实验底泥取自长沙市某污水处理厂，过筛处理除去大颗粒固体杂质，提高污泥均质性。实验接种污泥为实验室厌氧发酵装置长期驯化的种泥，装置以剩余污泥为底物，培养温度为37 ℃，pH控制在7.00±0.10，实验开始前，装置运行已达稳定。实验底泥及接种污泥的各项理化性质如表1所示。PS微塑料外观为白色粉末，平均粒径为50 μm；OFL化学式为C₁₈H₂₀FN₃O₄，纯度>98%，使用前储存于2~8 ℃条件下。

1)生化甲烷势(BMP)实验。为分别考察PS微塑料及OFL的单一污染和复合污染2种条件下对污泥厌氧消化的影响，本研究设置单一OFL组、单一PS微塑料组以及复合组3种实验条件。单一OFL组仅投加OFL作为污染物，OFL质量浓度分别为50与500 mg∙L⁻¹，即R1(OFL50)、R2(OFL500)组；单一PS微塑料组仅投加PS微塑料作为污染物，PS微塑料质量浓度分别为50与100 mg∙L⁻¹，即R3(PS50)、R4(PS100)组；复合组内同时投加PS微塑料与OFL，其中PS微塑料质量浓度固定为100 mg∙L⁻¹，而OFL质量浓度分别为50与500 mg∙L⁻¹，即R5(OFL50-PS100)、R6(OFL500-PS100)组。另设未添加污染物的对照组，即R0组。生化甲烷势(Biochemical Methane Potential， BMP)批式实验在全自动甲烷潜力测定仪(AMPTS II， Bioprocess Control)中开展。AMPTS II提供的厌氧培养瓶有效容积为400 mL，实验底泥和接种污泥投加量分别为75和225 mL。反应开始前，将污泥与污染物充分混合后，加入PBS缓冲液。通入氮气5 min排除顶空空气，创造无氧环境。实验过程中采用水浴装置全程控制温度在(37±1) ℃，搅拌器持续工作保持物料均匀混合。产气终点以反应器连续3 d日产量不足累积产量的1%作为指示^[10]。

2)厌氧消化阶段模拟实验。本研究设置4组模拟实验以考察在污染物介入下厌氧消化增溶、水解、产酸、产甲烷4个代谢过程的变化。增溶实验以新鲜污泥为消化底物，通过溶解性化学需氧量(SCOD)的质量浓度考察有机物的溶出程度；水解实验以含牛血清蛋白(BSA)的合成废水为底物，等量代替BMP实验中的实验底泥，观察3 d后BSA降解率；产酸实验通过投加定量谷氨酸、葡萄糖分别模拟蛋白和糖类底物，测定其产物即挥发性脂肪酸(VFAs)产量；产甲烷实验采用乙酸钠作为底物，测定甲烷产量。为保持微生物的正常代谢，合成废水成分主要有：1.0 g∙L⁻¹ KH₂PO₄、0.6 g∙L⁻¹ MgCl₂·6H₂O、0.4 g∙L⁻¹ CaCl₂以及1.0 mL∙L⁻¹微量元素储备液(含Fe²⁺、Co²⁺、Zn²⁺等)。除产甲烷实验外，其余3组实验均添加10 g∙L⁻¹甲烷抑制剂2-溴乙烷磺酸钠，阻断有机物向甲烷的转化，其余操作与BMP实验保持一致。

BMP实验产气量由AMPTS Ⅱ仪器自动进行计量。实验进程中定期取样，对样品做8 000 r∙min⁻¹离心、0.45 μm过滤处理后，测定其相关理化指标。COD采用消解分光光度法^[11]测定；可溶性蛋白和多糖的测定方法分别为Folin-Lowry法^[12]和蒽酮硫酸法^[13]；VFAs的测定采用气相色谱法(7820A，Agilent Technologies)^[14]；胞外聚合物(EPS)采用热提取法^[15]；溶解性有机物(DOM)及EPS组分结构的测定采用三维荧光法(Horiba Aqualog，HORIBA Scientific)。

采用修正Gompertz模型^[16]评估厌氧消化性能，进一步讨论2类污染物的作用机制。BMP实验结束后，将采集到的产甲烷数据导入Origin软件进行拟合。修正Gompertz模型如式(1)所示。

式中：P为累积甲烷产量，mL∙g⁻¹(以单位VS的产量计)；P_m为最大产甲烷潜力，mL∙g⁻¹；R_m为最大产甲烷速率，mL∙(g∙d)⁻¹(以单位VS在单位时间内的产量计)；λ为滞后期，d；t为反应时间，d；e取2.718 3。

16S rRNA测序工作委托第三方进行，细菌与古菌的测序引物分别为338F-806R与524F10extF-Arch958RmodR。BMP实验结束后，采集R0、R2、R4及R6组的样品，考察其细菌与古菌群落变化。

1)单一污染对累积甲烷产量的影响。图1(a)所示为R0、R1、R2的累积甲烷产量(以单位VS的甲烷产量计)。运行初期，各组立即表现出不同的增长速率。50 mg∙L⁻¹ OFL反应初期对产气量影响较小，后期抑制作用逐渐增强，而500 mg∙L⁻¹ OFL条件下自初期就呈现出较强的抑制。至反应结束时，R1累积产量较对照组降低了15.95%(P<0.05)，R2产气量于第18 d不再显著增加，最终产量与对照组相比显著降低了81.36%(P<0.05)。可见，OFL抑制了甲烷产量，且随着OFL质量浓度的提升，抑制逐渐增强。

由图1(b)中甲烷累积产量增长趋势可以发现，反应初期PS微塑料的存在会提升甲烷产生速率，而运行20 d后甲烷产量增长趋势逐渐平缓。反应结束时，R3和R4甲烷累积产量较对照组分别降低了5.78%和4.25%。可见，PS微塑料在一定程度上会造成产甲烷能力的下降，但其胁迫作用未随投量的增加而明显增强。在厌氧消化进程中，一些尺寸微小的污染物，如PVC微塑料^[5]、纳米零价铁^[17]等，被证实可有效促进污泥的增溶或水解，以缓解限速步骤对产气的影响，这也可能是PS微塑料对初期产气量具有轻微促进作用的原因。然而，PS微塑料的毒性也不可忽视。有研究发现，PS微塑料会刺激EPS的蛋白二级结构和表面官能团发生改变^{[18, 19]}，也会引起微生物群落的变化^[3]。如图1(b)所示，实验后期PS微塑料的生物毒性逐渐占主导地位，故导致了产气量增长的滞缓以及累积产量的降低。

2)复合污染对累积甲烷产量的影响。图1(c)为PS微塑料与不同质量浓度OFL复合污染下甲烷产量随反应时间的变化。至反应结束时，R5与R6的总产气量较对照组均显著降低(P<0.05)。将R5与R1的甲烷产量增长趋势进行对比发现，加入100 mg∙L⁻¹PS微塑料后甲烷产量增速有所变缓；100 mg∙L⁻¹ PS微塑料与500 mg∙L⁻¹ OFL复合作用时，R6产气量自第11 d起未见明显增长，与其对应单一条件组R2与R4对比，产气停止时间有所提前。上述实验结果表明，在厌氧消化产甲烷过程中2种污染物具有联合胁迫作用，但在不同复合条件下，协同抑制作用具体表现略有不同：低浓度抗生素复合PS微塑料主要会引起产气速率的降低，而高浓度抗生素与PS微塑料的复合则会导致反应提前终止。

3)厌氧消化产甲烷动力学分析。通过数据拟合可获得最大产甲烷潜力(P_m)，最大产甲烷速率(R_m)和滞后期(λ)3个重要参数，拟合结果如表2所示。在所有条件下，滞后期λ值均为0 d，这说明实验接种的微生物性能良好，能迅速适应环境并利用有机质^[20]。在不同质量浓度OFL的作用下，R1和R2组的P_m和R_m较对照组均有所降低，进一步说明OFL会抑制厌氧消化产甲烷。投加PS微塑料后，R_m拟合值较对照组有所增长，符合R3与R4前期产甲烷速率略高于对照的结果。与此同时，相比于R1，R5组的R_m下降了27.5%。这与图1(c)中R1与R5组产气量增长趋势的差异相一致。

厌氧消化过程中SCOD的变化是溶出与消耗2个进程共同进行的动态结果。如图2所示，R0的SCOD持续降低。可见，微生物能迅速参与污泥分解和有机物降解，保证了甲烷化过程的稳定性。R1和R2中出现了SCOD升高的现象。这表明，OFL的存在不利于消化过程中有机物的降解。R4组SCOD在第3 d有所升高，随后迅速降低。这说明，R4前期有机物溶出速率大于消耗速率。将各组反应后期的SCOD进行对比可以发现，单一OFL组(R1与R2)有机物降解的能力明显弱于单一PS微塑料组(R3与R4)。此外，复合组在10 d到20 d内SCOD积累效应加剧。这意味着，复合条件下有机物转化利用效率较单一组进一步降低，对消化过程产生不良影响。

为进一步探讨DOM的组分变化，通过三维荧光技术对R0、R2、R4、R6反应器内第3 d样品进行了测定。采用Chen提出的区域积分法(FRI)^[21]，将三维荧光区域分为5个区，分别表示不同类型的有机物：区域Ⅰ(Ex/Em=200-250/250-330)表征酪氨酸类物质、区域Ⅱ(Ex/Em=200-250/330-380)表征色氨酸类物质、区域Ⅲ(Ex/Em=200-250/380-600)表征富里酸类物质、区域Ⅳ(Ex/Em=250-600/250-380)表征溶解性微生物代谢产物、区域Ⅴ(Ex/Em=250-600/380-600)表征腐殖质类物质，并根据分区计算不同类型物质荧光响应百分比P_i,n值。如图3所示，R0中峰A的荧光强度最高，而在R2、R4、R6中荧光强度均有所下降，各污染组中区域IV的P_i,n也呈现出降低趋势(表3)。这说明，2种污染物会降低微生物可利用的有机物的相对含量。相较R0，R2与R6中新增峰B与峰C，且区域Ⅲ、Ⅴ的P_i,n随污染物的添加同步增长。此外R6中峰B和峰C的荧光强度在R2基础上有所增强，且R6中峰C在Em方向上出现红移。这表示，R6中腐殖质类物质的荧光团浓度及其特定官能团有所增加^[22]，而富里酸与腐殖质类物质的积累不利于生物降解^[23]。可见，在复合条件下溶解性有机物在结构上明显趋于难降解，这也是造成产甲烷性能低下的潜在原因之一。

1)对增溶阶段的影响。增溶阶段的代谢过程主要表现为有机物的溶出，通过图4(a)中各组第3 d SCOD的质量浓度考察单一及复合污染对这一阶段的影响。如图4(a)所示，R1与R2反应器SCOD质量浓度显著低于对照组(P<0.05)。可见，OFL会降低可溶性有机质的释放。相较之下，PS微塑料对增溶阶段的影响较弱，与对照组相比，R3与R4抑制率分别仅有3.81%和8.37%(P<0.05)。复合污染情况下存在协同作用，R5与R6较对照组抑制率增加至44.36%和55.66%。基于2种污染物对增溶阶段的单一影响，可以看出，在复合污染下OFL的抑制作用处于主导地位，PS微塑料的加入强化了OFL在增溶阶段的抑制作用，对污泥结构的转化和可溶性物质的溶出造成影响，严重限制后续阶段的反应。

2)对水解阶段的影响。在水解阶段，微生物将大分子复杂底物分解成为小分子有机物，图4(b)显示了第3 d各组牛血清蛋白(BSA)的降解率。OFL降低了BSA的降解率，且抑制作用随着投加量的增加而呈递增趋势。外源污染物的存在会造成微生物部分代谢功能(如水解酶代谢)紊乱^[6]，或者酶与底物碰撞结合的概率降低^[24]，从而抑制水解底物的降解。不同于单一OFL组，含PS微塑料的R3和R4组BSA降解率略高于对照组。基于OFL的强抑制作用，加入PS微塑料之后，R5的BSA降解率较R1降低了10.63%(P<0.05)。这表明，低浓度OFL与PS微塑料复合加强了OFL对水解的抑制效果。然而，相较R2，R6中BSA降解率提高了18.19%。其原因可能是，PS微塑料强大的吸附能力削弱了高浓度OFL在厌氧体系中的扩散与分布，减少OFL与微生物或水解酶之间的直接接触，一定程度上维持了水解过程的正常进行^[25]。

3)对产酸阶段的影响。产酸模拟实验以谷氨酸、葡萄糖为底物，考察了发酵4 d后系统内VFAs质量浓度的变化。乙酸、丙酸和丁酸等主要产物均按比例换算为单位体积的COD来计算总VFAs质量浓度，以考量底物的转化情况。如图4(c)所示，VFAs生成量随着OFL投加量逐渐增加而明显下降。这表明，OFL对产酸阶段具有抑制作用。相较对照组，50和100 mg∙L⁻¹ PS微塑料对产酸过程的抑制率分别为1.68%(P>0.05)和8.18%(P<0.05)。ZHANG等^[26]统计了5 μm PS微塑料对葡萄糖降解率的影响，发现50~200 mg∙L⁻¹ PS微塑料未显著影响产酸，当质量浓度达250 mg∙L⁻¹时，降解率较对照组下降了3.81%。这表明，较低剂量的PS微塑料可能不足以抑制产酸。此外，复合污染对产酸活动的抑制更为明显，尤其是R6，在第4 d仍然检测不到VFAs的生成。这表明，复合条件下抑制程度加剧，致使氨基酸、葡萄糖等小分子有机物无法有效转化成产甲烷菌可利用的底物，从而影响体系的能源利用和转化效率。

4)对产甲烷阶段的影响。如图4(d)所示，产甲烷阶段模拟实验进行了10 d。在提供充足乙酸钠为底物的情况下，R1与R2甲烷产量较对照组显著下降(P<0.05)，可见OFL会阻碍乙酸盐的转化。而在单一PS条件下，R3与R4甲烷产量与对照组相比未见显著性差异(P>0.05)。这说明，产甲烷微生物受PS微塑料的影响相对较小。在复合条件下，R5组产甲烷阶段的效率较R1降低了6.68%，该阶段效率的下降也是导致BMP实验中R5产甲烷速率低于R1的原因之一。产甲烷菌易受外界环境的影响，多项研究也证明有毒污染物会严重影响产甲烷菌的生长代谢情况^[2]。因此，根据单一OFL组与复合组中产甲烷阶段效率的下降推测，对应条件下产甲烷功能微生物的生长代谢水平可能受到了限制。

EPS的分泌是微生物防御有毒侵害的关键机制之一。由图5可看出，两类污染物均刺激了EPS的分泌，随着投加量的增长，EPS质量浓度(以单位体积COD计)也在增加。单一条件下，R1、R2组中2类EPS质量浓度均高于R3、R4组。这表明，OFL较PS微塑料具有更强的毒性。将复合组与单一OFL组进行对照发现，R5的EPS总质量浓度与R1基本相当(P>0.05)，R6较R2则显著提高了7.03%(P<0.05)。这表明，高浓度OFL条件下生物毒性复合效应更强。

污染物在到达细胞体之前需要穿过EPS层，通过三维荧光检测不同EPS的组分变化可以大致揭示不同污染条件对微生物的潜在毒性威胁。如图6(a)~图6(h)所示，R2和R6组中峰A、峰B的荧光强度及对应I区+II区的P_i,n值均明显低于对照组，即其中可生物降解物质的相对含量有所降低。基于表4，R4中Ⅲ区与Ⅴ区的P_i,n值与对照组基本相当，而投加了OFL的R2与R6组中富里酸类物质(Ⅲ区)与腐殖质类物质(Ⅴ区)的相对含量高于对照，且这2组中新增了峰E与峰F，可见EPS中富里酸类与腐殖质类物质的增加与OFL有直接关系。EPS中的腐殖质通常来源于自身分泌与环境吸附，与蛋白质和多糖不同，腐殖质难以生物降解。因此，EPS中腐殖质的富集相当于增加了细胞体外层结构的复杂性，使得相关酶与有机物的接触受限，这将对水解产酸等过程造成不利影响^[27]。

根据细菌属水平的结果(图7)，相对丰度最高的细菌菌属依次为：Hydrogenispora、Dechlorobacter、Clostridium_sensu_stricto_1。优势菌属Hydrogenispora具有良好的产酸性能^[28]，在R2、R4和R6中的相对丰度均低于对照，依次降低了55.63%、57.93%、60.47%，这与OFL抑制产酸的结果相吻合。结合2.3节的结果，PS微塑料对产酸的抑制远不及OFL和复合污染，尽管R4中Hydrogenispora相对丰度大幅降低，但其余一系列产酸菌，如通过水解蛋白产酸的Lutispora、Proteiniclasticum等^{[29, 30]}在R4中的相对丰度要明显高于对照以及其他污染组。这说明，其水解产酸功能细菌群落结构出现了变化。次优势菌种Dechlorobacter被证实具有降解抗生素的能力^[31]，在R2与R6中的相对丰度明显大于R0与R4。据此推测，该菌可能参与了抗生素的生物降解过程。产酸细菌Clostridium_sensu_stricto_1在各污染组的丰度要高于对照组。这表明，该菌属对有毒污染物具有一定的耐受能力，这也与其他研究结果一致^{[4, 32]}。

古菌在属水平的优势菌属分别为Methanobacterium、Methanosarcina、Methanosaeta(图8)。这3种菌分别代表了不同的产甲烷方式。丰度最高的Methanobacterium是嗜氢产甲烷菌，在R0、R2和R4中相对丰度分别为60.22%、95.62%和61.51%。复合组R6中Methanobacterium丰度水平与R2较为接近，为95.34%。这说明，复合污染体系内古菌受OFL影响主导。由于嗜氢产甲烷菌在OFL的影响下几乎覆盖了R2与R6的古菌群落。因此，在这2组中其他产甲烷菌的相对丰度降低。以乙酸为底物的Methanosaeta在R0和R4中的相对丰度为11.40%和11.17%，可视作重要的产甲烷途径之一，而在R2与R6中的占比仅为0.28%和0.21%。据此推测，OFL严重阻碍了利用乙酸产甲烷的代谢途径^[33]。次优势菌属Methanosarcina为兼性产甲烷菌，可利用的底物更为多样，其丰度排序为：R0(20.29%)>R4(19.14%)>R2(1.14%)≈R6(1.13%)。综上可知，OFL对古菌群落的影响表现在改变了其主要的产甲烷途径，结合2.3节OFL对产酸过程的抑制，推断在厌氧消化过程中，R2与R6乙酸生成受到限制，导致嗜乙酸产甲烷菌的底物缩减，从而诱导古菌群落向氢营养为主导的代谢途径演替。

1)当厌氧消化受到OFL胁迫时，甲烷产量会随其投加量增加而显著降低。机理分析发现，OFL会导致DOM生物降解性降低，EPS结构复杂化。产酸细菌Hydrogenispora等以及嗜乙酸产甲烷菌Methanosaeta丰度明显减少，导致产酸性能下降，不利于甲烷化。

2) PS微塑料对甲烷产量的抑制弱于OFL，且对初期甲烷生成速率略有提高；PS微塑料有利于Lutispora、Proteiniclasticum等消耗蛋白产酸的细菌的富集。

3)低浓度OFL与PS微塑料复合污染会减缓产甲烷速率，高浓度OFL与微塑料复合污染则会严重阻碍产酸活动的正常代谢。复合组微生物群落的变化主要受OFL影响，古菌群落向氢营养为主导的代谢途径演替。