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聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析

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杨艳平, 赵辰, 张纯纯, 王尚, 张朝晖, 高超, 曹卓松, 王景峰. 聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
引用本文: 杨艳平, 赵辰, 张纯纯, 王尚, 张朝晖, 高超, 曹卓松, 王景峰. 聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
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YANG Yanping, ZHAO Chen, ZHANG Chunchun, WANG Shang, ZHANG Zhaohui, GAO Chao, CAO Zhuosong, WANG Jingfeng. Rapid enrichment of glycogen accumulating organisms and analysis of community characteristics[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
Citation: YANG Yanping, ZHAO Chen, ZHANG Chunchun, WANG Shang, ZHANG Zhaohui, GAO Chao, CAO Zhuosong, WANG Jingfeng. Rapid enrichment of glycogen accumulating organisms and analysis of community characteristics[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
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聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析

  • 1.

    天津工业大学环境科学与工程学院，天津 300387

  • 2.

    军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津 300050

    • 作者简介: 杨艳平(1995—)，女，硕士研究生。研究方向：环境工程微生物。E-mail：y18822036007@126.com
    通讯作者: 王景峰(1974—)，男，博士，研究员。研究方向：污水生物处理理论与技术。E-mail：wangjingfeng0116@163.com
  • 基金项目:
    国家自然科学基金面上项目(51678565)；后勤科研重大项目(AWS18J004)；天津市自然科学基金资助项目(19JCYBJC23800)

  • 中图分类号: X703

Rapid enrichment of glycogen accumulating organisms and analysis of community characteristics

  • 1.

    School of Environmental Science and Engineering, Tiangong University, Tianjin 300387, China

  • 2.

    Institute of Environmental and Operational Medicine, Academy of Military Medicine, Chinese Academy of Military Science, Tianjin 300050, China

    • Corresponding author: WANG Jingfeng, wangjingfeng0116@163.com

摘要

  • 摘要: 为研究聚糖菌(GAOs)模型的群落结构及糖原相关功能基因的表达变化，通过厌氧末排水及磷限制条件的双重策略，建立快速、稳定的聚糖菌模型。应用宏基因组学技术测定了GAOs体系菌群结构的动态变化，并分析在驯化过程中糖原代谢通路关键功能基因的调节作用。结果表明，经过40 d左右的驯化，反应器呈现出典型的GAOs代谢模式，厌氧利用糖原吸收乙酸合成PHA，好氧消耗PHA补充糖原。稳定期的厌氧期糖原降解/VFA吸收、PHA合成/VFA吸收的值分别为1.036、2.468，与GAOs的化学计量学模型接近。宏基因组结果显示，反应器中包含Candidatus Contendobacter、Candidatus Competibacter和Candidatus Propionivibrio aalborgensis 3类GAOs，分别占细菌总数的7.13%、1.86%和0.20%，稳定期GAOs丰度增长为接种污泥的10.4倍左右。驯化过程对反应器内的糖原合成酶(glgA)和1, 4-α-葡聚糖分支酶(GBE1, glgB)等糖原代谢相关基因丰度有明显影响，且系统中同时存在糖酵解途径(glycolytic pathway)和ED途径(Entner-Doudoroff pathway)。以上结果从微观结构揭示了GAOs的富集过程菌群结构及糖原相关功能基因的作用，可为完善GAOs的代谢机理提供参考。
    Abstract: A fast and stable model of glycogen accumulating organisms (GAOs) was established to study the community structure of GAOs model and the changes in the expression of glycogen-related functional genes by the dual strategies of anaerobic drainage and phosphorus restriction. The dynamic changes of bacterial community structure of GAOs system were determined by metagenomics. The regulation of key functional genes of glycogen metabolism pathway in the cultivable process was analyzed. Results showed that after about 40 days of domestication, the reactor showed stable metabolic characteristics of GAOs, whereby glycogen was consumed to absorb acetate to synthesize PHA in the anaerobic period and PHA was consumed to supplement glycogen in the aerobic period. The values of glycogen degradation/VFA absorption and PHA synthesis/VFA absorption in stable anaerobic phase were 1.036 and 2.468 respectively, which were close to the stoichiometric model of GAOs. The metagenomic results showed that Candidatus Contendobacter, Candidatus Competibacter and “Candidatus Propionivibrio aalborgensis” in the reactor accounted for about 7.13%, 1.86% and 0.20% of the total bacteria, respectively, and the GAOs abundance in the stable period was about 10.4 times that of initial sludge. The process had a significant effect on the abundance of glycogen metabolism-related genes such as glycogen synthetase (glgA) and 1, 4- α-glucan branching enzyme (GBE1, glgB) in the reactor, and there were both glycolysis pathway and ED pathway in the system. The microbial community structure and the function genes of glycogen-related function in the enrichment process of GAOs were revealed from the microstructure, which provided reference for improving the theory of metabolic mechanism of GAOs.

  • 在饮用水处理工艺中，超滤(utrafiltration，UF)技术因其优异的固液分离性能和出水生物安全性，已成为第三代净水工艺的核心技术[1-3]，但超滤对有机物的低去除能力使其必须和其他净水技术联合使用才能保证出水水质[4-6]。吸附和预氧化是应用最广泛的膜前预处理技术[7-9]。一方面，在众多吸附剂中，磁性阴离子交换树脂(magnetic anion exchange resin，MIEX)是近年来为针对水中天然有机物(natural organic matter，NOM)去除而专门开发的一种新型树脂[10]。MIEX树脂颗粒的粒径约为150~180 μm，是传统树脂粒径的1/5~1/2倍，因而具有更大的比表面积和更低的固相传质阻力，可以提供更多的吸附活性点位[11]。与水处理中最常用的吸附剂粉末活性炭(powder activated carbon，PAC)相比，MIEX对有机物的去除速率是PAC的40倍，而且去除的有机物分子质量范围也较PAC更广泛[12]。已有大量的研究证明，MIEX对NOM、消毒副产物以及离子型污染物都有很好的去除效果[13-15]。作为一种新兴的吸附净水技术，MIEX正在受到越来越多的关注[16-17]。另一方面，在众多的预氧化技术中，高铁酸盐(FeO2−4)作为一种新型绿色高效氧化剂[18-19]，集氧化、吸附和絮凝于一体，能够有效消减水中各类有机污染物[20-21]。高铁酸盐具有比传统氧化剂更高的氧化电势(在酸性条件下为E0=2.20 V，在碱性条件下为E0=0.72 V)，而且没有消毒副产物生成[22]。同时高铁酸盐还具有微絮凝效应，其氧化有机物后会在水中形成新生态氢氧化铁胶体，能够进一步去除水中的颗粒态和胶体态污染物[23]。目前，高铁酸盐已被广泛用于污水、废水和给水的水质净化等领域[24-27]。

    众多周知，氧化法能够破坏大分子的结构，进而将其转化为小分子化合物，吸附则优先去除小分子有机物。因此，将氧化和吸附耦合作为UF的预处理工艺，可使得两者在净水方面存在较好的协同效果。但是，高铁酸盐预氧化和MIEX吸附在净水方面的性能差异对比，以及二者耦合是否存在明显的协同净水效应，还未见有研究报道。基于此，本研究以地表水模拟微污染水源水，系统地对比分析了MIEX吸附和高铁酸钾(K2FeO4)预氧化在有机物去除性能方面的差异，探讨了两者在净水性能方面存在协同效应的可能性，从水质净化角度为UF预处理工艺的筛选优化提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   实验材料

    实验所用MIEX由澳大利亚ORICA公司生产并提供，平均粒径为180 μm。为保持性能，MIEX在使用前放置在饱和NaCl浓盐水中避光保存。每次使用时，取出适量MIEX置于烧杯中，用超纯水多次清洗至上清液电导率和纯水基本相同后备用[28]。树脂投加量按充分沉降后的湿体积计算。实验所用K2FeO4购自天津三江科技有限公司(纯度为99%，主要杂质为NaCl≤0.46%、Pb≤0.001%、As≤0.000 1%、水不溶物≤0.2%、干燥失重(150 ℃)≤1.0%)。在本实验中，高铁酸钾的投加方式为固体粉末投加。

    实验中使用的原水来自于天津工业大学泮湖，使用前将湖水静置24 h去除较大颗粒物和表层悬浮物。稀释1倍后作为本实验进水，以模拟微污染水源水。实验进水综合水质特征为：实验原水的pH为8.31~8.37、浊度为1.93~1.96 NTU、UV254为0.187 1~0.190 0 cm−1、DOC为8.51~8.55 mg·L−1、电导率为1 716~1 718 mS·cm−1、SO2−4为140.2~143.4 mg·L−1。

    1.2   实验装置

    K2FeO4预氧化实验和MIEX吸附实验均在ZR4-6型混凝实验搅拌仪中进行。搅拌速度为100 r·min−1，吸附和预氧化时间均为60 min。反应结束后沉淀30 min，取上清液经0.45 µm滤膜过滤后，再进行水质测定分析。

    1.3   分析方法

    pH使用HACH 2100AN型测定仪测定；浊度采用HACH2100Q型便携式浊度检测仪测定；UV254采用Agilent Craay60 UV-Vis紫外分光光度计进行测定；DOC采用岛津TOC-Vcph测定仪进行测定；有机物分子质量分布采用高效凝胶色谱分析，使用美国Waters公司生产的Waters 1515-2414型高效凝胶色谱仪，检测器为Waters 2414示差折光检测器，标准物质为聚乙二醇。实验进水中亲、疏水NOM组分的制备根据沈兆欢[29]提供的方法进行。

    水样的三维荧光光谱(three-dimensional fluorescence spectrum, 3D-EEM)分析采用Perkin Elmer LS50B型荧光分光光度计(Perkin Elmer, New Jersey, USA)在室温(25 ℃)下进行。激发波长(excitation wavelength, Ex)为200~500 nm，扫描步长5 nm，发射波长(emission wavelength, Em)为200~600 nm，扫描步长为1 nm。激发和发射单色仪的狭缝宽度均设定为5 nm，扫描速度为1200 nm·min−1。采用荧光区域整合(fluorescence regional integration, FRI)技术对3D-EEM光谱数据进行分析。该方法先对3D-EEM图像及数据进行分区，激发-发射荧光光谱响应值矩阵分区与有机物种类对应关系[30]如表1所示。根据每个分区面积占总面积的比例计算每个区域的乘法因子Fi，再根据式(1)和式(2)计算标准化3D-EEM区域响应体积Φi,n，得出有机物构成情况[31]。

    表 1  激发-发射荧光光谱响应值矩阵分区与有机物种类对应关系
    Table 1.  Corresponding relationship between the matrix partition of excitation-emission fluorescence spectra response values and the types of organic matters
    区域Em/nmEx/nm有机物类别
    Ⅰ250~325200~250类酪氨酸类蛋白质
    Ⅱ325~380200~250类色氨酸类蛋白质
    Ⅲ380~500200~250类富里酸
    Ⅳ250~380250~400可溶微生物代谢产物
    Ⅴ380~500250~400类腐殖酸
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    Φi=∑ex∑emI(λexλem)ΔλexΔλem (1)
    Φi,n=FiΦi (2)

    式中：I(λexλem)为三维荧光各点响应值总和；Fi为3D-EEM每个区域的乘法因子；Δλem为发射光谱扫描步长，nm；Δλex为激发光谱扫描步长，nm；Φi,n为3D-EEM区域响应体积。

    1.4   协同效应系数

    为评价K2FeO4预氧化和MIEX吸附两者之间的协同效应，采用协同效应系数评估两者对各项指标的协同去除情况，协同效应系数[32]根据式(3)进行计算。

    S=−ηA−ηB−ηAηB−ηAB

    式中：S为协同效应系数；ηA为MIEX对有机物的去除率；ηB为K2FeO4对有机物的去除率；ηAB为MIEX和K2FeO4联合对有机物的去除率。当S>1时，表明两者有协同作用。

    2.   结果与讨论

    2.1   MIEX和K2FeO4净水效果对比分析

    1) MIEX和K2FeO4对有机物总量的去除。图1(a)和图1(b)分别为MIEX和K2FeO4投加量对DOC和UV254去除效果的影响规律，两者的去除率随MIEX和K2FeO4投加剂量的变化趋势相同。当MIEX的投加量由5 mL·L−1增至20 mL·L−1时，MIEX对DOC的去除率由17.7%增至50.9%，之后DOC的去除率明显有所减缓。MIEX规律在UV254的去除率方面表现更加明显，去除率由5 mL·L−1投加量下的48.7%增至20 mL·L−1投加量下的71.9%，之后去除率不再有明显变化。当K2FeO4投加量(以Fe计)由4.23 mg L−1增加至16.92 mg·L−1时，DOC的去除率由12.8%增至35.3%，UV254的去除率由14.4%增至53.0%。此后，DOC和UV254的去除率增长幅度均随K2FeO4投加量的进一步增加而明显减缓。在MIEX和K2FeO4的实验投加量范围内，MIEX对DOC和UV254的去除率均明显高于K2FeO4预氧化，这说明MIEX对总有机物和芳香族类有机物的去除效果均优于K2FeO4预氧化工艺。

    图 1  不同剂量MIEX和K2FeO4对有机物去除效果
    Figure 1.  Removal of organic matters by MIEX adsorption and K2FeO4 oxidation at different dosages
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    2) MIEX和K2FeO4对不太亲疏水组分有机物的去除。图2为MIEX和K2FeO4预氧化对不同亲疏水组分有机物的去除效果。需要特别指出的是，基于图1所得到的实验结果，在图2及后续实验中，K2FeO4和MIEX的投加量分别设定在16.92 mg·L−1和20 mL·L−1。在本实验中，通过树脂分级制备方法将原水中NOM组分分成疏水酸性组分(HoA)、疏水碱性组分(HoB)、疏水中性组分(HoN)、弱疏水组分(WHo)和亲水性组分(HiM)，原水中总疏水总分(THo)是各疏水组分含量之和。对比MIEX吸附和K2FeO4预氧化对这些组分的去除率可以发现，MIEX吸附对每种单一疏水组分和疏水性NOM总量(THo)的去除率均相差不大，为44.9%~51.6%，但对亲水性组分的去除率明显高于疏水性组分，去除率可高达76.9%。相比之下，K2FeO4预氧化只对疏水酸性和疏水碱性组分的去除率较高，去除率分别为47.3%和50.5%，与MIEX的去除率相差不大，对疏水酸性组分的去除率甚至略高于MIEX。但K2FeO4预氧化对疏水中性组分的去除率仅为27.5%，对弱疏水组分几乎没有去除(去除率仅为7.8%)，这些均远远弱于MIEX的去除效果。K2FeO4预氧化对亲水性组分不但没有去除，预氧化出水中亲水性组分反而增加了21.5%，同时考虑到预氧化对总NOM的去除率为33.8%，这再次证实了预氧化能够促使某些疏水性NOM组分向亲水性NOM转化[33]。

    图 2  MIEX和K2FeO4对亲疏水组分去除效果
    Figure 2.  Removal of hydrophilic and hydrophobic components by MIEX adsorption or K2FeO4 oxidation
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    3) MIEX和K2FeO4对不同种类有机物的去除效果分析。采用3D-EEM荧光光谱考察了MIEX吸附和K2FeO4预氧化对水中不同类型有机物的去除效果。图3(a)为原水的三维荧光光谱，图3(b)和图3(c)分别为MIEX吸附和K2FeO4预氧化出水的三维荧光光谱。原水在经上述2种预处理后，各组分有机物的荧光强度均有显著降低，其中，MIEX吸附对各组分有机物的消减幅度比K2FeO4预氧化更加明显。通过对三维荧光光谱进行荧光区域整合分析可以看出，原水中5种有机物质所占比例分别为类酪氨酸类蛋白质(Ⅰ)6.30%、类色氨酸类蛋白质(Ⅱ)8.56%、类富里酸(Ⅲ)19.08%、可溶微生物代谢产物(Ⅳ)33.51%和类腐殖酸(Ⅴ)32.55%。显然原水中IV和V类有机物占据主要成分，总占比为66.06%。MIEX对Ⅰ和Ⅳ类有机物去除率较低，仅为20.0%和26.2%；但对Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ类有机物的去除率均较高，分别为52.5%、54.0%和56.7%。K2FeO4对Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ类有机物的去除率均较低，去除率分别为16.6%、14.4%和17.7%；对Ⅱ类去除率较高，为46.2%，其次为Ⅲ类物质，去除率为39.3%。上述结果表明，MIEX对水中的Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ类有机物有着较高的去除率，而K2FeO4优先去除水中II类有机物。两者对Ⅲ类物质均有较高的去除率，但对Ⅰ类物质的去除率均较低。

    图 3  三维荧光光谱分区及FRI分析
    Figure 3.  Three-dimensional fluorescence spectra and FRI analysis
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    4) MIEX和K2FeO4对不同相对分子质量有机物的去除效果。对实验原水进行高效凝胶色谱分析发现，原水中有机物主要是中、小分子质量的有机物，其主要集中在10~15、1.7~2.7和0.2~1 kDa(图4)。通过对这3个分子质量区间对应的峰面积进行积分计算可知，MIEX对这3个分子质量的有机物均有很好的吸附和去除，由分子质量由高到低的3个峰所对应的去除率依次为60.7%、65.7%、74.9%。显然，MIEX对分子质量为0.2~1 kDa有机物的去除率最高，这与YU等[7]的研究结论是一致的。

    图 4  水中有机物分子质量分布
    Figure 4.  Molecular weight distribution of organic matters in water
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    K2FeO4预氧化对3个分子质量有机物的去除率由分子质量由高到低依次为31.3%、74.4%和34.8%。从去除率来看，K2FeO4预氧化对分子质量为1.7~2.7 kDa有机物的去除率最高，优于MIEX。对10~15 kDa有机物去除能力弱于MIEX。理论上，K2FeO4预氧化对分子质量为10~15 kDa有机物的去除率应该优于1.7~2.7 kDa的有机物，但测定结果却表明，预氧化对这一小分子有机物的去除率很低，这应该是因为高铁酸钾对更高分子质量的有机物去除并没有达到完全矿化，而是将大分子有机物氧化分解成小分子有机物，最终导致预氧化出水小分子有机物的去除率并不高[34]。

    2.2   K2FeO4和MIEX的协同净水效果

    1) K2FeO4和MIEX在有机物总量去除方面的协同效应分析。在对比了K2FeO4预氧化和MIEX吸附净水效果的差异之后，实验进一步分析了K2FeO4预氧化耦合MIEX吸附在净水性能方面的协同效应。图5反映了两者在有机物总量去除方面的协同效应。K2FeO4-MIEX联合处理对DOC的去除率可达84.7%，比单独MIEX吸附提高了33.8%，比单独K2FeO4预氧化提高了49.4%，两者对DOC去除的协同系数为2.08，这说明两者在有机物总量消减方面具有显著的协同去除效应。在对芳香族化合物(UV254)的去除方面，K2FeO4-MIEX联合处理对UV254的去除率为89.2%，比单独MIEX提高了17.3%，比单独K2FeO4预氧化提高了36.2%，两者对UV254去除的协同系数为1.22，也表现出一定的协同去除效应。

    图 5  MIEX和K2FeO4对有机物去除效果
    Figure 5.  Removal of organic matters by MIEX adsorption and K2FeO4oxidation
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    2) K2FeO4和MIEX在亲疏水组分去除方面的协同性。图6反映了K2FeO4-MIEX联合预处理对水中亲疏水有机物组分的协同去除率。经过K2FeO4预氧化协同MIEX吸附处理以后，对每一种单一疏水组分、总疏水性有机物以及亲水性有机物的去除效果均有明显的提升，最明显的是对亲水性有机物的去除效果。联合处理去除率为87.6%，比单独MIEX吸附提高11.1%，比单独K2FeO4预氧化提高109.1%，对应的协同效应系数高达2.34。这是因为MIEX对亲水组分的去除率明显高于对疏水组分的去除率，而K2FeO4预氧化则能促使一部分疏水组分转化为亲水组分(图2)，更有利于MIEX的吸附去除。此外，联合预处理对弱疏水性有机物也表现出一定的协同去除效应，对应的协同效应系数为1.30，这可能是K2FeO4预氧化促使一部分疏水性组分向弱疏水性组分转化，而MIEX对弱疏水性组分的去除率又远高于K2FeO4的结果。

    图 6  MIEX和K2FeO4对亲疏水组分协同去除效果
    Figure 6.  Synergistic removals of hydrophilic and hydrophobic components by MIEX and K2FeO4
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    3) K2FeO4和MIEX在不同种类有机物去除方面的协同性。如图7所示，三维荧光光谱分析结果表明，K2FeO4-MIEX联合处理对五类有机物质的去除效果都较单独处理有一定改善，其中是对原水中主要成分Ⅴ类有机物的联合去除率改善最为明显，联合去除率高达77.3%，比单独MIEX吸附提高20.6%，比单独K2FeO4预氧化提高59.6%，对应的协同效应系数高达1.57。其次，联合预处理对MIEX和K2FeO4都不擅长去除的I类有机物也表现出一定的协同去除效应，协同效应系数为1.29。MIEX和K2FeO4对Ⅴ类和Ⅰ类有机物都表现出协同去除效应的原因可能有2点：一方面，类腐殖质和类酪氨酸类蛋白质都属于大分子质量有机物，MIEX对中小分子质量有机物去除率较高，但对大分子质量有机物去除率较差[7]；而K2FeO4预氧化可以把大分子质量有机物分解成为小分子质量的有机物，但很难完全矿化，所以去除率并不高[35]；但将两者联合时，K2FeO4可以先通过预氧化将这些大分子质量物质分解为中小分子质量的化合物，然后其再被MIEX吸附去除，所以联合预处理的效果较2种单独预处理方法均有明显改善。另一方面，K2FeO4预氧化的副产物会产生氢氧化铁，有微絮凝效应，但形成的絮体尺度很小，扫捕能力较弱[23]。当预氧化出水进入膜反应器与MIEX混合后，氢氧化铁微絮凝体在MIEX的微磁场作用下会发生磁絮凝效应，矾花尺度明显变大，这会使絮凝体对大分子物质的扫捕沉淀效果进一步加强[36]。

    图 7  K2FeO4-MIEX出水FRI分析
    Figure 7.  FRI analysis of effluent after K2FeO4-MIEX treatment
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    4) K2FeO4和MIEX对不同分子质量有机物的协同去除效应。图8反映了K2FeO4和MIEX联合预处理对不同分子质量有机物的去除效果。联合预处理对3个分子质量的有机物均较单独预处理有明显提高，联合去除率随分子质量由高到低依次达到了72.0%、90.2%和86.2%。协同效应结果表明，K2FeO4和MIEX在去除分子质量为0.2~1 kDa有机物时表现出了明显的协同效应，对应的协同效应系数为1.20。根据图4的结果可知，K2FeO4预氧化将大分子质量有机物转化为0.2~1 kDa的小分子有机物，而MIEX对分子质量0.2~1 kDa的有机物的去除效率最高，因此，K2FeO4和MIEX对这一分子质量的有机物表现出较好的协同效应。本实验所用原水中分子质量高于15 kDa的有机物几乎没有，进水中有机物分子质量分布整体偏低，这致使K2FeO4预氧化将大分子质量有机物转化为中小分子质量有机物的效果不是特别明显，导致K2FeO4和MIEX之间的协同效应系数比预期偏低，但这种协同去除效应的存在是毋庸置疑的。

    图 8  K2FeO4-MIEX处理前后水中有机物分子质量分布
    Figure 8.  Molecular weight distribution of organic matters before and after K2FeO4-MIEX treatment
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    3.   结论

    1)在微污染水源水净化实验中，MIEX吸附工艺对总有机物和芳香族类有机物的去除效果均好于K2FeO4预氧化工艺, K2FeO4-MIEX联合处理工艺效果较单独MIEX吸附工艺提高了33.8%，较单独K2FeO4预氧化工艺提高了49.4%，两种工艺在有机物总体去除方面表现出很好的协同效应。

    2) K2FeO4-MIEX联合处理工艺对类色氨酸类蛋白质有机物的去除效果均较单独处理有明显改善，其中，对腐殖酸类有机物的协同去除效果最为明显，协同去除效应系数高达1.57。此外，二者在类酪氨酸类蛋白质的去除方面也表现出较好的协同去除能力，在一定程度上弥补了两种单独工艺对类酪氨酸类蛋白质去除能力较弱的缺陷。

    3) K2FeO4预氧化工艺对疏水酸性和疏水碱性组分的去除率较高，同时增加了出水中的亲水性有机物含量；MIEX吸附工艺对亲水性组分的去除率明显高于疏水性组分，这使得K2FeO4-MIEX联合预处理工艺对亲水组分去除具有显著的协同效应，协同去除系数高达2.34。此外，二者在弱疏水性有机物的去除方面也有一定的协同去除效应，对应的协同效应系数为1.30。

    4)凝胶色谱结果表明，MIEX吸附工艺对小分子质量的有机物去除率最高，K2FeO4预氧化工艺在有效去除中等分子质量有机物的同时，又促进了原水中大分子质量有机物向小分子质量有机物的转化，使得K2FeO4-MIEX联合预处理工艺对分子质量为0.2~1 kDa的有机物表现出明显的协同去除效应。

  • 图 1  反应器驯化中正磷酸盐、乙酸钠、胞内糖原和PHA的单周期变化图及驯化期间MLSS和SVI变化

    Figure 1.  Single-cycle changes of orthophosphate, sodium acetate, intracellular glycogen and PHA during acclimation and changes of MLSS and SVI during acclimation

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    图 2  驯化期间门水平相对丰度分布变化

    Figure 2.  Variation of relative abundance distribution of gate level during acclimation

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    图 3  驯化期间属水平主要物种(>0.5%)相对丰度分布及驯化期间总GAOs的相对丰度变化

    Figure 3.  Distribution of relative abundance of main species (>0.5%) at genus level during domestication and relative abundance changes of total GAOs during domestication

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    图 4  反应器驯化前后的扫描电镜图

    Figure 4.  Scanning electron microscope images of the reactor before and after acclimation

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    图 5  聚糖菌反应器中糖原代谢通路

    Figure 5.  Glycogen metabolism pathway in GAOs reactor

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    图 6  驯化过程中糖原代谢主要基因的相对丰度变化

    Figure 6.  Changes in relative abundance of major genes in glycogen metabolism during domestication

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    表 1  本研究中的厌氧生化转化指标与PAOs和GAOs模型的比较

    Table 1.  Comparison of the anaerobic biochemical transformations indicators from this paper with the metabolic models for acetate uptake by PAOs and GAOs

    模型类型P/VFAGly/VFAPHB/VFAPHV/VFAPHA/VFA
    PAO模型[17]0.500.501.330.001.33
    GAO模型[18]0.001.121.360.461.85
    PAO-GAM[19]0.081.081.740.282.02
    本研究(43 d)0.0031.0361.9500.5182.468
    　　注：P/VFA为厌氧磷酸盐释放(以P计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；Gly/VFA为厌氧糖原消耗(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；PHB/VFA为厌氧PHB合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；PHV/VFA为厌氧PHV合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；PHA/VFA为厌氧PHA合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比。
    模型类型P/VFAGly/VFAPHB/VFAPHV/VFAPHA/VFA
    PAO模型[17]0.500.501.330.001.33
    GAO模型[18]0.001.121.360.461.85
    PAO-GAM[19]0.081.081.740.282.02
    本研究(43 d)0.0031.0361.9500.5182.468
    　　注：P/VFA为厌氧磷酸盐释放(以P计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；Gly/VFA为厌氧糖原消耗(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；PHB/VFA为厌氧PHB合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；PHV/VFA为厌氧PHV合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比；PHA/VFA为厌氧PHA合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比。
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    表 2  GAOs富集过程中属水平群落多样性的变化

    Table 2.  Changes of genus-level community diversity during the enrichment of GAOs

    多样性指数第1天第4天第16天第20天第39天第43天
    Simpson’s diversity0.990 30.988 60.991 40.993 50.992 70.993 0
    Shannon-Wiener0.204 00.219 70.193 90.161 30.065 50.069 6
    多样性指数第1天第4天第16天第20天第39天第43天
    Simpson’s diversity0.990 30.988 60.991 40.993 50.992 70.993 0
    Shannon-Wiener0.204 00.219 70.193 90.161 30.065 50.069 6
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-09-07
  • 录用日期:  2021-01-26
  • 刊出日期:  2021-05-10
杨艳平, 赵辰, 张纯纯, 王尚, 张朝晖, 高超, 曹卓松, 王景峰. 聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
引用本文: 杨艳平, 赵辰, 张纯纯, 王尚, 张朝晖, 高超, 曹卓松, 王景峰. 聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
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YANG Yanping, ZHAO Chen, ZHANG Chunchun, WANG Shang, ZHANG Zhaohui, GAO Chao, CAO Zhuosong, WANG Jingfeng. Rapid enrichment of glycogen accumulating organisms and analysis of community characteristics[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
Citation: YANG Yanping, ZHAO Chen, ZHANG Chunchun, WANG Shang, ZHANG Zhaohui, GAO Chao, CAO Zhuosong, WANG Jingfeng. Rapid enrichment of glycogen accumulating organisms and analysis of community characteristics[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(5): 1792-1802. doi: 10.12030/j.cjee.202009049
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聚糖菌快速富集方法的建立及群落特性分析

    通讯作者: 王景峰(1974—)，男，博士，研究员。研究方向：污水生物处理理论与技术。E-mail：wangjingfeng0116@163.com
    作者简介: 杨艳平(1995—)，女，硕士研究生。研究方向：环境工程微生物。E-mail：y18822036007@126.com
  • 1. 天津工业大学环境科学与工程学院，天津 300387
  • 2. 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津 300050
  • 收稿日期:  2020-09-07
  • 录用日期:  2021-01-26
  • 网络出版日期:  2021-05-23
基金项目:
国家自然科学基金面上项目(51678565)；后勤科研重大项目(AWS18J004)；天津市自然科学基金资助项目(19JCYBJC23800)

摘要: 为研究聚糖菌(GAOs)模型的群落结构及糖原相关功能基因的表达变化，通过厌氧末排水及磷限制条件的双重策略，建立快速、稳定的聚糖菌模型。应用宏基因组学技术测定了GAOs体系菌群结构的动态变化，并分析在驯化过程中糖原代谢通路关键功能基因的调节作用。结果表明，经过40 d左右的驯化，反应器呈现出典型的GAOs代谢模式，厌氧利用糖原吸收乙酸合成PHA，好氧消耗PHA补充糖原。稳定期的厌氧期糖原降解/VFA吸收、PHA合成/VFA吸收的值分别为1.036、2.468，与GAOs的化学计量学模型接近。宏基因组结果显示，反应器中包含Candidatus Contendobacter、Candidatus Competibacter和Candidatus Propionivibrio aalborgensis 3类GAOs，分别占细菌总数的7.13%、1.86%和0.20%，稳定期GAOs丰度增长为接种污泥的10.4倍左右。驯化过程对反应器内的糖原合成酶(glgA)和1, 4-α-葡聚糖分支酶(GBE1, glgB)等糖原代谢相关基因丰度有明显影响，且系统中同时存在糖酵解途径(glycolytic pathway)和ED途径(Entner-Doudoroff pathway)。以上结果从微观结构揭示了GAOs的富集过程菌群结构及糖原相关功能基因的作用，可为完善GAOs的代谢机理提供参考。

English Abstract

    全文HTML

  • 聚糖菌(glycogen accumulating organisms, GAOs)是强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal，EBPR)系统中一类重要的功能微生物，基于它们在好氧阶段合成糖原的特征，MINO等[1]将其命名为GAOs。聚磷菌(polyphosphate accumulating organisms，PAOs)是EBPR系统参与除磷的主要功能微生物。很多报道指出，GAOs在低磷等特定条件下会在EBPR系统中大量增殖，造成除磷效果的恶化[2-3]。有研究表明，GAOs与PAOs竞争进水有机质，但不参与磷酸盐的去除，从而造成EBPR系统性能的恶化[4-5]。GAOs对于实际EBPR系统的影响尚处于模糊阶段，而在正常运行的EBPR污水厂中可同时监测到GAOs和PAOs，因此，有研究者认为适量的GAO可能是有效进行EBPR的好迹象。寻求GAOs快速富集的手段不仅可以完善聚糖菌功能基因及代谢机理的研究，同时可为GAOs的开发利用提供依据。

    GAOs对于碳源利用的特殊性为高C/P有机废水的处理提供了新的思路和理论支撑。近年来，由于GAOs在有机废水中可以较高效率生产聚β-羟基烷酸脂(poly-β-hydroxyalkanoates，PHAs)[6-7]，并在反硝化过程中发挥重要作用，故受到了广泛关注[8]。因此，稳定聚糖菌模型的建立方法是后续GAOs研究的必要条件。目前，富集GAOs的方法主要有使用低P/C配水及梯度降低进水磷酸盐的浓度[9]。这2种构建GAOs体系的方式也存在一定弊端：一是驯化时间相对较长；二是有可能GAOs的富集比例达不到预期，影响后续实验内容[10]。因此，建立一种快速高效富集GAOs的方式对于GAOs功能特性的研究十分重要。由于微生物群落结构的组成对于活性污泥体系处理废水具有重要意义，更丰富的群落结构可增强系统抗冲击负荷能力，确保出水的水质指标达标，特定菌群的存在也可能与系统功能菌群存在相互作用，同样也会影响活性污泥的处理效果，所以GAOs富集过程的群落组成进行分析是必要的。

    本研究通过厌氧末排水及限制进水磷酸盐浓度的策略，在序批式反应器(sequencing batch reactor，SBR)中快速高效地富集了GAOs，通过宏基因组方法，分析了驯化过程中的群落演替特征、糖原代谢相关基因丰度变化，并进一步验证了该策略的可行性和有效性。

1.   材料及方法

    1.1.   实验装置与运行方式

  • 采用厌氧-好氧交替运行的SBR工艺，反应器有效容积为11 L，径高比为1/4，体积交换率约为68%。采用进水-厌氧搅拌-沉降排水-好氧曝气-闲置的特殊运行方式，以6 h为一个完整周期，每天运行4个周期。每个周期包含厌氧搅拌1.5 h，好氧曝气4 h，沉降时间随着运行实际状况从40 min逐渐调整至15 min。由可编程控制器PLC控制全周期的运行，采用潜水泵控制进水，电动搅拌器控制搅拌速率，好氧时微孔曝气头输送空气。

    • 1.2.   接种污泥及进水水质

  • 接种污泥来自天津市津沽污水处理厂二沉池，为回流污泥。接种时呈黑色细砂状，过筛(筛孔0.25 mm)后接种至上述反应器。由人工配水模拟实际废水，水中各种成分的质量浓度如下：反应器进水以乙酸钠为唯一进水碳源，维持在400~440 mg·L−1；以氯化铵为氮源，N-NH4Cl控制在40 mg·L−1；以磷酸二氢钾为磷源，P-KH2PO4控制在5 mg·L−1左右；其他营养盐有MgSO4·7H2O 50 mg·L−1、KCl 20 mg·L−1、CaCl2 20 mg·L−1、FeSO4·7H2O 0.1 mg·L−1、CuSO4·5H2O 0.1 mg·L−1、MnSO4 0.1 mg·L−1。

    • 1.3.   取样频率及分析方法

  • 根据实际运行状况，选取了第4、16、20、39、43天共5个时间点进行完整单周期指标的测定。测定了厌氧运行过程中第0、5、15、30、60、90分钟及好氧运行过程中第60、120、180、240分钟的水样指标及胞内储存物指标。

    乙酸钠采用高效液相色谱法[11]测定，正磷酸盐采用钼酸铵分光光度法测定，污泥浓度(MLSS)采用称量法[12]测定，污泥沉降比SV30采用国标法测定，PHA采用气相色谱法[13]测定，胞内糖原的测定通过先去除EPS再用热碱裂解和乙醇提取，最后用硫酸-蒽酮法[14]测定。

    扫描电镜样品预处理：取0.5 mL厌氧末污泥混合液于离心管中，1 500 r·min−1，4 ℃离心30 min，弃上清，加入5~10倍体积的2.5%戊二醛固定24 h左右，4 ℃条件下储存并避光。用磷酸缓冲液洗3次，弃上清；乙醇溶液梯度脱水，分别用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇依次脱水10~15 min，最后用无水乙醇脱水2次，每次10~15 min，弃上清，转移到1.5 mL离心管中，放置到真空冷冻干燥机干燥12 h以上。

    • 1.4.   高通量测序及数据分析

  • 测序样本选择每个取样周期的厌氧90 min，每次取样量5 mL，连续3个周期取样，记为3个平行的生物学重复样本，作为GAOs体系物种丰度鉴定的样本。测序的污泥样本放入超低温冰箱 (−80 ℃)暂存。测序工作委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

    测序流程可以概括为样本DNA提取和检测、文库构建和检测、测序和质控、信息学分析。经检测合格的文库采用 Illumina PE150 完成测序工作。测序获得的原始数据(raw data)去除接头信息，低质量碱基和未测出的碱基等干扰数据，获取用于后续分析的有效数据(clean data)。使用 MEGAHIT 组装软件进行组装分析(assembly analysis)，完成后进行基因丰度分析、物种注释等信息学分析。通过DIAMOND软件将genes 与各功能数据库中的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对。比对结果经过过滤后获得该序列的物种信息。采用 MetaGeneMark对各样本的 Scaftigs(≥500 bp)进行开放阅读框(open reading frame，ORF) 预测，去除冗余结果后进行功能基因聚类分析。

    • 1.5.   统计学处理

  • 使用SPSS 17.0软件进行数据处理，以P<0.05为具有统计学意义的差异。利用方差分析对实验中的标准曲线进行统计学推断，确定其准确性。单个周期的功能基因分析采用时间为单一影响因子的单因素方差分析。

2.   结果与讨论

    2.1.   SBR快速启动及运行特性

  • 自污泥接种后，通过43 d左右的驯化，反应器的乙酸盐、正磷酸盐、胞内糖原、PHA等指标单周期变化稳定，表现为典型的GAOs代谢特征。反应器驯化初期和基本稳定时的单周期运行情况如图1所示。驯化初期活性污泥浓度(MLSS)约为3 000 mg·L−1，SV30为(31±2)%，SVI为(110±3) mL·g−1，COD去除率低，相比于糖原代谢，磷酸盐代谢更加明显。运行第4 天，厌氧期磷酸盐释放量仅为1.658 mg·L−1(见图1(a))。由此可见，接种污泥中存在部分PAOs，但接种污泥中PAOs的比例较低或者其活性受到了进水中低浓度磷酸盐的限制；厌氧结束后，大部分正磷酸盐随出水排出，微生物可利用的磷酸盐迅速降低。故在好氧1 h后，反应器中的磷酸盐就已经被基本消耗完。反应器厌氧释放磷好氧吸磷的特性符合PAOs的典型特征。厌氧前5 min对乙酸的消耗最快，15 min后趋于稳定，厌氧期乙酸盐的去除率仅为42%。厌氧期磷酸盐的迅速释放和乙酸的迅速吸收并不同步，主要可能有两方面原因：一是接种污泥中PAOs并不占优势，乙酸的吸收主要由其他菌种完成；二是上一周期末反应器内残留的硝态氮可能在厌氧初期发生了反硝化作用，反应器中的反硝化细菌在缺氧条件下利用乙酸盐作为电子供体，硝酸盐氮为电子受体，生成了氮气，造成了乙酸的迅速消耗。而对于胞内糖原来说变化并不显著，未表现出GAOs所具有的典型厌氧消耗糖原、好氧糖原合成的特征。由此可见，GAOs或者说聚糖代谢的模式在驯化初期并不占主导。乙酸为有机质时，PHB和PHV为主要PHA产物[15]。本研究中PH2MV的含量极低，故以PHB和PHV之和为PHA进行讨论，驯化初期PHB基本维持在0.06~0.07 g·g−1。

    稳定期时，污泥浓度为约4 700 mg ·L−1，厌氧乙酸盐去除率可达100%(见图1(b)~(c))。该稳态期厌氧末乙酸盐的吸收速率有明显提升，可达到2.45 mg· (L·min)−1。反应器整体的胞内糖原含量在驯化约43 d后有了较大程度的增加，从0.06~0.07 g·g−1增加到0.8~0.13 g·g−1，糖原表现为厌氧消耗好氧合成，为典型的GAOs代谢特征。PHA的变化也验证了GAOs代谢的特征，厌氧乙酸吸收的同时PHB迅速增多，厌氧前30 min的PHB合成速率是PHV合成速率的5倍左右，且厌氧末PHB占PHA的80.68%。这种对于PHB的偏好性与乙酸为单碳源有直接关系[16]。厌氧期磷酸盐的释放量(以P计)仅为0.399 mg·L−1，由此可见，以聚磷分解供能的代谢途径已受到明显抑制。对稳定期单周期厌氧的胞内储存物与液相中有机物的转换进行计算，并与典型的PAOs、GAOs等模型进行对比后的结果如表1所示。考虑到进水初期水质的不均匀性等原因，故该指标的计算以5 min为起点；在厌氧60 min后可检测到部分乙酸盐，但90 min时已无法测到，故以厌氧60 min为计算终点。这样可保证在这55 min里GAOs的胞内合成和胞外有机物吸收是同时进行的，从而便于准确反映GAOs的代谢特征。与已报道的GAOs、PAOs及PAO-GAM模型进行比对，本研究中厌氧磷酸盐释放/VFA吸收、糖原降解/VFA吸收、PHA(包含PHB和PHV)合成/VFA吸收的结果更符合GAOs模型或者是糖原积累代谢(glycogen accumulating metabolism，GAM)的代谢模式。

    • 2.2.   聚糖菌体系群落结构分析

  • 为进一步验证GAOs在体系中的富集，通过宏基因组方法分析了驯化过程中微生物群落结构的变化。在门水平上(见图2)，GAOs和PAOs所在的变形菌门(Proteobacteria)一直保持丰度最高(大于50%)，其次分别是拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、酸杆菌门(Acidobacteria)、Candidatus Saccharibacteria、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Candidatus Peregrinibacteria、浮霉菌门(Planctomycetes)等。在驯化过程中变形菌门丰度相对稳定，维持在50.44%~56.36%。变形菌门是细菌中最为广泛的门，又分成5个纲。其中，PAOs和GAOs主要存在于α、β、γ这3个分支中。该分类下也包含了大量与固氮相关的菌，与生态系统中多种元素的循环密不可分。

    拟杆菌门主要包含3大类细菌，广泛存在于人和动物肠道、海洋等自然环境中，多数情况下对人体无害。在本实验活性污泥中亦检测到较高比例的这类细菌，其相对丰度逐渐提高，增加了57.53%。绿弯菌门和硝化螺旋菌门的丰度分别增加了7.51%和29.27%。硝化螺旋菌门的明显增加可能跟铵盐作为进水氮源有关。在门水平上说，在整个驯化期间物种丰富度及占比没有显著变化。

    在属水平上对驯化中的微生物群落组成进行了分析(见图3)。Thauera(陶厄氏菌属)在接种初期占主导地位，其次包含Candidatus Contendobacter (Ca. Contendobacter)、Nitrospira (硝化螺旋菌属)、Dechloromonas(脱氯单胞菌属)、Candidatus Accumulibacter (Ca. Accumulibacter)、Zoogloea、Candidatus Competibacter (Ca. Competibacter)等菌属。其中，Nitrospira是主要的硝化功能菌属，Ca. Accumulibacter是主要的聚磷菌。由此可见，SBR系统中微生物的生物多样性丰富，为污水生物处理奠定了良好基础。

    随着驯化的进行，反应器中相对丰度最高的属由陶厄氏菌属(Thauera)转变为Ca. Contendobacter。Ca. Competibacter的相对丰度也有明显提高。目前，已有报道的GAOs可以分为3类：第1类组成了Competibacteraceae科的大部分；第2类是一类发育地位与Defluviicoccus vanus 相近的细菌(简称Defluviicoccus)；第3类是“Candidatus Propionivibrio aalborgensis”(Ca. P. aalborgensis)。从系统发育角度看，Ca. Contendobacter、Ca. Competibacter都属于Competibacteraceae科。Ca. Contendobacter是MCILROY等[20]近年来在实验室规模的反应器中，利用宏基因组技术发现的一类新GAO。系统发育表明其归属于Competibacter-lineage的亚群5。Ca. Competibacter是研究最多，也是最常见的一类GAO，为反硝化聚糖菌研究中的主要对象。GAOs与PAOs间关系的研究也大多是在该菌主导的体系中进行[21-22]。此外，实验中监测到了微量Ca. P. aalborgensis，该菌占丙酸弧菌属(Propionivibrio)的90%左右，在驯化期间占比从总菌种的0.1%增加到了0.2%。它是近年来EBPR系统中新发现的GAO，与Ca. Accumulibacter 有密切的亲缘关系，属于β变形菌纲。组学数据表明它们具备GAOs特有的糖原及PHA代谢的功能基因[23]，已被广泛用于GAOs的判别中[24-28]。运行43 d后，Ca. Contendobacter和Ca. Competibacter在系统中的相对丰度分别增加至37.79%和10.03%，总GAOs增加了9.38倍。因此，该运行模式不仅可以高效快速富集GAOs，还可以富集多种GAOs。

    本研究中，GAOs成为优势种群有以下原因：一是由于乙酸盐作进水单碳源，而GAOs更偏好于乙酸作为碳源[29-30]；二是由于磷酸盐的限制，在进水中磷酸盐浓度较低，厌氧末排水的运行方式去除了液相中大部分磷酸盐，进入好氧曝气阶段后，PAOs可利用的磷酸盐极少，抑制了磷酸盐的吸收和聚磷的胞内合成，从而限制了PAOs的增殖；而GAOs可以充分调动胞内糖原和PHA为其生命活动供能，在系统中迅速增殖，并最终在群落中占主导地位。PAOs在该运行方式下未发生明显增殖，但并未完全消失，在磷酸盐受限的情况下依然可以保持活性。分析其原因，可能是部分PAOs调用胞内糖原进行GAM代谢造成[9, 31]。

    Simpson’s diversity 和Shannon-Wiener是2个用来反映样本中微生物多样性的指数，此处用于反映各样本的物种多样性随着富集过程的变化[32]。前者数值越小，表明样品物种多样性越高；后者则相反，数值越大，表明群落物种多样性越高。按照已有的计算公式[32]计算GAOs体系在不同驯化阶段的多样性指数。由Simpson和Shannon指数在驯化过程中的结果(见表2)可知，随着GAOs富集过程的持续进行，体系中物种多样性呈现先升高后降低、最终逐渐稳定的趋势。这与富集过程的变化是一致的，接种污泥接触新的人工合成废水后微生物群落多样性又有了一定程度的提高。由于实验的运行条件更有利于GAOs等微生物的生长，导致系统中生物多样性逐渐降低，并最终趋于稳定。

    为深入了解GAOs体系中微生物群落的形态，用扫描电镜对驯化前后的群落进行了高分辨率的形态学观察(见图4)。驯化前期(图4(a)~(b))活性污泥呈现松散的絮状结构，大量胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)的存在影响了单个菌的形态观察。驯化后，菌群形态变化明显，此时菌群分布紧密，有明显的小颗粒状态(图4(c)~(d))。本系统以球菌为主，短杆菌次之(图4(b))；此外，图4(d)中球菌趋于两两并列，类似杆菌的形态。由于GAOs为系统优势菌群，电镜中的球菌很可能就是GAOs。电镜照片中丝状菌很少，证明污泥沉降性能好，无明显的污泥膨胀现象，微生物之间的团聚主要依靠胞外聚合物的作用。

    • 2.3.   糖原代谢功能基因分析

  • GAOs是依据其在厌氧好氧交替系统中利用糖原的功能而定义的，胞内糖原是GAOs在系统中增殖的先决条件。对系统中糖原代谢相关的功能基因变化进行了统计和分析(见图5和图6)，主要包含糖原的分解合成以及糖原供能过程，糖酵解途径(embden-meyerhof-parnas pathway，EMP)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(entner-doudoroff，ED)途径分别以各自的特征性酶展开讨论。柱状图反映了在驯化期间6个时间节点的特征酶基因的变化趋势，所有的值都以接种污泥进行归一化处理，柱状图的纵坐标表示驯化过程中某特定基因相对于接种污泥的增减程度，纵坐标数值大于1表示该基因随着驯化逐渐增强，反之逐渐减弱。

    糖原合成过程中的酶主要包含3种，即葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶(glgC)、糖原合成酶(glgA)和1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE1, glgB)，统计学分析表明驯化对(GBE1, glgB)的影响最为显著(P=0.01)。随着驯化的进行，(GBE1, glgB)的功能基因丰度逐渐升高，在20 d达到最高，这与糖原的测定结果一致。统计学结果还表明，驯化对glgA有显著影响(P=0.049)，其变化与(GBE1, glgB)一致，但驯化过程对glgC无显著影响(P=0.068)。糖原分解过程主要涉及糖原磷酸化酶(PYG, glgP)，统计学分析表明，(PYG, glgP)对驯化过程有显著性响应(P=0.012)。

    葡萄糖的供能过程主要包括EMP途径和ED途径。葡萄糖激酶(glk)和果糖磷酸激酶(PFK, pfkA)催化的反应是EMP途径的限速步骤，驯化期间其变化趋势相似。前期随着反应器的运行glk和(PFK, pfkA)的相对丰度都呈现上升趋势，第20天左右达到峰值，然后趋于稳定。KDPG醛缩酶(eda)是ED途径的特征酶，因此，该基因的有无及表达对于了解GAOs糖代谢途径具有重要参考意义。柱状图表明，在驯化过程中eda的基因丰度呈先升高后稳定的趋势。统计学分析显示，glk、(PFK, pfkA)和eda的相对丰度变化受驯化过程的显著影响(P=0.019, P=0.011, P=0.003)。

    GAOs对于EMP和ED途径的选择一直是研究热点。由于1 mol葡萄糖单位的糖原经EMP和ED途径各净得3 mol和1 mol的ATP，因此，2个途径的选择会直接影响到GAOs的产能水平，进而影响到其有机物的吸收及生长增殖等。有研究表明，Ca. Contenbacter不含ED途径相关功能基因[20]，而有的Ca. Competibacter同时包含EMP和ED两种途径，因此，本实验中eda丰度的上调与Ca. Competibacter的增殖相关。

3.   结论

  • 1)在厌氧好氧交替运行的SBR反应器中，利用厌氧末排水及进水磷酸盐限制的策略快速富集到了GAOs，反应器呈现GAOs典型代谢模式。厌氧消耗糖原合成PHA，好氧利用PHA补充糖原。实验中厌氧VFA利用、糖原消耗及PHA合成的化学计量学与典型的GAOs模型有较高一致性。

    2)宏基因组测序的结果表明，GAOs在系统中快速富集。从属水平来说，Ca. Contendobacter、Candidatus Competibacter两类GAOs在体系中占主导地位，各占总菌群的7.01%和1.86%，且在该运行条件驯化过程中增殖速度较快。

    3)在驯化过程中，糖原合成酶(glgA)和1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE1,glgB)等糖原代谢相关的标志性基因相对丰度随GAOs丰度增加而增加。因此，这2个酶可作为系统中聚糖菌富集的标志物，用以判断GAOs富集的程度；此外，检测到的eda基因及变化表明，实验驯化的GAOs中同时存在EMP和ED途径进行供能。

参考文献 (32)

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