包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤

唐万鹏, 王立立, 王东升, 阮翔, 李取生. 包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤[J]. 环境工程学报, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196
引用本文: 唐万鹏, 王立立, 王东升, 阮翔, 李取生. 包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤[J]. 环境工程学报, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196
TANG Wanpeng, WANG Lili, WANG Dongsheng, RUAN Xiang, LI Qusheng. Enhanced remediation of cadmium contaminated farmland soil by Solanum nigrum L . with coated rhizosphere growth-promoting agent[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196
Citation: TANG Wanpeng, WANG Lili, WANG Dongsheng, RUAN Xiang, LI Qusheng. Enhanced remediation of cadmium contaminated farmland soil by Solanum nigrum L . with coated rhizosphere growth-promoting agent[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196

包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤

    作者简介: 唐万鹏(1995—),男,硕士研究生,tangwp@stu2018.jnu.edu.cn
    通讯作者: 王立立(1973—),女,博士,副教授,towanglili@163.com
  • 基金项目:
    国家重点研发计划项目(2017YFD0801300)
  • 中图分类号: X53

Enhanced remediation of cadmium contaminated farmland soil by Solanum nigrum L . with coated rhizosphere growth-promoting agent

    Corresponding author: WANG Lili, towanglili@163.com
  • 摘要: 制备了一种具有镉活化功能的包裹型根际促生菌剂,用于强化镉超累积植物龙葵对镉污染农田土壤的植物修复作用。结果表明:包裹型菌剂Z16的多腔室结构适合菌株的生存,菌剂Z16的释菌浓度在24 h孵育后达到106 CFU·g−1;与菌液组EC相比,菌剂Z16组的龙葵地上部鲜重提高了19.81%,地上部和根部镉的富集系数分别提高了20.98%和168.97%,根际土壤碳酸盐结合态镉的浓度得到活化,龙葵对钙、锰和铁元素的吸收能力也得到增强。因此,与施用菌液EC相比,包裹型根际促生菌剂Z16通过在根际土壤持续释放菌株,可提高难溶性镉的活化效果及提高植物修复效率。本研究可为强化超累积植物-根际促生菌联用技术对镉污染农田的植物修复效率提供参考。
  • 钴白合金是铜钴矿深加工过程中的副产物,由于钴的存在,使得该合金具有良好的硬度及耐热性[1]。钴白合金的成分基本为钴、铜、铁,其他元素的含量极低[2]。我国可利用的钴矿石资源较少,大部分钴矿石依赖进口[3]。世界上最主要的钴资源是刚果(金)和赞比亚的铜钴矿,一般含钴品位为0.1%~0.5%,高品味的可达到2%~3%。但是,其副产物钴白合金中钴的含量可达10%左右;此外,在钴白合金中,还含有大量的铜、铁等元素,使其具有较高的回收价值[1-5]

    目前,钴白合金的回收处理工艺主要有火法、湿法和微生物浸出等[6]。火法处理的常规工艺为造渣熔炼-浸出工艺[7]。该工艺先通过向钴白合金中掺入碳酸钙等配料,之后再在高温下焙烧,以实现钴、铜与其他杂质金属的分离,最终通过硫酸酸浸得到钴和铜的浸出液。但是,火法处理的能耗较高,操作也相对复杂,而且对有价金属的回收不彻底[8-9]。湿法处理主要有常压氧化酸浸法[10]、加压氧化酸浸法[11]、机械活化-酸浸法[12]、电化学溶解法[13]。相比于火法处理,湿法处理能耗低,但是对于处理设备的要求较高,同时也会产生一定的环境污染。有研究结果表明,使用微生物浸出钴白合金可实现钴、铜的高效回收[14]。胡国宏等[15]使用A.f菌(氧化亚铁硫杆菌)进行钴白合金的浸出,钴和铜的浸出率分别可以达到了99.5%和99.0%,而且浸出率高、成本低。

    本研究通过消解分析钴白合金中各种金属的含量,初步估计其资源化利用的价值;并通过梯度实验探究接触浸出和非接触浸出的最佳固液比,以选出最佳工艺的最佳处理条件;最终,通过接触浸出和非接触浸出实验结果的对比分析,探究这2种方法对钴白合金中钴和铜的浸出机理。

    供试钴白合金来源于河南某有色冶炼厂。盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、高氯酸 (HClO4)、氢氟酸(HF)、硫磺(S)、黄铁矿(FeS2)、硫酸铵((NH4)2SO4)、磷酸二氢钾 (KH2PO4)、无水氯化钙 (CaCl2)、七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)、醋酸(HOAc)、盐酸羟胺(NH2OH·HCl)、双氧水(H2O2)、醋酸铵(NH4OAc)均为分析纯。

    电感耦合等离子发射光谱仪(OPTIMA 8300,珀金埃尔默股份有限公司)用于测定溶液中金属元素的浓度;X射线衍射仪(VG MK II,英国VG公司)用于分析固体样品的晶体结构;扫描电子显微镜SEM(Quanta FEG 250,美国FEI公司)用于观察固体样品的微观形貌;电热恒温鼓风干燥箱(DHP-9032,上海一恒科学仪器有限公司);pH计(DELTA320,梅特勒-托利多仪器有限公司);恒温水浴振荡器(THZ-82,金坛市荣华仪器制造有限公司)用于培养混合菌液。

    将钴白合金置于电热恒温鼓风干燥箱中105 ℃烘干至恒重,粉碎研磨,过100目筛筛分后备用。钴白合金的金属含量测定采用三酸消解法[1, 16],目标金属的赋存形态采用BCR连续萃取法[17-19]

    取若干容积为250 mL的锥形瓶,先分别加入85 mL无机盐培养基[20-23](2.0 g·L−1 (NH4)2SO4、1.0 g·L−1 KH2PO4、0.25 g·L−1 CaCl2、0.5 g·L−1 MgSO4·7H2O)、0.8 g硫磺、0.8 g黄铁矿;之后,接入At、Af、Lf菌液[24-25]各5 mL;透气膜封口后,置于恒温水浴振荡器中,在35 ℃条件下,以135 r·min−1振荡,培养至体系pH下降至0.8,便可用于生物淋滤实验。

    将培养稳定的菌液高速离心后,使菌体和生物酸分离。向pH为0.8的生物酸中直接加入钴白合金样品,并置于恒温水浴振荡器中,在35 ℃、135 r·min−1的条件下反应24 h,此为非接触淋滤实验[26-28]。该浸出过程无细菌参与。设定淋滤的固液比(g∶mL)为1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100,每个梯度做3个平行实验。反应结束后,测定上清液中目标金属浓度。

    按照上述最优淋滤效果对应的固液比,做非接触循环富集实验。浸出完成后,通过抽滤实现固液分离;向上清液中加入之前分离出的菌体,密封;之后,于恒温水浴震荡器中,培养条为35 ℃、135 r·min−1,培养至体系pH下降至0.8;再进行非接触淋滤实验。如此循环淋滤10次,之后测定每次淋滤后上清液中的目标金属浓度。

    向pH已达到0.8的菌液中直接加入钴白合金,置于恒温水浴震荡器中,在35 ℃、135 r·min−1条件下培养,隔天取样测钴、铜的浸出浓度,此为接触淋滤[26-28]。在该过程中,生物酸和细菌同时参与浸出。设定淋滤的固液比(g∶mL)为1∶100、2∶100、3∶100、4∶100。每个梯度做3个平行实验。在反应的第1、3、5、7、9 d取上清液测定目标金属浓度。

    钴白合金样品中的金属种类及含量如表1中所示。其中,钴百合金中含铜量为10.81%、钴为13.66%、铁为20.53%,即有一定的回收价值。但该样品中铁含量过高,在浸出过程中会产生铁钒沉淀,会影响铜、钴的浸出效果。因此,为设计出更加合理的浸出工艺参数,使用BCR连续萃取技术处理钴白合金,以分析其中钴、铜、铁的金属赋存形态[18],所得结果如图1所示。如图1所示,钴白合金中的钴、铜、铁均不存在硫化物及有机结合态。其中,钴的存在形态为酸溶态(46.27%)和氧化物结合态(53.73%);铜的存在形态为酸溶态(7.86%)、氧化物结合态(78.84%)、残渣态(13.3%);铁的存在形态全部为酸溶态。通过BCR实验结果可知,在生物淋滤过程中,样品中的钴通过生物酸中氢离子的作用,基本上可以被完全浸出;铜的浸出除了生物酸的作用外,还需要一定的氧化反应,并可通过菌体的接触实现残渣态铜的浸出。

    表 1  钴白合金中的金属元素种类及含量
    Table 1.  Types and contents of metal elements in cobalt white alloy %
    CuCoFeNiMnZnAs
    10.8113.6020.530.370.370.080.01
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    图 1  钴白合金中铜、钴、铁的赋存形态分析
    Figure 1.  Chemical morphology of Cu, Co and Fe of cobalt white alloy

    钴白合金样品的XRD谱图如图2所示。从图中可以看出,钴白合金在43°和45°有2个非常明显的峰值。通过与标准图谱卡片PDF#50-0795和PDF#85-1326[29]对比可知,钴白合金中所含的晶体成分主要为钴铁的合金态Co7Fe3和单质铜Cu。

    图 2  钴白合金的XRD图谱
    Figure 2.  XRD patterns of cobalt white alloy

    通过SEM能够直接观察钴白合金的形貌特征、颗粒尺寸,由图3可知,钴白合金的形状均为不规则的球体和长方体,粒度较小,分布均匀[30]

    图 3  钴白合金的SEM图
    Figure 3.  SEM micrographs of cobalt white alloy

    采用At、Af、Lf这3种菌株的混合培养体系,在35 ℃下连续培养,菌体数量在培养至11 d时增长至3.42×108 个·mL−1,菌液的pH从2.0降至0.8(图4)。这是因为,At菌将能源底物中的硫磺转化成了硫酸和供自身生长所需的能量[31]。直接向该菌液中加入钴白合金为接触浸出,该过程具有生物酸和菌体的共同作用;将菌液中的菌体通过高速离心去除,留下pH为0.8的生物酸浸出钴白合金为非接触浸出,该过程无菌体作用。

    图 4  细菌生长过程中体系的pH、菌数变化
    Figure 4.  Changes in pH and bacterial count of the system during bacterial growth

    图5中可以看出,随着培养时间的延长,菌液中的Fe3+质量浓度不断升高,Fe2+质量浓度极少。这是因为,Af、Lf氧化分解黄铁矿获取能量生长的过程中,伴随着氧化生成了Fe3+;同时,黄铁矿中分解出的硫被At菌转化成硫酸而进入体系中[32-34]

    图 5  细菌生长过程中体系的Fe3+、Fe2+浓度变化
    Figure 5.  Changes of Fe3+ and Fe2+ concentration in the system during bacterial growth

    经非接触浸出1 d后,测得不同固液比下目标金属铜和钴的浸出率如图6所示。随着固液比的升高,钴和铜的浸出率均逐渐下降。从非接触浸出钴白合金的实验中可以看出,最优固液比为1%,在pH为0.8的生物酸下,钴白合金中的酸溶态和氧化物结合态的钴能够100%浸出,其浸出液质量浓度为1 356.14 mg·L−1;而铜的浸出率为77.42%,浸出液质量浓度为837.19 mg·L−1

    图 6  不同固液比下非接触浸出钴白合金中钴铜的浸出率
    Figure 6.  Target metal leaching rate of non-contact bioleaching of cobalt white alloy at different solid-liquid ratios

    将1%固液比下的浸出渣多次水洗后,分析浸出渣中铜、钴、铁的赋存形态。由图7可以看出,浸出渣中未检测出钴;残留的铜中含有48.84%的氧化物结合态和51.15%的残渣态;铁被浸出后,又生成了铁钒沉淀进入了残渣态。因此,在浸出过程中,可先将样品中的钴优先浸出到溶液中;将铜留存在渣相中,富集后再次浸出,以实现钴白合金浸出过程中的铜、钴分离。

    图 7  固液比1%下钴白合金浸出渣中铜、钴、铁的赋存形态分析
    Figure 7.  Chemical morphology of Cu, Co and Fe of cobalt white alloy leaching slag under 1% solid-to-liquid ratio

    固液比1%下非接触循环第1次到第10次溶液中,铜和钴的质量浓度如图8所示。由图8可知,在循环的过程中,溶液中铜和钴的质量浓度基本呈倍数上升;而且,在实验过程中可以观察到,溶液的颜色有着明显的加深。循环到第10次时,溶液中钴的质量浓度可达12 877.25 mg·L−1,铜的质量浓度可达7 358.67 mg·L−1

    图 8  固液比1%下非接触不同循环次数下钴白合金中钴铜的浸出浓度
    Figure 8.  Concentration of cobalt white alloy target metal leaching with the number of cycles under 1% solid-to-liquid Ratio

    不同固液比下,接触浸出钴白合金中钴和铜的浸出率如图9所示。从不同固液比的接触浸出实验中可以看出,钴白合金中钴的浸出效果要明显优于铜的浸出效果。在接触浸出1 d,随着固液比的升高,铜和钴的浸出率逐渐下降。但浸出7 d,在固液比3%下的接触浸出过程中,钴白合金中的钴和铜依然能够完全浸出。

    图 9  不同固液比下接触浸出钴白合金中钴和铜的浸出率
    Figure 9.  Co and Cu leaching rate of contact bioleaching of cobalt white alloy at different solid-liquid ratios

    在非接触浸出实验中,在固液比1%下,仅生物酸作用,浸出反应1 d,钴100%浸出,铜浸出77.42%。这一结果与接触浸出实验中,在生物酸和细菌的双重作用下,浸出反应1 d的浸出效果基本一直。由于钴白合金的加入,抑制了菌体的生长,菌体数量降至2.41×108个·mL−1。但随着浸出时间的延长,菌体逐渐适应了周围的浸出环境,菌体逐渐生长,在浸出5 d时生长到了3.26×108个·mL−1,基本与接触浸出前的菌数一致(图10(b)),从而代谢出了新的生物酸(图10(a))。从图11接触浸出过程中Fe3+的浓度变化可以看出,随着浸出时间的延长,在固液比1%下,浸出3 d,Fe3+的质量浓度降到最低403.67 mg·L−1,铜达到100%浸出。3 d后,Fe3+的浓度逐渐上升。这是因为,铜的浸出需要Fe3+的参与;同时,在Af和Lf的作用下,将生成的Fe2+氧化生成Fe3+[35]。因此,提高接触浸出的固液比,并在足够的额浸出时间下,当铜的浸出所消耗Fe3+的速度与细菌氧化Fe2+成Fe3+的速度一致时,即浸出完全。

    图 10  接触浸出过程中pH和菌数的变化
    Figure 10.  Changes in pH and bacterial count during contact leaching process
    图 11  接触浸出过程中Fe3+浓度的变化
    Figure 11.  Change of Fe3+ concentration during contact leaching

    通过对比接触浸出和非接触浸出钴白合金的结果,并结合钴白合金中的金属赋存形态以及钴白合金淋滤前后的XRD图谱变化,可以推测出钴白合金中铜和钴的浸出机理。图12为钴白合金淋滤前后的XRD对比图,可见,淋滤前钴白合金XRD衍射图谱中有较为明显的吸收峰;淋滤后钴白合金XRD衍射图谱中几乎没有吸收峰,这表明钴铁合金和单质铜的结构被破坏[14]。此外,经生物淋滤处理后的钴白合金的硬度有着明显的下降,表面也更加疏松,均表明其结构发生了改变。

    图 12  钴白合金淋滤前后的XRD图谱
    Figure 12.  XRD patterns of cobalt white alloy before and after leaching

    在接触浸出1 d后,对不同固液比下的浸出渣中的钴、铜做金属赋存形态(图13)进行了对比分析。由图13(a)可知,随着固液比的升高,钴的浸出率逐渐降低,浸出渣中残余的钴也越来越多。经与原样中钴的对比可以看出,酸溶态的钴被优先浸出到溶液中,而浸出渣中残留的钴均为氧化物结合态。随着浸出时间的延长,体系内的细菌逐渐适应了周围的生存环境,持续代谢出新的生物酸,从而将浸出渣中的钴浸出到溶液中[36]

    图 13  不同固液比下接触浸出第1天残渣中金属赋存形态变化
    Figure 13.  Changes of metal forms in residues on the first day of contact leaching with different solid-to-liquid ratios

    同样,由图13(b)可知,随着固液比的升高,铜的浸出率也在逐渐降低。与原样对比,酸溶态的铜也被率先浸出到溶液中,浸出渣中剩余的铜为氧化物结合态和残渣态,该形态的浸出需要Fe3+的参与,最终生成Cu2+和Fe2+进入溶液中[37]。而随着浸出时间的延长,溶液中的Fe2+被细菌又逐渐氧化成Fe3+,Fe3+继续与固相中的铜发生反应,直至Fe3+的生成速率大于其反应的消耗速率时,整个铜的浸出反应达到完全。

    1)钴白合金中所含有价金属主要为铜、钴和铁,而且含量均很高(均在10%以上),资源化利用潜力巨大。铜和钴大部分以酸溶态和氧化物结合态存在,适宜于生物淋滤处理。

    2)非接触浸出钴白合金的最适固液比为1%,此时钴可100%浸出,铜浸出率为77.42%。非接触循环富集进行10次,最终浸出液中钴的质量浓度可达12 877.25 mg·L−1、铜的质量浓度可达7 358.67 mg·L−1

    3)钴白合金在接触浸出中,随着浸出时间的延长,铜和钴最终均能完全浸出。从浸出渣中钴和铜的赋存形态可以看出,钴浸出仅需生物酸的作用,铜的浸出除了需生物酸作用,还需Fe3+的参与。在菌体的直接作用下,浸出体系内部形成了Fe3+的生成和消耗的循环,以供给铜浸出。

  • 图 1  菌剂Z16外表面和内部的扫描电镜

    Figure 1.  Scanning electron microscopy of external and internal bacterial inoculant Z16

    图 2  菌剂Z16的释菌能力

    Figure 2.  Release ability of bacterial agent Z16

    图 3  龙葵株高和鲜重

    Figure 3.  Plant height and fresh weight of Solanum nigrum L.

    图 4  龙葵对钙、锌、锰和铁元素的吸收情况

    Figure 4.  Absorption of Ca, Zn, Mn, Fe by Solanum nigrum L.

    表 1  龙葵的Cd富集能力

    Table 1.  Cd bioconcentration capacity of Solanum nigrum L.

    处理组Cd富集质量分数/(mg·kg-1)Cd富集总量/µg
    地上部根部地上部根部
    CK4.68±0.02a3.38±0.29a2.57±0.17a0.09±0.01a
    EC4.48±0.13a3.31±0.05a4.09±0.11b0.19±0.02b
    Z165.42±0.14b8.91±0.02b5.24±0.32c0.55±0.07c
      注:不同字母代表不同处理组差异显著(p<0.05)。
    处理组Cd富集质量分数/(mg·kg-1)Cd富集总量/µg
    地上部根部地上部根部
    CK4.68±0.02a3.38±0.29a2.57±0.17a0.09±0.01a
    EC4.48±0.13a3.31±0.05a4.09±0.11b0.19±0.02b
    Z165.42±0.14b8.91±0.02b5.24±0.32c0.55±0.07c
      注:不同字母代表不同处理组差异显著(p<0.05)。
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    表 2  龙葵的Cd富集和转运系数

    Table 2.  Cd bioconcentration and translocation factor of Solanum nigrum L.

    处理组碳酸盐结合态Cd质量分数/(mg·kg−1)富集系数BCF转运系数TF
    根际土地上部根部
    CK0.252±0.006b5.16±0.02a3.73±0.32a1.39±0.12b
    EC0.247±0.011b4.95±0.15a3.66±0.05a1.35±0.04b
    Z160.217±0.003a5.98±0.16b9.84±0.02b0.61±0.02a
      注:不同字母代表不同处理组差异显著(p<0.05)。
    处理组碳酸盐结合态Cd质量分数/(mg·kg−1)富集系数BCF转运系数TF
    根际土地上部根部
    CK0.252±0.006b5.16±0.02a3.73±0.32a1.39±0.12b
    EC0.247±0.011b4.95±0.15a3.66±0.05a1.35±0.04b
    Z160.217±0.003a5.98±0.16b9.84±0.02b0.61±0.02a
      注:不同字母代表不同处理组差异显著(p<0.05)。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-29
  • 录用日期:  2022-05-06
  • 刊出日期:  2022-07-31
唐万鹏, 王立立, 王东升, 阮翔, 李取生. 包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤[J]. 环境工程学报, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196
引用本文: 唐万鹏, 王立立, 王东升, 阮翔, 李取生. 包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤[J]. 环境工程学报, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196
TANG Wanpeng, WANG Lili, WANG Dongsheng, RUAN Xiang, LI Qusheng. Enhanced remediation of cadmium contaminated farmland soil by Solanum nigrum L . with coated rhizosphere growth-promoting agent[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196
Citation: TANG Wanpeng, WANG Lili, WANG Dongsheng, RUAN Xiang, LI Qusheng. Enhanced remediation of cadmium contaminated farmland soil by Solanum nigrum L . with coated rhizosphere growth-promoting agent[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(7): 2278-2286. doi: 10.12030/j.cjee.202101196

包裹型根际促生菌剂强化龙葵修复镉污染农田土壤

    通讯作者: 王立立(1973—),女,博士,副教授,towanglili@163.com
    作者简介: 唐万鹏(1995—),男,硕士研究生,tangwp@stu2018.jnu.edu.cn
  • 暨南大学环境学院,广州 510630
基金项目:
国家重点研发计划项目(2017YFD0801300)

摘要: 制备了一种具有镉活化功能的包裹型根际促生菌剂,用于强化镉超累积植物龙葵对镉污染农田土壤的植物修复作用。结果表明:包裹型菌剂Z16的多腔室结构适合菌株的生存,菌剂Z16的释菌浓度在24 h孵育后达到106 CFU·g−1;与菌液组EC相比,菌剂Z16组的龙葵地上部鲜重提高了19.81%,地上部和根部镉的富集系数分别提高了20.98%和168.97%,根际土壤碳酸盐结合态镉的浓度得到活化,龙葵对钙、锰和铁元素的吸收能力也得到增强。因此,与施用菌液EC相比,包裹型根际促生菌剂Z16通过在根际土壤持续释放菌株,可提高难溶性镉的活化效果及提高植物修复效率。本研究可为强化超累积植物-根际促生菌联用技术对镉污染农田的植物修复效率提供参考。

English Abstract

  • 镉(Cadmium, Cd)是珠三角地区农田土壤重金属污染的主要元素之一,给农产品及环境安全带来较大威胁[1-2]。以种植超累积植物的方式修复土壤重金属污染可有效保持农田土壤的生态结构和功能,但在实际应用中往往受到土壤理化性质、重金属赋存形态等因素的影响,导致超累积植物生长缓慢、生物量小、对土壤重金属的修复效率低等问题[3-4]。通过将超累积植物与根际促生菌联用,借助根际促生菌与植物间的相互作用,促进植物生长,提高土壤矿质元素的生物有效性[5-7],进而提高植物修复效率的研究已成为近年来的热点 [8-12]

    龙葵是一种能生长在受镉污染严重的矿区,为生长速度快,且地上部分生物量大的镉超累积植物,已被广泛应用于土壤的植物修复研究中。阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是本课题组前期从根系土壤筛选并鉴定的具有产铁载体功能,可促进植物生长的根际促生菌。因此,从理论上讲,将龙葵与阴沟肠杆菌联用可大幅提高龙葵对镉污染农田土壤的修复效率。然而,受根际土壤环境多方面的影响,这种联用技术在实际应用中尚存在菌株定殖效果差、生态位竞争力不足的局限性[13-14]。通过液体接种到植物根际土壤菌株的存活能力往往较低,从而影响植物修复效率。此外,修复过程中需要定期接种菌液,亦会给农业生产带来不便[15]

    根际促生菌的封装技术是提高其在植物根际土壤中存活能力,并增强植物修复效率的有效方法[16]。海藻酸盐与钙盐发生交联反应形成的化合物对细菌无毒害作用,具有良好的生物相容性,且能被土壤环境自然降解,因而适用于微生物载体材料[17]。淀粉和乳清能提高细菌在干燥和低温环境下的活性[17],是固体菌剂中提高根际促生菌复苏能力和保存时间的有效添加成分。此外,植物对钙、锌、锰和铁4种金属元素的吸收会影响其自身生长,并参与植物富集和转运镉的生理过程。

    本研究选用海藻酸钠、氯化钙、黑麦粉、甜乳清粉为载体材料,阴沟肠杆菌为菌株[14],制备包裹型根际促生菌剂Z16,通过盆栽实验,研究对比菌液和菌剂对龙葵提取土壤重金属镉的影响,并分析该菌剂对龙葵吸收钙、锰、锌和铁这4种金属元素的影响,进一步证实菌剂的作用效果,以期为强化超累积植物-根际促生菌联用技术对镉污染农田的植物修复效率提供参考。

    • 龙葵种子购自中国科学院沈阳应用生态研究所。阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, EC)是由课题组前期通过磺酸盐(chrome azurol sulphonate,CAS)筛选培养基从镉污染土壤种植的龙葵根系土中筛选所得的一株具有产铁载体能力的根际促生菌[14],保藏于实验室−80 ℃冰箱。

      盆栽土壤采自广东省韶关市大宝山附近农田土壤。样品去除异物后放置温室风干、磨碎和混匀,过 4 mm 筛网。土壤阳离子交换量(cation exchange capacity,CEC)的测定按照《土壤 阳离子交换量的测定 三氯化六氨合钴浸提-分光光度法(HJ 889-2017)》标准执行。土壤理化性质:pH 6.33;总有机碳(total organic carbon,TOC) 29.51 g·kg−1;有效磷 22.40 mg·kg−1;CEC 98.81 cmol+·kg−1;总Cd含量 0.91 mg·kg−1;二乙烯三胺五乙酸提取态Cd 0.43 mg·kg−1;Tessier法[18]提取碳酸盐结合态Cd 0.28 mg·kg−1

      LB 培养基配方:胰蛋白胨(Tryptone)10 g·L−1;酵母提取物(Yeast extract)5 g·L−1;氯化钠(NaCl) 10 g·L−1;pH 7.0~7.5。

      菌剂材料:海藻酸钠(Sodium alginate) 质量分数为2.5%,氯化钙(CaCl2)0.1 mol·L−1,黑全麦粉质量分数为7.5%,甜乳清粉质量分数为2%,菌液EC 108 CFU·mL−1

    • 1) 包裹型菌剂的制备与SEM观察。将EC菌从斜面培养基接种到LB液体培养基中,在28 ℃、150 r·min−1摇床条件下培养14~18 h,以转速4 000 r·min−1离心10 min后收集菌体,用无菌水等体积重悬备用(菌液浓度为108 CFU·mL−1)。称取2.5 g的海藻酸钠和7.5 g的黑麦粉放置于100 mL无菌水溶剂搅拌混合,在高温灭菌、冷却后加入2 g的甜乳清粉。将黏稠的溶液与EC菌液按1∶1的比例搅拌混合。利用滴管吸取适量混合溶液,缓慢滴入0.1 mol·L−1的氯化钙溶液。海藻酸钠和氯化钙发生交联反应形成胶粒状固体小球,过滤后在−50 ℃条件下进行真空冷冻干燥2 d,得到干燥的包裹型菌剂待用。将干燥的包裹型菌剂放置于铜台上,利用导电胶固定,干燥喷镀后进行扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察其外部。使用灭菌刀片侧切颗粒菌剂后,放置于铜台上,利用导电胶固定,干燥喷镀后观察其内部。称取适量菌剂于无菌蒸馏水中,在28 ℃、150 r·min−1 摇床条件下孵育 48 h。孵育期间,每间隔6 h取出,吸取少量菌液并稀释梯度倍数,涂布平板。最后放置在28 ℃培养箱培养14~18 h,取出计数。

      2) 盆栽实验。盆栽实验在温室内进行,温度控制在(30±2)℃。采用直径为18 cm的塑料花盆。每个花盆装有1.5 kg土壤。调节盆中持水量约80%。盆栽设计:共设菌剂Z16组、加菌EC组和对照CK组3个处理,每个处理3个平行。菌液通过灌根的方式加入6 mL。每隔30 d补充1次,共补充2次。菌剂通过与根周土壤混合的方式加入6 g,间隔30 d补充1次,共补充2次。龙葵生长60 d后,分别收集龙葵地上部茎叶、地下部根系和根系土壤,测量龙葵株高,并称量地上部茎叶和地下部根系鲜重。随后,将茎叶和根放入105 ℃烘箱内杀青30 min,然后在60 ℃条件下恒温烘干,称量地上部茎叶和地下部根系干重。将烘干的地上部茎叶和地下部根系粉碎,称取0.1 g茎叶和根,分别加8 mL硝酸进行微波消解,经0.45 μm过滤定容。根系土壤放于温室自然风干,采用Tessier法提取碳酸盐结合态Cd。用石墨原子吸收分光光度计测定消解茎叶、根及提取液中镉浓度,使用火焰原子吸收分光光度计测定消解茎叶和根部的钙、锌、锰和铁元素的浓度,并根据仪器检测浓度与最终定容体积计算含量。

      3) 数据统计与分析。每个处理组设置3个平行,使用Excel对数据进行计算整理,通过IBM SPSS Statistics软件Duncan 新复极差法,在0.05水平上分析样品间差异的显著性(p<0.05),使用Origin软件作图。

      Cd富集总量、Cd富集系数和Cd转运系数依次按式(1)~(3)计算。

      式中:A为龙葵Cd富集总量,µg;BCF为Cd富集系数;TF为Cd转运系数;C地上部为地上部Cd富集质量分数,mg·kg−1C根部为根部Cd富集质量分数,mg·kg−1M地上部为龙葵地上部干重,g;M根部为龙葵根部干重,g;C为土壤总Cd质量分数,mg·kg−1

    • 海藻酸钠与氯化钙交联形成稳定性较好的胶囊,从而为菌株提供保护屏障。适当的黑麦和甜乳清粉为菌株的生存提供营养。如图1(a)和(b)所示,包裹型菌剂Z16呈现胶囊状小球颗粒,粒径为2~4 mm。图1(c)和(e)扫描电镜观测结果表明,菌剂的外表面粗糙,带有褶皱,菌株可黏附并密集分布。图1(d)和(f)表明,菌剂内部结构形成不同大小空间的腔室,这种特殊的内部结构为大部分菌株的生存提供了物理空间。内部菌株分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)填充腔体内部,成熟的生物膜已形成。菌剂Z16的活性如图2所示。包裹型菌剂在孵育24 h后,释菌数量达到106 CFU·g−1,短时间内形成较高的菌液浓度,具备良好的活性。

    • 温室种植盆栽在经过生长60 d的种植期后收获。不同处理组龙葵的株高和鲜重如图3所示。其中,加菌的EC和Z16组龙葵株高显著高于不加菌的CK组(p<0.05),分别提高了29.90%和33.44%;而接种菌液EC和菌剂Z16的2个处理组的龙葵株高无显著差异(p>0.05)。接种菌剂Z16和接种EC菌对龙葵地上部和根部鲜重的影响不同,且都显著高于对照组CK(p<0.05)。与对照组CK相比,接种菌液EC和菌剂Z16的龙葵地上部鲜重显著增加(p<0.05),分别提高了54.73%和85.39%。与接种菌液EC相比,接种菌剂Z16可进一步提高龙葵地上部鲜重的19.82%。另外,接种菌液EC和菌剂Z16的龙葵根部鲜重均较CK组显著增加(p<0.05),分别提高了92.31%和76.92%,而菌液EC和菌剂Z16组的根部的鲜重上并没有显著差异(p>0.05)。

      不同处理下龙葵对土壤Cd 的富集能力如表1所示。与接种菌液EC组相比,接种菌剂Z16可进一步提高龙葵对Cd的富集质量分数及总量(p<0.05)。菌剂Z16地上部及根部的Cd富集质量分数分别提高了20.98%和168.97%;菌剂Z16地上部和根部Cd富集质量分数分别提高了28.09%和192.02%。

      表2显示,与对照组CK相比,接种菌液EC的富集系数并未产生显著变化(p>0.05),而菌剂Z16则显著提高了龙葵地上部和根部的Cd富集系数(p<0.05),分别为15.92%和163.43%。与对照组CK相比,接种菌液EC的龙葵Cd转运系数并未产生显著变化(p>0.05),而接种菌剂Z16则显著降低了龙葵Cd转运系数(p<0.05),降低了56.23%,且其对镉的富集主要集中在龙葵根部。另外,与对照组CK相比,接种菌液EC的龙葵根际土壤难溶性碳酸盐结合态Cd未产生显著变化(p>0.05),而菌剂Z16可显著降低龙葵根际土壤中碳酸盐结合态Cd的浓度(p<0.05),降低了13.89%。

      植物生长所必须的金属元素钙、锌、锰和铁在龙葵地上和根部的浓度分布及转运系数如图4所示。不同处理组龙葵地上部和根部对Ca、Zn、Mn和Fe 4种元素的吸收和转运有较大差异。与对照CK相比,接种菌液EC并未提高龙葵地上部对Ca、Zn的吸收量(p>0.05),但可显著提高地上部分对Fe和Mn的吸收量(p<0.05)。与接种菌液EC相比,接种菌剂Z16可明显提高龙葵地上部和根部对Ca和Mn元素的吸收量(p<0.05)。其中,地上部分别提高了17.80%和19.29%;根部分别提高了14.35%和20.83%,但降低了地上部对Zn元素的吸收量。虽然与对照CK处理相比,接种菌剂Z16使龙葵地上部分和根部对Fe元素的吸收量分别提高了26%和13.45%,但接种菌剂Z16对龙葵地上部Fe元素的吸收量较接种菌液EC却降低了12.5%,而根部对Fe元素的吸收量较接种菌液EC略有增加(p<0.05),约增加了6.1%。另外,在龙葵对Ca、Zn、Mn和Fe的转运系数方面,与对照CK相比,接种菌液EC提高了龙葵Zn、Mn和Fe的转运系数(p<0.05),分别提高了24.67%、22.57和35.07%而对龙葵Ca的转运系数影响不大(p>0.05)。与对照CK相比,菌剂Z16将龙葵Mn的转运系数(p<0.05)提高了20.64%;但对Ca、Zn和Fe的转运系数则影响不大(p>0.05)。与接种菌液EC相比,接种菌剂Z16使龙葵Zn和Fe的转运系数有所降低(p<0.05),分别降低了25.23%和17.63%。

    • 包裹型菌剂Z16的外表面粗糙,多有褶皱,内部结构形成了不同大小的多腔室。这种特殊结构可为内部生存的菌株提供避免外部压力的物理屏障,可有效提高菌株的存活能力[19]。菌剂添加的黑麦与甜乳清粉可为菌株生长提供营养,延长保存菌剂的使用时间,还可缓解真空冷冻干燥对菌株细胞蛋白和膜的损伤,从而提高菌剂复苏过程的细胞活性[20-21]。海藻酸钠与氯化钙交联形成的胶囊颗粒具有缓释特性,使得菌株在根际土壤环境中能保持长时间的效用[22]。另外,菌剂内部的生物膜含有大量具有高持水能力的胞外聚合物(EPS),能改变土壤结构和孔径分布,在增加土壤保水量、减少土壤水分蒸发及增加植物蒸腾作用中发挥重要作用[23]。因此,在土壤中,使用菌剂较施用菌剂发挥的作用更长效。

      盆栽结果表明,经菌剂Z16处理后的根际土壤难溶性碳酸盐结合态Cd的质量分数低于对照CK组和菌液EC组。这表明菌剂Z16对根际土壤难溶性碳酸盐结合态镉具有更强活化能力,促进了龙葵对镉的富集。根际促生菌通过分泌植物生长激素,可促进植物生长[14],使得接种菌液EC和菌剂Z16均能显著提高龙葵的株高和鲜重。相较接种菌液EC,菌剂Z16可进一步提高龙葵鲜重。其原因有两方面:一方面由于菌剂内部的多腔室结构为菌株生存提供生态位,提高了菌株在根际土壤中的竞争和存活能力;另一方面,经过土壤微生物的作用,菌剂丰富的有机成分可增加土壤肥力,为龙葵生长提供额外养分[24]。与对照CK组相比,接种菌剂EC和菌剂Z16均显著提高了龙葵对Cd的富集总量,菌液EC组对龙葵地上部和根部富集质量分数和富集系数影响较小,而菌剂Z16则显著提高了龙葵地上部和根部对土壤Cd的富集质量分数和地上部的Cd富集系数。根际促生菌分泌的螯合物质是影响植物根系对重金属富集的重要原因[25]。菌剂的缓释特性让菌株在较长时间内分泌更多螯合物质,从而提高了根际促生菌的存活能力,并促进龙葵对土壤Cd的富集。有研究者报道,可将生物炭作为微生物吸附载体制备固体菌剂[26],然而,生物炭对土壤重金属具有极强的物理化学吸附特性,阻碍了超累积植物对土壤中重金属的提取过程。

      Mn和Fe是龙葵生长所需的微量金属元素,参与植物光合作用和细胞中的酶反应[27]。与对照组CK相比,接种菌液EC和菌剂Z16提高了龙葵对Mn和Fe金属元素的吸收。这是由于菌株分泌低分子有机酸物质活化了土壤难溶性Mn和Fe金属元素,而金属元素生物有效性的提高则促进了龙葵根系对土壤金属元素的吸收[28]。铁载体是对环境中铁(III)具有高度亲和力的低分子量化合物,其产出受到生物体周边环境的铁浓度调节[29]。在铁生物利用性较低的土壤环境中,菌剂处理提高了菌株产铁载体的数量,进而增强了龙葵对Fe元素吸收。另外,不同类型的铁载体将引起根际微生物间的铁资源竞争。在菌剂载体的保护下,菌株会分泌出更多抑制型铁载体,从而可提高其与其他根际微生物间的铁资源竞争力。这有利于构建对植物有益的根际土壤核心微生物组网络,以优化根际微生物群落结构,进而发挥更长效作用[30-32]。与对照组CK相比,菌剂Z16提高了龙葵地上部和根部对Ca元素的吸收,而菌液EC却无此作用。这可能与菌剂外表层的钙盐有一定关系,外源添加钙养分可能导致龙葵对Ca元素吸收能力的提高[33]。另外,有研究表明,外源添加低浓度的钙能提高龙葵对Cd的富集,这可能也是造成菌剂处理后的龙葵Cd富集量显著高于菌液处理的原因[34]。金属元素在植物细胞的膜转运过程中存在竞争关系[35],使得菌剂Z16在提高龙葵地上部对Mn和Cd的吸收的同时,降低了其对Fe和Zn的吸收。与接种菌液组的差异表明,尽管在菌剂作用下,龙葵的植物根部可吸收更多Zn和Fe,但转运系数的降低影响了龙葵地上部对这2种金属元素的吸收。

      超累积植物富集重金属Cd的过程可分为3步:根系从土壤高效地吸收重金属;通过木质部将重金属转运到地上部;最后在枝叶细胞积累[36]。这一过程中的膜转运是影响土壤重金属元素进入植物细胞的关键因素。金属元素从土壤转运到植物的器官和组织需要不同类型的转运体,其中包括ZIP家族、Nramp家族及ATPases等[37-39];部分金属转运体参与多种金属元素的转运[40],如PEDAS等[41]发现HvIRT1参与Fe、Zn、Mn和Cd元素的转运,WU等[42]发现 HvNramp5参与Mn和Cd元素的金属转运。因此,龙葵地上部和根部对Cd富集与其对其他金属的吸收具有关联性。比如Cd通过其他金属的转运体进入龙葵体内,菌剂处理可能导致了龙葵体内与Mn、Zn、Fe等金属元素相关的转运体表达量增加,在这些微量金属元素被吸收的同时,Cd元素也通过这些转运体被龙葵富集。

    • 1)利用海藻酸盐与钙盐交联形成的载体材料,与根际促生菌结合,研制出包裹型根际促生菌剂Z16。其内部的多腔室结构为菌株提供了生存空间,缓慢释放菌株于24 h孵育后。释菌浓度可达到106 CFU·g−1。与菌液EC相比,菌剂Z16通过增强龙葵对Ca、Mn和Fe 3种金属元素的吸收能力,能进一步促进龙葵生长。

      2)与菌液EC相比,菌剂Z16通过持续释放菌株,可发挥更持久的活化镉及促进超累积植物提取镉的作用。根际土壤难溶性碳酸盐结合态镉的质量分数降低了12.15%;地上部和根部的Cd富集系数分别提高了20.98%和168.97%;地上部和根部的Cd富集总量分别提高了28.09%和192.02%。因此,微生物载体与根际促生菌发挥的协同作用可提高该菌株参与的根际促生菌-超累积植物联合修复效率。

    参考文献 (42)

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