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人工湿地是一种集生态和景观性于一体的高效低耗的废水生态处理技术。随着人工湿地越来越广泛的应用于处理垃圾渗滤液、畜禽养殖废水厌氧消化液和食品废水等高氮低碳废水，有机碳源的匮乏已成为制约人工湿地高效脱氮的瓶颈，特别是针对总氮（TN）的高效去除[1-2]。长期以来，反硝化作用被人们一直认为是将活性氮转化为氮气（N2）的唯一途径，然而在实际运行的湿地中，针对高氮低碳废水的传统硝化和反硝化脱氮能力被限制在一定水平，且由于传统厌氧反硝化过程需要大量碳源，往往需要外加碳源以补充其不足，从而导致其处理废水成本较高[1, 3]。
近年来日益成熟的厌氧氨氧化处理工艺为解决此问题提供了新的途径。厌氧氨氧化（anaerobic ammonia oxidation, anammox）过程是指在厌氧条件下分别以氨盐（NH4+）和亚硝酸盐（NO2−）为电子供体和电子受体的高效生物脱氮过程，该过程无需碳源，且伴随硝酸盐（NO3−）的生成[4-5]。随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR和高通量测序已被用于人工湿地中厌氧氨氧化菌的研究[5-7]。厌氧氨氧化过程已经被证明可以成为人工湿地中主要的脱氮过程，发挥高效的脱氮作用[1, 6, 8]。同时有研究表明，在人工湿地中厌氧氨氧化菌呈现出种群多样性[6, 8]；C/N比、植物等环境因子和反硝化作用等脱氮过程对厌氧氨氧化菌的群落、丰度有着重要的影响[5, 9-10]。
目前虽然有学者对不同C/N条件下厌氧氨氧化菌在人工湿地的存在特征有少量研究，但在不同C/N和湿地植物多重耦合作用下针对处理高氮低碳废水的人工湿地中厌氧氨氧化菌的存在特征却尚乏报道。基于此，本文通过不同C/N比和植物配置，构建4组垂直流人工湿地处理高氮低碳废水，考察各湿地中氮污染物的去除差异；利用荧光定量PCR和高通量测序技术，对比研究各湿地的微生物群落、主要功能微生物及厌氧氨氧化菌的存在特征，进一步探讨C/N和湿地植物多重耦合作用下对湿地中厌氧氨氧化菌的影响特征。
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4组垂直流人工湿地反应器均采用3 mm厚的有机玻璃进行构建，反应器尺寸均为20 cm × 17.0 cm × 40 cm。湿地填料（砾石）取自处理高氮低碳废水的、运行3年后闲置1年的潜流人工湿地中试系统，每个人工湿地的填料层高度为30 cm，砾石粒径分布为5—22 mm，孔隙率为0.38，湿地床高为35 cm。反应器进水方式均为自下而上，进水口位于反应器底部。
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根据进水C/N比和湿地植物配置将4个人工湿地分别命名为T1、T2、T3、T4，具体为（1）T1：无碳源（C/N = 0），无湿地植物；（2）T2：无碳源（C/N = 0），湿地植物为鸢尾；（3）T3：有碳源（C/N = 0.5），无湿地植物；（4）T4：有碳源（C/N = 0.5），湿地植物为鸢尾。4个湿地反应器均采用间歇进水，周期为3 h，包括进水阶段0.5 h和反应阶段2.5 h，水力负荷均为2 cm·d−1。根据猪场养殖污水厌氧消化液的高氮低碳特性，本试验用水为人工模拟配制，其实际进水的NH4+-N（NH4Cl）、NO2−-N（NaNO2）、NO3−-N（KNO3）和TN的质量浓度分别为（282.58±16.58）、（395.98±24.31）、（88.03±19.26）、（779.33±53.38） mg·L−1；葡萄糖为有机碳源，COD浓度按需配制。各湿地的水力停留时间均为4.1 d。通过高纯氮气（纯度>99.9%）对湿地配水吹脱0.5 h控制湿地进水溶解氧DO<1 mg·L−1。进水pH值控制在7.5—8.5。各湿地的运行环境温度为（25±2） ℃。各湿地开始运行之前，试运行40 d以恢复湿地微生物的活性，之后开始正式运行，运行时间为90 d。
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正式运行期间，各湿地进出水样品采集周期均为每2 天采集1次。各湿地运行结束（第90 天）后，进行填料样品采集，从每个湿地中的不同层（0—10、10—20、20—30 cm）采集填料样品，混合均匀后将其保存于–20 ℃待DNA的提取和后续分子生物学的分析。
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水质指标NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N和TN的测定参照《水和废水监测分析方法》（第四版）[11]。溶解氧和pH测定采用Muti 3620 IDS水质分析仪。
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将采集到的湿地填料经摇床重复振荡洗脱3次至生理盐水中，收集洗脱液并经0.2 μm的水系滤膜抽滤，洗脱的微生物即存在于滤膜上，遂将滤膜剪碎，以用于DNA的提取。湿地填料中DNA提取采用FastDNATM Spin Kit for Soil DNA提取试剂盒（MP Biomedicals, USA），并用Nano Drop 2000UV-Vis Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, USA）测定DNA浓度。采用引物Amx368f/Amx820r扩增厌氧氨氧化菌16S rRNA基因片段。采用1%凝胶电泳检测扩增产物质量和特异性。PCR扩增产物外送用于厌氧氨氧化菌16S rRNA质粒标准品的制备（美吉生物，上海），载体为pMD 18-T。目标基因定量引物序列及退火温度如表1所示。
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荧光定量PCR：厌氧氨氧化菌16S rRNA基因定量采用TransStart® Top Green qPCR SuperMix（SuperMix）试剂盒（全式金，北京）进行荧光定量PCR（qPCR）反应（LightCycler480Ⅱ, Roche, Germany）。用引物Amx368f/Amx820r定量厌氧氨氧化菌16S rRNA的拷贝数，20 µL反应体系为：DNA模板2 µL，引物各0.4 µL，SuperMix 10 µL，ddH2O 7.2 µL，反应程序为：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。每个样品做3次平行，最终结果扩增效率在90%—110%之间，可决系数R2 > 0.99，溶解曲线为单一峰。
高通量测序：提取的填料样品DNA送生工生物工程（上海）公司开展Miseq高通量测序。细菌16sRNA的V3-V4区域的PCR扩增引物为341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。
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利用和Origin 8.0和SPSS软件，进行数据分析和绘图。并采用单因素方差（One-way ANOVA）分析多组数据间的差异性，其显著水平设为P<0.05。图中相关数据为平均值±标准差。
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经90 d的运行，4个人工湿地对NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N和TN的去除效果如图1所示。T1、T2、T3和T4对NH4+-N的去除率分别为（93.52±1.72）%、（96.74±2.16）%、（94.50±3.35）%和（95.97±2.52）%，去除效果均较好，无显著性差异（P>0.05），其中T2的去除效果最优。此外T2对NO2−-N的去除率亦最高，为（93.06±7.91）%，T1湿地去除率最低，仅为（77.96±11.72）%，T1和T2对NO2−-N的去除存在显著性差异（P<0.05）。T1、T2、T3和T4中NO3−-N均有不同程度的生成，呈现T4<T3<T2<T1，这表明有植物的湿地NO3−-N生成量均低于无植物湿地，有碳源湿地均低于无碳源湿地，这与Lin等[13]研究一致。TN作为考察人工湿地脱氮性能的重要指标，T1、T2、T3和T4的TN去除率分别为（75.48±6.41）%、（84.90±3.96）%、（77.94±7.43）%和（80.16±4.32）%，且T2与T1、T3、T4对TN的去除均存在显著性差异（P<0.05）。T1和T2中C/N为0，T3和T4中C/N（=0.5）亦较低，但各湿地仍发挥出较高的TN去除效果且伴随NO3−-N生成，而反硝化脱氮过程需要足够的碳源（C/N=2—5）作为电子供体将硝酸盐转化为氮气[14]，厌氧氨氧化过程是将NH4+-N和NO2−-N转化为氮气，同时生成NO3−-N，此过程无需碳源，因此猜测厌氧氨氧化过程是各湿地中氮污染物去除的主要途径。
T1、T2、T3和T4的TN去除效果呈现出T1<T3<T4<T2，表明有植物无碳源湿地的脱氮效果最佳；有碳源湿地的脱氮效果优于无碳源无植物湿地；且有植物湿地的脱氮效果优于无植物湿地。Lin等[13]发现添加碳源后，种植植物湿地去除NO3−-N的能力明显高于无植物湿地。夏艳阳等[10]发现，有碳源有植物系统对NH4+-N和TN的去除效果优于有碳源无植物系统的去除效果，与本研究一致。此外，添加的碳源有助于反硝化过程，去除一部分由厌氧氨氧化过程产生的NO3−-N，提高TN的去除效果[10]。
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采集到的湿地填料样品提取DNA后，针对厌氧氨氧化菌16S rRNA基因进行PCR扩增并经1%凝胶电泳特异性检测，初步检出各湿地中存在厌氧氨氧化菌，之后通过qPCR定量填料样品中的厌氧氨氧化菌16S rRNA基因拷贝数。Anammox bacterial 16S rRNA是参与厌氧氨氧化过程中NH4+-N和NO2−-N转化的关键基因，厌氧氨氧化菌的基因丰度分布特征如图2所示。T1、T2、T3和T4湿地的厌氧氨氧化菌基因丰度分别为2.20 × 108、2.88 × 108、2.34 × 108、2.42 × 108 copies·g−1。相较于T1、T3和T4中的厌氧氨氧化菌基因丰度略微提高，但增长不显著，而T2的厌氧氨氧化菌基因丰度增长幅度最大，这表明有植物无碳源的湿地系统可能更有利于厌氧氨氧化菌的生长富集，可能是因为植物根际提供的好氧-缺氧-厌氧微环境促进了厌氧氨氧化菌的生长，且植物根际会分泌一部分碳源，在反硝化菌的作用下利用碳源将硝酸盐还原为亚硝酸盐为厌氧氨氧化菌提供底物[10]。
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基于反应器90 d的运行，利用高通量测序技术对4组人工湿地的微生物群落结构进行分析，如图3所示，门相对丰度大于1%。由图3可知，变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacterodidetes)等在各人工湿地中相对丰度较高，且是人工湿地和厌氧氨氧化反应器的优势菌种[4-6, 9]。
变形菌门中包含许多参与硝化-反硝化脱氮过程和有机物生物降解转化的菌属[15]，相较于其他菌门其在各湿地中的相对丰度均最高（>40%）。厌氧氨氧化菌属于浮霉菌门，因此其占比可反映出各湿地的厌氧氨氧化性能。T1、T2、T3和T4湿地的浮霉菌门的相对丰度存在显著差异，分别为13.38%、17.48%、6.54%、8.14%，表明植物对浮霉菌门的富集发挥促进作用，而有机物表现出抑制作用，猜测原因可能是有机物对厌氧氨氧化菌生长的抑制[4]。绿弯菌门是厌氧氨氧化系统常见的细菌，可产生生物膜结构，在缺氧条件下清除厌氧氨氧化菌可产生的代谢物且有助于厌氧氨氧化菌形成颗粒态[16]。绿弯菌门相对丰度呈现出T1>T2>T3>T4。装甲菌门(Armatimonadetes)也是厌氧氨氧化系统中常见的细菌，其可能会导致氨氮的过度消耗，导致厌氧氨氧化细菌可利用底物不足[17]。T3（2.95%）和T4（1.71%）中的厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度高于T1（0.69%）和T2（0.66%），这是因为厚壁菌门具有反硝化作用，而T3和T4中外加的碳源为其提供了足够的底物[4]。放线菌门属于革兰氏阳性细菌，大部分是异养细菌，对有机物有一定的降解能力，其相对丰度呈现T3>T1>T4>T2，表明适当的有机物和植物对其生长富集有强化作用。植物和碳源显著影响湿地系统内部微生物群落结构与多样性，因此湿地植物、碳源与微生物之间存在相互影响、相互作用关系[18-20]。从整体来看，4组垂直流湿地中的微生物群落均较为丰富，但微生物群落结构存在显著性差异。
基于4组垂直流人工湿地中的微生物群落结构发生了显著性变化，对各湿地中参与脱氮过程的主要功能微生物进行分析，探究各湿地内部主要功能微生物的存在特征及差异。
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硝化-反硝化过程被认为是人工湿地中重要的微生物脱氮途径，其主要参与者为硝化细菌（氨氧化细菌、亚硝化细菌）和异养反硝化细菌，基于高通量测序结果对各湿地中硝化细菌和反硝化细菌进行筛选分析，共检测出8种反硝化菌属和6种硝化菌属，见表2。
Flavobacterium属是具有代表性的反硝化菌属[6, 21]，其在T1、T2、T3和T4中相对丰度均最高，且显著高于其他反硝化菌属，是各湿地反硝化菌中的优势菌属。除Flavobacterium属外，Thermomonas属是常见的兼性异养反硝化细菌，Pseudomonas属是需氧自养菌[6]。Thermomonas属在T2、T3和T4中相对丰度显著高于其他反硝化菌属，而T1中Pseudomonas属占比最高。T1、T2、T3和T4中的反硝化菌相对丰度分别为2.48%、5.83%、8.63%、10.17%，呈现出T4>T3>T2>T1，表明有机物是反硝化菌生长富集的重要限制因子，且植物对反硝化菌的富集有积极作用[10]。Ye等[22]研究发现植物根系分泌物可以加速反硝化细菌的生长，同时能一定程度上提高微生物丰富度和生物多样性。此外，植物的根际可为反硝化菌提供一部分碳源，强化其生长富集。硝化菌属包含氨氧化菌属和亚硝酸盐氧化菌属。如表2所示，其中Nitrosomonas和Nitrosovibrio是将NH4+-N转化为NO2−-N的氨氧化菌[6, 23]，Nitrospira、Nitrosococcus、Nitrolancea和Nitrobacter是将NO2−-N转化为NO3−-N的亚硝酸盐氧化菌[24-25]。相较于反硝化菌属，各湿地中的硝化菌属相对丰度明显较低。T4中的硝化菌属相对丰度最高（0.89%），而T1、T2、T3中硝化菌属占比无明显差别（0.44%、0.56%、0.42%），表明有植物有碳源的湿地系统更有利于硝化细菌的富集生长。Nitrosomonas和Nitrobacter均是T1和T2中的硝化菌中的优势菌属，而Nitrosomonas是T3和T4中的优势菌属，且湿地中的Nitrosomonas和Nitrobacter属相对丰度具有较大差异，这表明碳源的添加可显著改变湿地系统的硝化菌属结构。从整体来看，植物和碳源对4组人工湿地中硝化菌属和反硝化菌属的群落结构及占比具有显著影响，可见植物和碳源是硝化反硝化菌群落演替的重要因子。
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厌氧氨氧化过程作为一种新型微生物脱氮过程，其主要参与者是厌氧氨氧化菌[5]，为考察在有无植物和碳源情况下厌氧氨氧化菌群落的存在特征，通过高通量测序共检出4种厌氧氨氧化菌属，如图4所示。在4组湿地系统中均检出Candidatus Kuenenia、Candidatus Brocadia、Candidatus Scalindua和Candidatus Jettenia属。Candidatus Kuenenia属在各湿地中相对丰度最高，分别为6.61%、10.47%、4.91%和6.92%，且均占厌氧氨氧化菌属的比例很高（>90%），说明其是4组湿地系统中厌氧氨氧化菌属的重要组成，发挥积极的脱氮作用。此外，T2（0.51%）和T4（0.43%）中的Candidatus Scalindua属相对丰度显著高于T1（0.19%）和T3（0.13%）。而Candidatus Brocadia和Candidatus Jettenia属相对丰度在各湿地之间无明显差异。Candidatus Kuenenia属更适宜在低氮负荷下生长，而Candidatus Brocadia属更适宜在高氮负荷下富集[7]，这与本研究的结果相反。这可能是因为本研究中湿地进水中的亚硝酸盐底物相对充足，而Candidatus Kuenenia属相较Candidatus Brocadia属对亚硝酸盐底物有更高的亲和力[26]。van der Star等[7]研究表明厌氧氨氧化菌属群落的组成受氮负荷、C/N比、溶解氧浓度等因素的影响较大。T1、T2、T3和T4中的厌氧氨氧化菌属相对丰度分别为6.83%、11.03%、5.06%和7.38%，表明厌氧氨氧化菌属是各湿地系统中的优势脱氮菌，呈现出T2>T4>T1>T3。厌氧氨氧化菌属相对丰度在各湿地之间存在显著性差异（P<0.05）。Wang等[9]研究表明，相较于反硝化过程，C/N比低于2时更有利于厌氧氨氧化过程的进行。在高C/N比下，NO2可能主要用于反硝化过程，而非厌氧氨氧化过程[14]。本研究中，较低的C/N比和较高的氮污染物浓度可为厌氧氨氧化菌的生长提供适宜的生境，但碳源的添加和植物的配置仍会对厌氧氨氧化菌的富集生长产生一定的影响。以上结果表明，有植物无碳源的湿地系统更加有利于厌氧氨氧化菌的生长繁殖，而碳源的添加一定程度上会对起抑制作用，但植物在一定程度上可缓解碳源对厌氧氨氧化菌生长的抑制。
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（1）各人工湿地系统对NH4+-N、NO2−-N和TN均有较好且稳定的去除效果。其中有植物无碳源湿地系统的脱氮效果最佳，TN平均去除率可达84.90%；有碳源湿地系统的脱氮效果优于无碳源无植物湿地系统；且有植物湿地的脱氮效果优于无植物湿地。各人工湿地系统的主要脱氮途径为厌氧氨氧化过程，且在不同程度上存在厌氧氨氧化与反硝化的协同耦合脱氮。
（2）各湿地中的微生物群落均较为丰富，其中优势菌门为变形菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、放线菌门和拟杆菌门。但由于C/N和植物配置差异，微生物群落结构存在显著性差异。
（3）各湿地系统中均检出4种厌氧氨氧化菌属，其中Candidatus Kuenenia属在各湿地中占比最高（>90%），且其在无碳源有植物湿地中显著高于其他3组湿地。受C/N和植物配置差异影响，各湿地中的厌氧氨氧化菌属结构之间存在一定差异。相较于其他三组湿地，有植物无碳源湿地更有利于厌氧氨氧化菌的生长富集。
处理高氮低碳废水的垂直流人工湿地中厌氧氨氧化菌分布特征
Distribution characteristics of anammox bacteria in vertical flow constructed wetlands for treating high-nitrogen wastewater with low carbon
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摘要: 为探明C/N和湿地植物对湿地中厌氧氨氧化菌的影响特征，基于不同C/N比和植物配置，构建4组垂直流人工湿地处理高氮低碳废水，研究其对氮污染物的去除特征差异，并利用荧光定量PCR技术和高通量测序技术对湿地中的主要功能微生物及厌氧氨氧化菌的分布特征进行分析。结果表明，在进水TN浓度为779.33 mg·L−1时，各湿地的TN平均去除率分别为75.48%、84.90%、77.94%和80.16%。整体来看，无碳源有植物湿地的脱氮效果最佳；有碳源湿地的脱氮效果优于无碳源无植物湿地；且有植物湿地的脱氮效果优于无植物湿地。各湿地中微生物群落结构在门上平上存在显著差异，且厌氧氨氧化菌属结构存在显著差异。 各湿地中均检出4种厌氧氨氧化菌属，其中Candidatus Kuenenia属在各湿地中占比最高（> 90%）。无碳源有植物湿地中厌氧氨氧化菌属相对丰度最高，且有植物湿地均高于无植物湿地，表明有植物无碳源的湿地系统更加有利于厌氧氨氧化的生长繁殖，而碳源的添加会对其起抑制作用，但植物在一定程度上可缓解碳源对厌氧氨氧化菌生长的抑制。各人工湿地系统的主要脱氮途径为厌氧氨氧化过程，且在不同程度上存在厌氧氨氧化与反硝化的协同耦合脱氮。Abstract: Based on different C/N ratio and plant configurations, four sets of vertical flow constructed wetlands (CWs) were constructed to treat high-nitrogen wastewater with low-carbon. The differences in characteristics of nitrogen pollutants treatment were studied, and the distribution characteristics of the main functional microorganisms and anaerobic ammonia oxidation (anammox) bacteria were analyzed. The results showed that when the influent TN concentration was 779.33 mg·L−1, the average removal efficiencies of TN in each CWs were 75.48%, 84.90%, 77.94% and 80.16%, respectively. By comparison, the CW treatment with plants and no carbon source showed the best nitrogen removal performance, and the CW treatment with carbon sources attained better nitrogen treatment performance than CW treatment with no carbon sources and no plants. Meantime, the CWs treatment with plants nitrogen treatment performance was better in than CWs without plants. At phylum level, there were significant differences in the microbial community structure in each CWs. Besides, there were significant differences in the structure of anammox bacteria among CWs. Four anammox bacteria genera were detected in each CWs, in which Candidatus Kuenenia accounted for the highest proportion (> 90%). The relative abundance of anammox bacteria genera in CW with plants and no carbon sources was the highest, and CWs with plants are higher than CWS without plants, indicating that CW system with plants and no carbon sources are more conducive to the growth and reproduction of anammox bacteria. The addition of carbon source inhibited the growth and reproduction of anammox bacteria, but plants could alleviate the inhibition of carbon source on the growth of anammox bacteria to a certain extent. The main nitrogen removal pathway of each CWs system was anammox process. And to varying degrees, there was synergistic coupling of anammox process and denitrification process for nitrogen removal.
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氯代多环芳烃（Cl-PAHs）是饮用水氯消毒[1]、电子垃圾的处理[2-3]、金属冶炼[4]、垃圾焚烧[5-6]以及烹饪[7]等人类活动过程中产生的副产物，它具有与多氯联苯和二噁英相似的平面结构和类似的环境行为[8]，其毒性与多环芳烃母体相当甚至高于母体。目前已在大气[9-10]、沉积物[11]、汽车尾气[12]、冶炼厂废气[4]、垃圾焚烧厂的飞灰和烟道气[6]及烧烤食品[7]中检测到氯代多环芳烃。氯代多环芳烃作为一类新型的高风险有机污染物广泛存在于环境中，对人类健康具有一定的潜在威胁。
氯代多环芳烃（Cl-PAHs）和多环芳烃(PAHs)主要通过工业废水排放和大气沉降进入地表，造成土壤污染。低水溶性和相对较高的辛醇-水分配系数(lgKow)可导致其在土壤中的积累。目前土壤中多环芳烃的测定方法有索氏抽提-高效液相色谱法[13]、微波萃取-高效液相色谱法[14]、加速溶剂萃取气相色谱-质谱法[15-16] 、加速溶剂萃取高效液相色谱法[17] 等。土壤中氯代多环芳烃的测定方法主要有加速溶剂萃取气相色谱-质谱法[18-19]、超声萃取高效液相色谱法[3]、索氏抽提萃取气相色谱-质谱法[20] 等。加速溶剂萃取设备昂贵；索氏抽提虽然设备简单但要消耗大量的有机溶剂。此外这些方法均需要进一步的浓缩、净化，操作过程繁琐，费时费力。因此发展一种简便、快速、成本低廉、环境友好的样品前处理方法对于土壤中氯代多环芳烃（Cl-PAHs）和多环芳烃的测定很有意义。
超分子溶剂（supramolecular solvent, SUPRAS）是指含亲水基和疏水基的两亲性分子在水溶性有机溶剂作用下分散在水相中，通过疏水相互作用按照一定的顺序形成的一种具有纳米结构的胶束聚集体。超分子溶剂微萃取(supramolecular solvent-based microextraction, SSBME)是由西班牙学者Rubio 等[21]提出的一种以超分子溶剂为萃取剂的新型萃取技术。超分子溶剂的一个显著特点是其具有高浓度的亲和位点，使其在较小的溶剂体积下能取得高的萃取效率，因此特别适用于微萃取；此外超分子溶剂具有纳米孔腔结构，它可以使小分目标化合物进入其中，但对腐殖酸、蛋白质、糖类等大分子具有限制进入作用，从而在萃取的同时可以达到净化的目的；超分子溶剂还有一个优点，它具有非挥发性和不易燃性，使用安全。超分子溶剂微萃取具有简便、快速、环境友好、成本低廉等优点，已经在环境、食品等领域得到了广泛应用。目前已用于鱼和贝类中噁喹酸和氟甲喹[22]、水中磺胺类[23]、生小麦中的赭曲霉毒素A[24]、人尿液中羟基多环芳烃[25]等化合物的分析。
本文尝试采用SSBME结合高效液相色谱法建立一种同时测定土壤中氯代多环芳烃（Cl-PAHs）和多环芳烃(PAHs) 的简便快速方法。
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 仪器与试剂
Agilent 1200 型高效液相色谱仪( 美国安捷伦公司)，配二极管阵列紫外和荧光检测器；Vortex Genie 2涡旋振荡器 (美国 Scientific Industries)；KMS-181E 磁力搅拌器（精凿科技上海有限公司）；飞鸽牌TDL-4013离心机（上海安亭科学仪器厂）；乙腈（LC- grade，美国 Honeywell 公司）；实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水。1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、四氢呋喃购于阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度 ≧98.0%；1-葵醇购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，纯度 98.0%。
16种多环芳烃混标（200 µg·mL−1，其中苊烯无荧光，不在测定之列)及2-氯蒽、9-氯菲、9-氯蒽、9,10-二氯蒽、1-氯芘（纯度大于95%）均购于百灵威化学试剂有限公司。
1.2 色谱条件
色谱条件：色谱柱为多环芳烃专用分析柱（SUPELCOSILTMLC-PAH，150 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相为乙腈-水，采用梯度洗脱，乙腈变化为：0—18 min，40％—64％；18—25 min，64％；25—35 min，64％—100％；35—44 min，100%。流速为2 mL·min−1; 进样量10 μL。
20种目标化合物的荧光激发和发射波长见表1，高效液相色谱图见图1。
表 1 荧光激发和发射波长Table 1. Fluorescent Excitation wavelength and Emission wavelength时间/min Time 激发波长/nm Ex 发射波长/nm Em 0.00 275 330 13.90 255 375 17.90 245 450 19.80 245 370 23.50 265 390 32.40 273 440 36.50 290 410 38.50 240 480 40.00 265 420 | Show Table
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图 1 氯代多环芳烃和多环芳烃的高效液相色谱图（1—20色谱峰对应的化合物见表2）Figure 1. Chromatogram of Cl-PAH and PAH (The number of 1—20 were the same as those in table 2.)1.3 供试土壤样品的制备
40 g 风干的山参种植土用100 mL 丙酮-二氯甲烷（1:1）超声提取3次后，加入100 mL含2400 ng 氯代多环芳烃和多环芳烃的丙酮-二氯甲烷（1:1）溶液，搅拌混匀后于通风橱中氮气吹至近干，继续放置干透后储存于磨口玻璃瓶。此土壤样品含目标化合物60 ng·g−1，用于超分子溶剂的制备及萃取的优化。
1.4 超分子溶剂的制备
移取3 mL1-辛醇于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入8 mL四氢呋喃、29 mL去离子水，然后以900 r·min−1磁力搅拌5 min，静置2 min后3000 r·min−1 离心5 min，用玻璃滴管将上层形成的超分子溶剂转移到具塞玻璃瓶中，放于冰箱4 ℃储存备用。
1.5 超分子溶剂微萃取过程
于5 mL 聚丙烯离心管中加入200 mg 土壤，3粒玻璃珠（3 mm直径），加入400 μL 超分子溶剂，3200 r·min−1蜗旋振荡2 min，然后5000 r·min−1 离心5 min，用1 mL注射器移出上清液，过0.22 μm 滤膜后高效液相色谱测定。
1.6 标准工作曲线用标准样品制备
将16种多环芳烃混标和5种氯代多环芳烃用乙腈配制成10000 µg·L−1的混标储备溶液，并逐级稀释成1000、100、10 ng·mL−1使用液。将此混标使用溶液添加到用丙酮-二氯甲烷（1:1）超声提取过的空白山参种植土中，使添加浓度分别为2.5 、10 、50 、 250、500、1000 ng·g−1, 4 ℃冰箱放置过夜，然后按1.5节方法萃取，用于标准工作曲线的测定。
2. 结果与讨论(Results and discussion)
2.1 萃取条件的优化
以添加60 ng·g−1,目标化合物的200 mg供试土壤样品为萃取对象，以目标化合物的峰面积为指标，考察了超分子溶剂的组成（脂肪醇种类、脂肪醇的量、四氢呋喃量）、萃取溶剂体积、涡旋振荡时间等因素对萃取效率的影响。
2.1.1 不同链长脂肪醇制备的超分子溶剂对萃取效率的影响
超分子溶剂通常由两亲分子在分散剂存在下在水相体系中通过自组装生成。本研究采用烷基醇与四氢呋喃制备超分子溶剂。为此恒定总体积为40 mL，考察了1.5 mL1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、1-葵醇在水中分别与8 mL四氢呋喃制备的超分子溶剂对萃取效率的影响。结果表明随着脂肪醇碳链的增加，制备的超分子溶剂萃取效率逐渐增大。超分子溶剂中有两类亲和位点，一种是极性端羟基产生的氢键作用力，另一种是醇碳链部分的疏水作用力（范德华力、色散力）。对于萃取多环芳烃及氯代多环芳烃这类非极性和弱极性化合物而言，醇碳链部分的疏水作用力起主要作用，而碳链越长，这种作用力越强，因而萃取效率越大。但实验发现1-葵醇制备的超分子溶剂导致部分目标化合物色谱峰展宽且重叠，无法准确定量。故以下实验选1-辛醇制备超分子溶剂。
2.1.2 1-辛醇用量对超分子溶剂体积和萃取效率的影响
四氢呋喃的量保持8 mL，制备体系总体积为40 mL，考察了1-辛醇用量为0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL时对萃取效率的影响。结果表明，改变1-辛醇用量，对制备的超分子溶剂的萃取效率无明显影响；但是随着1-辛醇用量的增加，生成的超分子溶剂体积增大，见图2。有文献[26]报道SUPRAs的体积Y(mL) 与烷基醇的用量X(mg) 和四氢呋喃在溶液中的体积百分比Z之间呈如下关系：Y = X（0.17 + e0.0389Z），即超分子溶剂的体积与醇的用量呈线性关系，本实验结果与文献报道一致。为了一次能制备更多的超分子溶剂，选定1-辛醇用量为3 mL。
2.1.3 四氢呋喃用量对萃取效率的影响
作为超分子溶剂的组成部分，四氢呋喃的用量不仅与制备的超分子溶剂体积有关，而且对超分子溶剂的萃取效率亦有一定影响。为此固定1-辛醇用量为3 mL，制备体系总体积为40 mL，考察了不同四氢呋喃的量对萃取效率的影响，如图3所示。结果表明，四氢呋喃用量的增加对低分子量的目标化合物的萃取效率影响不大；但对于高分子量的目标化合物，随着四氢呋喃用量的增加，萃取效率增大；当四氢呋喃大于8 mL后趋于稳定。因此本实验制备超分子溶剂时选定四氢呋喃的量为8 mL。
图 3 四氢呋喃的量对萃取效率的影响Figure 3. Effect of volume tetrahydrofuran on extraction efficiency2.1.4 超分子溶剂体积对萃取效率的影响
为取得理想的萃取结果，考查超分子溶剂体积分别为300、350、400、500、600、700、800 μL时对萃取效率的影响。结果表明，随着萃取溶剂体积的增大，目标化合物的峰面积明显下降，即检测灵敏度下降；但同时回收率逐渐增大，当超分子溶剂体积大于400 μL时回收率趋于平稳。虽然增加萃取溶剂的体积可以萃取出更多的目标化合物，提高萃取回收率，但同时也会使目标化合物在萃取相中浓度的下降，而二者相比后者影响更大，进而导致检测灵敏度下降。综合以上结果，选定萃取溶剂的体积为400 μL。
2.1.5 涡旋振荡时间的影响
涡旋振荡可以促进萃取溶剂与样品的充分接触，提高萃取效率。为此，考查了涡旋振荡时间分别为1、2、3、4、5、6、7、8 min时对萃取效率的影响，结果表明涡旋振荡时间大于2 min后，目标化合物的峰面积变化很小。
基于以上实验结果，优化后的实验条件为，以3 mL 1-辛醇、8 mL四氢呋喃和29 mL水混合制备超分子溶剂；萃取溶剂的体积为400 μL，涡旋振荡2 min。
2.2 方法的线性范围、检出限及定量限
在优化的萃取条件下，对添加 5 种氯代多环芳烃和15种多环芳烃系列浓度的空白土壤样品进行超分子溶剂微萃取，然后HPLC荧光测定，以质量浓度 C(ng·g−1)对峰面积 A 绘制校正曲线，得到20种目标化合物的线性回归方程、线性范围及相关系数；并以目标化合物的S/N=3时的浓度定义为方法的检出限，S/N=10时的浓度定义为方法的定量限，见表2。结果表明，范围内，目标化合物在2.5—1000 µg·kg−1（9-氯菲、1-氯芘在10—1000 µg·kg−1）范围内线性关系良好，线性相关系数均大于 0.999；方法的检出限为0.07—2.3 µg·kg−1，定量限为 0.2—7.0 µg·kg−1。
表 2 目标化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 2. Linear ranges ,regression equation, correlation coefficients(r), limits of detection (LOD, S/N=3) and limits of quantitation (LOQ, S/N=10) of target compoundsNo. 化合物Compound 线性范围/(µg·kg−1)Linear range 标准曲线方程Regression equation 相关系数R2 检出限/(µg·kg−1)LOD 定量限/(µg·kg−1)LOQ 1 萘(Na) 2.5—1000 A=0.3182C+6.4532* 0.999 0.3 0.9 2 苊(Ace) 2.5—1000 A=0.7244C+2.6573 0.999 0.6 1.8 3 芴(Fl) 2.5—1000 A=1.5523C+0.7832 0.999 0.3 1.0 4 菲(Phe) 2.5—1000 A= 1.1875C+14.6108 0.999 0.2 0.6 5 蒽(Ant) 2.5—1000 A=2.0918C+0.2058 0.999 0.2 0.8 6 荧蒽(Fu) 2.5—1000 A=0.4013C+3.0251 0.999 0.5 1.9 7 芘(Py) 2.5—1000 A=1.0748C+6.6492 0.999 0.2 0.7 8 9-氯菲(9-ClPhe) 10—1000 A=0.0600C+1.0583 0.999 2.3 7.0 9 9-氯蒽(9-ClAnt) 2.5—1000 A=0.4078C+0.8628 0.999 0.7 2.2 10 2-氯蒽(2-ClAnt) 2.5—1000 A=0.8810C+0.2803 0.999 0.5 1.5 11 苯并[a]蒽(BaA) 2.5—1000 A=1.3297C-0.4912 0.999 0.4 1.3 12 䓛(Chr) 2.5—1000 A=1.7998C+5.9356 0.999 0.2 0.6 13 1-氯芘(1-ClPy) 10—1000 A=0.2456C-0.7780 0.999 2.1 5.4 14 苯并[b]荧蒽(BbF) 2.5—1000 A=0.8110C+1.7058 0.999 0.1 0.4 15 9，10-二氯蒽(9,10-DClAnt) 2.5—1000 A=1.6689C+0.0170 0.999 0.1 0.3 16 苯并[k]荧蒽(BkF) 2.5—1000 A= 1.8488C+1.3040 0.999 0.07 0.2 17 苯并[a]芘(BaP) 2.5—1000 A=1.3673C-0.2231 0.999 0.09 0.3 18 二苯并[a,h]蒽(DahA) 2.5—1000 A=1.1604C+2.9443 0.999 0.1 0.4 19 苯并[ghi]苝(BghiP) 2.5—1000 A=0.6349C+0.3495 0.999 0.2 0.6 20 茚并[1，2，3-cd]芘(Ipy) 2.5—1000 A= 0.3413C-0.2224 0.999 0.3 1.0 * A: peak area ；C：concentration（µg·kg−1）. | Show TableDownLoad:
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2.3 实际样品的测定及方法的加标回收率和精密度
用建立的超分子溶剂微萃取高效液相色谱分析方法对山参土（2018年5月采于吉林浑春某地）和大连某地环境污染土壤样品（采于2019年10月）进行了测定。并在山参土样品中添加低、中、高的3个浓度水平的混标溶液，每个浓度水平平行测定3次，结果如表3所示。结果显示，大连某环境污染样品所有目标化合物均检出，且污染严重；山参图样品中检出萘、菲、荧蒽和芘等化合物，其余目标化合物未检出；目标化合物的加标回收率为：76.5%—105.3%，相对标准偏差（RSD）0.2%—8.5%。
表 3 实际样品测定结果、方法的回收率及精密度(n=3)Table 3. Determination results in real soil samples and recoveries and precisions of methods (n=3)化合物Compound 污染土中含量/(µg·kg−1)Content of contamined soil 山参土中含量/(µg·kg−1)Content of mountain soil 加标水平/(µg·kg−1)Spiked level 加标回收率/%Recovery RSD/% 萘(Na) 63.2 8.0 10、100、1000 90.1、97.3、88.3 7.7、3.9、1.6 苊(Ace) 563.1 nd 10、100、1000 83.0、77.9、84.8 8.3、5.4、0.7 芴(Fl) 1442.5 nd 10、100、1000 102.1、86.2、85.1 5.7,3.0,0.5 菲(Phe) 11122.8 8.0 10、100、1000 80.2、91.8、87.0 3.3、1.6、0.6 蒽(Ant) 3756.6 nd 10、100、1000 88.9、77.6、78.2 5.2、0.3、0.6 荧蒽(Fu) 19443.7 3.3 10、100、1000 94.3、79.2、85.7 3.7、4.2、0.2 芘(Py) 21200 7.6 10、100、1000 78.5、100.8、95.6 7.6、2.3、0.5 9-氯菲(9-ClPhe) 2241.6 nd 10、100、1000 78.0、84.9、84.0 7.8、3.4、0.2 9-氯蒽(9-ClAnt) 4901.8 nd 10、100、1000 81.2、90.4、78.6 8.5、3.7、0.6 2-氯蒽(2-ClAnt) 7202 nd 10、100、1000 85.6、86.6、79.1 6.8、5.3、0.4 苯并[a]蒽(BaA) 8787.4 nd 10、100、1000 95.2、88.0、87.3 4.5、1.8、0.3 䓛(Chr) 7392.2 nd 10、100、1000 96.2、89.4、87.6 3.6、2.5、0.3 1-氯芘(1-ClPy) 3022.7 nd 10、100、1000 82.3、87.1、90.7 7.9、4.0、0.5 苯并[b]荧蒽(BbF) 9073.9 nd 10、100、1000 86.5、88.1、88.6 4.2、3.9、0.2 9，10-二氯蒽(9,10-DClAnt) 392.7 nd 10、100、1000 81.2、85.2、83.0 3.6、1.8、0.6 苯并[k]荧蒽(BkF) 4041.7 nd 10、100、1000 90.2、87.9、87.5 3.2、2.4、0.3 苯并[a]芘(BaP) 9703.7 nd 10、100、1000 85.0、89.3、87.6 4.2、3.1、0.4 二苯并[a,h]蒽(DahA) 2581.7 nd 10、100、1000 79.1、89.7、88.4 4.5、2.4、0.2 苯并[ghi]苝(BghiP) 8263 nd 10、100、1000 89.2、105.3、94.8 4.2、1.6、0.6 茚并[1，2，3-cd]芘(Ipy) 7178 nd 10、100、1000 78.3、79.5、76.5 6.8、7.6、2.5 * nd: not detected. | Show TableDownLoad:
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3. 结论(Conclusion)
本文建立了超分子溶剂微萃取结合高效液相色谱荧光检测技术快速测定土壤中5种氯代多环芳烃和15种多环芳烃的分析方法。方法的基质加标回收率为 76.5%—105.3%，相对标准偏差为 0.2%—8.5%。本方法简便、快速、成本低廉且环境友好，样品处理过程不超过15 min，而且一次可同时处理多个样品。本方法可用于土壤中5种氯代多环芳烃和15种多环芳烃的快速分析检测。
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图 1 NH4+-N (a)、NO2--N (b)、NO3--N (c)和TN (d)的去除效果
Figure 1. Treatment performance of NH4+-N (a)、NO2--N (b)、NO3--N (c) and TN (d)
图 2 厌氧氨氧化菌的基因丰度分布特性
Figure 2. Distribution characteristics of genes abundance of anammox bacteria
表 1 目标基因定量引物序列及退火温度
Table 1. Primer sequences and annealing temperature for target genes of q-PCR
目标基因Target gene 引物Primers 引物序列 (5′-3′)Primer sequences 退火温度/℃Annealing temperature 引物长度/bp Primer length 参考文献Reference Anammox 16S rRNA Amx368f TTCGCAATGCCCGAAAGG 56 470 [12] Amx820r AAAACCCCTCTACTAGTGCCC
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表 2 硝化-反硝化相关菌属存在特征
Table 2. Characteristics of nitrification-denitrification bacteria related genus
菌属 Bacterial genera 相对丰度/% Relative abundance T1 T2 T3 T4 反硝化相关菌属 Flavobacterium 2.01 4.06 7.01 8.06 Thermomonas 0.10 1.47 1.17 1.79 Enterobacter 0.00 0.00 0.00 0.00 Pseudomonas 0.16 0.17 0.17 0.20 Hydrogenophaga 0.07 0.02 0.07 0.02 Aeromonas 0.00 0.01 0.00 0.01 Janthinobacterium 0.02 0.01 0.01 0.02 Acidovorax 0.12 0.09 0.19 0.06 总计 2.48 5.83 8.63 10.17 硝化相关菌属 Nitrosomonas 0.12 0.13 0.23 0.70 Nitrosovibrio 0.00 0.01 0.01 0.01 Nitrospira 0.04 0.03 0.05 0.05 Nitrosococcus 0.03 0.03 0.01 0.01 Nitrolancea 0.08 0.08 0.04 0.03 Nitrobacter 0.17 0.28 0.07 0.08 总计 0.44 0.56 0.42 0.89
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