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养殖场排放大量的猪场废水含有大量有机物、氮、磷等营养物质，若不加以有效处理，会对周围生态环境造成危害[1-2]。目前对于猪场废水较为常见的处理方式是厌氧发酵处理，但厌氧发酵仅能去除有机物，不能有效去除其中的氮、磷等营养物，因此，猪场沼液普遍呈现出高氨氮(NH4+-N≥400 mg·L−1)、低碳氮比(C/N<3)的特点[3-4]。传统的硝化反硝化工艺在针对猪场沼液脱氮时，反硝化作用对碳源的需求无法得到满足而致使其脱氮效率低[5-6]。不少学者探索采用新型自养脱氮工艺提升对猪场沼液脱氮的处理效果，其总氮去除率可达40%~70%，但其存在启动时间过长，运行管理不便，能耗高和除磷效果差等缺点[3,7]。因此，针对猪场沼液处理中高效脱氮除磷除碳的需求，开发低能耗、高效率的新型工艺迫在眉睫。
曝气生物滤池(biological aerated filter, BAF)是一种集吸附、氧化和过滤于一体的新型膜生物处理工艺,广泛应用于污水处理中[8]。目前传统曝气生物滤池常用的滤料包括沸石、陶粒、焦炭、石英砂、活性炭等[9]，但传统滤料存在耐冲击负荷差、脱氮除磷功能微生物富集效果较差等问题[10]。因此，滤料的选择关系着反应器启动、运行的稳定性及除污性能。活性炭纤维(activated carbon fiber, ACF)由有机纤维经高温炭化、活化制备而成，呈现纤维状，其具有比表面积大、微孔含量及容量高、吸附再生后仍有较好的吸附效果等特点[11-12]，被认为是BAF较为理想的滤料，能较好地富集脱氮除磷功能菌[13-14]。因此，为进一步提高传统BAF脱氮除磷性能，本研究利用生物强化技术，接种课题组前期富集驯化的脱氮除磷功能混合菌泥[7,15]，在微曝气条件下启动ACF-BAF。并通过数学模型进行污染物去除动力学模拟，结合启动前后微生物种群组成的变化规律及微生物活性进行脱氮除磷机理探讨，本研究结果可为新型ACF-BAF工艺处理实际猪场沼液提供参考。
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BAF实验装置图如图1所示。反应器由有机玻璃制成，有效容积为1.5 L，内填约40% (体积百分比)的活性炭纤维布。进、出水口分别位于反应器两侧上方，出水口一侧设有挡泥板，以防止较大的污泥颗粒堵塞出水口及污泥流失，进水口一侧不同高度处设有3个取样口。
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BAF接种的特效脱氮除磷污泥来自课题组前期富集驯化的混合污泥[7,15]。接种量约为反应器有效容积的40%，混合液悬浮固体质量浓度(MLSS)约为3 000 mg·L−1。
实验用水取自成都市双流区某大型养猪场实际废水厌氧发酵后所产生的沼液，分2个阶段逐步提升NH4+-N质量浓度的方式进水，在第I阶段将沼液稀释1.3倍，同时添加少量微量元素与碱度。其中微量元素母液组成[7]为：0.1 g·L−1 CuCl2·2H2O、0.1 g·L−1 ZnSO4·7H2O、0.3 g·L−1 FeCl3、0.1 g·L−1 H3BO4、0.1 g·L−1 CoCl2、0.1 g·L−1 EDTA，母液添加量为1 mL·L−1。以NaHCO3提供碱度，进水COD为343~409 mg·L−1，NH4+-N为302~479 mg·L−1，NO2−-N、NO3−-N和TN分别为0.5~1.0、1.0~3.0和303~482 mg·L−1，TP为20~37 mg·L−1，TSS为3~10 mg·L−1，pH为6.5~7.5。
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反应器放置于恒温水浴锅内，控制温度为(30±1) ℃。装置底部安装曝气盘，连接空气泵与转子流量计，以调节曝气量。控制DO为(0.6±0.1) mg·L−1，进水C/N为0.8~1.0。采用序批式进出水的方式来运行反应器，每天运行2个周期，每批次置换率为50%，1个运行周期分为进水0.5 h，曝气10 h，沉淀1 h，排水0.5 h。在反应器启动过程中，分2个阶段逐步提升进水NH4+-N质量浓度，第I、II阶段NH4+-N质量浓度分别为302~357 mg·L−1和431~479 mg·L−1。反应器运行期间，每隔14 d采用气-水联合的方式进行1次反冲洗[16]，底部污泥的SRT设置为14 d。
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本实验中化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)、亚硝态氮(NO2−-N)、硝态氮(NO3−-N)、总氮(TN)、总磷(TP)等均采用国家标准方法测定[17]；pH采用PHSJ-6L型便携式pH计测定；DO采用JPB-607A型溶解氧仪测定。
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高通量测序样品分别取自启动前接种污泥(0#)，第I、II阶段运行末期(50 d和100 d)反应器内不同部位处的填料上的生物膜和污泥的混合样品(分别编号为1#(50 d)、2#(100 d))。采用DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取污泥样品的DNA[18]，利用1%琼脂凝胶电泳检测其浓度及质量。测定合格的DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。测序引物为338F(ACTCCTACGGGAGGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[19]，对目标样品的16S rRNA进行PCR扩增。每个样品的扩增均重复做3次，扩增结束后将同一样品的PCR扩增产物混合并用2%琼脂糖凝胶电泳检测[20]。PCR扩增产物由QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量并在Illumina Miseq上测序。使用I-sanger生物信息云数据分析系统(http://www.i-sanger.com/)对微生物基因序列信息进行分析。利用UPARSE软件，依据97%的相似度对序列信息进行OTU聚类分析，利用UCHIME软件去嵌合体。采用RDP classifier对OTU代表序列进行物种分类注释[21]。
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反应器内各污染物去除过程较复杂，可通过经验公式对复杂过程中的基质去除进行数学模型的模拟[22-23]，对不考虑微生物生长污染物的去除速率根据指数模型(式(1))进行计算。
式中：v为污染物去除速率; ρ为污染物质量浓度, mg·L−1; t为反应时间, h; kn为反应速率常数; n为反应级数。
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为测定AnAOB、AOB、NOB、反硝化菌和除磷菌的活性，取启动成功后的污泥50 mL，测定其MLSS，再将其置于250 mL的锥形瓶中，加入100 mL基质溶液，进行批次活性实验测定方法参照郑照明等[24]和张杰等[25]的研究，通过曝气或通入氮气控制溶解氧DO，设置不同进水污染物质量浓度监测其在12 h的变化情况，以此表征各功能菌的活性。测定条件如表1所示。
AnAOB、AOB、NOB、反硝化菌和除磷菌的活性表征，反应速率k1、k2、k3、k4和k5根据式(2)~式(5)进行计算。
式中：C1、C2、C3、C4和C5分别为反应时间内TN、NH4+-N、NO3−-N、COD和TP的变化量，mg·L−1；Δt表示时间， h； ρ表示污泥质量浓度， g·L−1。
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1) NH4+-N及TN去除变化分析。反应器启动过程中，氮素转化去除的变化如图2所示。在第I阶段(1~50 d)，此阶段中NH4+-N、TN平均负荷分别为0.202 7 kg·(m3·d)−1和0.203 7 kg·(m3·d)−1，反应器运行前7 d，NH4+-N去除率较低，仅有42%左右，此时NH4+-N的去除过程包括活性炭纤维布的吸附截留及部分接种微生物生物转化去除。随着微生物挂膜生长增殖，其对NH4+-N的分解转化率逐步提升。在18 d时，明显观察到填料表面附着一层生物膜，此时NH4+-N去除率稳定在60%以上。反应器运行27 d后，BAF对NH4+-N和TN的去除效果趋于稳定，平均去除率分别为71.91%和61.19%，平均出水质量浓度分别为94.82 mg·L−1和131.58 mg·L−1，NH4+-N、TN平均去除负荷分别为0.131 9 kg·(m3·d)−1和0.116 9 kg·(m3·d)−1。由此可见，活性炭纤维布滤料有利于微生物的附着，具有较好的挂膜性能。
在第II阶段(51~100 d)，进水NH4+-N质量浓度提升至431~479 mg·L−1，TN质量浓度为432~482 mg·L−1，NH4+-N、TN的平均负荷分别为0.272 1 kg·(m3·d)−1和0.273 0 kg·(m3·d)−1。由于NH4+-N负荷提高，NH4+-N和TN的去除率出现不同程度的下降，此时去除率分别为51.48%和40.80%。随着反应器内的微生物逐渐适应该环境，NH4+-N和TN的去除效率逐步提升至稳定，后期其平均去除率分别为61.03%和51.87%，平均出水质量浓度为175.21 mg·L−1和217.16 mg·L−1，此时的NH4+-N、TN平均去除负荷分别为0.173 0 kg·(m3·d)−1和0.143 0 kg·(m3·d)−1。分析原因，较高质量浓度的NH4+-N对微生物具有毒害作用，抑制了反应器内相关脱氮菌的活性[26]。有研究[27]表明，NH4+-N质量浓度的提升会导致系统中NO2−-N去除速率下降，NO2−-N积累使其质量浓度上升从而抑制氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)的活性。当AOB活性下降时，曝气量保持不变，反应器内的溶解氧将会上升，从而抑制厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidizing bacteria, AnAOB)的活性，对脱氮系统的稳定性造成影响[10]。但随着反应器内微生物对环境的适应，系统再次达到新的平衡。由此可见，本研究中以活性炭纤维布为滤料，接种特效脱氮除磷菌泥有利于曝气生物滤池的快速启动。
2) TP及COD去除变化分析。图3为反应器启动过程中对TP和COD的去除性能。在第I阶段，TP和COD进水平均负荷为0.017 7 kg·(m3·d)−1和0.210 6 kg·(m3·d)−1。反应器启动时，TP的平均去除率仅有43.74%，此时TP的去除基于活性炭纤维布对磷具有一定的吸附效果[28]，以及接种污泥中含有的相关除磷菌呈现出一定的活性。随着反应器中的微生物挂膜生长，生物除磷过程加强，后期总磷平均去除率为60.04%，平均出水质量浓度为11.45 mg·L−1，平均去除负荷为0.011 9 kg·(m3·d)−1。反应器启动后对COD的去除性能随时间逐渐提高，后期去除率稳定在69.38%左右，出水COD平均值为107.68 mg·L−1，平均去除负荷为0.147 8 kg·(m3·d)−1。由于本研究中反应器采用的是低能耗微曝气，溶解氧处于较低水平(0.6 mg·L−1)，且沼液中复杂的有机物成分也增加了其降解难度，随微生物增殖，系统中持续的曝气，好氧菌活性及数量均有所提升，且反应器中存在的除磷菌除磷过程及反硝化菌进行反硝化时消耗耗氧有机物(以COD计)，提升其去除率。在第II阶段，TP和COD去除率均有所降低，分别为42.75%和64.33%，随着系统逐渐稳定，TP和COD去除率亦逐步回升。后期稳定后总磷和COD的平均去除率为52.58%和77.11%，平均出水质量浓度为12.89 mg·L−1和91.44 mg·L−1，平均去除负荷分别为0.009 3 kg·(m3·d)−1和0.188 2 kg·(m3·d)−1。NH4+-N质量浓度的提升，对反应器内的除磷微生物及AOB造成不同程度的胁迫，降低了其活性， AOB活性的抑制减少了溶解氧的消耗，以致反应器内的其余好氧异养菌活性提升，可将COD去除率维持在较高水平，而TP去除效果出现一定程度的降低。同时沼液中的其他复杂成分浓度增加对微生物产生的抑制作用也是性能下降的原因之一。微生物在适应新环境后，系统对TP和COD的去除性能逐渐提升。污染物负荷的提升，使得反应器内对溶解氧及碳源消耗更大，反应器局部出现厌氧环境也促进了厌氧消化过程对COD的去除。多种异养微生物的同时作用使得COD去除率最终高于第I阶段后期的水平。由此可见，该反应器启动成功后能够较好地同步脱氮、除磷和除碳。
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图4为反应器成功启动后，各污染物去除动力学模型拟合曲线，表2为拟合曲线对应的参数。可以看出，NH4+-N (R2=0.998 9)、TP (R2=0.968 9)和COD (R2=0.990 5)的去除过程遵循一级反应动力学关系，TN (R2=0.995 5)的去除过程遵循二级反应动力学关系，得到NH4+-N、TN、TP和COD对应的去除动力学方程分别为ρt=452.84e−0.081 4t、ρt=1/(2.114 0×10−4t+2.204 4×10−3)、ρt=28.36e−0.073 0t和ρt=406.68e−0.114 5t。在NH4+-N、TP和COD的去除过程中反应速率在一定程度上受到底物质量浓度的影响，呈现一级动力学规律；而TN在本研究中的去除途径主要包括厌氧氨氧化和反硝化过程，在电子供体匮乏的条件下，其呈现二级动力学规律。NH4+-N和TN在本研究中进水质量浓度相近，但其动力学过程却呈现出差异性。分析原因为，在反应器中NH4+-N的去除途径主要为短程硝化、硝化及厌氧氨氧化过程将其转化为NOx−-N及N2，且AOB和AnAOB均为自养型细菌，其限制因素较少。而TN的去除主要依靠厌氧氨氧化和反硝化过程，反硝化细菌作为异养菌，受碳源的影响较大，初期碳源充足时厌氧氨氧化和反硝化同时作用下TN去除速率较高，而后碳源被快速消耗殆尽，NOx−-N开始积累，去除过程主要为厌氧氨氧化，其去除速率迅速降低。由此可见，在本研究中底物质量浓度对去除速率的影响较大。动力学模型能够较好地拟合反应器内污染物去除过程，其拟合度均较高，可通过该动力学模型对反应器稳态运行状况进行预测，指导运行过程中的操作与调控，对工况优化及工程应用具有重要意义。
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1)多样性指数分析。各阶段系统中各类多样性指数如表3所示。3个样本的覆盖率均大于0.99，表明测序结果可代表样品中微生物的真实情况。Ace、Chao、Shannon和Simpson指数分别用于反应样本中微生物的多样性及丰富度，Ace、Chao、Shannon指数越高，则代表物种多样性和丰富度越高，Simpson指数则反之。1#的Ace、Chao、Shannon指数均高于0#，而Simpson指数则低于0#，说明接种后，反应器内物种的多样性和丰富度均高于接种污泥。2#的多样性和丰富度低于1#但仍高于0#，说明随着氨氮的提高，对部分微生物生长有抑制作用，降低了其多样性和丰富度。但2#仍高于接种污泥，说明活性炭纤维表面特征适宜微生物生长，可为微生物提供较好的生长环境。
2) ACF-BAF反应体系中微生物种群组成分析。应器启动运行阶段，反应器内接种污泥0#、第I阶段末的污泥1#和第II阶段末的污泥2#的微生物种群组成如图5所示。Patescibacteria菌门由接种污泥的0.15%提升至1#和2#中的35.95%和32.61%(图5(a))。拟杆菌门(Bacteroidetes)作为反应器内的另一优势菌门，其相对丰度由启动前的1.92%增加至1#和2#样本中的15.63%和12.10%，该菌门下属黄杆菌纲中的norank_f__NS9_marine_group具有反硝化功能，其相对丰度由启动前的0.01%增长至第I、II阶段的1.43%和4.02%(图5(b))，使得系统具有稳定的反硝化功能。浮霉菌门(Planctomycetes)在3个样品中的相对丰度分别为3.86%、2.59%和2.43%，系统较大程度上截留富集该菌门，保证其在反应器内发挥相应的功能；相比于接种污泥，其相对丰度略有下降，说明NH4+-N质量浓度提升对该菌门下某些菌属有一定的抑制作用[29]；反应器内检出唯一的AnAOB菌属 Candidatus_Brocadia归属于浮霉菌门，其丰度由启动前的0.95%分别变化至0.81%和2.22%，因此推测该菌属更适宜在高基质质量浓度废水中生长，且在第II阶段中Candidatus_Brocadia在浮霉菌门中的占比提升，该门下的其余非AnAOB菌属被淘洗出反应器，Candidatus_Brocadia的成功富集保证了系统中厌氧氨氧化过程。绿弯菌门(Chloroflexi)多为兼性厌氧菌，在厌氧氨氧化系统中较常见，多为丝状菌且位于污泥菌胶团絮状体的内部，可充当絮体骨架促进厌氧氨氧化菌形成颗粒[30]。本研究中，Chloroflexi菌门相对丰度从0#样品的3.97%提升至1#的7.10%，最后再到2#样品的26.80%，形成的菌胶团可为AnAOB的提供适宜的生长环境，减缓恶劣环境对AnAOB生长的抑制作用，检出优势菌属中的norank_f__norank_o__SBR1031、OLB13及norank_f__A4b均属于绿弯菌门，其为厌氧消化核心微生物种群[31]。变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度下降较为明显，由接种时的87.74%降至29.12%(1#)和16.82%(2#)。 XIN等[32]的研究表明，当NH4+-N的平均进水质量浓度高于253.55 mg·L−1时，会产生大量的游离氨(free ammonia, FA)，可能会抑制某些功能菌的生长。SUI等[33]的研究也表明，在高质量浓度FA和低溶解氧的条件下，变形菌门相对丰度有较为明显的下降。因此，在今后实际工程应用中，应通过改进反应器构型等手段提高污泥截留率，以此保证系统内较高的脱氮除磷效率。酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度由接种污泥的0.21%增加至1#的3.93%和2#的1.43%。放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度由接种污泥中的1.11%增长至3.69%和6.36%，该菌门的细菌可分泌出降解复杂多糖的胞外酶，可对大分子有机物进行有效降解[34]，此外，此菌门下存在部分聚磷菌，在好氧和厌氧条件下均可利用和贮存各种糖类物质，积累细胞聚磷酸盐[35]，如优势菌属中的Micropruina，该菌属的相对丰度变化趋势与放线菌门相同，由启动前的未检出(<0.01%) 分别增加至第I、II阶段的3.26%和6.09%。绿菌门下的norank_f__PHOS-HE36为聚磷菌，具有聚磷作用[36]，其相对丰度由0.26%增加至第II阶段的2.36%，在反应器内实现富集。
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1)脱氮除磷功能菌活性分析。反应器内脱氮除磷功能菌活性如图6所示。其中AnAOB和反硝化菌的活性分别达到4.05 mg·(g·h)−1和3.08 mg·(g·h)−1，表明反应器内厌氧氨氧化和反硝化占主导地位。同时，AOB和NOB的活性分别为1.57 mg·(g·h)−1和2.82 mg·(g·h)−1，AOB的存在将NH4+-N转化为NO2−-N，保证厌氧氨氧化的顺利进行，而由于低溶解氧的状态导致NOB的活性受到抑制。除磷菌的活性为1.49 mg·(g·h)−1，系统内的好氧反硝化聚磷菌和传统聚磷菌可实现较好的摄磷作用，从而达到除磷目的。通过对脱氮除磷功能菌的活性测定，证实了系统内厌氧氨氧化、短程硝化、硝化、反硝化和除磷过程处于良好的动态平衡，可实现同步脱氮除磷除碳。
2) ACF-BAF处理猪场沼液脱氮除磷机理分析。迄今为止，关于通过接种脱氮除磷菌泥及以活性炭纤维作为滤料强化曝气生物滤池处理猪场沼液脱氮除磷的研究鲜有报道。由于本研究中接种的菌泥中包括Acinetobacter、Candidatus_Brocadia、Hydrogenophage、Alicycliphilus、Micropruina、norank_f__PHOS-HE36等脱氮除磷功能菌群，因此，ACF-BAF第I、II阶段分别在第27、72 天时污染物处理效果逐渐趋于稳定，启动时间远远短于传统以ANAMMOX为核心衍生的各类工艺。由此可见，通过接种特效脱氮除磷菌泥可克服以AnAOB为代表的世代周期较长的功能菌群的启动培养周期长的问题。而以活性炭纤维作为滤料，其巨大的表面积及发达的孔隙结构是微生物优良的载体，除接种菌泥外，纤维布填料也是ACF-BAF工艺得以快速启动的重要原因之一，与脱氮除磷功能密切相关的菌属Candidatus_Brocadia、Micropruina、norank_f__NS9_marine_group、norank_f__PHOS-HE36均得以大量富集截留，保证了ACF-BAF高效的脱氮除磷效能。系统微曝气低溶解氧状态及生物膜特性可使反应器内同时存在厌/缺/好氧微环境，进而同时实现传统反硝化菌及聚磷菌的脱氮除磷功能。脱氮除磷功能菌活性也表明系统中的脱氮途径以厌氧氨氧化和反硝化过程为主，除磷过程则以微生物聚磷为主，其余通过吸附和沉淀作用去除。同时，ACF-BAF反应器启动成功阶段的污染物去除动力学表明，COD、NH4+-N和TP遵循一级动力学模型，而TN遵循二级动力学模型，ACF-BAF启动成功后，对NH4+-N、TN、TP和COD的平均去除率相比以聚丙烯树脂填料为滤料、接种普通活性污泥启动的BAF分别提高了9.33%、16.80%、15.24%和4.87%[37]，大大降低了后续处理的成本和压力。反应启动成功时的NH4+-N、TN的平均去除负荷分别为0.173 0 kg·(m3·d)−1和0.143 0 kg·(m3·d)−1，相比于传统工艺的0.015 6 kg·(m3·d)−1和0.0150 kg·(m3·d)−1而言[38]，亦或是新型的短程硝化-厌氧氨氧化工艺(CANON工艺)的0.125 6 kg·(m3·d)−1和0.116 1 kg·(m3·d)−1而言[7]，本研究对NH4+-N、TN的去除负荷均有显著提升。本研究对TP和COD的平均去除负荷为0.009 3 kg·(m3·d)−1和0.188 2 kg·(m3·d)−1，传统A2O工艺为0.008 0 kg·(m3·d)−1和0.491 6 kg·(m3·d)−1[39]，在本工艺中在COD进水及去除负荷均低于传统工艺时仍能保持氮磷去除负荷更高。本工艺基于CANON工艺的同时耦合反硝化除磷过程，显著改善了工艺脱氮除磷性能。可见，接种脱氮除磷菌泥可强化ACF-BAF处理实际猪场沼液的除污效能，具有快速启动、高效同步脱氮除磷及节约后续处理成本等优点。
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1)在微曝气(DO=(0.6±0.1) mg·L−1)，温度为(30±1) ℃的条件下，通过改变沼液进水NH4+-N质量浓度，接种特效脱氮除磷污泥，在100 d内实现了ACF-BAF工艺处理猪场沼液的启动；启动成功后，反应器对COD、NH4+-N、TN和TP的平均去除率为77.11%、61.03%、51.87%和52.58%，其对氮和磷的去除负荷分别为0.143 0 kg·(m3·d)−1和0.009 3 kg·(m3·d)−1，均显著高于传统工艺和部分新型工艺。
2) COD、NH4+-N、TP的去除过程遵循一级动力学模型，TN的去除过程遵循二级动力学模型。其拟合度均较高，可通过该动力学模型对反应器稳态运行状况进行预测，指导应用中的操作与调控，对工况优化及工程应用具有重要意义。
3)反应器启动成功后，优势脱氮除磷功能菌属为Acinetobacter(8.34%)、Candidatus_Brocadia (2.22%)、norank_f__NS9_marine_group(4.02%)、Micropruina(6.09%)、norank_f__PHOS-HE36(2.36%)。本工艺相对比传统工艺而言，可显著降低曝气能耗成本及除磷成本，符合可持续高效低碳脱氮除磷工艺节能技术的特点，可降低后续处理成本。
脱氮除磷功能菌泥强化低溶解氧ACF-BAF工艺处理猪场沼液效能及微生物种群分析
The performance and microbial community structure of a bioaugmentated ACF-BAF process treating anaerobic digested swine wastewater under low dissolved oxygen condition
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摘要: 猪场沼液是一种高氨氮低C/N比废水，传统工艺处理时启动时间长、运行管理不便、能耗高、总氮难去除且除磷效果差。本研究以活性炭纤维 (activated carbon fiber, ACF)作为曝气生物滤池(biological aerated filter, BAF)的滤料，接种特定的脱氮除磷菌泥，在低溶解氧(DO=(0.6 ± 0.1) mg·L−1)条件下，通过改变进水NH4+-N质量浓度的方式在100 d内成功启动了处理猪场沼液的生物强化ACF-BAF，对其微生物种群组成和功能菌群活性进行了分析，并探讨了其脱氮除磷的机理。结果表明，ACF-BAF启动成功后的NH4+-N、TN、TP和COD的平均去除率分别为61.03%、51.87%、52.58%和77.11%，其对氮、磷的去除负荷分别为0.143 0 kg·(m3·d)−1和0.009 3 kg·(m3·d)−1，均显著高于传统工艺及部分新型工艺。其中NH4+-N、TP和COD的去除过程符合一级动力学方程，TN的去除过程符合二级动力学方程。高通量测序结果表明，处理猪场沼液的ACF-BAF反应系统中存在的与脱氮除磷功能相关菌属有Candidatus_Brocadia(2.22%)、反硝化菌norank_f__NS9_marine_group(4.02%)、Acinetobacter(8.34%)和除磷菌Micropruina (6.09%)，norank_f__PHOS-HE36(2.36%)。ACF-BAF系统中脱氮过程以厌氧氨氧化和反硝化途径为主，除磷过程主要为微生物聚磷。将ACF-BAF工艺应用于实际猪场沼液处理，可快速启动并实现高效同步脱氮除磷，节约后续处理成本。
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关键词:
- 猪场沼液 /
- 活性炭纤维(ACF) /
- 曝气生物滤池(BAF) /
- 生物强化 /
- 同步脱氮除磷 /
- 微生物种群
Abstract: Anaerobic digested swine wastewater is a kind of wastewater with high ammonia nitrogen and low C/N ratio, the traditional treatment process has the disadvantages of long start-up time, inconvenient operation and management, high energy consumption, difficult removal of total nitrogen and poor phosphorus removal. In this study, activated carbon fiber (ACF) was used as the filter media of biological aerated filter (BAF), inoculated with specific nitrogen and phosphorus removal bacterial sludge. Under low dissolved oxygen (DO = (0.6 ± 0.1) mg·L-1) conditions, the bioaugmented ACF-BAF was successfully started within 100 d by changing the influent NH4+-N concentration, and the microbial population composition and functional bacterial activity were analyzed, and the mechanism of nitrogen and phosphorus removal was investigated. The results indicated that the average removal rates of NH4+-N, TN, TP and COD were 61.03%, 51.87%, 52.58%, and 77.11%, respectively. The removal loads of nitrogen and phosphorus were 0.143 0 kg·(m3·d)-1和0.009 3 kg·(m3·d)-1, respectively, which were significantly higher than those of the conventional process and some new processes. The removal process of NH4+-N, TP and COD could be fitted by the first-order kinetic model, and the TN removal process could be fitted by the second-order kinetic model equation. The results of high-throughput sequencing showed that the bacteria related to nitrogen and phosphorus removal in the ACF-BAF system were Candidatus_Brocadia(2.22%), norank_f__NS9_marine_group(4.02%), Acinetobacter(8.34%), Micropruina(6.09%), norank_f__PHOS-HE36 (2.36%). The results of activity and contribution rate of bacteria showed that nitrogen removal process in ACF-BAF was realized mainly by anaerobic ammonia oxidation and denitrification, and phosphorus removal process in ACF-BAF was realized mainly microbial phosphorus accumulation. The application of ACF-BAF process treating anaerobic digester liquor of real swine wastewater can realize quick start-up and realize an efficient simultaneous nitrogen and phosphorus removal, and reduce the follow-up processing cost. -
山楂Crataegi Fructus为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. Major N. E. Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实. 山楂为药食两用品种，在临床应用广泛，具有消食健胃，行气散瘀，化浊降脂之功效，常用于肉食积滞，胃脘胀满，瘀血经闭等症[1]. 研究表明，山楂富含黄酮、有机酸、三萜酸等化学成分，其中的三萜酸类成分主要为山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸等，大多具有保肝、抗炎、抗肿瘤、降血糖、调血脂等作用[2]. 因此，三萜酸类成分的组成和含量对山楂的质量控制具有重要意义.
加速溶剂萃取法（ASE）是一种利用有机溶剂在高温高压下快速高效提取化合物的自动化萃取技术，有简便、省时、回收率高、溶剂用量少等优点[3]. 文献报道采用ASE萃取中药中的齐墩果酸和熊果酸的提取效率优于超声提取[4]. 目前尚未见山楂中5种三萜酸类成分ASE提取的报道.
三萜酸类的检测主要为高效液相色谱法，采用紫外/二极管阵列检测器[5]. 但由于三萜酸类紫外吸收弱，只能在200 nm附近检测，易受干扰，对低含量成分的灵敏度受限. 有报道建立了基于蒸发光散射检测器（ELSD）、串联质谱检测器（MS/MS）的检测方法[6,7]. 电雾式检测器（charged aerosol detector，CAD）是一种通用型检测器，其响应值不依赖于被测物质的光学性质和离子化效率，具有较高的检测灵敏度和均匀一致的响应因子，适合缺少紫外发色基团的药物成分的检测. 迄今尚未见采用CAD同时测定山楂中多种三萜酸的报道. 本研究拟建立ASE-CAD方法用以检测山楂及其炮制品中山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸等5种三萜酸类成分的含量.
1. 仪器与试药
1.1 仪器
ASE350 快速溶剂萃取仪（赛默飞世尔科技有限公司）、Vanquish Core高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司，配双元泵、Corona Veo RS电雾式检测器、变色龙色谱管理软件Chromeleon CDS 7.2.10）；MS205DU电子天平（d=0.01mg，梅特勒-托利多有限公司）；SB-3200DT超声波清洗器（180 W，40 kHz，宁波新芝生物科技公司）.
1.2 试剂
山楂酸（批号 PS011005）、科罗索酸（批号 PS000533）、白桦脂酸（批号 PS010392）、齐墩果酸（批号 PS012022）、熊果酸（批号 PS012671）对照品均购自成都普思生物科技公司；色谱级乙腈、乙酸铵均购自赛默飞世尔公司；超纯水由纯水机（Milli-Q Integral-3）新鲜制备；其余试剂均为分析纯.
1.3 样品制备
山楂饮片S1—S9购自河北、山东、四川、广东等地. 自制炮制品S10—S12以S1为原料按照《中国药典》2020年版四部通则 0213制备.
取山楂及其炮制品，50 ℃烘干4 h，粉碎过30目筛. 精密称取样品粉末3.0 g，加入硅藻土适量，混合均匀，转至底层垫有纤维素膜的34 mL萃取池中，加盖后置于ASE 350快速溶剂萃取仪中，于100℃下加速溶剂萃取5 min，冲洗体积60%，循环两次，待萃取液冷却至室温后定容至50 mL，过0.45 µm滤膜，即得.
分别取山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸对照品适量，精密称定，以甲醇溶解定容为2.5 mg·mL−1的溶液，作为对照品贮备液.
2. 结果与讨论
2.1 色谱条件
采用Thermo Acclaim C30 （4.6 mm × 250 mm, 5 μm）色谱柱；1%乙酸铵溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，0 — 2 min，70% B，2 — 20 min，70% B — 80%B；体积流量1.0 mL·min−1，柱温25˚C，电雾式检测器气化温度70˚C，进样体积5 μL. 上述条件下，5个成分的分离度均大于2. 0，理论塔板数均大于6000，对称因子0. 98 — 1. 02. 色谱图见图1.
图 1 混合对照品（A）及供试品（B）的HPLC-CAD色谱图Figure 1. Chromatograms of （A） mixed standard solution and （B） sample solution of five triterpenic acidsELSD、CAD均为通用型检测器，适用于检测弱紫外吸收化合物. 本研究对比了两种检测器的检测性能. 取浓度为25 μg·mL−1的混合对照品溶液，在相同色谱条件下连续进样6次，ELSD测定山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸的RSD分别为4.15%、3.55%、3.24%、3.15%和3.07%，均大于3%；而CAD测定的RSD均小于1%，且同等浓度下ELSD无法检出山楂酸. CAD具有更高的精密度和灵敏度，适用检测山楂中5种三萜酸类成分.
白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸互为同分异构体（C30H48O3），山楂酸（2α-羟基齐墩果酸）与科罗索酸（2α-羟基熊果酸）互为同分异构体（C30H48O4）. 上述成分在常规C18柱上难以有效分离，而改用C30柱后可获得理想分离效果. 推测原因是后者通过在超纯球形多孔硅胶表面键合C30烷基链，为结构相近的疏水性异构体提供了更好的空间结构选择性.
考察了柱温（25℃、30℃、35℃）对分离度的影响，熊果酸和齐墩果酸保留特性相似，柱温越高分离度越差，而柱温降低会导致压力增高. 试验确定柱温25℃时，两者良好分离，且系统压力小于20 MPa.
2.2 ASE提取条件优化
对影响ASE提取效率的提取温度（80、100、120℃）、静态提取时间（3、5、7、10 min）进行了单因素考察，循环次数均为2次，提取池冲洗体积为60%. 结果发现，温度由80℃提高到100℃时，提取率增加较明显，但继续升高到120℃时，提取效率增加很少甚至下降；静态提取时间为5 min时，主要成分的提取率最高；ASE不同提取条件下，各成分的提取率普遍高于超声提取30 min，表明ASE提取效果优于超声提取. 综上，优选的提取方法为ASE甲醇提取，提取温度100℃，静态提取时间5 min.
2.3 线性关系考察
精密量取“2.2”项下混合对照品储备液适量，以甲醇稀释制成浓度为250、100、75、50、25、10、5、2 μg·mL−1 的系列混合标准溶液，经 0.45 μm微孔滤膜滤过后，分别吸取 5 μL续滤液注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定. 以浓度（C）对数值对峰面积（A）值进行强制过原点的线性回归，结果5种三萜酸类成分在5.00 — 75.00 μg·mL−1浓度范围内线性关系良好，相关系数均＞0.998.
2.4 精密度
精密吸取浓度为25 μg·mL−1混合对照品溶液 5 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录色谱峰面积. 结果显示，RSD 分别为山楂酸0.35%、科罗索酸0.24%、白桦脂酸0.33%、齐墩果酸0.67%、熊果酸0.41%，精密度较好.
2.5 重复性和稳定性
精密称取同一批次（S6）供试品6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，测定含量. 结果显示，各成分含量RSD分别为山楂酸1.05%、科罗索酸0.58%、白桦脂酸1.31%、齐墩果酸1.40%、熊果酸1.22%，表明本方法重复性良好.
取同一供试品溶液分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果各成分峰面积RSD分别为山楂酸1.05%、科罗索酸0.38%、白桦脂酸0.97%、齐墩果酸0.62%、熊果酸1.06%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好.
2.6 加样回收率
精密称取同一批次（S6）供试品6份，粉碎过30目筛. 精密称取粉碎后样品1.5 g，加入硅藻土适量，混合均匀，转至底层垫有纤维素膜的34ml萃取池中，然后依次加入样品中已知含量100%的山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸的对照品，加盖后置于ASE 350快速溶剂萃取仪中，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别测定并计算加样回收率. 山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸的加样回收率分别为97.31%、88.63%、98.16%、98.83%和100.39%，RSD分别为0.96%、1.65%、1.38%、0.69%和4.39%.
2.7 定量限和检测限
取对照品溶液逐级稀释，测定山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸的峰高，分别以信噪比（S/N）等于10和3为标准，测定定量限和检测限分别为5 μg·mL−1和2 μg·mL−1.
2.8 样品测定
取山楂及其炮制品，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算含量，结果见表1.
表 1 不同山楂样品中5种三萜酸的含量（μg·g−1，n=3）Table 1. Contents of five triterpenic acids in samples （μg·g−1，n=3）编号 饮片类型 产地 山楂酸 科罗索酸 白桦酯酸 齐墩果酸 熊果酸 总含量 S1 生山楂 四川 25.36 104.37 97.85 666.70 3983.37 4877.65 S2 生山楂 四川 63.61 125.56 90.90 757.82 4594.35 5632.24 S3 生山楂 广东 306.18 761.31 42.14 368.50 2097.14 3575.27 S4 生山楂 广东 208.78 528.70 34.83 251.71 1506.44 2530.46 S5 生山楂 山东 22.46 91.73 84.91 539.25 3280.92 4019.27 S6 生山楂 山东 25.82 92.45 77.10 579.53 3502.93 4277.83 S7 生山楂 河北 30.76 95.43 107.39 609.00 3748.19 4590.77 S8 炒山楂 河北 25.50 80.58 76.47 576.21 3311.61 4070.37 S9 焦山楂 河北 7.26 84.12 60.64 510.54 3024.49 3687.05 S10 炒山楂 四川 21.79 96.87 96.11 747.55 4549.72 5512.04 S11 焦山楂 四川 25.88 95.87 79.16 534.37 3228.27 3963.55 S12 山楂炭 四川 17.32 82.37 79.07 546.74 3343.75 4069.25 | Show Table
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三萜酸类成分是山楂中主要活性物质之一. 本研究选取含量较高且具有代表性的齐墩果烷型（山楂酸、齐墩果酸）、乌苏烷型（科罗索酸、熊果酸）和羽扇豆烷型（白桦脂酸）等3种类型的三萜酸类成分作为测定指标，可有效控制山楂及其炮制品的质量. 在检测12批样品中，除S3、S4外，含量排序均为熊果酸 > 齐墩果酸 > 科罗索酸 ≈ 白桦脂酸 > 山楂酸，而S3、S4为熊果酸 > 科罗索酸 > 齐墩果酸 > 山楂酸 >白桦脂酸. 所有样品的熊果酸含量都远高于其他三萜酸，是山楂及其炮制品中最主要的三萜酸类成分，齐墩果酸次之.
从生山楂逐步炮制得到炒山楂、焦山楂和山楂炭的过程中，5种三萜酸类成分普遍存在含量先略微升高，随后降低的趋势，表明适当炒制可能会促进这5种三萜酸类成分的释放，但随着炮制温度升高、时间延长，含量最终下降. 总体而言，5种三萜酸类成分在炮制过程中含量变化并不大，说明高温炒制对此类成分影响有限.
3. 结论
本研究建立了快速溶剂萃取-电雾式检测器同时测定山楂及其炮制品中5种三萜酸类成分含量的方法，为山楂及其炮制品的质量评价提供了参考. 快速溶剂萃取法的应用为中药复杂成分的快速高效提取提供了新的选择；通用型电雾式检测器在山楂中5种三萜酸类成分检测中表现出的高灵敏度、准确度和良好的普适性，为无紫外吸收或弱紫外吸收成分的检测提供了可靠的解决方法.
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图 5 门、属水平菌群结构及分布
Figure 5. Structure and distribution of bacterial community at genus level
图 6 脱氮除磷功能菌活性
Figure 6. Activity of functional bacteria for nitrogen and phosphorus removal
表 1 脱氮除磷功能菌活性测定条件
Table 1. Test conditions for activity of functional bacteria for nitrogen and phosphorus removal
功能菌 进水指标质量浓度/(mg·L-1) NH4+-N NO2--N NO3--N COD TP DO AnAOB 120 160 0 0 0 0 AOB 140 0 0 0 0 1.0±0.1 NOB 0 120 0 0 0 1.0±0.1 反硝化菌 0 40 60 120 0 0.5±0.1 除磷菌 0 40 60 120 20 1.0±0.1
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表 2 污染物去除动力学参数
Table 2. Kinetic model parameters of pollutants removal
污染物指标 零级动力学 一级动力学 二级动力学 k0 R2 k1 R2 k2 R2 NH4+-N 25.896 1 0.961 2 0.081 4 0.998 9 2.492 2×10−4 0.982 1 TN 23.369 5 0.906 4 0.071 0 0.981 4 2.114 0×10−4 0.995 5 TP 1.472 3 0.899 9 0.073 0 0.968 9 3.120 0×10−3 0.930 4 COD 29.196 3 0.945 7 0.114 5 0.990 5 4.244 0×10−4 0.934 0
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表 3 多样性指数表
Table 3. Diversity index table
Sample Ace指数 Chao指数 覆盖率/% Shannon指数 Simpson指数 Sobs指数 0# 292.81 302.03 99.8 6 2.04 0.25 243 1# 434.36 435.46 99.7 9 3.23 0.11 356 2# 357.19 355.87 99.8 7 2.98 0.15 312
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