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近年来，随着药物与个人护理用品 (pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)大量使用，水环境中PPCPs及其代谢产物对淡水生态系统构成潜在威胁。布洛芬作为一种非甾体抗炎药，广泛应用于高烧、炎症和风湿病等疾病的治疗，是世界上消耗最多的PPCPs之一[1]。成人摄入的布洛芬往往只有20%被机体利用，其余则通过汗液或排泄物进入水环境[2-3]。制药行业生产废水布洛芬质量浓度甚至高达200 mg·L−1，而传统的污水处理工艺无法有效的去除水中布洛芬，河流和湖泊等地表水体中布洛芬检出浓度越来越高[4-5]。生物长期暴露于布洛芬的环境，其中枢神经系统[6]、心血管[7]、肾脏[8]等会受到损伤。因此，研究水中布洛芬有效去除方法具有一定的迫切性。
微生物燃料电池(microbial fuel cells, MFCs)通过阳极微生物代谢，将污染物蕴含的化学能转化为电能，实现废水资源化，具有成本低，无二次污染等特点[9]。严伟富等[10]研究表明，在132 h内MFCs对水中10 mg·L−1的氧四环素去除率可达99.0%。邓经惠[11]发现沉积物MFCs对沉积物中磺胺甲恶唑去除率高达80%以上。李峰等[12]研究表明，MFCs闭路运行模式下盐酸环丙沙星与磺胺甲恶唑的去除率均显著高于开路运行模式(p < 0.05)。目前，对于水中布洛芬的去除更多集中在厌氧生物法[13]、光催化法[14]和高级氧化技术等[15]。使用MFCs处理含布洛芬废水能够拓展布洛芬废水处理方法，对布洛芬废水资源化具有重要意义。本研究构建了双室MFCs处理含布洛芬废水，探讨了MFCs以布洛芬作为底物的产电性能，分析了阳极生物膜微生物的群落结构及功能基因组成，为微生物电化学法处理布洛芬废水提供参考。
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布洛芬(分析纯，纯度99%)购自阿拉丁上海生化科技股份有限公司，色谱纯甲醇购自美国Fisher公司。
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双室MFCs反应器由阳极室和阳极室构成，两室通过质子交换膜隔开；阳极和阴极均为碳毡(2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm)，外接1 000 Ω电阻。阳极室接种活性污泥，阳极液为含乙酸钠的人工废水，阴极液为含50 mmol·L−1K3Fe(CN)6的磷酸盐缓冲液(pH=7)[16]。MFCs以0.82 g·L−1乙酸钠为底物启动后，换成10 mg·L−1 布洛芬为底物，运行温度为28 ℃。设置开路MFCs为对照组，实验组和对照组运行条件一致。数据采集器(PS-DAQ，北京恩迈科华技术有限公司)每5 min记录一次MFCs输出电压。
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待MFCs以布洛芬为底物稳定产电，阳极换液后每12 h使用岛津高效液相色谱(L-200，日立公司，日本)在波长223 nm波长下检测阳极液中布洛芬浓度。流动相由甲醇和水(pH=2，磷酸调节)按80∶20配制，流速为1 mL·min−1 [17]。
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MFCs以布洛芬为底物运行3个月后，采用美国MP生物医疗公司土壤微生物DNA提取试剂盒提取阳极生物膜微生物基因组DNA，定量分析后，送样至安诺优达基因科技有限公司宏基因组测序。
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非冗余基因集序列使用Diamond软件处理后与NCBI的NR数据库进行比对，而获得MFCs阳极生物膜微生物群落结构以及功能基因信息。直系同源蛋白分组比对数据库(evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups, eggNOG)分析同源序列聚类(clusters of orthologous group, COG)，京都基因和基因组数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析代谢通路。
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以乙酸钠与布洛芬为燃料的MFCs输出电压变化如图1所示。以乙酸钠为底物时，MFCs电压峰值为0.54 V；当底物更换为布洛芬时，输出电压急剧下降至0.1 V以下。布洛芬的化学结构相对复杂，不易被阳极微生物代谢，且布洛芬对部分阳极微生物具有毒性，布洛芬的加入抑制了阳极微生物的产电性能。经过约30 d的驯化，阳极碳毡上形成了肉眼可见的生物膜，MFCs以布洛芬为底物输出电压持续增加，且对阳极室布洛芬的加入响应灵敏，最大输出电压稳定在0.60 V左右。MFCs以布洛芬为底物时最大输出电压高于乙酸为底物，原因可能是阳极布洛芬降解过程生成了电子中介体，促进了电子传递；也可能是布洛芬降解产物促进了阳极产电微生物的代谢，提高了MFCs产电性能。LI等[18]发现MFCs以酚类化合物为底物的输出电压高于葡萄糖为底物。ZENG等[19]研究表明酚类化合物的降解产物促进了阳极电化学活性细菌的生长。
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MFCs处理组和传统微生物厌氧处理对照组布洛芬去除率变化如图2(a)所示。MFCs处理组108 h的布洛芬去除率为85.33%，而对照组仅为46.11%。一级动力学拟合结果如图2(b)所示，对照组与MFCs处理组拟合方程R2分别为0.966和0.991，表明ln(Ct/C0)与处理时间相关性较好。MFCs能够强化微生物厌氧去除水中布洛芬，对照组中布洛芬半衰期达115.9 h，MFCs处理组中半衰期仅为36.4 h。陶玥彤等[20]研究表明，生物电化学系统促进了沉积物中大环内酯类和四环素的去除。
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MFCs阳极生物膜的电镜照片如图3所示，MFCs在以布洛芬为燃料启动后，阳极碳毡表面聚集大量微生物，微生物通过胞外聚合物成团包裹碳丝，形成松散的生物膜。生物膜中存在大量孔隙，增加了生物膜的表面积，有利于对布洛芬的吸附和降解。
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1)门和纲水平上对微生物群落结构的分析。膜生物反应器常用于水中布洛芬的去除，随着反应器去除布洛芬性能的稳定，生物膜常常含有较多Proteobacteria。ZHANG等[21]在降解含布洛芬的废水生物反应器中发现Proteobacteria为最优菌门。NAVROZIDOU等[22]使用固定化生物反应器处理布洛芬，Proteobacteria同样为优势菌。李峰等[12]等采用人工湿地型MFCs去除磺胺甲恶唑与盐酸环丙沙星，发现Proteobacteria在阳极生物膜中含量最高。由图4可见，Proteobacteria 在2个样品中含量最为丰富，在MFCs阳极生物膜中相对丰度为83.58%，是对照组的1.38倍。在纲水平，Beta-proteobacteria在阳极生物膜的相对丰度达到54.66%，高于对照组的24.19%。芳香族化合物降解性能电化学活性微生物在Beta-proteobacteria广为分布，阳极生物膜富集的Beta-proteobacteria有助于MFCs对水中布洛芬的去除[23]。HASSAN等[24]研究也表明，MFCs在污染物降解过程定向富集微生物，从而维持有利于污染物降解与产电的微生物群落结构。
2)属与种水平微生物群落分析。电极生物膜和对照组细菌在属与种水平的含量差异如图5所示。由图5(a)可见，Pusillimonas在MFCs阳极生物膜中含量最高，相对丰度为18.64%，远高于对照组(0.02%)。Pusillimonas能以羟基吡啶、3-氰基吡啶以及5-羟基吡啶甲酸等杂环化合物作为唯一碳源进行代谢，常用于杂环有机污染物去除[25-26]。Burkholderia作为第2优势菌，在阳极生物膜中相对丰度为18.18%，高于对照组中的2.24%。Burkholderia可降解苯、甲苯和二甲苯等单环芳烃，生成的吩嗪作为电子中介体，强化了微生物对布洛芬的去除[27-28]。此外，芳香族化合物降解过程发挥重要作用的微生物如Agrobacterium(7.04%)[29]、Martelella(4.56%)[30]和Ruegeria(1.74%)[31]等在阳极生物膜的相对丰度也显著高于对照组。
生物膜在种水平的相对丰度统计结果如图5(b)所示。可见，Pusillimonas sp.ye3(11.49%)为相对丰度最高的微生物，其次为Burkholderia cenocepacia(11.02%)。Pusillimonas sp. T7-7(7.14%) 和Martelella sp. AD-3(4.56%) 在MFCs阳极生物膜中的含量也远高于对照组。其中，Burkholderia cenocepacia能以芳香烃作为碳源生长[32]；Martelella sp. AD-3能降解蒽[33]和菲[34]等多环芳烃。这些能以芳香烃类化合物为碳源生长的微生物在阳极生物膜相对丰度高达34.21%，说明MFCs以布洛芬为底物，对芳香烃降解性能微生物有较好的富集。
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1) COG注释与分析。功能基因与eggNOG数据库比对后统计样本COG功能分类(图6)。代谢基因在2个样品中相对丰度最高，其次为细胞过程与信号基因和信息储存与处理基因，且这些基因丰度在MFCs阳极生物膜均高于对照组。在COG二级分类目录中，能量产生与转化基因、信号传导机制及无机离子转运与代谢等基因丰度在阳极生物膜含量高于对照组。另外，未知功能基因在2个样品中相对丰度也较高，表明微生物电化学法和传统厌氧生物法去除水中布洛芬涉及大量未知代谢途径。
2) KEGG功能注释与分析。KEGG注释统计如表1所示。尽管MFCs阳极生物膜代谢通路、模块类别和酶种类均低于对照组，但基因数量却比对照组高11.22%，说明在MFCs去除水中布洛芬的过程中，阳极生物膜菌群功能向着专一化和特定化演化。严伟富等[10]研究也表明，随着MFCs以四环素为底物持续产电，阳极微生物向特定群落进化，从而可强化氧四环素的降解。
KEGG一级功能分类如图7(a)所示。除有机体系外，其他代谢类型基因数量在阳极生物膜微生物中均高于对照组，其中环境信息处理基因丰度为对照组的1.29倍。KEGG代谢通路的进一步分析结果如图7(b)所示。阳极生物膜微生物的碳代谢和氮代谢的功能基因数量分别是对照组的1.09倍和1.29倍，表明MFCs以布洛芬作为底物，促进了微生物的碳、氮代谢，更多的氧化磷酸化关联基因也为碳氮代谢提供了能量保障[35]。此外，双组分系统、细菌分泌系统、磷酸转移酶系统、ABC转运蛋白、鞭毛组装、群体感应以及肽聚糖生物合成等涉及微生物在应对环境逆境的信号传导及调控代谢相关基因在MFCs阳极微生物中也有所增加，表明MFCs处理组中生物膜微生物的抗逆性增强。
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1) MFCs强化了微生物对水中布洛芬的去除性能，初始质量浓度为10 mg·L−1的布洛芬处理108 h，去除率达85.33%。
2)以布洛芬为唯一底物的MFCs阳极生物膜中，Pusillimonas、Burkholderia、Agrobacterium、Martelella和Ruegeria等与芳香族化合物降解相关微生物丰度显著高于传统厌氧生物法对照组。
3)抗逆代谢通路、碳代谢通路和氮代谢通路在MFCs处理组阳极微生物中得到了强化。
MFCs降解布洛芬性能及电极生物膜宏基因组分析
Ibuprofen degradation in MFCs and metagenomics analysis of electrode biofilms
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摘要: 布洛芬作为一种高性价比消炎药被大量使用，环境中布洛芬浓度升高易引起抗生素抗性基因污染等环境问题。本研究构建了双室微生物燃料电池(MFCs)以去除水中布洛芬，分析了阳极生物膜微生物群落结构并注释了基因功能。结果表明，MFCs阳极微生物以10 mg·L-1布洛芬作为唯一碳源，外接1 000 Ω电阻，输出电压约为0.60 V，运行至108 h时布洛芬去除率达85.33%，是对照厌氧生物处理的3.18倍。微生物群落结构分析结果表明，MFCs阳极生物膜微生物群落结构与传统厌氧生物膜差异显著，Proteobacteria在阳极生物膜相对丰度高达83.57%，而对照组中仅为60.52%，Pusillimonas、Burkholderia、Agrobacterium、Martelella及Ruegeria在属水平相对丰度也高于对照组。代谢通路分析结果表明，环境信息处理通路在MFCs阳极微生物显著增强，其碳代谢及氮代谢基因数量分别高于对照组9.02%和28.58%。Abstract: Ibuprofen is a widely used non-steroidal anti-inflammatory drug with high performance and low price. The increase of ibuprofen concentration in the environment is easy to cause environmental problems such as resistance gene contamination. In this study, dual-chamber microbial fuel cells (MFCs) were constructed to remove ibuprofen from water, and metagenomic sequencing was used to analyze the microbial community structures and annotate functional genes of anodic biofilm. The results showed that the maximum voltage was about 0.60 V generated from MFCs when anodic microbes took ibuprofen as the sole carbon source and the external resistance was 1 000 Ω, and ibuprofen removal efficiency reached to 85.33% at 108h of MFCs running, which was 3.18 times of the anaerobic control group. Compared with the traditional anaerobic method, the composition of the microbial community in the anodic biofilm also changed significantly. At phyla level, the relative abundance of Proteobacteria was 83.57% in anodic biofilm, which was just 60.52% in control group. At genus level, the relative abundance of Pusillimonas, Burkholderia, Agrobacterium, Martelella and Ruegeria was also higher than that in control group. Metabolic pathway analysis showed that the environmental information processing pathway was significantly enhanced in anodic biofilm microorganisms, and the genes related to carbon and nitrogen metabolism were 9.02% and 28.58% higher than those of control group, respectively.
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Key words:
- ibuprofen /
- microbial fuel cells /
- metagenomics /
- microbial community /
- functional genes
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在众多的污水处理方法中，活性污泥法受到人们的广泛关注，活性污泥法作为重要的处理污水方法之一，具有很多优势. 但是随着国内外对污水治理的日益重视和城市污水处理厂的不断建设，大量的剩余污泥作为活性污泥法处理污水的副产物排出[1]. 污泥因其含水率高、含有大量病原体和微生物等有害生物、重金属及有机物含量高等特点，容易对环境造成二次污染[2]，污泥的有效处理处置是亟待解决的重要问题. 污泥脱水是常规的污泥处理方法，在污泥脱水之前需要经过一定的调理使其满足后续脱水要求，所以，选择合适的污泥调理方法对改善污泥脱水性能尤为重要.
过氧化钙（CaO2）作为一种热稳定性好的环境友好型材料，被广泛应用于农业种植、水产养殖、食品保存、医疗以及环境领域[3]. CaO2具有高能的过氧化物共价键，当CaO2与水接触时，能够缓慢释放过氧化氢（H2O2），同时还会生成羟基自由基、过氧化氢自由基等具有强氧化性的自由基（反应式见式（1—5））[4]. 近年来，因其具有稳定的氧化性，CaO2在污泥处理方面的应用成为一个新的研究热点. Wang 等研究发现，通过CaO2预处理污泥后，难降解有机物可以转化为可生物降解，促进污泥中可生物降解基质的水解和分解代谢，进而增强污泥厌氧消化效果[5]. 有研究表明，CaO2可以破解污泥EPS结构，释放污泥中的束缚水[6]. Wang等的研究表明，通过联合CaO2和微波预处理污泥，预处理后污泥的CST值相较于原泥下降52% [7]. 通过热处理与CaO2联合调理，可以提升污泥脱水性能[8].
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (4) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (5) 除了直接使用CaO2对目标物进行氧化，对CaO2进行活化也是一种常用的技术[8]. 有研究认为，通过微波活化CaO2，能促进CaO2产生更多的HO·和·O2-[7]. 通过过渡金属（Fe2+/Fe3+和Ag+）活化CaO2分解是常用的活化方法[9]. 利用Fe2+活化CaO2可以形成类芬顿反应，但如果不进行pH调节， Fe2+易于被氧化成Fe3+，限制了芬顿反应的效率. 有研究指出，利用含铁矿物对H2O2进行活化可以克服这一缺陷[10]. 黄铁矿（FeS2）是一种常见的脉石矿物，与矿床中的有价矿物伴生，可通过常规浮选方法轻松处理[11]. 最近有研究发现，利用黄铁矿活化CaO2降解磺胺，相比常规的芬顿反应，磺胺的氧化效率从30%提升至80%,（主要反应见式（6—9））[12]. Zhou等研究表明利用黄铁矿活化CaO2处理邻苯二甲酸二乙酯（DEP），78%的DEP在24 h内被降解[13]. 这些结果说明，通过黄铁矿活化CaO2能有效促进HO·产生，但目前尚未发现关于利用黄铁矿活化过氧化钙调理污泥的研究，其对污泥脱水性能的影响及机理尚未清晰，因此本研究利用黄铁矿-CaO2作为一种新型的芬顿法对污泥进行调理，以期达到破解EPS从而释放结合水的效果，并通过EPS性质及污泥絮体性质变化探究其对污泥脱水性能的影响机理.
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (6) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (7) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (8) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (9) 本研究对不同污泥样品进行EPS的提取，并对提取出来的EPS样品进行含量测定、三维荧光光谱检测，以表征调理前后污泥EPS性质变化. 同时对不同污泥样品的粒径分布进行检测，探究调理方法对污泥絮体团聚性能变化的影响.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 实验材料
本研究中污泥取自于广州市某污水处理厂二沉池，污泥取至实验室后，先过20目筛，去除大颗粒杂质和毛发，之后置于冰箱在4 ℃下保存. CaO2采购于上海麦克林生化科技有限公司. 黄铁矿采购于佛山市大昌顺材料科技有限公司，黄铁矿在使用之前对其进行研磨，并过100目筛，利用0.1 mol·L−1HNO3 洗去表面杂质及氧化层，干燥后备用[14].
1.2 实验方法
1.2.1 污泥脱水性能实验
为了探究不同调理条件对污泥脱水性能的影响，本研究对黄铁矿单独调理、CaO2单独调理以及两者复合调理污泥进行实验室规模的污泥脱水性能实验，250 mL的烧杯作为污泥调理容器，在调理容器中加入100 mL污泥样品进行实验. 利用重量法对污泥总固体（TS）进行测定[15]. 在黄铁矿单独调理实验中，设置6组不同黄铁矿调理剂量实验组，各组黄铁矿投加量分别为0、1、2、4、6 g·L−1. CaO2单独调理实验中，设置6组不同CaO2调理剂量实验组，各组CaO2投加量分别为10、30、50、80、100 mg·g−1 TS. 为了研究单独调理与复合调理以及不同复合调理方法之间的污泥脱水性能变化，设置了两组复合调理实验，第一组：CaO2投加量30 mg·g−1 TS，黄铁矿投加剂量1 g·L−1，第二组：CaO2投加量100 mg·g−1 TS，黄铁矿投加剂量1 g·L−1. 将单独调理和复合调理的实验组分别设置为A30、A100和B30、B100. 其中，A30为30 mg·g−1 TS CaO2单独调理，B30为30 mg·g−1 TS CaO2 +1 g·L−1黄铁矿复合调理，A100为100 mg·g−1 TS CaO2单独调理，B100为100 mg·g−1 TS CaO2 +1 g·L−1黄铁矿复合调理.
1.3 分析方法
1.3.1 污泥脱水性能
本研究中利用毛细吸水时间（CST）作为评价污泥脱水性能的指标. CST利用CST测定仪进行测定（HDFC-10A），利用测定后CST数据进行标准化CST（SCST）计算[16]，计算公式如下：
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) 其中，CSTa为调理后污泥样品的CST值，CST0为原泥的CST值.
1.3.2 EPS提取及其分析
在本研究中，EPS根据其存在形态分类为溶解性EPS（S-EPS）、松散束缚EPS（LB-EPS）和紧密束缚EPS（TB-EPS）[17]，本研究采用一种改进的热提取方式对EPS进行提取，具体方法参照文献[18]. EPS中的多糖含量利用硫酸-蒽酮法测定，蛋白质含量利用福林酚法进行测定[19].
1.3.3 三维荧光光谱（3D-EEM）测定方法
本研究中利用荧光光谱仪（Hitachi F-4600）对提取出的EPS进行3D-EEM的测定，光谱数据的发射波长（Em）以及激发波长（Ex）范围从220 nm到450 nm，采集间隔为10 nm. 光谱数据的利用5 nm的发射和激发狭缝带宽以及1500 nm·min−1的扫描速度进行收集.
1.3.4 污泥絮体粒径测定方法
本研究利用激光粒度仪（Mastersize 3000）对污泥絮体粒径分布及絮体粒径D50和D90值的测定. 其中，D50与D90分别定义为颗粒直径的第50和第90百分位数[20].
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 污泥脱水性能变化
由图1可见，单独投加CaO2之后，污泥SCST值随着CaO2的投加量的增加呈现先下降再上升的趋势，单独投加CaO2，投加量为30 mg·g−1 TS的实验组SCST值最低为0.61. 在投加剂量不高于80 mg·g−1 TS时，CaO2单独调理有利于提升脱水性能，但当CaO2投加量增加至100 mg·g−1 TS时，SCST值增加至1.39，说明过量的CaO2不仅不会提升污泥脱水性能，反而会使得原污泥脱水性能下降. 随着黄铁矿投加量增加，黄铁矿单独调理的SCST值也表现出先下降再上升的，最优黄铁矿单独调理剂量为1 g·L−1，SCST值为0.70. 但当投加量继续增加时，黄铁矿单独调理对污泥脱水性能的提升效果变弱，在投加量为6 g·L−1的单独调理下，SCST值为0.92，污泥脱水性能提升不明显. 这说明过量的过氧化钙投加，带来过强的氧化性能，会使得污泥的脱水性能下降，这一趋势与Chen等的研究结果相似，过强的氧化性可能会导致过量的EPS释放，降低污泥脱水性能[6]. 但在CaO2投加量为30 mg·g−1 TS复合调理时，虽然氧化性能更强，但污泥有更佳的脱水性能，SCST值下降至0.55，这说明利用黄铁矿活化过氧化钙对污泥进行复合调理能有效提升污泥的脱水性能.
图 1 过氧化钙（a）、黄铁矿（b） 单独调理和复合调理（c）污泥样品的SCST值Figure 1. SCST values of calcium peroxide （a）, pyrite （b） single conditioning and composite conditioning （c） sludge samples2.2 EPS含量变化
不同结构的EPS对剩余污泥的脱水性能影响程度可能不同，Dai等认为S-EPS中有机物含量较高或LB-EPS中有机物含量较低，具有较好的脱水性能[21]. He等指出污泥脱水性与S-EPS中有机物浓度呈正相关，而与LB-EPS中生物聚合物含量呈负相关[22]. 剩余污泥脱水性能除了和EPS的组成结构有关，还与EPS的组成成分相关，Wei等研究发现，污泥脱水性能与EPS中蛋白质含量呈负相关性[23]，而且蛋白质含量是决定污泥脱水性能的关键因素[24]，为了进一步探究污泥调理过程中污泥性质的变化，本研究对提取出的EPS样品进行蛋白质和多糖含量的测定. CaO2调理后污泥EPS结构发生明显的变化（图2a），在30 mg·g−1 TS的CaO2投加量下，S-EPS蛋白质含量略有下降，而内层EPS（LB-EPS、TB-EPS）蛋白质含量增加，相较于单独调理，CaO2/黄铁矿复合调理由于其更强的氧化性能，在CaO2投加量为30 mg·g−1 TS时的复合调理污泥样品中，内层EPS蛋白质含量增加幅度更大. 当CaO2投加量增加至100 mg·g−1 TS后，所有层EPS中蛋白质含量均增加，与低CaO2投加量相似，复合调理因其更强的氧化性，内部EPS含量较单独调理增加更多. 调理后污泥的总EPS（T-EPS）蛋白质含量均增加，高剂量CaO2导致更多的蛋白质释放，而复合调理对蛋白质含量的提升高于单独调理.
图 2 原泥以及调理后污泥EPS中蛋白质含量（a），多糖（b）蛋白质-多糖含量比率（c）变化Figure 2. The concentration of protein （a）, polysaccharide （b） and the ratio of protein to polysaccharide （c） in EPS of raw sludge and conditioned sludge调理前后EPS多糖含量的变化见图2b，随着CaO2投加量增加，内外层EPS多糖含量均增加. 值得注意的是，高CaO2投加剂量的复合调理样品中，S-EPS和LB-EPS的多糖含量较单独调理均下降. T-EPS中多糖的变化趋势与蛋白质不同，T-EPS中多糖含量随着氧化性能的增强表现出先增加后下降的趋势，这可能是低CaO2剂量调理下，EPS结构被破解，内层EPS释放至外层. 但在高剂量CaO2的复合调理下，多糖类物质可能被分解为更小的有机分子或直接被矿化，导致T-EPS中多糖含量下降.
有研究认为，LB-EPS中蛋白质/多糖比率（PN/PS）与脱水性有负相关性[25]. 本实验中，B30样品LB-EPS的PN/PS最小（图2c），且无论高剂量或低剂量，在同一剂量下复合调理得到的LB-EPS样品，其PN/PS值均小于单独调理. 但当用高剂量过氧化钙对污泥进行调理后，LB-EPS中的PN/PS上升，污泥脱水性能下降. 但本实验发现，高剂量的过氧化钙调理后虽然PN/PS上升，但仍然低于原泥，这与脱水性能变化不一致，这是因为污泥脱水性能的变化影响十分复杂，并不能只靠EPS中的PN/PS进行指示.
从EPS含量变化可以看出，使用CaO2单独调理以及CaO2/黄铁矿复合调理都可以改变EPS原有结构，破解EPS结构. 在同一CaO2投加量下，复合调理得到的EPS破解效果更加明显. 结合污泥脱水结果分析，污泥调理方法在一定范围内对EPS结构进行破解，可能有利于污泥脱水性能的提升，但对EPS结构的过度破解可能会使得大量有机质的释放，进而使得污泥脱水性能下降.
2.3 3D-EEM
为了更深入地了解调理前后以及各调理方法对各层EPS的性质以及其含量的影响，本研究利用三维荧光光谱对各层EPS的有机成分进行表征，各样品EPS的三维荧光光谱见图3. 本研究中EPS的荧光光谱峰主要有两个，分别为A峰（Em/Ex：340 nm/225 nm）和B峰（Em/Ex：350 nm/280 nm）. 根据Wen等提出的三维荧光光谱分区方法，A峰位于区域Ⅱ，归类为芳香类蛋白物质，B峰位于区域Ⅳ，归类为色氨酸和类蛋白物质[26].
图 3 原泥（a）、A30（b）、B30（c）、A100（d）、B100（e）EPS样品三维荧光光谱图Figure 3. 3D-EEM spectra of EPS samples of raw sludge（a）; A30（b）; B30（c）; A100（d）; B100（e）A峰在原泥S-EPS中强度较低，但经过调理后，A峰强度上升，芳香类蛋白含量增加. 在A100中，S-EPS中的A峰出现最强的荧光强度，说明在此调理方法下内层EPS和胞内的芳香类蛋白向外释放，聚集在外层EPS中. 但经过氧化性更强的B100调理后，A峰强度下降，这可能是由于芳香类蛋白的分解导致含量下降. S-EPS中B峰的荧光强度在A30和B30调理下均下降，当CaO2投加量增加后，S-EPS的B峰强度增加，S-EPS中B峰最强峰强度出现在B100调理下. 原泥中LB-EPS中A峰和B峰强度稍强于S-EPS，经过预处理后污泥LB-EPS中A、B峰强度增加，且两峰强度的增加幅度明显大于S-EPS. 不同调理方法对LB-EPS的荧光光谱图影响与S-EPS相似，A、B峰在B100调理下均出现最强荧光强度. 原泥TB-EPS中的芳香类蛋白和色氨酸含量明显高于S-EPS和LB-EPS，这一结果与EPS含量一致. 不同调理手段下B峰强度在TB-EPS中的变化与在S-EPS、LB-EPS中的变化相似，B峰在A100调理下出现最大荧光强度，随后下降. 但与 S-EPS、LB-EPS 变化趋势不一致的是，TB-EPS 中 A 峰的最大荧光强度出现在 B30 调理下， 这一结果说明，芳香类蛋白比色氨酸更易于从胞内和内层 EPS 释放至胞外和外层 EPS.
荧光峰强度变化趋势可以说明，在一定条件下，随着调理方法的氧化性的增强，EPS中物质被分解，EPS结构破解程度增加，胞内物质向TB-EPS转移，同时TB-EPS中的物质向外层的LB-EPS和S-EPS转移. 当调理方法氧化性能过强，各层EPS中物质被分解甚至矿化，导致各层EPS中荧光峰强度下降，同时还发现，各层EPS中不同物质对于不同调理方法的变化趋势并不完全相同.
2.4 调理方法对絮体粒径的影响
由图4a可以看出，经过调理后的污泥絮体粒径分布曲线均向左移动，同时图4b中看到原泥有最大的D90以及D50值，调理后污泥的D50以及D90均有明显的下降，说明调理后污泥的絮体粒径下降. 这是由于强氧化性的调理方法将EPS结构破解后，会使得污泥絮体分解，形成尺寸更小的絮体[27]. 随着调理方法的氧化性能增强，污泥的粒径分布曲线左移程度越大，且有更小的D50和D90值，可以认为氧化性能越强的调理方法能够更高效、更彻底地破坏原有污泥絮体结构，使得原有稳定的大颗粒絮体失稳进而形成众多小尺寸的絮体. 这一现象与Ling等研究结果一致，通过对污泥絮体的破解，可以有效地释放束缚水，提升污泥脱水性能[28]. 在本研究中，在同一CaO2投加量下，复合调理后的污泥样品相较于单独调理后的污泥样品有更小的粒径，这也再次说明本研究中复合调理有更高效的EPS破解性能，但高剂量的过氧化钙投加量可能会过度破解絮体结构，过度破解絮体使得絮体粒径下降可能会增加小颗粒污泥对过滤介质的堵塞作用，降低污泥的脱水性能[29].
图 4 原泥以及调理后污泥样品的絮体粒径分布（a）和粒径 D50、D90 变化（b）Figure 4. Floc particle size change distribution （a） and particle size D50, D90 change （b） of raw sludge and conditioned sludge samples3. 结论（Conclusion）
本研究提出一种利用黄铁矿活化CaO2的污泥调理技术，结果表明，单独利用CaO2或者黄铁矿对污泥进行调理，随着CaO2或黄铁矿投加量的增加，污泥脱水性能呈现先上升后下降的趋势，在30 mg·g−1 TS CaO2和1 g·L−1黄铁矿的投加量下分别得到过氧化钙和黄铁矿的最优单独调理效果，同时发现，当CaO2和黄铁矿投加量为30 mg·g−1 TS和1g L−1时，复合调理后的污泥样品脱水性能优于单独调理. 但实现污泥脱水性能的提升需要对调理药剂投加量进行控制，过多的药剂投加可能会带来污泥脱水性能的下降.
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图 4 门水平与纲水平上的微生物群落结构
Figure 4. Microbial communities of anodic biofilm at phylum and class levels
表 1 KEGG注释统计
Table 1. Annotation summary of KEGG
实验组 基因数量 代谢通路 KEGG模块 KO 酶 对照组 24 988 439 447 361 7 115 3 783 MFCs组 27 792 521 443 346 6 174 3 226 
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