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传统生物脱氮的硝化过程可分为两个阶段，第一阶段：氨氧化菌（AOB）将氨氮（NH4+-N）氧化为亚硝酸盐（NO2--N）；第二阶段：亚硝酸盐氧化菌（NOB）将亚硝酸盐氧化为硝酸盐（NO3- -N）。因此，硝化反应是由两类微生物独立完成的生化反应过程。
废水中的氨氮因pH值的不同有分子态和离子态两种存在形式。游离氨（FA）是氨氮的分子态形式，通常存在于城市污水和工业废水中。游离氨（FA）浓度可通过Anthonisen 等[1]提出的公式计算得出：
由公式可以看出，FA浓度是氨氮浓度、温度T和pH值三者的函数，并且与三者呈正相关。高氨氮废水的特征是氨氮浓度高，同时还具有较高的pH值，这导致废水中产生较高浓度的FA。高浓度的FA对AOB和NOB的活性具有一定的抑制作用[2-3]，降低了生物脱氮硝化过程的生化反应速率，导致系统运行费用增加。几十年来，众多学者针对FA抑制硝化菌的活性方面开展了大量研究[4-11]，大多集中于FA选择性抑制 AOB和NOB活性实现短程硝化。此外，FA对AOB和NOB的分解代谢和合成代谢过程均具有一定程度的抑制作用，这揭示了FA抑制其代谢能力的机制[12-14]。
微生物组成是影响生物脱氮效能的关键因素[15]。高通量测序技术是第二代测序技术[16]，借助这项技术，许多研究人员研究了生物脱氮硝化过程中FA对细菌种群结构的影响[17-19]。这些研究清楚地表明，随着FA浓度的增加，微生物多样性和硝化细菌丰度均会降低。此外，FA对AOB和NOB活性的抑制阈值的差异[20-22]，很可能是由于细菌种群结构的不同引起的。然而，在众多文献中，用于分析微生物群落的活性污泥大多源于FA浓度有差异的生物反应器和污水处理厂，对于在精确/受控条件下驯化的微生物群落的研究较少。为了补充这一研究内容，本试验应用16S r RNA 基因-Illumina MiSeq 高通量测序技术，研究了4种FA浓度（0.5、5、10、15 mg·L−1）条件下长期驯化的活性污泥细菌种群结构的差异以期揭示FA影响生物脱氮硝化过程的生物学机制，为生物脱氮技术的应用提供微生物理论支撑。
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试验用水采用人工模拟废水，主要成分包括：氯化铵（115 mg·L−1），乙酸钠（385 mg·L−1），磷酸二氢钾（26 mg·L−1）和微量元素浓缩液。接种污泥取自兰州市安宁污水处理厂A2/O工艺好氧段。试验装置为包括SBR反应器（有效容积为4 L）、水浴加热系统及自动控制系统在内（以溶解氧DO、pH值和氧化还原电位ORP为控制参数）的3部分。
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试验通过控制NH4+ -N浓度，温度和PH值使进水FA浓度分别达到0.5、5、10、15 mg·L−1，对应4个编号为R0.5、R5、R10和R15的SBR反应器。各反应器的溶解氧置于相同水平。具体运行参数见表1。当SBR系统运行稳定时，分别从每个反应器中取3个活性污泥平行样品，共有12个样品。提取所有样品的微生物DNA并进行高通量测序。
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采用Water DNA Isolation Kit试剂盒提取12个样品中的微生物DNA，将其作为PCR模板， 对16S rRNA 通用引物进行V4 区扩增，在4 ℃下保存。委托上海派森诺生物科技有限公司进行高通量测序。
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Mothur软件用以计算菌群的Chao1、ACE、Shannon、Simpson多样性指数，RStudio用以获得UniFrac距离矩阵，QIIME2软件用以对样品菌群数据进行流程化分析并生成各分类水平的OTU丰度表。通过Galaxy平台进行LEfSe分析。
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表2展示了4组样品的α多样性指数。Chao1指数[23]和ACE指数[24]用以评估样本菌群的丰富度，Shannon指数[25]和Simpson指数[26]用以评估样本菌群的均匀度。表2显示4个多样性指数在R0.5中均为最高，而在R15均为最低。这表明R0.5具有最高的微生物多样性，而R15的微生物多样性最低。此外，4组活性污泥样品中序列数和OTU数也基本呈现随FA浓度的增加而逐渐降低的趋势，反映出微生物多样性在R0.5中最高，在R15中最低的特点。
图1为4组活性污泥样品的Chao1和Shannon指数稀疏曲线。随着测序量的深入，Chao1指数稀疏曲线趋于平缓，但还没有饱和。Shannon指数稀疏曲线在后半段非常平缓，说明测序量已足够反映微生物的多样性特征。
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基于UniFrac距离的非度量多维尺度分析（NMDS）方法用以评估样品微生物β多样性的差异。Unifrac距离分为Unweighted和Weighted两种。Unweighted UniFrac只考虑物种在样品中存在与否 [27]；Weighted UniFrac不仅考虑物种的存在与否，还考虑其丰度[28]。
图2为两种基于UniFrac距离的NMDS二维排序图。两两样品之间的距离远近代表样品间菌群结构的相似程度。4组样品组间距离较大，说明不同FA浓度条件下菌群结构差异较大。图2（a）和图2（b）中，R0.5和R5样品的距离较近，说明R0.5和R5的物种组成及丰度较为相似。
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在门水平上，4组活性污泥样品中共鉴定出32个菌门，其中相对丰度大于0.5%的优势菌门共有9种（表3）。
图3为门水平下的细菌种群结构及分布。可以看出，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、Parcubacteria、浮霉菌门（Planctomycetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、Ignavibacteriae、绿菌门（Chlorobi）和Omnitrophica的相对丰度较高，约占总菌门的95.20%—99.62%。这项研究中观察到的细菌种群结构与Cao等[29]的相似, 他利用SBR处理白葡萄酒生产废水。主要区别在于，变形菌门（54.50％）和拟杆菌门（25.95％）的平均相对丰度略低。
FA能够显著影响微生物在门水平上的种群结构和丰度。变形菌门是活性污泥样品中最优势菌门，相对丰度为45.90%—70.46%。众多研究表明，在城市污水处理厂的活性污泥系统中，变形菌门的相对丰度约占27.5%—65%[30]，这与本研究获得的结果几乎一致。4 组活性污泥样品中变形菌门的相对丰度均为最高。该菌门在R15（70.46%）的相对丰度最高，在R0.5（45.90%）最低。拟杆菌门的相对丰度在R10（41.25%）最高，在R15（11.84%）最低。此外，一些菌门的相对丰度随着FA浓度的变化表现出独特的变化趋势，如Parcubacteria和Omnitrophica仅在R5中以较高的相对丰度（13.35%和3.37%）存在，而在其它3组活性污泥样品中的相对丰度均低于0.1%。浮霉菌门和绿菌门在R0.5（6.80%和1.24%）和R15（3.96%和2.28%）中具有较高的相对丰度，在R5（1.35%和0.40%）和R10（0.49%和0.03%）的相对丰度较低。Ignavibacteriae在R0.5（1.24%）和R5（2.54%）中均具有较高的相对丰度，在R10（0.38%）和R15（0.89%）的相对丰度较低。需要指出的是，参与硝化反应的主要门类硝化螺旋菌门在R15（0.96%）的相对丰度最低。因此，过高的FA浓度不利于其增殖。
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在属水平上，4组活性污泥样品中共得到406个菌属。其中陶厄氏菌属（Thauera，31.97%）、腐螺旋菌属（Saprospiraceae，8.78%）、噬纤维菌属（Cytophagaceae，8.38%）、赖文氏菌属（Lewinella，4.86%）和动胶菌属（Zoogloea，4.60%）等相对丰度大于1.0%的菌属共有14种，构成了属水平上的优势菌群（表4）。
图4为4组样品中丰度前50的属的分层聚类热图，展示了菌属的丰度分布趋势以进一步比较样品间的物种组成差异。基于列聚类（组间和组内）分析，相同FA浓度下平行样品之间的相关性最强，微生物的群落结构组成更相似。列聚类分析表明不同FA浓度下各自形成了特有的菌群。基于行聚类分析，50种菌属可划分为两大分支，进一步划分为4个显著的微生物区域，分别对应4个FA浓度，其中R0.5对应Longilinea—Zoogloea，R5对应SM1A02—Acidovorax，R10对应Lewinella—Nitrospira，R15对应Comamonas—Thauera。
亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）分别进行氨氮氧化和亚硝酸盐氧化过程[31-33]，它们在R10中的丰度最高。需要指出的是，动胶菌属（Zoogloea）和陶厄氏菌属（Thauera）共存于4个SBR系统中，且它们的丰度均较高。此外，这两类菌属的相对丰度与FA浓度之间呈现显著的线性关系。首先，对于动胶菌属，它是污水生物处理中重要的化能异养型兼性好氧菌，对有机物和氮均有一定去除能力，并且是形成菌胶团的主导功能菌属[34-35]。随着FA浓度的增加，动胶菌属的相对丰度逐渐降低，两者呈显著的负相关（y=13.31-3.5x, R2=0.806; Pearson’s ρ=-0.933）。因此，FA浓度增加显著降低了动胶菌属的相对丰度。
对于陶厄氏菌属，它是属于变形菌门的一类革兰氏阴性菌，具有高效的反硝化作用，是污水生物处理中重要的反硝化菌。此外，它还具有降解芳香族化合物的功能[36]。陶厄氏菌属利用污水中的有机物进行新陈代谢活动，在缺氧条件下利用硝态氮作为电子受体进行反硝化，使自身得到增殖[37]。与动胶菌属变化趋势相反，陶厄氏菌属的相对丰度与FA浓度呈显著的正相关（y=-8.72+16.2x, R2=0.97, Pearson’s ρ=0.986）。也就是说，FA对陶厄氏菌属的相对丰度具有显著的促进作用。本研究中，4组样品中陶厄氏菌属的相对丰度（5.05％%—56.29％）远高于Srinandan等 [38]和Du等 [39]的结果。这可能是环境条件和进水质量的差异所致。Cao等的研究中，在FA浓度分别为2.9、5.6、11.1、 19.5 mg·L−1的条件下，陶厄氏菌属（相对丰度< 0.1）并不是优势菌属。这可能是因为其研究中的C / N（4个反应器中的C / N分别为16.5、8.3、4.1和2.4）高于本研究（4个反应器中的C / N为2、0.9、0.6和1.5）。此外，从陶厄氏菌属的生化反应过程来看，在R0.5和R5中，系统硝化结束时硝态氮为主要产物（50 mg·L−1），而在R10和R15中，硝化结束时亚硝态氮为主要产物（30 mg·L−1）。结合陶厄氏菌属相对丰度的变化规律，推断其在还原硝态氮和亚硝态氮的过程中，其更倾向于利用亚硝态氮作为电子受体。
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LEfSe（LDA Effect Size）分析方法用以发现4组样品组间在丰度上有显著差异的物种，即微生物标记物。LEfSe分析设定LDA阈值为4.3，P值小于0.05（图5b）。结果表明，共得到24个具有显著差异的微生物标记物（α= 0.01）。R0.5的微生物标记物共有11个，包括鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）、鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae）、动胶菌属（Zoogloea）等；R5的微生物标记物共有3个，包括Parcubacteria、伯克氏菌目（Burkholderiales）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）；R10的微生物标记物共有5个，包括噬纤维菌目（Cytophagales）、噬纤维菌属（Cytophagia）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、噬纤维菌科（Cytophagaceae）、赖文氏菌属（Lewinella）；R15的微生物标记物共有5个，包括陶厄氏菌属（Thauera）、红环菌科（Rhodocyclaceae）、红环菌目（Rhodocyclales）、变形菌门（Proteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）。相对丰度最高的微生物标记物分别是R0.5中的鞘脂杆菌纲（28.37％），R5中的Parcubacteria（13.35％），R10中的噬纤维菌目（31.42％）和R15中的陶厄氏菌属（56.29％）。而这4种微生物标志物各自在其他样品中并不显著。从定量的角度来看，4种FA浓度都有利于各自特定的微生物标记物的培养。这表明FA对生物脱氮硝化过程的菌群结构有深刻影响。
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（1）基于微生物多样性指数，R0.5系统的细菌种群的丰富度和均匀度最高，而R15的细菌种群的丰富度和均匀度最低。FA对系统微生物多样性有显著影响。
（2）在4种FA浓度条件下，细菌种群在门水平上差异显著。最优势菌门变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度与FA浓度呈正相关，硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度与FA浓度呈负相关。拟杆菌门（Bacteroidetes）等其他优势菌门的相对丰度也受FA浓度显著影响。
（3）在4种FA浓度条件下，属水平上形成了不同的优势菌群。亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）的丰度在R10中丰度明显高于其它3个系统。动胶菌属（Zoogloea）和陶厄氏菌属（Thauera）是两类优势菌属，它们分别与FA浓度呈现显著的负相关和正相关。
（4）LEfSe分析共获得24种具有显著差异的微生物标记物。其中，R0.5中的微生物标记物最多（11个），而R5中的微生物标记物最少（3个）。不同FA浓度条件下，4组样品的关键微生物标记物分别是R0.5中的鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia），R5中的Parcubacteria，R10中的噬纤维菌目（Cytophagales）和R15中的陶厄氏菌属（Thauera）。
游离氨对生物脱氮硝化过程细菌种群结构的影响
Effect of free ammonia on microbial community structure in biological nitrification process
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摘要: 为揭示游离氨（FA）对硝化过程影响的生物学机制，本试验以人工模拟废水为研究对象，采用4组平行的SBR反应器（R0.5、R5、R10和R15），基于16S rRNA基因-IlluminaMiSeq高通量测序技术，考察了4种FA浓度（0.5、5、10、15 mg·L−1）对SBR反应器中的细菌种群结构的影响。结果表明，FA会显著影响系统内的微生物多样性和菌群结构。R0.5的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数均为最大，其具有最高的微生物多样性，而R15的微生物多样性最低。在微生物门水平上，最优势菌门变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度与FA浓度呈正相关，硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度在R15中最低。在微生物属水平上，亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）的相对丰度在R10中显著较高，动胶菌属（Zoogloea）和陶厄氏菌属（Thauera）的相对丰度与FA浓度呈显著的线性相关。基于LEfSe分析共获得了24种具有显著差异的微生物，从而得到了4种FA浓度条件下的关键微生物标记物。本研究加深了对生物脱氮硝化过程菌群结构的认识，为深入研究生物脱氮硝化的抑制机理提供了借鉴。
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关键词:
- 游离氨 /
- Illumina MiSeq高通量测序 /
- 硝化过程 /
- 微生物多样性 /
- LEfSe组间差异
Abstract: Based on 16S rRNA genes-Illumina MiSeq high-throughput sequencing, this study is to investigate the community and structure of characteristic microbial communities related to nitrification under four FA concentrations (0.5, 5, 10, 15 mg·L−1) settled in four parallel laboratory-scale sequencing batch reactors (SBRs, denoted as R0.5, R5, R10, R15) to reveal the biological mechanism of how does FA influence the nitrification. Results indicated that FA concentration significantly affects the microbial diversity and community structure in the system. The largest α-diversity values of Chao1, ACE, Shannon and Simpson were achieved in R0.5, which represents with highest diversity of bacterial community, while the lowest was achieved in R15. At the the phylum level, the relative abundance of Proteobacteria which is the predominant phylum, increased with the increasing of FA concentration. The relative abundance of Nitrospira in the nitrification process was the lowest in R15. At the genus level, the relative abundance of Nitrosomonas and Nitrospira was significantly higher in R10. The relative abundance of Zoogloea and Thauera showed a significant linear correlation with FA concentration. A total of 25 groups of microorganisms with significant differences were obtained based on LEfSe analysis, thereby key biomarkers of the microflora were obtained at the microbiological classification level under four FA concentrations. This study has deepened the understanding of the microbial community structure in the biological nitrification process, and provided a reference for in-depth study of the inhibition mechanism of biological nitrification process. -
农村污水的分质收集处理是农村污水资源化的重要方式。农村生活污水按照其污水来源和水质特征的不同，可以大致分为灰水和黑水2大类。其中，灰水是指不包括冲厕污水(黑水)在内的生活杂排水，主要包括餐厨污水、洗涤污水和洗浴污水等[1-2]。灰水由于基本不含肠道病原微生物、污染物浓度较低且易于自然生物处理的特点，具有很高的直接回用价值[1]。为缓解水资源压力，灰水单独采用管道收集并直接用于灌溉的回用方式已经得到了一定的应用[3]。而农村污水治理工程设施投资中的管道敷设成本占所有建设投资的70%以上，管道敷设成本过高直接限制了农村地区污水收集治理工作的有效开展[4-5]。小管径重力流排水系统具有管道成本低、施工开挖土方量少、建设迅速等诸多优点，非常适用于经济条件相对落后的农村地区[6-7]。基于此，小管径重力流灰水管道系统具有明显的经济优势和生态环境效益，具有较大的推广潜力和应用前景。
排水管道生物膜具有一定的污水预处理功能，并且可能产生CH4、H2S等具有环境和健康风险的气体，对于市政排水管道生物膜的微生物群落特征已经有了相对广泛的研究[8-10]。然而，农村污水特征与市政排水相比，其水质水量具有明显的随时间变化规律，即每天在用餐时段污水水量较大，而夜间基本没有污水排放[11]。具体到管道容量较小的小管径系统中，在早中晚时段，污水排放高峰期，管道经常临近满管流状态；而在夜间，基本处于断流状态。不同的流态决定了不能直接套用市政污水管道生物膜数据来解析农村污水管道生物膜，当前对于农村污水管道生物膜的认识仍处于起步阶段，更是罕有针对农村灰水管道生物膜的研究。
本研究采用实验室规模的小管径重力流灰水管道系统，研究了小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落、氮硫循环管道功能菌特征以及氮循环功能基因分布情况，重点探讨了管道敷设坡度对于小管径重力流灰水管道生物膜细菌群落的影响。本研究丰富了排水管道生物膜认知体系，为小管径重力流灰水管道的优化设计和应用提供了参考。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
本研究采用的实验装置为实验室规模的小管径重力流管道模拟系统。整个系统由3套不同敷设坡度(5‰，10‰，15‰)的透明UPVC排水管道系统(φ50 mm×3.5 mm，单组管道总长5 m，溢彩，中国)、PVC阀门(百盛，中国)、高位水箱(PVC板自制)、循环水箱(PVC板自制)、潜水泵(HQB-5000，森森，中国)、恒温器(300 W，YEE，中国)等组成(图1)。灰水由潜水泵经循环水箱提升至高位水箱，沿排水管道依靠重力作用流下，最终回到循环水箱。灰水在整套系统中循环流动，模拟小管径重力流灰水管道的生物膜生境，同时保证了3套管道中的灰水水质相同，有效避免了水质差异造成的生物膜群落结构差异。为进行生物膜取样，在距直管道起点1 m处设置30 cm长的取样管道，两侧采用50 mm PVC活接头(联塑，中国)连接，确保取样管道的轴线与直管道重合。
图 1 小管径重力流模拟装置示意图Figure 1. Schematic diagram of simulated small diameter gravity sewers1.2 水质特征及分析测试方法
为模拟实际农村灰水在小管径重力流管道中的真实流态，本研究利用调节潜水泵功率和阀门开闭的方式保持管道内的充满度随时间有规律的变化，管道实际充满度和平均灰水流速如图2所示。整个实验设备的运行水温维持在20 ℃并保持避光运行，以模拟真实的灰水管道运行状态。本研究进水采用人工配制的灰水，配制方法见表1。每2 d换水一次，运行水质条件见表2。整套设备连续运行60 d，形成成熟的管道生物膜。
表 1 配制灰水组分浓度Table 1. Composition of synthetic gray water常量物质 浓度/(mg·L−1) 微量物质 浓度/(μg·L−1) 葡萄糖 80 CaCl2·2H2O 73.50 蛋白胨 80 MgSO4·7H2O 51.25 CH3COONa 54 Na2SiO3·9H2O 30.43 NaHCO3 91 Al2(SO4)3·16H2O 11.78 KCl 57 FeCl3·6H2O 4.83 KNO3 7 ZnSO4·7H2O 0.88 NH4Cl 19 H3BO3 0.58 NaH2PO4·2H2O 15 CuSO4·5H2O 0.39 食用油 30 MnCl2·4H2O 0.27 十二烷基苯磺酸钠 5 KI 0.03 EDTA 20.00 注：pH=7。 | Show Table
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图 2 管道充满度及流速随时间的变化Figure 2. Variation of relative depth and flow velocity with time in sewers表 2 实验灰水水质特征Table 2. Characteristics of gray water in the experiment测试结果 pH DO/(mg·L−1) COD/(mg·L−1) 
-N/(mg·L−1)TN/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) 
/(mg·L−1)LAS/(mg·L−1) 平均值 7.07 4.26 121.56 4.90 14.33 3.83 18.07 2.69 标准差 0.13 0.57 85.88 0.63 1.22 0.94 7.33 1.60 注：LAS为阴离子表面活性剂。 | Show TableDownLoad:
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相关研究[12-13]表明，经过60 d的连续运行，排水管道生物膜可以发育成熟。连续运行后，在第60天拆卸取样管道，用经过灭菌处理的药匙刮下少量位于管道内表面底部的生物膜样品，置于无菌离心管中，迅速置于4 ℃冰箱中保存，用于生物膜样品的形貌观测。另取3份平行样品，迅速置于4 ℃便携式恒温箱(FYL-12MC-B4,福意联，中国)中临时暂存，在0.5 h内，转移至−80 ℃冰箱中保存，用于生物膜细菌的群落分析，取3份平行样品群落分析结果的算术平均值。
将生物膜样品浸没于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃避光静置24 h。然后依次利用25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液进行梯度脱水，最后于−50 ℃中冷冻干燥，制得扫描电镜样品。将样品喷碳后，置于JSM-5610LV型扫描电镜(JEOL，日本)下，分析生物膜样品的形貌特征。
采用PowerSoil® DNA Isolation Kit (MoBio，美国)试剂盒提取生物膜样品的DNA，并利用细菌16S rRNA通用引物338F和806R进行PCR扩增。总PCR反应体系的体积为20 μL，包括超纯水13.25 μL，10×PCR ExTaq Buffer 2.0 μL，DNA模板(100 ng·mL−1)0.5 μL，引物338F和806R (10 mmol·L−1)各1.0 μL，dNTP 2.0 μL, ExTaq (5 U·mL−1) 0.25 μL；在95 ℃中维持5 min，继而进行30个扩增循环，每个循环包括95 ℃孵育30 s，58 ℃孵育20 s，72 ℃孵育6 s；最后在72 ℃维持7 min，得到扩增产物。扩增产物经纯化定量回收后，采用Illumina HiSeq 2500 (Illumina，美国)高通量测序平台进行测序分析。细菌高通量测序结果以97%的相似度划分为分类操作单元(OTU)，获得的OTU与细菌Silva分类学数据库比对，得到细菌群落组成信息。DNA提取和高通量测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成，高通量测序数据通过百迈客云计算平台进行处理和分析(
www.biocloud.net )。将细菌16S rRNA测序结果与Greengenes分类学数据库比对后形成的OTU文件(97%相似度)上传至PICRUSt在线分析网站(
http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/ )，运算形成按拷贝数标准化处理的OTU文件，进而依据网页内置程序进行PICRUSt宏基因组预测[14], 预测得到的KEGG分类数据(ko)通过与KEGG数据库进行比对，获得相关功能基因丰度。2. 结果和讨论
2.1 灰水管道内胶状生物膜的形貌结构
经过60 d的连续运行，小管径重力流灰水管道内壁形成了厚度相对均匀的淡黄色的胶状生物膜。生物膜的扫描电镜结果如图3所示。可以看出，脱水后的灰水管道生物膜呈粗糙的表面结构，生物膜中分布着大量的不同种类的细菌、真菌、原生动物和胞外聚合物(EPS)，灰水管道生物膜中的微生物以细菌为主，细菌种类多样，杆菌球菌密布，覆盖了整个生物膜表面。真菌数量相对较少，但仍广泛分布在灰水管道生物膜中。观察到的原生动物体表有六边形鳞片构成的外壳，从形貌特征上分析可能为网足属原生动物。原生动物的大量出现表明经过60 d的连续运行，灰水管道生物膜已经形成了复杂的微型生态系统，确认了此时生物膜已经成熟。
2.2 灰水管道胶状生物膜的细菌群落结构
通过对9个样品(每组管道各3个平行样品)的高通量测序，共获得443 338条有效序列，共划分为230个OTU。其中181个OTU为3个坡度共有(图4)，说明不同坡度下小管径重力流灰水管道生物膜细菌中绝大部分物种是共有的，坡度变化对于灰水管道生物膜中主要的细菌种类影响不大。根据香农指数曲线(图5)所示，随着取样序列数的增加，3个坡度下的平均Shannon指数逐渐趋于平缓，这说明本研究中的高通量测序深度满足进一步分析的要求，测序结果能够充分反映细菌的群落结构。
小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构如图6和图7所示。细菌主要以Proteobacteria (变形菌门) (57.76%±5.76%)、Actinobacteria (放线菌门) (38.46%±5.50%)、Bacteroidetes (拟杆菌门) (2.18%±0.73%)和Acidobacteria (酸杆菌门) (0.79%±0.25%)为主，其中以变形菌门和放线菌门为优势菌门。在15‰的坡度下，放线菌门的丰度显著减小，高流速条件下不利于生物膜上放线菌的生存。另外，生物膜中存在一定丰度的Nitrospirae (硝化螺旋菌门) (0.12%±0.01%)，这证明生物膜中存在硝化过程。Paenarthrobacte (38.35%±5.50%)、Ensifer (剑菌属) (17.11%±1.50%)和Spingopyxis (11.73%±4.32%)是生物膜中的优势细菌属。Paenarthrobacte是一种好氧生长的球形放线菌，可以利用多种碳源，并且可以水解淀粉类物质[15]。剑菌属是一种好氧生长的杆状变形菌，能够利用包括葡萄糖、半乳糖在内的多种碳源，不能水解淀粉，具有硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，能够附着在其他细菌表面并使其裂解，是一种非专性捕食性细菌[16]。Spingopyxis是一种好氧生长的呈黄色外观的杆状变形菌，可以利用多种碳源，没有发酵功能，不能水解淀粉，部分种有硝酸盐还原能力[17]，它的存在解释了灰水管道生物膜淡黄色外观的成因。优势细菌属都能利用多种碳源，说明小管径重力流灰水管道生物膜对于多种有机物都有一定的生物降解能力。坡度对细菌优势属的相对丰度有显著的影响：5‰和10‰坡度下细菌丰度差异不明显，而15‰坡度下的细菌丰度与前2个坡度有显著差异。主要表现在15‰坡度下，Paenarthrobacte、Hydrogenophaga(噬氢菌属)和Haliangium丰度降低，而Ensifer (剑菌属)、Spingopyxis、Sphingobium (鞘脂菌属)和Pseudomonas (假单胞菌属) 丰度升高。
为深入分析管道坡度对细菌群落结构的影响，在属水平下进行LEfSe分析(图8)。图8只显示满足线性判别分析LDA值大于3.5的差异指示物种。LEfSe分析表明，在本研究中的3个管道坡度下，管道生物膜的细菌中共有24个差异指示物种，其中5‰坡度下含有10个，10‰坡度下含有5个，15‰坡度下含有9个，差异指示物种的丰度在相应的坡度下的丰度显著高于另外2个坡度的丰度。5‰坡度下的差异指示物种包括Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Rhodobacterales (红杆菌目)、Flavihumibacter、Bacteroidetes (拟杆菌门)、Sphingobacteriaceae (鞘脂杆菌科)、Sphingobacteriia (鞘脂杆菌纲)、Flavobacteriales、Chitinophagaceae、Sphingobacteriales (鞘脂杆菌目)、Flavobacteriia。10‰坡度下的差异指示物种包括Actinobacteria (放线菌门)、Paenarthrobacter、Micrococcales (微球菌目)、Micrococcaceae (微球菌科)、Actinobacteria (放线菌门)。15‰坡度下的差异指示物种包括Alphaproteobacteria (α变形菌纲)、Proteobacteria (变形菌门)、Terrimonas、Thiotrichaceae (硫发菌科)、Thiotrichales (硫发菌目)、Blastomonas (芽单胞菌属)、Beggiatoa (贝日阿托菌属)、Obscuribacterales、Desulfurellales (硫还原菌目)。5‰、10‰、15‰ 3个坡度下差异贡献最大的指示物种分别是Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Actinobacteria (放线菌门)和Alphaproteobacteria (α变形菌纲)。管道敷设坡度的变化可显著影响小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构。
2.3 氮循环和硫循环功能细菌分布特征
排水管道生物膜中的功能细菌主要由氮循环细菌和硫循环细菌组成，一般可以将其分为反硝化细菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫酸盐还原细菌和硫氧化细菌5类[18-20]。本研究利用基于通用引物的高通量测序技术，研究了小管径重力流灰水管道生物膜中功能细菌(属水平)的分布特征(表3)。在本研究中，灰水管道生物膜中存在大量的以Pseudomonas (假单胞菌属) (2.78%±0.56%)和Rhodobacter (红杆菌属) (2.05%±0.94%)为主体的含有反硝化细菌的属，其中，假单胞菌属下的部分种属于好氧反硝化细菌[21]，含有反硝化细菌的属总丰度随着管道坡度的增大而逐渐降低。Nitrospira (硝化螺菌属) (0.13%±0.01%)是本研究中唯一检出的一种硝酸细菌属，以Acidiphilium (嗜酸菌属) (0.04%±0.02%)为主要代表的硫氧化菌属也有检出。在0.01%的检出限下，没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。在排水系统中，亚硝酸细菌的丰度比硝酸细菌的丰度大约低一个数量级[22]，而本研究中灰水管道生物膜的硝酸细菌丰度仅为0.1%左右，因此，亚硝酸细菌在基于通用引物的高通量测序中难以检出。
表 3 灰水管道生物膜功能细菌相对丰度(属水平)Table 3. Relative abundance of functional bacteria in gray water sewer biofilms at genus level功能菌 属名 相对丰度/% 坡度5‰ 坡度10‰ 坡度15‰ 含有反硝化细菌的属 Rhodobacter 2.745 2.423 0.986 Pseudomonas 2.121 1.990 3.024 Paracoccus 0.735 0.681 0.273 Aeromonas 0.491 0.594 0.828 Xanthomonas 0.296 0.258 0.139 Acinetobacter 0.262 0.214 0.277 Microbacterium 0.093 0.065 0.058 Vibrio 0.086 0.081 0.130 Bacillus 0.081 0.083 0.082 Rhizobium 0.064 0.065 0.171 Comamonas 0.045 0.044 0.028 Erythrobacter 0.019 0.022 0.050 硝酸细菌 Nitrospira 0.126 0.132 0.118 硫氧化细菌 Acidiphilium 0.059 0.049 0.017 Sphingomonas 0.004 0.006 0.011 Beggiatoa 0.001 0.008 0.029 | Show TableDownLoad:
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在本研究中，基于通用引物未能检出硫酸盐还原菌，说明硫酸盐还原菌在管道生物膜内丰度很低，这可能是由于2个原因：其一，灰水中不含人类粪便，生活污水中的硫酸盐还原菌主要源自人类粪便[23]，本研究采用的灰水引入的硫酸盐还原菌数量较少；其二，在硫酸盐还原菌适宜生长在厌氧环境中，而本研究是好氧管道系统，环境条件不利于硫酸盐还原菌的生长。小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的反硝化菌和一定量的硝化细菌，而在生物膜中的硫酸盐还原菌没有达到检出水平，表明小管径重力流灰水管道具有一定的生物脱氮功能并且H2S积累的风险很低。输送生活污水的小管径重力流管道普遍存在的H2S积累问题，在小管径重力流灰水管道中可以忽略，这一现象有利于小管径灰水管道的安全应用和大范围推广。
2.4 氮循环功能基因分布特征
基于2.3节中功能细菌的分析结果，小管径重力流灰水管道生物膜中S循环过程(特别是H2S产生过程)基本可以忽略，而反硝化菌广泛存在于自然界中，其属水平的分类尚不完全，并且已确认的反硝化菌属中并非所有的菌种都具备反硝化功能[24]，须从功能基因的角度进行深入分析，因此，本章节探讨氮循环功能基因在不同坡度管道下的分布特征。硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图9所示。由于灰水管道生物膜中基本不含亚硝化细菌，因此，氨单加氧酶基因amoABC以及羟胺氧化酶基因hao基本没有预测丰度，而灰水管道生物膜中一定丰度的硝化细菌携带的亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB预测丰度很高，这明确了灰水管道生物膜中硝化作用的存在。随着管道坡度的增大，亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB的丰度均显著增大，管道生物膜的硝化作用增强，说明大坡度的管道有利于灰水氨氮的去除。反硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图10所示。硝酸盐还原酶基因narGHI和napAB、亚硝酸盐还原酶基因nirK、一氧化氮还原酶基因norBC以及氧化亚氮还原酶基因nosZ在生物膜中均能大量预测到，这说明虽然本研究的灰水管道处于好氧运行状态，但其管道生物膜上仍然可以发生完整的反硝化过程。另外，nosZ的丰度显著小于其他反硝化基因，说明在灰水管道生物膜上发生的反硝化过程主要的终产物是N2O，这与好氧反硝化的终产物相吻合，同时结合管道的好氧状态，可以确定小管径灰水管道生物膜主要发生好氧反硝化过程。在15‰坡度下，灰水管道生物膜的反硝化功能基因总数显著高于另外2个坡度，表明大坡度的管道敷设方案可以加强灰水在管道内的反硝化过程，有利于灰水的生物脱氮过程。综合硝化功能基因和反硝化功能基因的预测结果，采用大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用。根据农村地区的污水管网敷设工程经验，15‰的管道敷设坡度在很多农村地区都具有实际应用的可行性，因此，对于小管径重力流灰水管道，在地质条件和经济条件允许的情况下，应尽量采用大坡度(15‰)的管道敷设方案。
3. 结论
1)小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的细菌、真菌乃至原生动物。其中细菌主要以Proteobacteria (变形菌门)、Actinobacteria (放线菌门)和Bacteroidetes (拟杆菌门)为主，优势菌属为Paenarthrobacte、Ensifer (剑菌属)和Spingopyxis。管道坡度的变化会显著影响灰水管道生物膜细菌群落组成。
2)管道功能菌主要以反硝化细菌、硝酸细菌和硫氧化细菌为主。基于通用引物的Illumina HiSeq高通量测序没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。小管径重力流灰水管道具有生物脱氮潜力，H2S积累风险低，有利于其推广应用。
3)灰水管道生物膜中具有完整的反硝化过程功能基因，反硝化过程以好氧过程为主。亚硝化过程功能基因缺失，硝化过程功能基因丰富。大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案可以提高氮循环相关功能基因丰度，有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用，在条件允许的地区，应优先采用大坡度(15‰)的灰水管道设计方案。
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图 2 基于NMDS分析的二维排序图（a）Unweighted UniFrac，（b）Weighted UniFrac
Figure 2. 2D distribution figure based on NMDS analyses
图 3 门水平上的菌群结构及分布
Figure 3. The structure and distribution of flora at the phylum level
图 5 （a）微生物群落的5级进化分支图，（b）基于LEfSe分析结果（LDA值设为4.3）的微生物标记物
Figure 5. （a）Five-level cladogram of microbial communitiesand ,（b）Biomarker based on the analyse results of LEfSe (LDA score set as 4.3)
表 1 SBR反应器运行条件
Table 1. Operating conditions of SBR reactors
FA/（mg·L−1） 初始运行参数Initial operational parameters 运行周期及各阶段反应时间/minPhase time of the SBR COD/（mg·L−1） NH4+-N /（mg·L−1） 温度/ ℃Temperature pH 周期时间One cycle 进水Filling 曝气Aeration 缺氧Anoxia 沉淀排水Setting 0.5 80 40 20±2.0 7.5±0.2 520 5 270 180 45 5 80 90 25±2.0 8.0±0.2 570 5 300 200 25 10 80 130 30±2.0 8.0±0.2 660 5 360 240 25 15 80 55 35±2.0 8.5±0.2 490 5 240 160 45
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表 2 4组活性污泥样品中微生物群落的丰富度及多样性
Table 2. Four groups in activated sludge samples the richness and diversity of microbial communities
样品Samples 有效序列数Amount of effective sequencing OTUs 微生物数量Amount of microbial groups 细菌群落的α多样性α-diversity of bacterial community 门Phylum 纲Class 目Order 科Family 属Genus 种Species Chao1 ACE Shannon Simpson R0.5 45637 2766 27 55 69 101 137 54 1915 1915 8.83 0.99 R5 40901 2521 20 48 58 79 107 47 1731 1732 7.85 0.97 R10 44160 1349 17 31 44 57 68 33 1238 1268 6.24 0.94 R15 38423 1438 20 39 59 74 79 41 1169 1179 5.68 0.86
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表 3 门水平上样品中的主要菌群
Table 3. The main flora in the samples at the phylum level
门水平微生物Taxon 总计Total 样品Samples R0.5 R5 R10 R15 变形菌门（Proteobacteria） 54.50% 45.90% 53.49% 48.17% 70.46% 拟杆菌门（Bacteroidetes） 25.95% 31.17% 19.55% 41.25% 11.84% 绿弯菌门（Chloroflexi） 4.05% 4.40% 3.85% 3.10% 4.86% Parcubacteria 3.59% 0.95% 13.35% 0.06% 0.01% 浮霉菌门（Planctomycetes） 3.15% 6.80% 1.35% 0.49% 3.96% 硝化螺旋菌门（Nitrospirae） 2.78% 6.15% 2.44% 1.57% 0.96% Ignavibacteriae 1.27% 1.24% 2.54% 0.38% 0.89% 绿菌门（Chlorobi） 0.99% 1.24% 0.40% 0.03% 2.28% Omnitrophica 0.60% 0.01% 2.37% 0.00% 0.00%
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表 4 属水平上样品中的主要菌群
Table 4. The main flora in the samples at the genus level
属水平微生物 Taxon 总计 Total 样品Samples R0.5 R5 R10 R15 陶厄氏菌属（Thauera） 31.97% 5.05% 28.76% 37.78% 56.29% 腐螺旋菌属（Saprospiraceae） 8.78% 21.45% 13.08% 0.36% 0.24% 噬纤维菌属（Cytophagaceae） 8.38% 1.46% 0.09% 31.10% 0.85% 赖文氏菌属（Lewinella） 4.86% 1.21% 1.44% 9.03% 7.76% 动胶菌属（Zoogloea） 4.60% 11.23% 5.12% 1.09% 0.94% 厌氧绳菌属（Anaerolineaceae） 3.21% 3.28% 3.16% 2.22% 4.16% 硝化螺旋菌属（Nitrospira） 2.78% 1.57% 0.96% 6.14% 2.44% 脱氯菌属（Dechloromonas） 2.40% 0.04% 9.51% 0.05% 0.00% 丛毛单胞菌属（Comamonadaceae） 1.63% 2.66% 2.32% 1.20% 0.33% OM190 1.42% 4.46% 0.88% 0.30% 0.05% 固氮弓菌属（Azoarcus） 1.30% 3.68% 0.85% 0.38% 0.30% 食酸菌属（Acidovorax） 1.27% 1.08% 3.88% 0.09% 0.03% 亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas） 1.25% 0.13% 1.09% 3.17% 0.60% 浮霉菌属（Planctomycetaceae） 1.01% 0.12% 0.11% 0.07% 3.76%
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