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MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A

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蔡文婷, 许嘉鑫, 杜克斯, 程建华. MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A[J]. 环境工程学报, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
引用本文: 蔡文婷, 许嘉鑫, 杜克斯, 程建华. MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A[J]. 环境工程学报, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
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CAI Wenting, XU Jiaxin, DU Kesi, CHENG Jianhua. Degradation of bisphenol A using horseradish peroxidase immobilized on MIL-88B(Fe)[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
Citation: CAI Wenting, XU Jiaxin, DU Kesi, CHENG Jianhua. Degradation of bisphenol A using horseradish peroxidase immobilized on MIL-88B(Fe)[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
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MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A

  • 1.

    华南理工大学环境与能源学院，广州 510006

  • 2.

    华南理工大学华南协同创新研究院，东莞 523808

    • 作者简介: 蔡文婷(1996—)，女，硕士研究生。研究方向：水污染控制。E-mail：673062212@qq.com
    通讯作者: 程建华(1976—)，男，博士，教授。研究方向：水污染控制。E-mail：jhcheng@scut.edu.cn
  • 基金项目:
    国家自然科学基金资助项目(21976060)；东莞市引进创新团队项目(2020607263005)

  • 中图分类号: X703.1

Degradation of bisphenol A using horseradish peroxidase immobilized on MIL-88B(Fe)

  • 1.

    College of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China

  • 2.

    South China Institute of Collaborative Innovation, South China University of Technology, Dongguan 523808, China

    • Corresponding author: CHENG Jianhua, jhcheng@scut.edu.cn

摘要

  • 摘要: 通过溶剂热合成法制备了水稳定性的铁基金属有机骨架材料MIL-88B(Fe)，并将辣根过氧化酶(HRP)以共价固定法负载在MIL-88B(Fe)上得到MIL-88B(Fe)/HRP复合材料，并用于降解双酚A (BPA)。通过XRD、FTIR、SEM和TGA等手段对材料进行了表征。结果表明，HRP成功固定在MIL-88B(Fe)表面，没有改变MIL-88B(Fe)的形貌和晶体结构；在添加亲水剂聚乙二醇后，MIL-88B(Fe)/HRP可高效去除BPA，1 h内BPA去除率可达99.2%。分别考察了PEG用量、BPA初始质量浓度、固定化酶投加量等对降解效率的影响。结果表明，在PEG/BPA质量比0.4、pH = 7、25 ℃、BPA初始质量浓度20 mg·L−1、固定化酶投加量为0.06 g·L−1的条件下，3 h内可去除98.4%的BPA。此外，MIL-88B(Fe)/HRP复合材料具有较好的稳定性和可重复使用性，固定化HRP的贮存稳定性、热稳定性均优于游离HRP，循环使用4次后，固定化HRP的残余活性仍高于80%。以上研究结果可为新型酶固定材料的开发及其在废水处理中的应用提供参考。
    Abstract: In this study, a water-stable Fe-based metal-organic framework material of MIL-88B (Fe) was prepared through a solvothermal method, then horseradish peroxidase was immobilized on MIL-88B (Fe) using covalent fixation method to prepare MIL-88B (Fe)/HRP composite for the degradation of bisphenol A (BPA). The material was characterized via XRD, FTIR, SEM and TGA methods. The results showed that HRP was successfully immobilized on MIL-88B(Fe) without changing its morphology and crystal structure. The BPA degradation experiments showed that MIL-88B(Fe)/HRP could effectively remove BPA by adding the hydrophilic agent polyethylene glycol, and the removal rate of BPA was up to 99.2% within 1 h. The effects of PEG dosage, initial BPA concentration and immobilized enzyme dosage on the BPA degradation efficiency were investigated. The results showed that at PEG/BPA mass ratio of 0.4, pH=7, 25 ℃, initial BPA concentration of 20 mg·L−1, immobilized enzyme dosage of 0.06 g·L−1, 98.4% BPA could be removed within 3 h. At the same time, MIL-88B(Fe)/HRP had good stability and reusability. The storage stability and thermal stability of immobilized HRP were better than that of free HRP. After 4 cycles, the residual activity of immobilized HRP was still more than 80%. This study provides a reference for the development of new enzyme fixation materials and their application in wastewater treatment.

  • 挥发性有机化合物(VOCs)作为PM2.5和臭氧的重要前驱体，已经对大气环境质量和人体健康造成直接和间接的危害[1-2]，VOCs废气治理成为了近年来的环境热点话题之一。在VOCs废气的众多处理技术中，催化燃烧技术因处理效率高、能耗低、二次污染小而在工业上应用广泛[3]。为达到VOCs催化燃烧所需温度，工业上多采用电加热使VOCs废气达到起燃温度。由于电加热是采用热传导的加热方式，因而对大气量的VOCs废气加热时能耗巨大。另外，VOCs催化燃烧时，持续的高温环境会使催化剂活性组分烧结而影响VOCs降解效果[4]。微波加热应用于VOCs催化燃烧是一种新技术，它利用电磁波的选择性仅对催化剂进行加热，因而能耗低且催化剂受热均匀、快速[5]。而且，微波对催化剂活性组分的热点效应有利于引发VOCs的催化燃烧，同时微波的偶极极化作用还可降低VOCs的反应阈能而促进其氧化降解[6]。卜龙利等[7]、姚泽等[8]利用吸波型催化剂证实了微波催化燃烧VOCs效果优于电加热催化燃烧。

    微波催化燃烧技术的关键是高效而稳定的催化剂。过渡金属氧化物催化剂种类丰富、经济性好、不易中毒，但其对于某些难降解有机物的催化活性差、低温活性以及热稳定性有待提高[9]。贵金属催化剂具有催化活性高、高温下稳定性好和适用范围广的优点，但也存在资源稀少和价格高昂的问题[10]。目前，市面上较为常见的是铜锰铈三元金属氧化物催化剂。胡旭睿[11]研究证实，铜锰铈氧化物催化剂对芳香烃类、醇类、酮类等有机物具有良好的氧化性能，但其矿化效果不佳且对芳香烃的降解效果低于醇、酮类。贵金属Pt、Pd等在低温时对芳烃类和3个碳以上的直链烷烃活化能力强[12]。已有研究证实，将贵金属与过渡金属复合可以增强催化剂活性。SHI等[13]通过还原法和离子交换法合成了Pt /Ce-USY催化剂，其对1,2-二氯乙烷的催化活性高于Pt/USY催化剂，Pt与CeO2之间的相互作用抑制了碳物质的沉积，从而增强了催化剂的耐久性。LEE等[14]将贵金属金、钯沉积在CeO2表面，证实适量Au的加入使得Pd/CeO2催化剂活性增强。CHEN等[15]合成了Pd/Fe3O4催化剂用于去除CO，当沉积适量Fe3O4时，CO氧化的起燃温度明显降低。因此，本研究在铜锰铈三元催化剂基础上复合微量贵金属Pt，以期提高催化剂对芳烃类VOCs的活化能力，进而提高总VOCs的去除效果。

    本研究选取油墨印刷VOCs废气中含量最多的2种物质甲苯和乙酸乙酯作为目标污染物，以蜂窝状堇青石为载体制备Pt复合铜锰铈(CMC)负载型催化剂(Pt-CMC/堇青石)，重点考察Pt复合前后催化剂对模拟VOCs废气催化燃烧效果的差异，以探究低含量贵金属添加对铜锰铈氧化物催化剂催化活性的影响程度。

    1.   材料与方法

    1.1   实验原料与仪器

    蜂窝状正方体堇青石(7目，边长150 mm)；硝酸铜、硝酸锰(50 wt%)、硝酸铈、氯铂酸，分析纯；硅溶胶，分析纯。超声波清洗器(KQ3200，昆山市超声仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(101-3AB，天津泰斯特仪器有限公司)； 箱式电阻炉(SX-4-10，天津泰斯特仪器有限公司)；单模腔微波装置(ZDM-2，南京汇研微波系统工程有限公司)；气相色谱仪(GC/FID，6890 N，美国安捷伦科技公司)；泵吸式VOC检测仪(XS-2000-VOC，希思智能科技)；扫描电子显微镜(JSM-6510LV型，日本电子)；比表面积及孔径分析仪(V-sorb2800P型，北京金埃谱公司)；X射线衍射仪(X’Pert型，荷兰帕纳科)。

    1.2   催化剂制备与表征

    本研究采用等体积浸渍法进行负载型催化剂的制备，即载体吸水率测试基础上配置适量体积的浸渍液、然后浸渍液被载体完全吸收的一种催化剂制备方法。首先，将正方体堇青石切割成圆柱型载体(D×L=27×150 mm)，称重并测其吸水率，根据吸水率确定助剂硅溶胶的用量；其次，按3∶3∶1的质量负载比例分别称取铜(2.5%(质量分数))、锰、铈的金属盐，称取一定量的硅溶胶以及少量氯铂酸(Pt的质量分数0.01%)，加入去离子水超声震荡30 min配制完全溶解的浸渍液；最后，将堇青石载体置于浸渍液中将浸渍液完全吸收，样品静置风干后放入烘箱中80 ℃过夜烘干，电阻炉内500 ℃煅烧4 h，自然冷却后即可制得Pt-CMC/堇青石催化剂。不加入氯铂酸、仅加入氯铂酸和其余步骤均相同情况下，可分别制得CMC/堇青石、Pt /堇青石催化剂。

    利用扫描电子显微镜观察催化剂表面形貌及活性组分分布状况，借助BET测试仪分析催化剂的比表面积及孔径孔体积，使用X射线衍射仪测试活性组分的晶体结构及晶粒大小。

    1.3   实验装置与方法

    实验装置如图1所示，整个装置分为配气、催化燃烧和尾气净化3部分。在配气系统中，空气依次通过变色硅胶柱和活性炭柱去除水分和有机物，其流量通过气体流量计控制；实验时采用微量注射泵将液态甲苯和乙酸乙酯(按一定比例混合)以恒定速度连续均匀地注入三口烧瓶中，三口烧瓶被电加热套加热而将有机物气化，气化的甲苯和乙酸乙酯被空气带出并在混合瓶内混合均匀。实验开始前催化剂置于石英管内，石英管填装催化剂的长度为360 mm，锥形收口的长度是20 mm，上下两端开口外径分别为32 mm和9 mm，壁厚2 mm；石英管固定在单模腔微波装置上形成固定床反应器，实验开始后微波通过单模腔持续辐照在固定床上，催化剂吸波升温达到VOCs催化燃烧温度；石英管下端连接混合瓶，通入的VOCs气体在固定床上发生催化燃烧反应，床中插入的热电偶探针与温度显示仪连接以实时监测床层温度变化，石英管上下分别设进、出气采样口。催化燃烧后的VOCs尾气分别通过缓冲瓶和装有乙醇和碱液的尾气吸收瓶，净化后的废气经通风橱排空。

    图 1  微波催化燃烧VOCs实验装置示意图
    Figure 1.  Schematic diagram of the experimental device for microwave catalytic combustion of VOCs
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    本研究利用CMC/堇青石、Pt-CMC/堇青石和Pt /堇青石催化剂在处理气量0.12 m3·h−1、气时空速(gas hourly space velocity，GHSV)1 500 h−1条件下，考察了不同微波功率(30、40、50、60、70 W)和不同VOCs浓度(1 000、1 500、2 000 mg·m−3)下甲苯和乙酸乙酯的催化燃烧效率，分析微波催化燃烧甲苯反应动力学及Pt复合影响，比较3种催化剂的催化活性及Pt复合对总VOCs去除效率的提升作用，探究Pt-CMC/堇青石催化剂对甲苯、乙酸乙酯和总VOCs催化活性的稳定性。

    1.4   分析方法

    本研究主要利用气相色谱仪对甲苯和乙酸乙酯的进气和出气质量浓度进行定量分析，气相色谱检测条件为[16]：柱箱初始温度100 ℃，以20 ℃·min−1的速率升温至180 ℃，保持3 min，加热器温度为190 ℃，检测器温度300 ℃；设定分流比为50∶1；尾气吹脱用氮气，流量30 mL·min−1。

    使用手持泵吸式VOC检测仪对反应器进气和出气的总VOCs浓度进行检测，从而分析反应过程中总VOCs的催化燃烧效率。文中数据为2次平行实验的平均值，以此消除实验偶然性误差的影响。

    2.   结果与讨论

    2.1   催化剂表征

    1) BET。根据表1数据可知，与堇青石载体相比，CMC/堇青石与Pt-CMC/堇青石2种催化剂的比表面积有不同程度的增加，这表明催化剂的吸附能力也相应增强。与堇青石载体相比，CMC/堇青石催化剂总孔容相对减小，平均孔径有所增大。推测其原因是，活性组分负载后，载体表面的部分孔隙被活性组分填充和覆盖，载体结构的原有孔道被拓宽。Pt-CMC/堇青石催化剂活性晶粒间相互积聚生成了包括微孔和介孔在内的新孔道，催化剂的比表面积及孔体积都明显增大，这有利于污染物分子在催化剂表面的吸附与活化。因此，Pt的复合在一定程度上增强了催化剂的吸附活化性能。

    表 1  堇青石载体和2种催化剂的比表面积、孔体积及孔径数据表
    Table 1.  Data table of specific surface area, pore volume and pore diameter of Cordierite and two catalysts
    供试样品比表面积/(m2·g−1)微孔面积/(m2·g−1)孔体积/(cm3·g−1)总孔容/(cm3·g−1)平均孔径/nm
    堇青石0.11NDND0.3036.79
    CMC/堇青石0.66NDND0.0941.23
    Pt-CMC/堇青石2.951.110.000 470.3836.85
    　　备注：ND为未检出。
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    2) XRD。如图2所示，2 θ在10°~40°之间存在着较为密集的堇青石特征衍射峰。对比XRD谱图可以发现，活性组分的负载和制备时的高温煅烧不会改变堇青石自身的晶体结构；与堇青石载体相比，CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石催化剂的特征衍射峰强度减弱，活性晶粒的平均尺寸有不同程度的减小。活性组分负载后堇青石特征峰峰强减弱的原因可能是活性组分一定程度上覆盖和屏蔽了堇青石表面的特征峰[17]；贵金属Pt复合后，金属氧化物等活性组分晶体特征峰的峰高有微弱增大，这可能是不同尖晶石活性组分共存所致。6个处于17.5°、21.9°、28.7°、34.1°、36.7°、38.3°位置较为明显的特征峰，均归属于铜锰铈及其金属氧化物，这说明在贵金属Pt复合前后，铜锰铈金属氧化物都是微波催化燃烧VOCs的主要活性组分。在堇青石载体、CMC/堇青石催化剂和Pt-CMC/堇青石催化剂上，3种催化剂的晶粒平均尺寸分别为50.7、13.9和14.5 nm。Pt复合后，催化剂晶粒尺寸变化较小，而比表面积却从0.66 m2·g−1增大到2.95 m2·g−1，由此可以说明贵金属Pt的复合使活性颗粒的分散性增大[18]。

    图 2  堇青石载体及CMC/堇青石、Pt-CMC/堇青石催化剂的XRD谱图
    Figure 2.  XRD spectra of Cordierite support and CMC/Cordierite and Pt-CMC/Cordierite catalysts
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    结合特征峰组分分析可知，少量贵金属Pt的添加改变了催化剂上铜和锰的晶相。贵金属Pt复合前，锰以+4价的MnO2和中间价态的Mn3O4形式存在；贵金属Pt复合后，部分金属锰的价态升高，以Mn5O8形式存在，且Cu2O的晶体在掺杂后未检测到，检测出以+4价存在的PtO2。有文献报道，Cu、Mn金属离子价态升高，可以增强催化剂的活性[19]。

    3) SEM。图3给出堇青石载体和CMC/堇青石、Pt-CMC/堇青石催化剂的表面形貌。可以看出，堇青石载体呈明显的层状结构，表面孔隙较多且分布均匀，有利于活性组分的负载。CMC/堇青石催化剂表面存在着较多微米尺寸的活性颗粒，不均匀地分布在载体表面；部分活性组分经高温煅烧后团聚成大块与堇青石结构连结在一起，填充载体原有孔隙的同时也产生了新的孔隙。Pt-CMC/堇青石催化剂表面的活性颗粒在载体表面上分布更均匀、分散度更高。对比Pt复合前后催化剂的微观形貌，可以看出，Pt的复合改变了活性颗粒的分散性，活性物质的再分散可能导致催化剂的吸附性改变。

    图 3  堇青石载体、CMC/堇青石与Pt-CMC/堇青石催化剂的微观表面形貌
    Figure 3.  Microscopic surface morphology of Cordierite, CMC/Cordierite and Pt-CMC/Cordierite catalyst
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    2.2   催化剂性能实验

    1)吸波升温曲线。图4为堇青石载体、CMC/堇青石、Pt-CMC/堇青石和Pt/堇青石在200 W微波功率辐照下的吸波升温曲线。由图4可见，堇青石载体温度几乎不变，这表明其吸波性能很差；而Pt/堇青石催化剂在15 min内温度也仅升高了3 ℃，其原因是贵金属具有高热稳定性，且吸波性能差。CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石催化剂升温效果明显好于前2种，微波辐照15 min时分别升温至300和355 ℃，说明铜锰铈及其金属氧化物具有良好的吸波性能，是2种催化剂吸波升温的主要原因；Pt复合催化剂升温速率更快，这可能是Pt的复合提高了催化剂上活性晶粒的分散性，降低了金属对微波的反射，以及颗粒尺寸变大增强了微波辐照时的局部热点效应，从而使得催化剂的吸波升温性能提高[20-21]。催化剂的快速升温有助于微波热点效应和高温活性区的出现，从而有助于甲苯和乙酸乙酯的快速氧化与彻底降解。

    图 4  堇青石载体及3种催化剂的吸波升温曲线
    Figure 4.  Wave absorption heating curve of Cordierite and three catalysts
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    2)催化剂活性。在甲苯和乙酸乙酯的进气浓度分别为1 000和500 mg·m−3，进气量为0.12 m3·h−1，微波功率分别选取30、40、50、60、70 W的条件下，开展CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石催化剂对甲苯和乙酸乙酯双组分VOCs废气的催化燃烧性能试验，结果如图5所示。图5中纵坐标C/C0为反应实时浓度与进气浓度比值(图6同)，可直观表示降解效率并使数据间具有可比性。

    图 5  不同微波功率下CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石催化燃烧甲苯和乙酸乙酯效率曲线
    Figure 5.  CMC/Cordierite and Pt-CMC/Cordierite catalytic combustion efficiency curves of toluene and ethyl acetate under different microwave power
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    图 6  不同催化剂对甲苯和乙酸乙酯的催化活性比较
    Figure 6.  Comparison of catalytic activity of three catalysts to toluene and ethyl acetate
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    由图5可见，微波功率30 w时，2种催化剂对甲苯和乙酸乙酯的降解呈不稳定态势，其原因是床层温度偏低(CMC/堇青石床层温度低于66 ℃)，催化剂对污染物的去除以吸附-脱附为主。随着微波功率增大，甲苯和乙酸乙酯的降解效率也随之升高，但2种催化剂对甲苯和乙酸乙酯降解效率的差异却由大变小：40 W时，催化剂对甲苯和乙酸乙酯降解效率的差异最大；70 W时，这种差异最小，此时固定床温度高，污染物在催化剂表面完全燃烧，温度的作用掩盖了Pt的复合作用。

    同一微波功率下，降解甲苯与乙酸乙酯时， Pt-CMC/堇青石催化剂表现出更高的VOCs催化活性。40 W微波功率下，Pt-CMC/堇青石对甲苯和乙酸乙酯的降解效率分别为82%和93%，而CMC/堇青石降解甲苯和乙酸乙酯的效率分别为66%和82%。推测其原因是，Pt-CMC/堇青石的比表面积相比CMC/堇青石大幅增加，从而有利于甲苯与乙酸乙酯的吸附与活化；同时，活性组分更好的分散性使得Pt-CMC/堇青石升温更快，而高温则有利于VOCs的催化燃烧。如果要使CMC/堇青石催化剂对甲苯和乙酸乙酯的降解效率与Pt-CMC/堇青石相同，则须提高微波功率至47 W。由此可见，Pt的复合提高了催化剂的低温催化活性，有效降低了VOCs的催化燃烧成本。

    贺丽娜等[16]证明了甲苯的微波催化燃烧为假一级反应。因此，依据一级反应动力学方程ln(C0/C)=kt，对CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石3种催化剂在微波功率分别为50、60、70 W时降解双组分VOCs废气中甲苯的反应动力学进行线性拟合，相应方程与参数如表2所示。结果表明，CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石微波催化燃烧甲苯的反应符合假一级反应动力学，同时R2值随微波功率的增加而增大，此时一级动力学拟合程度越高，证明高温下的催化燃烧反应为一级反应。反应速度常数k值对比发现，微波功率越大，k值越大，催化反应速度越快；微波功率60 W时，Pt-CMC/堇青石降解甲苯的k值为0.129，明显高于CMC/堇青石的0.111 9。可见，Pt的复合增强了甲苯的吸附活化作用而加快了反应速率，进而提高CMC活性组分对甲苯的微波催化燃烧效率。

    表 2  微波催化燃烧甲苯反应动力学
    Table 2.  Reaction kinetics of microwave catalytic combustion of toluene
    功率条件催化剂ln(C0/C)=ktkR2
    50 WPt-CMC/堇青石y=0.0594x−0.02040.05940.9828
    60 WCMC/堇青石y=0.1119x−0.13980.11190.9553
    60 WPt-CMC/堇青石y=0.129x−0.07970.1290.9887
    70 WCMC/堇青石y=0.1045x−0.04280.10450.995
    70 WCMC/堇青石y=0.1299x+0.0310.12990.9983
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    3)催化剂比较。图6为微波功率40 W、进气量0.12 m3·h−1，甲苯和乙酸乙酯浓度各为1 000 mg·m−3条件下，CMC/堇青石、Pt-CMC/堇青石和Pt/堇青石催化剂降解单组分甲苯、乙酸乙酯及二者混合的效率曲线。无论是单、双组分甲苯和乙酸乙酯的催化燃烧降解，均是Pt-CMC/堇青石的活性最高，CMC/堇青石次之，而Pt/堇青石则未表现出催化活性。对于Pt/堇青石而言，其在微波辐照下几乎不升温，从而无法为VOCs的催化燃烧提供所需的温度条件，因此甲苯和乙酸乙酯几乎不降解。无论是甲苯或乙酸乙酯的单组分降解，还是双组分废气降解，乙酸乙酯的降解效率均高于甲苯。以Pt-CMC/堇青石为例，单组分甲苯和乙酸乙酯的降解效率分别为84%和95%(此时床层温度相近)。乙酸乙酯比甲苯更易于降解的原因可能为：一是乙酸乙酯等含氧有机物比甲苯更易被催化剂吸附活化；二是乙酸乙酯上的C-O键比甲苯的C-H键键能低而更易断裂[22-23]。

    比较分析图6中甲苯和乙酸乙酯的降解效率发现：对于单组分甲苯和乙酸乙酯的降解，Pt-CMC/堇青石较CMC/堇青石有约7%和6%的提升；对于甲苯与乙酸乙酯的双组分降解，Pt-CMC/堇青石较CMC/堇青石有约5%和4%的提升。由此可见，Pt复合对甲苯降解效率的提升大于乙酸乙酯。分析认为，CMC/堇青石对于一些C-H键较弱、吸附性好的含氧有机物如乙酸乙酯、丙酮等具有良好的活化性能，但催化氧化C-H键较强的芳香类物质的能力则稍弱，而贵金属Pt活化C-H键的能力很强，弥补了铜锰铈金属氧化物活化苯环能力的不足[24]。此外，CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石对甲苯和乙酸乙酯双组分废气的降解效率明显高于各自单组分，其原因是双组分VOCs废气的初始浓度更高，催化燃烧时放出更多热量使得床层温度更高，从而有利于VOCs的氧化降解。

    4)总VOCs去除。微波功率40 W时，对催化剂催化燃烧1 000 mg·m−3甲苯的总VOCs去除率进行测试，其结果和床层温度变化如图7所示。由图7(a)可见，Pt/堇青石的总VOCs去除率为负值且波动幅度大，CMC/堇青石和Pt-CMC/堇青石的总VOCs去除率分别为25%和40%，Pt的复合将总VOCs的去除效率提高了15%。如图7(b)所示，Pt/堇青石的不吸波使其床层温度为常温，催化燃烧反应未发生，甲苯在催化剂表面进行吸附-脱附动态平衡过程，因而其总VOCs去除率波动大且多为负值；Pt-CMC/堇青石床层升温速率快于CMC/堇青石，稳定后的床层温度高出CMC/堇青石床层30 ℃，这是总VOCs去除效率提高的主要原因。分析认为，Pt的复合在提升催化剂吸波升温能力的同时，其对甲苯C-H键的活化能力也有助于提高总VOCs的去除效率。随着微波功率的增加，床层温度急剧升高，总VOCs去除率也随之升高，催化剂对总VOCs去除效率的差别也随之减小，Pt复合的影响被床层温度影响掩盖而体现不出。因此，Pt的复合提高了催化剂的低温催化活性，有助于低温下VOCs的催化氧化。

    图 7  不同催化剂的总VOCs去除效率及床层温度曲线
    Figure 7.  The total VOCs removal efficiency and bed temperature curves of the three catalysts
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    5)稳定性实验。根据图5的实验结果可知，微波功率70 W时Pt-CMC/堇青石催化剂对甲苯和乙酸乙酯的催化效果最好，同时总VOCs的去除率也最高。因此，在微波功率70 W、进气量0.12 m3·h−1、双组分气体中甲苯和乙酸乙酯初始浓度各为1 000 mg·m−3和500 mg·m−3条件下对Pt-CMC/堇青石催化剂进行了连续7次(每次实验3 h)的稳定性测试，结果如图8所示。

    图 8  Pt-CMC/堇青石催化燃烧甲苯和乙酸乙酯稳定性测试结果
    Figure 8.  Pt-CMC/Cordierite catalytic combustion toluene and ethyl acetate stability test results
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    如图8(a)、8(b)所示，连续稳定性试验中，甲苯和乙酸乙酯被完全去除，乙酸乙酯的去除效率较甲苯更稳定，催化剂展示出良好的催化活性和稳定性。图8(c)的总VOCs去除率从97.5%略微降至96.5%，表明Pt-CMC/堇青石对双组分VOCs废气具有高的矿化效率与稳定性。微波功率70 W的稳定性实验中，催化剂床层温度320 ℃，高于40 W时的210 ℃，可见，床层温度的升高是提升总VOCs去除率的有效手段之一。连续的高温稳定性实验，会引起催化剂孔隙结构的微变和活性颗粒的团聚，进而引起双组分VOCs(特别是甲苯)去除效率的波动；然而，Pt复合增强了催化剂表面活性颗粒的分散性，增大了催化剂的比表面积与孔容，从而有效提高了催化剂活性，保证了催化剂性能的稳定。

    3.   结论

    1)等体积浸渍法制备的Pt-CMC/堇青石催化剂比CMC/堇青石催化剂具有更大的活性颗粒尺寸，Pt的再分散作用使得催化剂表面活性组分分布更加均匀；Pt的复合提高了催化剂的孔隙率，进而有利于VOCs分子在催化剂表面的吸附与活化；Pt复合后的尖晶石活性组分峰有微弱增大，Cu、Mn价态升高而使催化剂活性增强。

    2)复合Pt后，催化剂的吸波升温能力有一定的增强，这与吸波活性组分分布均匀、散热能力增强有关。反应动力学分析表明，Pt的复合加快了催化燃烧反应速率，高温下甲苯的催化燃烧反应为一级反应；复合Pt后的催化剂其低温催化活性明显提高，Pt-CMC/堇青石催化剂表面总VOCs去除效率比CMC/堇青石提高15%。

    3)对于Pt-CMC/堇青石和CMC/堇青石催化剂而言，乙酸乙酯的降解效率高于甲苯，可认为含氧的乙酸乙酯比甲苯更易被催化剂吸附活化，C-O键比甲苯的C-H键键能低而更易断裂；Pt复合对甲苯降解效率的提高大于乙酸乙酯，其原因是Pt对苯环中C-H键的活化能力强而有助于苯环的氧化与开环。

  • 图 1  MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的SEM图谱

    Figure 1.  SEM images of (a) MIL-88(Fe), (b) MIL-88(Fe)/HRP

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    图 2  MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的XRD图谱

    Figure 2.  XRD patterns of MIL-88B(Fe) and MIL-88B(Fe)/HRP

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    图 3  HRP、MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的FTIR图谱

    Figure 3.  FTIR spectra of HRP, MIL-88B(Fe) and MIL-88B(Fe)/HRP

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    图 4  MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的TGA图谱

    Figure 4.  TGA curves of MIL-88B(Fe) and MIL-88B(Fe)/HRP

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    图 5  不同条件下催化材料对BPA的去除率

    Figure 5.  Removal rate of BPA by catalytic materials under different conditions

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    图 6  PEG投加量对BPA去除率的影响

    Figure 6.  Effect of PEG dosage on the removal rate of BPA

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    图 7  不同降解实验条件对BPA降解效果的影响

    Figure 7.  Effects of different degradation conditions on the degradation of BPA

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    图 8  游离和固定化HRP的米氏方程图和Lineweaver-Burk图

    Figure 8.  Michaelis-Menten plots and Lineweaver-Burk plots of free and immobilized HRP

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    图 9  游离和固定化HRP的稳定性

    Figure 9.  Stability of free and immobilized HRP

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    图 10  固定化HRP可重用性

    Figure 10.  Reusability of immobilized HRP

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    图 11  MIL-88 (Fe)/HRP降解BPA前后的XRD图谱

    Figure 11.  XRD patterns before and after BPA degradation by MIL-88B(Fe)/HRP

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    表 1  不同材料固定化酶对BPA的去除率

    Table 1.  BPA removal rate of enzyme immobilized with different materials

    固定化材料酶催化剂投加量/(g·L−1)BPA初始浓度/(mg·L−1)降解时间/min去除率/%参考文献
    海绵蛋白支架漆酶1.0021 440>95[21]
    MCMSs漆酶2.002072085[22]
    PFMHRP0.14258.718093[23]
    TiO2 修饰的PVDF薄膜漆酶<0.4034.55 76091.7[24]
    NF薄膜HRP1202018095[25]
    APTES改性的TiO2纳米颗粒漆酶50034.5300>80[26]
    磁丝纤蛋白纳米颗粒HRP5005016080.3[27]
    MCNHRP0.5105085.7[28]
    MIL-88(Fe)HRP0.10206099.2本研究
    　　注：NF薄膜、APTES改性的TiO2纳米颗粒、磁丝纤蛋白纳米颗粒3种固定化材料的催化剂投加量单位为U·L−1。
    固定化材料酶催化剂投加量/(g·L−1)BPA初始浓度/(mg·L−1)降解时间/min去除率/%参考文献
    海绵蛋白支架漆酶1.0021 440>95[21]
    MCMSs漆酶2.002072085[22]
    PFMHRP0.14258.718093[23]
    TiO2 修饰的PVDF薄膜漆酶<0.4034.55 76091.7[24]
    NF薄膜HRP1202018095[25]
    APTES改性的TiO2纳米颗粒漆酶50034.5300>80[26]
    磁丝纤蛋白纳米颗粒HRP5005016080.3[27]
    MCNHRP0.5105085.7[28]
    MIL-88(Fe)HRP0.10206099.2本研究
    　　注：NF薄膜、APTES改性的TiO2纳米颗粒、磁丝纤蛋白纳米颗粒3种固定化材料的催化剂投加量单位为U·L−1。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-04
  • 录用日期:  2021-03-31
  • 刊出日期:  2021-07-10
蔡文婷, 许嘉鑫, 杜克斯, 程建华. MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A[J]. 环境工程学报, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
引用本文: 蔡文婷, 许嘉鑫, 杜克斯, 程建华. MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A[J]. 环境工程学报, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
shu
CAI Wenting, XU Jiaxin, DU Kesi, CHENG Jianhua. Degradation of bisphenol A using horseradish peroxidase immobilized on MIL-88B(Fe)[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
Citation: CAI Wenting, XU Jiaxin, DU Kesi, CHENG Jianhua. Degradation of bisphenol A using horseradish peroxidase immobilized on MIL-88B(Fe)[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(7): 2295-2304. doi: 10.12030/j.cjee.202103027
shu

MIL-88B(Fe)固定辣根过氧化物酶去除双酚A

    通讯作者: 程建华(1976—)，男，博士，教授。研究方向：水污染控制。E-mail：jhcheng@scut.edu.cn
    作者简介: 蔡文婷(1996—)，女，硕士研究生。研究方向：水污染控制。E-mail：673062212@qq.com
  • 1. 华南理工大学环境与能源学院，广州 510006
  • 2. 华南理工大学华南协同创新研究院，东莞 523808
  • 收稿日期:  2021-03-04
  • 录用日期:  2021-03-31
  • 网络出版日期:  2021-07-23
基金项目:
国家自然科学基金资助项目(21976060)；东莞市引进创新团队项目(2020607263005)

摘要: 通过溶剂热合成法制备了水稳定性的铁基金属有机骨架材料MIL-88B(Fe)，并将辣根过氧化酶(HRP)以共价固定法负载在MIL-88B(Fe)上得到MIL-88B(Fe)/HRP复合材料，并用于降解双酚A (BPA)。通过XRD、FTIR、SEM和TGA等手段对材料进行了表征。结果表明，HRP成功固定在MIL-88B(Fe)表面，没有改变MIL-88B(Fe)的形貌和晶体结构；在添加亲水剂聚乙二醇后，MIL-88B(Fe)/HRP可高效去除BPA，1 h内BPA去除率可达99.2%。分别考察了PEG用量、BPA初始质量浓度、固定化酶投加量等对降解效率的影响。结果表明，在PEG/BPA质量比0.4、pH = 7、25 ℃、BPA初始质量浓度20 mg·L−1、固定化酶投加量为0.06 g·L−1的条件下，3 h内可去除98.4%的BPA。此外，MIL-88B(Fe)/HRP复合材料具有较好的稳定性和可重复使用性，固定化HRP的贮存稳定性、热稳定性均优于游离HRP，循环使用4次后，固定化HRP的残余活性仍高于80%。以上研究结果可为新型酶固定材料的开发及其在废水处理中的应用提供参考。

English Abstract

    全文HTML

  • 双酚A (bisphenol A, BPA)是合成塑料的原料，可以制成各种常见的塑料品，如水瓶、运动器材、医疗器械等。不合理的使用使其广泛存在于工业废水、地表水、地下水甚至饮用水中[1]。双酚A具有神经毒性、免疫毒性、致癌性和致畸性[2]，也可影响人和动物的内分泌系统，导致雄性动物雌性化和生殖能力下降。因此，去除双酚A对生态环境和人类健康有重要意义。

    目前，双酚A的脱除方法有物理法、化学法、生物法等。其中，酶法处理因其速度快、选择性强而得到了广泛的应用[3]。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)是一种具有铁卟啉活性中心的血红素蛋白，能在过氧化氢的存在下氧化降解双酚A。当底物分子被氧化成自由基后，可以重新排列、偶联形成相应的聚合物以及其他化合物[4]，这些化合物无毒，易于从水中去除。然而，游离的HRP存在着热稳定性和存储稳定性差、成本高、难回收且不能重复利用的缺点。一种有效的解决方法是将酶固定在特定载体上[3]，可显著改善其稳定性，实现其长期使用。

    金属有机骨架(metal organic frameworks, MOFs)是由金属离子和有机配体通过络合作用自组装形成的具有周期性网络结构的晶态多孔材料，既结合了无机材料的稳定性，又结合了有机材料的多样可修饰性。MOFs材料由于具有较大的比表面积、可调节的多孔形态和良好的生物相容性，在生物传感、催化、药物缓释等领域取得了重大突破[5]。已有研究证明金属有机骨架可以用于酶的共价固定化。SHIN等[6]通过二环己基碳二亚胺使胰蛋白酶接枝到MIL-88B-NH2(Cr)上，并用于牛血清蛋白降解。DOHERTY等[7]利用戊二醛将β-葡萄糖苷酶固定在NH2-MIL-53(A1)上用于催化水解D-水杨苷转化成葡萄糖。据报道，MIL-88B(Fe)是一种高稳定性、高生物相容性的铁基MOF[8]。基于此，本研究中，利用MIL-88B(Fe)富含官能团的优势，采用EDC/NHS作为交联剂，将HRP负载于MIL-88B(Fe)上，并考察了固定化酶降解双酚A的影响因素，探究了固定化酶的稳定性和可重复使用性。

1.   材料与方法

    1.1.   实验原料

  • HRP(>160 U·mg−1，冻干粉，RZ>2)，双酚A(BPA)，三氯化铁(FeCl3·6H2O)，对苯二甲酸(H2BDC)，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙醇(C2H5OH)和苯酚购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。4-氨基安替比林(4-AAP)、过氧化氢(H2O2，质量分数为30%)、聚乙二醇(PEG)购自国药化学试剂有限公司(中国上海)。

    • 1.2.   表征

  • 采用X射线衍射仪(XRD，Bruker D8)对MIL-88B(Fe)和MIL-88B(Fe)/HRP材料进行表征。采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，Thermo-Nicole，美国)对材料表面的官能团进行测定。采用扫描电子显微镜(SEM, Carl Zeiss显微镜，德国)观察样品的形貌。采用热重分析仪(TGA，EXSTAR，日本)测定热稳定性。

    • 1.3.   MIL-88B(Fe)的制备

  • MIL-88B(Fe)材料根据文献[9]报道的方法进行制备：将0.756 g (2.770 mmol)三氯化铁和0.231 g (1.385 mmol)对苯二甲酸溶解在60 mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。在室温下搅拌30 min后，将溶液转移到高压反应釜中，置于150 ℃的烘箱中恒温加热反应2 h。反应结束后自然冷却至室温，将所得固体用离心分离并用乙醇洗涤数次，最后在真空干燥箱中60 ℃干燥12 h后，得到MIL-88B(Fe)粉末材料。

    • 1.4.   MIL-88B(Fe)/HRP的制备

  • 将10 mg MIL-88B(Fe)材料、40 mg的EDC和20 mg的NHS加入到10 mL质量浓度为0.04 mg·mL−1的酶溶液中，在室温下搅拌4 h，反应结束后，所得混合物用去离子水清洗以去除未固定的游离酶。收集含残留酶的上清液，采用Bradford法，用紫外分光光度计在波长为595 nm处测定蛋白含量[10]，以计算得出酶的负载量。将MIL-88B(Fe)/HRP分散在去离子水中，并在4 ℃的冰箱中保存。

    • 1.5.   酶活性的测定

  • 以苯酚、4-AAP和H2O2为底物，采用比色法测定酶的活性[11]。通过记录在510 nm处的吸光度变化来监测催化反应。1个活性单位被定义为在上述条件下每分钟水解1×10−6 mol的H2O2所需HRP的量。

    • 1.6.   降解实验

  • 降解实验在锥形瓶(150 mL)中进行。试剂按如下顺序添加：双酚A (10~100 mg·L−1)溶液、2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7, 200 mmol·L−1)、1 mg·mL−1 PEG (0.1~0.8 mL)、H2O2和MIL-88B(Fe)/HRP材料(0.02~0.10 g·L−1)。将混合溶液用磁力搅拌器搅拌，并在预定的时间用注射器取出上清液，用0.22 μm过滤器过滤以备后续测定。所有实验均进行3次，数据取平均值。

    采用分光光度法(λ=510 nm)测定双酚A的质量浓度。在铁氰化钾存在下，双酚A与4-氨基安替比林在pH为10.0±0.2时反应生成橙色染料，吸光度值与双酚A的浓度成正比[3]。

    • 1.7.   回收实验

  • 每次反应结束后，用离心分离法分离出所使用的MIL-88B(Fe)/HRP，并用去离子水清洗，以去除物料内残留的反应溶液。之后，在上述实验条件下，催化剂在新的反应介质中重复使用。每一轮降解在25 ℃进行，并测定保留活性。所有实验均进行3次，取平均值。

2.   结果与讨论

    2.1.   材料表征

  • 1) SEM分析。由图1(a)可以看出，MIL-88(Fe)的形态为纺锤状。EDS能谱分析表明了MIL-88B(Fe)中Fe、C、O元素的存在和均匀分布。通过EDC/NHS将HRP共价固定在MIL-88(Fe)上后，Fe-MOF的形态保持不变(图1(b))。

    2) XRD分析。合成的MIL-88B(Fe)的XRD图谱如图2所示。衍射峰与之前报道MIL-88B(Fe)的相应峰[002]、[101]、[103]、[202]和[211]匹配良好[12]，并且衍射峰强度高，说明MIL-88(Fe)结晶良好。MIL-88B(Fe)/HRP的特征峰与MIL-88B(Fe)基本一致，表明在HRP存在下，MIL-88B(Fe)的结构完整性和结晶形态得以保留，且结合过程中没有导致相变。峰强变弱表明酶成功负载在MIL-88B(Fe)上。

    3) FTIR分析。为了进一步分析MIL-88B(Fe)样品的分子结构和官能团，对其进行了FTIR光谱表征，结果如图3所示。分别在552、1 394和1 548 cm −1处观察到MIL-88B(Fe)的特征吸收峰，这与文献[13]中报道的结果相同。在552 cm −1处的强波段为Fe—O振动峰。在1 548 cm−1和1 394 cm−1处的2个峰是羧基的不对称振动峰和对称振动峰，这证实了MIL-88B(Fe)材料中存在二羧酸配体[14]。在负载HRP后，MIL-88(Fe)出现了新的特征峰，其中1 029.93 cm−1为酰胺键的N—H弯曲振动峰，其在1 174~955 cm−1的蛋白质特征结构区域内[15]，3 700~3 000 cm−1处的特征峰为—OH和—NH基团[16]。可以看出，固定化酶材料同时具有MIL-88B(Fe)和HRP的特征吸收峰，表明MIL-88(Fe)/HRP的成功制备。

    4) TGA分析。热重曲线(图4)表明，MIL-88B(Fe)在<350 ℃条件下具有良好的热稳定性。当温度高于350 ℃时，结构发生坍塌(急剧失重)。与MIL-88B(Fe)相比，MIL-88(Fe)/HRP的TGA曲线有2个明显的失重步骤。第1次质量损失(<100 ℃)是由于吸附水和结合水的蒸发[17]。第2次质量损失(约300 ℃)是由于MOF骨架的坍塌所致，这与MIL-88B(Fe)的变化趋势一致。当温度达到450 ℃时，固定化酶保留了29.9%的初始质量，比MIL-88B(Fe)的25.3%稍微高一点，这是由于固定化酶在热解过程中残留了一些有机物所导致的[18]。

    • 2.2.   不同反应条件对BPA降解效果的影响

  • 1)反应时间及PEG的影响。在pH为7.0的条件下，对双酚A (20 mg·L−1)进行了降解实验，以评价合成材料的催化性质。如图5所示，MIL-88(Fe)的吸附性能较差，在3 h内对双酚A的去除率仅为22.6%。在添加了过氧化氢之后，没有观察到明显的催化效果。在相同条件下，以MIL-88(Fe)/HRP为催化剂，1 h内可去除50.5%的BPA。较低的BPA降解率可能是因为催化过程中自由基和聚合产物附着在酶上，导致酶被灭活，从而使反应终止[19]。为了防止这种情况发生，一些研究者建议在反应体系中加入如聚乙二醇(PEG)等高亲水性物质。PEG可以在HRP活性中心附近形成保护层，防止反应过程中形成的游离苯氧基破坏过氧化物酶；同时，PEG对降解产物的亲和力比酶强，可以防止降解产物与酶结合[20]。在PEG的作用下，MIL-88(Fe)/HRP材料可以实现高效快速降解BPA，反应1 h后，BPA的去除率高达99.2%。与之前的相关研究相比，MIL-88(Fe)/HRP表现出优异的催化性能(表1)。

    在催化剂投加量为0.06 g·L−1、BPA初始质量浓度为20 mg·L−1时，可以看出，在初始60 min内双酚A降解速度较快，随着时间的推移，降解速度有所减慢，在3 h基本达到降解平衡，此时双酚A的降解率为98.4%。因此，确定最佳降解反应时间为3 h。如图6所示，当PEG/BPA的质量比为0.1时，双酚A的降解率为72.7%。随着PEG用量的增加，双酚A的降解率显著提高。这是由于酶失活数量的减少，降解反应得以继续。当PEG/BPA的质量比为0.4时，双酚A降解率达到98.4%，且随着PEG的进一步添加，降解率保持不变。因此，确定最佳PEG/BPA的质量比为0.4。

    2)反应温度的影响。由图7(a)可以看出，在较低温度(15~35 ℃)下，各温度下的降解率差异较小；随着反应温度提高，酶开始失活。因此，选择常温25 ℃进行后续实验。

    3)双酚A初始质量浓度的影响。如图7(b)所示，当双酚A质量浓度为10 mg·L−1时，MIL-88B(Fe)/HRP的降解效率最高；随着双酚A质量浓度由10 mg·L−1增加到100 mg·L−1，其去除率有所下降。其原因是，过多的双酚A分子聚集，导致无法接触HRP上的活性位点[29]。此外，随着双酚A质量浓度的增加，酶催化的反应速率趋于平衡，双酚A的去除率开始降低。值得注意的是，即使双酚A质量浓度为100 mg·L−1时, 仍有93.1%的BPA在4 h内被去除，这显示了MIL-88B(Fe)/HRP优秀的降解性能及其在废水处理中潜在的应用前景。

    4)催化剂用量的影响。如图7(c)所示，当催化剂用量由0.02 g·L−1增加到0.10 g·L−1时，双酚A的降解率迅速提高，这是因为降解双酚A的催化活性位点有所增加。当催化剂用量为0.10 g·L−1时，1 h内可去除99.2%的BPA，但酶用量过高势必会导致成本增加。为了降低成本，控制反应速率以及方便测量，选择0.06 g·L−1作为双酚A降解的最佳催化剂剂量。

    • 2.3.   酶促反应动力学

  • 利用米氏方程和Lineweaver-Burk图计算游离酶和固定化酶的动力学参数(米氏常数Km和最大反应速率vmax)。采用Bradford法测定得出材料固定化酶的最大负载量为38.9 mg·g−1，在保证酶的质量相同的情况下测定游离酶和固定化酶的参数。如图8(a)所示，随着底物浓度的增加，酶促反应速率先增加后趋于平稳。与游离酶相比，由于传质受限，固定化酶的反应速率较低[30]。米氏常数Km值是指酶与底物之间的亲和力，其值的大小只与酶的性质有关系，Km值越小，底物与酶的亲和力越高。如图8(b)所示，游离酶的Km为0.34 mmol·L−1，固定化酶的Km值增加到了0.47 mmol·L−1，vmax由19.23 mmol·(L·min)−1下降到14.28 mmol·(L·min)−1。这是由于共价固定改变了酶蛋白的构象，阻碍了底物与HRP活性位点的接触，使亲和力降低，最大反应速率降低。经实验测定，固定化酶可以保留游离酶活性的70.6%。

    • 2.4.   热稳定性和贮存稳定性

  • 在工业应用中，酶的高温变性也是一个迫切需要解决的问题。固定和游离HRP的热稳定性实验，是通过在25~60 ℃内孵育1 h后，测量其残余活性来进行。由图9(a)可以看出，经过60 ℃热处理后，游离HRP的残余活性下降到55.9%，而固定化后的HRP仍保持初值的70.2%。在不同温度下，MIL-88B(Fe)/HRP的活性均高于游离酶。上述结果表明，固定化酶比游离酶具有更好的耐热性，这是由于固定化限制了酶的构象变化所致。据报道，MIL-88B(Fe)的保护作用可以抑制酶分子的展开和非特异性聚集，从而防止HRP的热变性[31]。

    合成样品的贮存稳定性是评价固定化效率的重要指标。对MIL-88B(Fe)/HRP和游离HRP均通过在4 ℃去离子水中存储30 d后的残余活性进行评估(图9(b))。与所预期一样，MIL-88B(Fe)/HRP的活性下降速度明显慢于游离酶。固定化后的HRP在储藏15 d后仍保留了高达90%的初始活性，而游离的HRP的活性则降低到初始活性的64%。30 d后，游离HRP只剩下26.2%的初始活性，而合成材料的活性达到70%以上。游离HRP活性的丧失可能是由于在贮存过程中蛋白构象发生变化，活性位点不能与底物反应[32]。相反，MIL-88B(Fe)/HRP由于与酶形成强共价键，对构象变化表现出很强的抗性[33]。因此，固定化酶比游离HRP更稳定，保质期更长。上述结果表明，MIL-88B(Fe)/HRP具有良好的耐久性，在工业应用中具有较大的潜力。

    • 2.5.   固定化HRP的可重复使用性

  • 酶固定化的主要目的之一是实现酶的重复利用。为此，研究了MIL-88B(Fe)/HRP在连续使用数次后的残留活性。如图10所示，固定化的HRP经过4次循环，残余活性仍超过80%，且第4次降解后MIL-88B(Fe)/HRP的XRD谱图仍保留了原材料的特征峰(图11)。这表明催化剂经循环使用后其结构没有发生变化，具有较高的稳定性。其原因与HRP和MIL-88B(Fe)通过EDC/NHS形成的强共价键有关，共价键的形成可增强催化剂的结构稳定性，防止酶的脱落，从而保持较高的催化活性[34]。但催化剂的相对活性随着重复使用次数的增加而降低，对于活性降低的可能原因有3点：一是由于样品量微小，部分MIL-88B(Fe)/HRP在回收过程中丢失，材料回收率仅为91.3%；二是反应过程中产物在催化剂表面的积累会阻碍HRP的活性位点，对下一个反应周期产生不利影响[35]；三是HRP在与底物反应过程中蛋白发生部分折叠或变性，导致酶失活[36]。从整体上看，固定化酶具有分离简单、稳定性好、可回收等优点，从而可大大降低酶体系的实际应用成本。

3.   结论

  • 1)通过EDC/NHS共价交联体系将HRP固定化到MIL-88B(Fe)上，可得到MIL-88B(Fe)/HRP复合材料；通过一系列XRD、FTIR、SEM、TGA等手段的表征，证明了MIL-88B(Fe)的成功合成，及HRP的成功负载。

    2)在PEG/BPA质量比为0.4的情况下，最终确定在pH为7、25 ℃、BPA的初始质量浓度为20 mg·L−1，固定化酶投加量为0.06 g·L−1的实验条件下，3 h内可去除98.4%的BPA。

    3)在酶固定化后，酶与底物的亲和力降低。酶的活性保留了游离HRP的70.6%。

    4)在固定化酶之后，MIL-88B (Fe)/HRP比游离HRP具有更好的热稳定性、贮存稳定性和可重复使用性，这可为工业应用提供潜在的可能性。

参考文献 (36)

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