2.4 PN含量和RH的相关性
RH变化及PN含量与RH之间的关系如图5所示。在好氧污泥颗粒化过程中，RH整体呈增加趋势。接种污泥的RH为27.27%，在SBR运行初期，RH基本呈缓慢增加趋势，在第70天RH达到60.01%。随后因为初期AGS大量形成，反应器中絮状污泥被颗粒状污泥代替，所以RH开始显著增加，在第100天时RH为77.58%。随着AGS逐渐成熟稳定，第110 天时AGS的RH为76.80%，约是接种污泥的2.8倍(图5(a))。LIU等[26]发现RH和SBR运行期间的选择压密切相关，因此，其在好氧污泥颗粒化过程中具有重要作用。同样，DIGANCE等[27]的研究表明, 污泥EPS中的PN是污泥的主要疏水成分。在本实验中发现PN含量变化与RH变化存在密切关系，如图5(b)所示。PN含量和RH呈正相关关系，r为0.934。此外，张丽丽等[28]发现AGS的PN含量与RH密切相关，污泥RH随PN含量的增加而增大。结合第2.4节的结果可知，在好氧污泥颗粒化过程中，PN含量增加，污泥Zeta电位降低且RH升高，有利于微生物细胞间的相互聚集，促进AGS形成。
图 5 RH变化及PN含量与RH的关系Figure 5. Change of RH and the relationship between PN content and RH2.5 EPS的3D-EEM图谱分析
采用3D-EEM技术对接种污泥和AGS的EPS组分进行比较。接种污泥和AGS的EPS的3D-EEM如图6所示。接种污泥和AGS的EPS的3D-EEM中均出现荧光峰A(Ex: 270~285 nm，Em: 295~320 nm)、荧光峰B(Ex: 270~295 nm，Em: 325~390 nm)和荧光峰 C(Ex: 310~380 nm，Em: 400~470 nm)，其中荧光峰A和荧光峰B分别代表酪氨酸和色氨酸类蛋白质，均属于溶解性微生物代谢产物，酪氨酸类蛋白质是AGS形成的重要成分，可促进絮状污泥颗粒化[29-30]；而色氨酸类蛋白质为疏水性物质，其与EPS中芳环氨基酸结构共同作用，可提高AGS结构稳定性[31]。AGS的EPS的荧光峰A和荧光峰B的荧光强度明显高于接种污泥，这表明在好氧污泥颗粒化过程中，污泥EPS中酪氨酸和色氨酸类蛋白质含量有所增加。AGS的EPS的3D-EEM出现2个新荧光峰：即代表芳香族蛋白类物质的荧光峰D(Ex: 220~230 nm，Em: 290~310 nm)和代表富里酸类物质的荧光峰E(Ex: 220~240 nm，Em: 400~470 nm)，而芳香族蛋白类物质的存在有利于AGS的形成[28]。
2.6 EPS的FT-IR分析
为了确定接种污泥和AGS的EPS官能团的差异，在4000~500 cm−1内进行了EPS的FT-IR分析，结果如图7所示。1 650~1 600 cm−1吸收峰是由蛋白质二级结构(酰胺Ⅰ)中的C=O拉伸震动引起的β-折叠和α-螺旋，1 550 cm−1吸收峰是由酰胺Ⅱ中的N—H弯曲产生[32-33]。AGS EPS在1 650~1600 cm−1和1 550 cm−1处的吸收峰面积分别为133.87、52.51(见表3)。有研究[34-35]发现，酰胺Ⅰ中的蛋白质二级结构具有促进微生物絮凝，加快推进好氧污泥颗粒化进程的作用，而从接种污泥提取的 EPS中未出现相似的吸收峰。
表 3 荧光染料Table 3. Fluorescent dye荧光染料 Em/nm Ex/nm 标记目标 染色时间/min 异硫氰酸荧光素 488 500~550 PN 60 刀豆蛋白A 543 550~600 PS 30 碘化丙啶 535 615 死细胞 30 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 346 454 活细胞 10 | Show TableDownLoad:
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接种污泥和AGS的EPS分别在1 400 cm−1和1 410 cm−1处出现与C=O对称拉伸有关的吸收峰[36]。接种污泥的EPS中存在与PN(酰胺Ⅲ)有关的C—N拉伸所产生的1 260 cm−1吸收峰，吸收峰面积为36.43(见表3)，而从AGS中提取的EPS中并未出现类似吸收峰。因PS中C—O伸缩震动和C—OH变形震动造成在1 140 cm−1和1 100 cm−1处出现吸收峰，2处吸收峰面积分别为85.89、108.65(见表3)，表明好氧污泥颗粒化过程中PS含量没有明显变化，这与PS含量测定结果(图3)相一致。
表 4 EPS中各类物质吸收峰面积Table 4. Absorption peak area of various substances in EPSEPS来源 PN PS(1 140~1 100 cm−1) 核酸(993~893 cm−1) 酰胺Ⅰ(1 650~1 660 cm−1) 酰胺Ⅱ(1 550 cm−1) 酰胺Ⅲ(1 260 cm−1) 接种污泥 — — 36.43 85.89 3.93 AGS 133.87 52.51 — 108.65 7.10 | Show TableDownLoad:
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2.7 EPS的CLSM分析
为确定AGS EPS分布情况，采用CLSM对AGS EPS分布进行了研究。如图8所示，AGS表面附着PN(绿色区域)和PS(蓝色区域)。EPS分布在AGS外表层，从而将微生物细胞包裹在EPS中。一方面，EPS在AGS表面形成保护层，在一定程度上可用来抵御环境恶化以及有毒物质对微生物细胞的危害；另一方面，在营养物质匮乏时，微生物将EPS作为新的能源物质来维持自身的生命活动。AGS表面的PS为高分子粘性物质，可以作为细胞间的连接基质，与丝状菌嵌合形成交叉的网状骨架结构(图8(b))，为微生物细胞与其他微小颗粒间形成架桥。在外界选择压的改变下，附着在AGS表面的PN改变细胞表面的特性，进一步促进微生物细胞间以及微生物与污泥微粒间的相互凝聚并形成微生物聚集体，最终形成好氧颗粒污泥。由图8(b)和图8(d)图发现，绿色区域面积大于蓝色区域面积，表明AGS EPS中PN含量高于PS含量，与图3测定结果相符合。
3. 结论
1)在好氧污泥颗粒化过程中，EPS中PN含量增加明显，由接种污泥的13.98 mg·g−1增加到AGS的41.86 mg·g−1，PS含量维持在15.88~26.74 mg·g−1，PN/PS整体呈增大趋势，由0.88增加到1.57，表明AGS EPS成分以PN为主导。
2) PN含量和污泥Zeta电位、RH分别呈负相关和正相关，r分别为0.950、0.934。PN含量增加，污泥Zeta电位降低，污泥RH升高，有利于微生物细胞间的相互聚集，促进好氧污泥颗粒化。
3) EPS中代表酪氨酸和色氨酸类蛋白质的荧光强度增强，AGS EPS中出现芳香族蛋白和富里酸类物质以及含有N—H官能团的蛋白质，为好氧污泥颗粒化奠定物质基础。
4)EPS分布在AGS表层并包裹微生物细胞。
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图 2 废水处理各阶段出水污染物平均浓度变化
Figure 2. Average concentrations of the pollutants in effluent at different stages of the wastewater treatment system
图 4 好氧池、厌氧池门水平细菌群落结构及分布
Figure 4. Bacterial community structure and distribution in aerobic tank and anaerobic tank at the phylum level
图 5 好氧池、厌氧池纲水平细菌群落结构及分布
Figure 5. Bacterial community structure and distribution in aerobic tank and anaerobic tank at the class level
图 6 好氧池、厌氧池属水平细菌群落结构及分布
Figure 6. Bacterial community structure and distribution in aerobic tank and anaerobic tank at the genus level
表 1 中药废水处理系统出水指标监测结果
Table 1. Status of the effluent from the Chinese medicine wastewater treatment system
检测单元 pH 其他水质参数浓度/(mg·L−1) 溶解氧 SS COD BOD5 氨氮 TN TP 阴离子表面活性剂 调节池 9.05 1.01 47.00 1296.67 931.33 4.05 8.05 0.38 0.95 二沉池出水 7.46 3.67 13.00 81.33 12.67 0.47 2.33 0.12 0.03 去除率/% — — 72 94 99 88 71 68 97
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表 2 好氧池、厌氧池的微生物群落丰富度和多样性指数
Table 2. Richness and diversity indexes of microbial community in the aerobic tank and anaerobic tank
检测单元 OTUs Chao ACE Shannon Simpson 覆盖率/% 好氧池 253 259.2432 262.2059 6.4124 0.9751 99.53 厌氧池 78 78.3333 78.5846 3.9206 0.8622 99.96
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