Effect of C/N on denitrification and N₂O release with glucose as the carbon source

本研究采用批次实验的形式，污泥取自在SBR内驯化并适应了以葡萄糖为碳源的反硝化污泥。通过沉淀、离心去除上清液，加入蒸馏水后再次进行沉淀、离心、去除上清液，将以上步骤重复至少3次，以确保污泥中无化学物质残留。MLSS和MLVSS分别为2.61 g·L⁻¹和2.42 g·L⁻¹，温度维持在22 ℃，使用3 mol·L⁻¹的HCl和3 mol·L⁻¹的NaOH调节pH至6.5。此外，实验前进水用氮气吹脱以去除DO。污泥经淘洗后，加入不含${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N和COD的原水混合均匀后，倒入500 mL的广口瓶中，随后将${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N和COD按实验要求分别配成浓缩液，在反应开始后，立即注射入广口瓶中，并将广口瓶置于磁力搅拌器上进行搅拌，转速为150 r·min⁻¹。

在${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N或${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N分别为电子受体的条件下，分别探究C/N为1.5、3、6.5、10和20时对反硝化脱氮及N₂O产生的影响。每隔10 min取水样，以检测反应器中${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N、溶解态N₂O，持续100 min。每次取样结束后向广口瓶中通入适量氮气以补充瓶内气压。

实验通过投加NaNO₃或者NaNO₂分别调节${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N和${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度为100 mg∙L⁻¹，投加不同量葡萄糖调节C/N为1.5、3、6.5、10、20。将${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N或${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N和葡萄糖按实验要求分别配成浓缩液，在反应开始后，立即注射入广口瓶中，实验具体运行条件如表1所示。

本实验中各污染物的检测指标均参考《水和废水监测分析方法》^[16]的方法进行：${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N采用紫外分光光度计法；COD采用重铬酸钾法；pH采用Five Go pH计进行测量；DO采用Multi 3620IDS溶解氧仪进行测量；MLSS和MLVSS采用重量法测定；溶解态N₂O采用岛津气相色谱仪GC-2014通过顶空平衡法进行测量。

反硝化反应过程^[17]如式(1)所示。

式中：Nar为硝酸盐还原酶(nitrate reductase)；Nir为亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase)；Nor为一氧化氮还原酶(nitric oxide reductase)；Nos为N₂O还原酶(nitrous oxidereductase)。

由式(1)看出，反硝化过程需要大量电子供给，而这些电子供体通常来源于外部的有机碳源，内部碳源(poly-β-hydroxybutyrate，PHB)以及死亡的细胞组织等^[18]，反硝化的进行将受限于溶液中的电子供体数目，因此，C/N是衡量反硝化系统运行情况的重要指标。

1) C/N=1.5时的反硝化的脱氮效果。当C/N为1.5时，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图1所示。以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，在100 min内，${\rm{NO}}_x^{\rm{ - }}$-N (=${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N+${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N)由100 mg∙L⁻¹降至67 mg∙L⁻¹，反硝化速率为8.81×10⁻³ g·(g·h)⁻¹。其中${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N由99.8 mg∙L⁻¹降至54 mg∙L⁻¹，平均降解速率为1.14×10⁻² g·(g·h)⁻¹；${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N由0.2 mg∙L⁻¹积累到13 mg∙L⁻¹，平均积累速率为3.17×10⁻³ g·(g·h)⁻¹。在反应过程中，N₂O不断积累达到最大值为1.79 mg∙L⁻¹，积累速率为0.45 mg·(g·h)⁻¹，峰值转化率为3.43%。

当C/N为1.5时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素的变化情况如图2所示。以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，在100 min内，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N由100 mg∙L⁻¹降至35.8 mg∙L⁻¹，反硝化速率为1.59×10⁻² g·(g·h)⁻¹。与以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的工况比较，在相同的C/N条件下，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的反硝化速率是${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N的1.95倍。这是因为，${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N作为电子受体参与反硝化时必须转化为${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N才能继续进行，且${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N作为电子受体时的消耗反应速度要优于${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N作为电子受体时的速度^[19]。N₂O最大积累量为2.62 mg∙L⁻¹，积累速率为1.63 mg·(g·h)⁻¹，峰值转化率为4.08%，且N₂O最大积累量、积累速率及峰值转化率均高于以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的情况。这说明以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体进行反硝化反应时N₂O的释放量高于以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N做电子受体进行反硝化反应时的N₂O释放量，主要是由于反硝化反应过程中浓度较高的${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N会抑制Nos酶的活性^[20]。这与吴光学等^[21]、翟晓峰等^[22]的研究结果一致。

2) C/N=3时的反硝化的脱氮效果。当C/N为3时，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图3所示。在以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，在100 min内，${\rm{NO}}_x^{\rm{ - }}$-N由99.6 mg∙L⁻¹降至43.5 mg∙L⁻¹，反硝化速率为1.39×10⁻² g·(g·h)⁻¹。其中${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N由99.2 mg∙L⁻¹降至26 mg∙L⁻¹，平均降解速率为1.81×10⁻² g·(g·h)⁻¹；${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N由0.4 mg∙L⁻¹积累至17.5 mg∙L⁻¹，平均积累速率为4.24×10⁻³ g·(g·h)⁻¹。在反应过程中，N₂O不断积累达到最大值，为2.42 mg∙L⁻¹，较C/N为1.5时高，N₂O积累速率为0.60 mg·(g·h)⁻¹，N₂O峰值转化率为4.32%。

当C/N为3时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图4所示。以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，在100 min内，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N由96 mg∙L⁻¹降为0 mg∙L⁻¹，反硝化速率为2.38×10⁻² g·(g·h)⁻¹，N₂O最大积累量为10.53 mg∙L⁻¹，积累速率为5.22 mg·(g·h)⁻¹，峰值转化率为10.97%。虽然以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，N₂O的最大积累量较高，但此时并非最终结果，随着反应进程的推进，N₂O被还原被N₂，TN(以${\rm{NO}}_x^{\rm{ - }}$-N计)被完全去除，反硝化过程进行地较为充分。

与C/N为1.5时所得的结果相似，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的反硝化速率以及N₂O的积累量、积累速率及峰值转化率均高于以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时的情况。随着C/N的提高，此时各C/N下的反应速率均高于C/N为1.5时。这主要是由于碳源的增加提供了更多的电子受体，促进了反硝化过程的进行，而N₂O积累量的增加除了与反硝化过程中各种酶之间的电子竞争^[21]有关，也与葡萄糖^[23]相对复杂的代谢过程有关。

3) C/N=6.5时的反硝化的脱氮效果。当C/N为6.5时，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图5所示。在以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，100 min内，${\rm{NO}}_x^{\rm{ - }}$-N由101.2 mg∙L⁻¹降至19.5 mg∙L⁻¹，反硝化速率为2.03×10⁻² g·(g·h)⁻¹。${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N去除率达到100%，平均降解速率为3.09×10⁻² g·(g·h)⁻¹。${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度先升高后降低，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的积累速率和降解速率分别为1.48×10⁻² g·(g·h)⁻¹和1.97×10⁻² g·(g·h)⁻¹，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度的最大积累值为43.3 mg∙L⁻¹，截至反应进行到100 min时，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度降至19.5 mg∙L⁻¹。N₂O的最大积累量为5.01 mg∙L⁻¹，积累速率为1.24 mg·(g·h)⁻¹，峰值转化率为6.14%。

当C/N为6.5时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图6所示。在以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，在反应进行的100 min内，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N由98 mg∙L⁻¹降为0 mg∙L⁻¹，反硝化速率为4.05×10⁻² g·(g·h)⁻¹。N₂O最大积累量为17.29 mg∙L⁻¹，积累速率为14.29 mg·(g·h)⁻¹，N₂O峰值转化率为17.64%。与C/N为1.5和3时相似，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时的反硝化速率以及N₂O的积累量、积累速率及峰值转化率均高于以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时的情况。

4) C/N=10时的反硝化的脱氮效果。当C/N为10时，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图7所示。以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化脱氮率达到100%，反硝化速率为2.45×10⁻² g·(g·h)⁻¹，${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N的平均降解速率为4.89×10⁻² g·(g·h)⁻¹。${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度先升高后降低，前50 min内，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度上升至50.4 mg∙L⁻¹，之后随着${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N浓度的耗尽；在后50 min，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度下降至0 mg∙L⁻¹，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的积累速率为2.50×10⁻² g·(g·h)⁻¹。N₂O积累量先增加后减少，在前40 min内，N₂O浓度达到最大积累值10.36 mg∙L⁻¹，之后N₂O浓度开始下降；截至100 min时，溶液中N₂O浓度减少为1.02 mg∙L⁻¹。N₂O积累速率为6.42 mg·(g·h)⁻¹，N₂O峰值转化率为10.49%。

当C/N为10时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图8所示。在以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度由95.6 mg∙L⁻¹迅速被完全降解，平均降解速率为5.92×10⁻² g·(g·h)⁻¹。溶液中N₂O浓度先增加后减少，于20 min时达到最大积累值28.20 mg∙L⁻¹，积累速率为34.96 mg·(g·h)⁻¹，峰值转化率为29.49%。与C/N为1.5、3和6.5时相似，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时的反硝化速率以及N₂O积累量、积累速率及峰值转化率均高于以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的情况。

5) C/N=20时的反硝化的脱氮效果。当C/N为20时，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图9所示。以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化脱氮率在反应进行的80 min内达到100%，反硝化速率为3.25×10⁻² g·(g·h)⁻¹，${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N在40 min内被降解完毕，平均降解速率达到6.15×10⁻² g·(g·h)⁻¹。${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度先升高后降低，在前40 min内，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度上升至55.2 mg∙L⁻¹，之后${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度下降至0 mg∙L⁻¹，反应在80 min内基本结束。${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的积累速率为3.07×10⁻² g·(g·h)⁻¹。N₂O浓度先增加后减少，在反应开始后的40 min时，N₂O浓度达到最大积累值18.27 mg∙L⁻¹，之后N₂O浓度开始下降；截至100 min时，溶液中N₂O浓度减少为0.12 mg∙L⁻¹。此条件下，N₂O积累速率为11.32 mg·(g·h)⁻¹，N₂O峰值转化率为17.43%。

当C/N为20时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中各氮素变化的情况如图10所示。以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的条件下，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N浓度由97.8 mg∙L⁻¹被迅速完全降解，平均降解速率为8.08×10⁻² g·(g·h)⁻¹。溶液中N₂O浓度先增加后减少，于20 min时达到最大积累值40.27 mg∙L⁻¹，积累速率为49.92 mg·(g·h)⁻¹，峰值转化率为41.17%。

随着C/N的增加，在不同电子受体情况下脱氮效率均有所升高，这说明低C/N条件限制了反硝化过程的进行。而且，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的反硝化效果比以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的反硝化效果差。当C/N为3、以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，产生的N₂O在达到峰值后呈下降趋势，说明反硝化进程在N₂O到达峰值后并未结束。但由于系统碳源不足，反硝化进行的不够充分，N₂O在反应结束后并未完全降解。通过对比以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体，C/N为6.5、10、20时的N₂O浓度，均呈现达到峰值后下降的趋势，并且产生峰值的时间随C/N的升高而缩短，N₂O均反应完全。此趋势在以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体，C/N为10、20时也同样出现。主要是由于C/N的升高促进了系统的反硝化进程和N₂O的降解。但是由于${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N作为电子受体参与反硝化时必须转化为${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N才能继续进行，导致以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体出现此现象滞后于${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N，碳源不足导致了其反应速率的滞后。

而在相同实验条件下，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的反硝化过程速率分别是以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体反硝化速率的2、1.7、2.05、2.46、2.53倍，与理论值1.67倍不符。这说明，${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N的还原速率在反硝化过程中受到了抑制，亦可以说以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体还原时受抑制的程度高于以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时受抑制的程度。MA等^[24]认为，在反硝化过程中会产生一定的FNA，而FNA对反硝化菌的活性有抑制作用^[25]。在本研究中，在${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体被还原的过程中，当C/N为1.5~20时，FNA最大值由0.01 mg·L⁻¹上升至4.25×10⁻² mg·L⁻¹；在${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体被还原的过程中，FNA最大值在0.074~0.077 mg·L⁻¹内。有研究^[26]表明，硝酸盐还原在FNA浓度为0.01~0.025 mg·L⁻¹时，硝酸盐还原能力受抑制程度达到60%；同时，污泥亚硝酸盐还原能力也受到FNA的限制，当FNA浓度由0.01 mg·L⁻¹上升至0.2 mg·L⁻¹时，亚硝酸盐的还原能力下降80%。相对于Nir酶而言，Nar酶对C/N的变化更敏感。这也从另一个角度证明了：以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，随着C/N的增加，Nar酶因竞争电子的能力比Nir酶要强，从而导致${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的浓度积累随着C/N的增加而升高。随着C/N的上升，加剧了FNA的积累以及各还原酶间的竞争^[27]，进而导致了反硝化过程被抑制以及N₂O的释放。

在不同C/N条件下，当以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程的${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N的降解速率和N₂O的最大积累值变化情况如图11所示。在不同C/N条件下，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，反硝化过程中${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的降解速率，N₂O的最大积累值、FNA最大值变化情况如图12所示。由图11和图12可见，N₂O的积累值均随着C/N的增加而增加。这可能是因为随着C/N的增加：一方面，各反硝化酶的电子消耗率差异拉大，使得更多的${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N被快速向${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N和N₂O转化，增加了N₂O的来源；另一方面，溶液中${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N积累值增加，使得FNA浓度升高，进而会抑制Nos酶活性^[28-29]，导致N₂O得不到及时降解而造成积累^[30-31]。

王莎莎等^[32]在探究不同电子受体在反硝化过程中N₂O的产量时，发现在${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N反硝化过程中N₂O的含量是硝酸盐反硝化中的9.12倍。ALINSAFI等^[33]认为，反硝化过程中亚硝酸盐的大量积累抑制了Nos酶的活性，导致大量N₂O的产生。张兴兴等^[27]指出，FNA对Nos酶的抑制浓度为0.001 5~0.002 5 mg·L⁻¹。反应初期${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的大量投加，FNA对Nos酶产生了抑制效果，反硝化以N₂O为主要终产物；随着反应进行，FNA浓度逐渐降低，将N₂O还原为N₂。而随着C/N的升高，N₂O的峰值亦逐渐上升。C/N的升高为反硝化提供了更多的电子，${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的还原速率亦随之升高，导致N₂O的积累量升高。

而在相同的C/N条件下，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N或${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N分别作为电子受体时，前者的反硝化脱氮速率和N₂O产生量均比后者小。以C/N=1.5为例，分析其原因有2点：一方面，相对于${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时溶液中FNA浓度变化更大，分别为0~0.010 0 mg∙L⁻¹和0~0.073 8 mg∙L⁻¹，本实验中药品在反应开始前一次性投加，而${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的瞬时投加会导致其在系统中的积累，使${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N和水中的H⁺反应产生FNA，使反硝化过程中的Nos酶活性被抑制，从而促进了N₂O积累量的上升；另一方面，相对于${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时Nir酶和Nos酶电子排布落差更大。在反硝化过程中，碳源氧化与氮氧化物还原关联紧密，碳源氧化产生的电子被各氮氧化物还原酶利用，从而使各氮氧化物被还原。有研究^[34-35]表明，在还原过程中，各氮氧化物还原酶同时存在着电子竞争的关系，被优先还原的氮氧化物竞争电子的能力优于后被还原的氮氧化物，反硝化过程中4种酶的竞争导致了N₂O的积累。因此，可能的原因之一是：由于Nir酶竞争电子能力强于Nos酶，在没有${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N存在时，Nar酶不参与竞争电子，Nir酶能获得绝大部分电子；而${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N存在后，Nar酶优先参与竞争电子，使得流向Nir酶和Nos酶的电子总量很少^[35]，这大大削弱了Nir酶与Nos酶竞争电子之间存在的优势，故Nir酶和Nos酶之间电子排布的落差要小于${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N不存在的情况，因此，当${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，更多N₂O因没有足够电子而未能被Nos酶还原为N₂。

对于C/N对N₂O释放量的影响，目前有不同的研究结论。有研究^[36-37]表明，以乙酸钠为碳源时，随着C/N的增加，反硝化速率随之上升，而N₂O的产量呈下降趋势。以葡萄糖为碳源时，N₂O的产量随着C/N的增加而升高^[38-39]。以葡萄糖为碳源时，无论电子受体是${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N或${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N，系统中N₂O的峰值产量均随C/N值的增加而增加。这主要是因为，相比于乙酸钠，葡萄糖作为较复杂的有机物，需要经过2个氧化过程才得以降解：首先反硝化细菌将其氧化得到丙酮酸和ATP；然后，丙酮酸进入三羧酸循环时被丙酮酸脱氢酶复合物转化为乙酰辅酶A^[23]，在无氧条件下，丙酮酸在乙酰辅酶A的作用下无法完全氧化，最终转化为乙醇，仍需进一步降解方能被异养菌吸收利用^[40]。代谢过程越复杂，反硝化速率也就越慢，从而导致${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N的累积。同时，有机物质在反硝化过程中不仅要参与氧化，还要部分转化为细胞物质。不同物质转化为细胞物质的比例不尽相同。一般来说，单碳化合物的生长量比较低^[9]，这样对细胞生长造成阻碍，使其有更多的能量用来脱氮，葡萄糖作为高碳化合物，微生物生长量要高于醇类。此外，也有研究^[41]表明，以葡萄糖驯化培养出的反硝化污泥中含有大量Comamonadaceae种属，其主要基因Brachymonas会促使反硝化过程产生大量的N₂O。而以乙酸钠为碳源进行反硝化时，Thauera是系统中的主要反硝化基因^[34]，其所含的的NosZ基因能够将N₂O还原为N₂。为了达到污水脱氮过程中高效脱氮和N₂O回收利用的目的，通过增加其产生量以回收利用，例如SCHERSON等^[5-6]提出的CANDO(coupled aerobic-anoxic nitrous decomposition operation)工艺就获得了很高的N₂O转化率和能源回收率。

综上所述，以葡萄糖为碳源的反硝化系统中，尽管随着C/N的增加，反硝化速率有所增加，但是，会产生更多的峰值N₂O。这一方面是由于反硝化菌对葡萄糖特殊的代谢过程导致的，另一方面是由于葡萄糖对反硝化菌群落结构的改变所导致的。系统中含有的大量与N₂O生成相关的基因，FNA浓度的积累、反硝化酶之间的电子竞争可能是导致N₂O大量产生的原因。当然，在碳源充足的情况下，这些N₂O如果没有被释放到大气中，最终也将会被完全还原。因此，如果需要减少其排放，应该设法避免水中溶解的N₂O吹脱到大气中；如果需要回收与利用N₂O，需要朝相反的方向努力。

1)在相同C/N条件下，相对于以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体而言，以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体的反硝化系统中产生的N₂O量更少。

2)以${\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，随着C/N的增加，在5种C/N下峰值N₂O转化率逐渐升高，分别为3.43%、4.32%、6.14%、10.49%和17.43%；反硝化速率由8.81×10⁻³ g·(g·h)⁻¹升至3.25×10⁻² g·(g·h)⁻¹。

3)以${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$-N为电子受体时，随着C/N的增加，在5种C/N下峰值N₂O转化率逐渐增大，分别为4.08%、10.97%、17.64%、29.49%和41.17%；反硝化速率由1.59×10⁻² g·(g·h)⁻¹升至8.08×10⁻² g·(g·h)⁻¹。