典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例

刘洋, 黄玉冰, 赵甜甜, 向武. 典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104
引用本文: 刘洋, 黄玉冰, 赵甜甜, 向武. 典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104
LIU Yang, HUANG Yubing, ZHAO Tiantian, XIANG Wu. Algae availability of typical peat-derived iron phenol complexes: A study based on Microcystis aeruginosa[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104
Citation: LIU Yang, HUANG Yubing, ZHAO Tiantian, XIANG Wu. Algae availability of typical peat-derived iron phenol complexes: A study based on Microcystis aeruginosa[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104

典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例

    通讯作者: E-mail: xiangw@cug.edu.cn
  • 基金项目:
    国家自然科学基金(41977263,41472316)资助.

Algae availability of typical peat-derived iron phenol complexes: A study based on Microcystis aeruginosa

    Corresponding author: XIANG Wu, xiangw@cug.edu.cn
  • Fund Project: the National Natural Science Foundation of China (41977263,41472316).
  • 摘要: 铁是影响水生态系统初级生产力的关键微量元素。泥炭沼泽普遍含有丰富的溶解有机质,其中酚酸类物质具有稳定的芳香环结构,与铁有较强的络合能力,提高了陆源溶解性铁向水生态系统的有效输出。泥炭沼泽源酚铁配合物的生物可利用性对藻类生长及铁的生物地球化学循环有重要影响。本文通过一系列培养试验,研究了泥炭源典型酚铁络合物的藻类可利用性及其影响因素。结果表明,4种酚酸对藻类生长的影响均呈现“低促高抑”的规律,从藻类生物量和叶绿素含量来看,抑藻效果从高到低:水杨酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>咖啡酸。当水杨酸浓度达到20 mg·L−1时,对藻类的光合作用抑制最强。对照试验表明,水杨酸络合态铁更难被藻类利用,这与其络合物稳定性较高有关。利用不同分子量段泥炭源DOM-Fe的培养试验显示,对藻类生长的促进作用从高到低依次为:>3 KD,1—3 KD,<1 KD。低分子量DOM(<1KD )络合态铁,由于其在培养体系中更加稳定,相对不易被藻类利用。
  • 城市化持续快速的推进,导致了不透水面积显著增加,从而引发城市水文的变化,严重的影响了水质和径流状况[1-2]。由于大量的污染物随着雨水径流排放到水体,城市雨水已成为城市河湖水质恶化的主要污染源[3]。水生生态系统中过量的氮输入将导致水体富营养化,最终会改变生态群落结构,降低生境质量,增加“藻华”事件的发生率和持续时间[4-5]。人工湿地(CWs)污水处理技术具有建造成本投入低、设施后期维护便捷、景观效果明显等优点,被广泛用于各类型污水的小型化和分散化处理。

    国内外对CWs的研究已经很多,对CWs的除氮技术也在逐渐优化,单纯的处理工艺往往导致人工湿地的除氮效果不好,潮汐流(TF)和潜流(SF)CWs组合形成的好氧和厌氧环境[6-7],有利于氮进行硝化和反硝化反应,从而达到对氮的去除,可防止处理后的污水排入环境导致水体“富营养化”。CWs中的氮通过植物的吸收作用、基质的过滤和吸附、氨挥发、微生物的氨化、硝化反硝化和厌氧氨氧化等方式被去除[8]。研究表明,填料基质和植物作用所做的贡献仅占CWs脱N量的20%—30%[9]。ZHANG等[10]研究发现,微生物参与的硝化反硝化作用是CWs去除废水中TN的主要途径,可占66.9%—80.5%。DU等[11]研究发现,植物种植增加了微生物的丰富度和生物多样性;同时,相关的反硝化属假单胞菌、不动杆菌、根瘤菌、芽孢杆菌和红假单胞菌丰度的增加,增强了微生物对氮的去除作用。HE等[12]研究发现,γ–变形菌、α–变形菌和β–变形菌是人工湿地基质中的主要细菌,并在减少硝酸盐和亚硝酸盐的功能上发挥了重要作用。但是,现有的研究缺少潮汐流人工湿地污染物的去除途径和微生物群落相结合的分析,以及植物的种植对微生物群落以及微生物氮净化作用的影响分析。

    本研究构建潮汐流和潜流人工湿地组合,采用工业废弃物—赤泥制成的颗粒作为基质,种植黄菖蒲作为净水植物,分析该潮汐流-潜流人工湿地组合对氮的去除效果以及微生物群落的变化,探讨水生植物和微生物群落对氮去除效果的影响,以期为人工湿地强化脱氮提供科学依据。

    实验基质所用赤泥取自山西省吕梁市华兴铝业有限公司,取回后自然风干。将其研磨成粉,过100目筛,保存于干燥处。赤泥颗粒的具体实验方法:将过100目筛的赤泥和水泥粉末按照3∶7的比例混合,再加入2.5%的起泡剂,加入去离子水充分搅拌后放入模具中,放室温条件下养护24 h。自然晾干后取出赤泥块放于温度22℃、相对湿度≥ 90%的数控水泥砼标准养护箱中,28 d后取出,将其切割成粒径为10—20 mm的颗粒。

    本实验中人工湿地模型工艺组合(TF–SF)由潮汐流湿地单元(TF)和潜流湿地单元(SF)组成(图1)。在装置运行上,TF采用间歇进水和瞬间排水,SF采用瞬间进水和缓慢排水,并且进水和排水同时进行,以保证基质始终处于淹没状态。用两台蠕动泵控制TF单元进水,进出水方式为下行流,PLC时控器负责定时调控装置的进出水;SF单元采用上行流方式进水,进水由自吸水泵控制。在TF单元,自上而下取样(10—70 cm),SF单元自下而上取样(0—40 cm)。TF-SF由两个亚克力圆柱体组成。圆柱体直径为30 cm,高度为100 cm,体积约为70 L。装置的填料高65 cm(底部为Ф25—50 mm砾石,厚度为25 cm;中部为Ф10—20 mm赤泥颗粒,厚度为30 cm;上部Ф2—5 mm砾石,厚度为10 cm),在潮汐流人工湿地单元和潜流人工湿地单元最上部砾石层种植黄菖蒲水生景观植物。为了植被的光合作用,在两个湿地单元上均设有30 W的节能灯作为补充光照,灯光由PLC时控器定时调控,光照时间为每天的6:30—18:30。

    TF单元运行方式为:瞬时进水0.33 h—反应期4.82 h—瞬时排水0.05 h—闲置期5.80 h,每个周期12 h,每天2个周期,每个周期处理水量为10 L。SF单元运行方式为:瞬间进水和缓慢排水,且进水和排水同时进行,处理水量为10 L,水力停留时间为11.95 h。2019年7月启动反应器,实验室温度为18—25 ℃,实验用水为人工模拟污水,由葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾配制,同时投加无水氯化钙、硫酸镁、FeSO4·7H2O等补充微量元素,污水pH为4.81—6.42。其他主要水质指标见表1。反应器进行为期2个月的微生物挂膜,直到出水稳定后,开始正式实验。

    图 1  潮汐流–潜流人工湿地模型图
    Figure 1.  TF–SF model diagram
    表 1  实验水质
    Table 1.  Experimental water quality
    项目水质参数Project water quality parameters初始浓度范围/(mg · L−1)Initial concentration range
    CODcr304.72—902.62
    NH+4-N13.51—27.09
    TN15.12—26.54
    NO3-N0.00—1.04
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    CODcr、TN、NH+4-N、NO3-N等指标的测定按照国家环境总局编著的《水和废水监测分析方法(第四版)》[13]进行。

    种植植物前,测定用于实验的植物生物量,供后续计算使用。植物高度在实验运行的全过程中进行长期测量,以观察植物长势,实验结束后,对湿地植物进行收割,分为地上、地下两部分,测定植物生物量、根长[14]。在实验的开始和结束时测定植物的湿重W1(g),挑选代表性的植株样品在105 ℃下干燥10 min,以灭活植物中酶的活性,然后在70 ℃下干燥12 h,测定干重W2(g),将植物粉碎成粉末(过40目筛),混合均匀并密封保存,采用H2SO4-H2O2溶液消解,采用半微量凯氏法测定植物全氮[14]

    植物氮积累量(PA),单位为mg·株−1,计算公式如下:

    PA=PB×PC (1)

    式中,PA为植物氮积累量(mg·株−1),PB为植物不同器官生物量(g·株−1),PC为植物不同器官全氮含量(mg·g−1)。

    通过OMEGA Soil DNA试剂盒提取基质中微生物DNA。使用通用细菌引物16S rRNA的5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3′和5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′(V3—V4区)对提取的DNA进行PCR扩增。PCR扩增条件:98 ℃(3 min)初始变性,然后进行25个循环,98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,最后5 min延伸至72 ℃。将所有序列读数聚类到操作分类单位(OTU)(相似性阈值为97%)。高通量测序服务由上海美吉生物平台提供(上海,中国)。

    实验数据使用Microsoft Excel 2010统计分析,数据图使用Origin 2015软件进行绘制。

    TF–SF的进水TN含量为15.12—26.54 mg·L−1,平均TN含量为21.52 mg·L−1图2);潮汐流人工湿地单元(TF)出水的TN去除率为53.96%—76.22%,平均去除率为68.88%;TF–SF的出水TN去除率为57.52%—81.29%,平均去除率为68.99%。TF–SF进水的NH+4-N含量为13.51—27.09 mg·L−1,平均含量为21.86 mg·L−1;TF出水的NH+4-N去除率为74.80%—87.26%,平均去除率为81.79%;TF–SF出水的NH+4-N去除率为55.59%—78.59%,平均去除率为70.12%。在TF–SF中,SF对NH+4-N的去除没有起到促进作用,反而其出水的NH+4-N含量高于其进水。NH+4-N和TN表现出相似的去除趋势,这是因为NH+4-N是进水中氮的主要来源,NH+4-N经过硝化-反硝化作用去除,说明人工湿地有较强的反硝化作用。TF的运行方式可将氧气带入装置,进而提高氮的去除效果。

    图 2  人工湿地中NH+4-N和TN的去除率
    Figure 2.  Removal rate of NH+4-N and TN in constructed wetland

    随着运行时间的增加,TF–SF的NH+4-N去除率越来越低。这是由于SF的运行方式为快速进水和缓慢排水,一直处于充满水的状态,其氧含量过低,硝化强度相比TF较低,仅发生在SF的上部;且基质对NH+4-N的吸附作用,致使一部分NH+4-N留存在SF中。随着运行时间的增加,NH+4-N残留量越来越高,从而使得SF出水NH+4-N含量越来越高。基于以上现象,应在装置运行一段时间后,进行停床处理,排空TF–SF内的水,使得系统内留存的氨氮能够与空气接触,减小TF–SF内NH+4-N的留存量。另需对装置进行改良,对SF进水补充适量碳源,提高污水的停留时间,为该单元发挥反硝化作用提高能量。

    NH+4-N为进水主要氮源形态,NO3-N是在硝化反应过程中生成的(图3)。TF–SF进水NO3-N含量为0—1.04 mg·L−1,平均值为0.50 mg·L−1;TF出水NO3-N含量为0—0.26 mg·L−1,平均值为0.12 mg·L−1;TF–SF出水的NO3-N含量为0—0.23 mg·L−1,平均含量为0.09 mg·L−1。在TF–SF中,TF和SF出水的NO3-N含量均很小,均低于1.0 mg·L−1,有些甚至浓度为零,整体呈不规律的变化。在TF–SF中,TF在第2天出水的NO3-N浓度明显增加,而SF中又降低,说明TF中发生了硝化反应,SF中发生了反硝化作用。在TF–SF运行的第4—10天和第16天,TF和SF出水浓度都低于进水,说明TF内发生了反硝化作用。在TF中,出水NO3-N含量低于进水,说明TF中发生了同步硝化—反硝化[15]。TF在充满水的状态下,NH+4-N主要通过填料或生物膜的吸附作用被消耗;微生物的硝化作用主要发生在TF处于空置的状态时,此时大气中的O2进入基质的孔隙间,与基质表面的生物膜发生接触,此时NH+4-N转化成NO3-N。

    图 3  人工湿地中NO3-N的含量变化
    Figure 3.  NO3-N content in constructed wetlands

    与SF相比,TF单元表现出更好的NO3-N去除效果。其原因是,在TF中,首先发生了除氮的第一步—硝化反应,生成了NO3-N,其中消耗了大部分可用碳源;在水进入到SF中,虽SF为缺氧和厌氧环境,有利于反硝化作用的发生,但因其可利用碳源含量少,缺少反硝化作用所需的能量。反硝化细菌多为异养细菌,污水中有机碳源的含量制约着反硝化细菌的生长繁殖,从而影响了反硝化作用,有机碳浓度较低会使NO3-N的去除效果表现较差[16]

    微生物吸收、基质过滤以及植物根系截留为人工湿地系统中有机物的主要去除途径,在对有机物的去除中,植物的贡献较小,可溶性有机物通过在淹水过程中与基质表面的微生物膜接触反应被消耗分解,不溶性有机物通过基质截留后在排空阶段、系统充氧时被微生物降解[17]。TF–SF进水的COD含量为304.72—1315.83 mg·L−1,平均含量为739.31 mg·L−1;TF出水的COD去除率为29.01%—78.91%,平均去除率为60.07%;TF–SF出水的COD去除率为38.43%—95.80%,平均去除率为67.12%(图4),说明TF–SF对有机物具有较好的去除效果。在TF–SF中,TF和SF都对有机物较好的去除。TF独特的间歇进水和瞬时排水的潮汐运行模式下,基质上附着的有机物在TF空置时被硝化作用利用,减少了COD含量。TF–SF进水的COD浓度变化较大,这是由于本实验进水配置采用葡萄糖作为碳源,4 d配置1次,葡萄糖在室温下易挥发[18],使得进水COD含量变化较大。

    图 4  人工湿地中COD的去除率
    Figure 4.  COD removal rate in constructed wetlands

    TF–SF中第2天的COD去除率较低,是因为TF–SF进水的COD含量较低,进水中可利用的碳源较低。然而,第2天的NH+4-N和TN的去除率却没有表现的很差,这是因为TF–SF刚培养完微生物,系统内能量充足,硝化反应所需能量系统内可提供,从而在进水COD含量较小的情况下也表现出较高的除氮效果。在TF–SF运行的第6—10天,SF对COD的去除发挥了一定作用,说明SF利用进水中的碳源发生了反硝化作用,使得装置的除氮效果表现较好。随着运行时间的增加,SF逐渐对COD的去除不发挥作用,且SF中COD的含量高于TF,可能是由于基质对有机物的吸附作用,部分COD残留在SF中,致使SF出水的COD含量高于其进水。对此,应延长水体在装置内的停留时间,以提高其除氮效果,保证其长时间的稳定运行。

    实验期间,进水和出水的pH、溶解氧(DO)的平均值如表2所示。与进水DO相比,在TF–SF中,TF和SF的出水DO浓度都下降了6.74—7.48 mg·L−1。这是因为微生物去除COD和氨氧化过程中消耗了水体中的DO。在TF中,好氧微生物利用进水中的溶解氧以及从大气携带进入的O2发生硝化反应,使得DO浓度降低;SF中的DO含量更低,说明SF单元为缺氧和厌氧环境,进行反硝化作用,可弥补TF由于氧含量高导致反硝化作用不好的缺点,可提高氮的去除率。

    表 2  潮汐流-潜流人工湿地的进出水参数
    Table 2.  Water inlet and outlet parameters of TF–SF
    组别GrouppHDO / (mg·L−1)
    进水 Inflow5.748.62
    TF出水 TF effluent5.611.88
    TF–SF出水 TF–SF effluent5.821.14
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    在TF和SF中,硝化反应和反硝化反应的进行需要一定的碱性环境来维持系统内pH的缓冲性能。由于赤泥呈强碱性(pH=10—12),本实验设计时将进水配置呈弱酸性。在前期的培养实验中,基质的碱性被进水中和,装置内呈弱酸环境(表2)。因此,不适合的pH环境减弱了基质表面微生物的活性,导致对氮的去除效果降低。在今后的研究中,需注意进水的pH值。

    TF–SF的微生物多样性和丰富度见表3,采用Alpha多样性分析方法对TF–SF中细菌的多样性进行分析。在TF–SF中,TF和SF的微生物测序中样本文库覆盖率均大于0.99,说明测序结果能够代表湿地的真实情况[19]。TF–10(即TF中10 cm处理深度)、TF–30(即TF中30 cm处理深度)和SF–60(即SF中60 cm处理深度)的Ace指数分别为1587.47、1514.32、1550.49,Chao指数分别为1556.43、1499.46和1526.75,TF–10和SF–60的Ace指数和Chao指数均大于TF–30;TF–10、TF–30和SF–60的Shannon指数分别为5.54、5.23和5.59,Simpson指数分别为0.0110、0.0189和0.0109,TF–10和SF–60的Shannon指数均大于TF–30,且TF–30的Simpson指数最大,因为TF–10和SF–60这两个取样点都在植物根系周围,说明人工湿地中种植植物可拥有更高的微生物群落丰富度和多样性,进而提高了人工湿地对氮的去除作用。植物根系分泌氧气和有机物,可促进微生物富集生长,所以种植植物可以提高微生物群落多样性。

    表 3  潮汐流-潜流人工湿地微生物多样性和丰富度
    Table 3.  Microbial diversity and richness in samples of TF–SF
    组别Group测序数量 Sequence number丰富度指数 Richness index多样性指数Diversity index覆盖率Fraction of Coverage
    SequencesSobsAceChaoShannonSimpsonCoverage
    TFCW-104574413811587.471556.435.540.01100.994
    TFCW-304130212791514.321499.465.230.01890.993
    SFCW-604945314281550.491526.755.590.01090.996
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    TF–SF中微生物独有和共有的OTU数目。从图5可知,在TF–SF中,TF–10、TF–30和SF–60检测到的细菌OTU数目分别为1381、1279和1428,说明相比于SF,TF的运行方式会使装置内细菌的种类减少,一些不能适应TF内部厌氧—好氧环境交替出现的菌群会逐渐消亡,最终留存下来的菌群成为优势菌群。TF–SF中共有的OTU有981个,分别占TF–10、TF–30和SF–60检测到的OTU数目的71.04%、76.70%和68.70%,说明TF–SF中,TF–10和TF–30微生物群落不同,这是因为TF中植物根系周围具有富集微生物的作用;TF–10和SF–60微生物群落不同,是因为TF和SF不同的运行方式致使其氧环境不同。

    图 5  潮汐流-潜流人工湿地系统OTU数量和Venn图
    Figure 5.  OTUs and Venn diagrams for TF–SF

    TF–SF微生物门(Phylum)水平组成见图6(a)。可将微生物检测频率>1%的菌门作为主要的菌门[20]。共发现有9个菌门,分别为Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Bacteroidota(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Patescibacteria(髌骨细菌门)、Acidobacteriota(酸杆菌门)、Nitrospirota(硝化螺旋菌门)、Myxococcota(粘球菌门),这9种菌门在TF-SF中3个取样点的相对丰度比例之和为94.35%—96.27%。

    图 6  潮汐流-潜流人工湿地系统基质微生物门分类(a)、纲分类(b)和属分类(c)水平上细菌菌落组成
    Figure 6.  Percent of community abundance on phylum (a), class (b) and genus (c) level in substrate of TF–SF

    本研究中的主要优势菌门为变形菌门,其在生物脱氮的过程中具有重要作用,这与ZHANG等[21]、LI等[22]的研究结果一致,说明人工湿地基质具有相似的优势菌门。MIAO等[23]研究表明,变形菌门和厚壁菌门对反硝化作用有重要作用,硝化螺旋菌门含有丰富的硝化功能的菌属。变形菌门在TF–10、TF–30和SF–60的相对丰度分别为28.04%、30.12%和21.90%,厚壁菌门的相对丰度分别为7.68%、9.01%和3.73%,硝化螺旋菌门的相对丰度分别为1.22%、0.79%和2.22%,变形菌门和厚壁菌门在3个取样点的相对丰度表现为TF–30 > TF–10 > SF–60,这种趋势与各取样点的氮去除率一致。TF–30处变形菌门的相对丰度高于TF–10,但TF–30硝化螺旋菌门的相对丰度却低于TF–10,这是因为植物的种植改善了微生物的多样性。

    TF–SF微生物纲(Class)水平组成见图6(b)。将微生物检测频率>1%的菌纲作为主要的菌纲,共发现15个菌纲。变形菌门中的γ–变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α–变形菌纲 (Alphaproteobacteria) 在TF–SF中3个取样点的相对丰度占比分别为14.89%—22.81%、7.01%—7.94%。γ–变形菌纲和α–变形菌纲均属于革兰氏阴性菌,说明TF–SF中的基质富集了革兰氏阴性菌,促进了系统中污染物的生物降解。LI等[24-25]发现γ–变形菌在去除NO3-N和NO2-N方面具有重要作用。γ–变形菌纲在3个取样点的相对丰度表现为TF–30 > TF–10 > SF–60,这种趋势与各取样点的氮去除率一致。

    有关研究表明,不动杆菌属(Acinetobacter)、硫杆菌属 (Thiobacillus)和索氏菌属(Thauera)等具有反硝化作用,参与氮的转化[26-28]。硝化杆菌属(Nitrobacter)和硝化螺菌属(Nitrospira)具有硝化功能[29-30],亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)具有氨氧化功能[31]。另外,YAO等[32]研究表明,不动杆菌可通过异养来转化氮硝化和好氧反硝化。

    TF–SF微生物属(Genus)水平组成见图6(c)。其中检测出相对丰度大于0.5%的菌属有71个,包括不动杆菌属、硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属,以及其他未知属。TF–SF中硝化作用硝化螺菌属丰度(0.79%—2.22%)高于具有氨氧化细菌的亚硝化单胞菌属(0.12%—0.52%)。某些硝化螺菌属能将NH+4-N完全氧化成NO3-N,这可能是TF–SF有较好氨氮去除效果的原因[33]。硝化螺菌属是常见的亚硝酸盐氧化菌[34],在TF–10、TF–30和SF–60中的丰度分别为1.22%、0.79%和2.22%,TF–10和SF–60中的硝化螺菌属丰度均高于TF–30,说明植物的种植有利于基质表面NO2-N的氧化,从而提高了氨氮的去除效果。

    不动杆菌属是丰度最高的异养反硝化菌属,在TN去除过程中具有重要作用。不动杆菌属在TF–10、TF–30和SF–60中的丰度分别为1.15%、1.38%和0.07%,TF–30处不动杆菌的丰度最高,且此处的氮去除效果最好,说明不动杆菌丰度的增加是微生物氮去除率较高的原因。

    黄菖蒲(学名:Iris pseudacorus L.)为鸢尾科、鸢尾属植物,为多年生湿生或挺水宿根草本植物,植株高大,根茎短粗,绿色长剑形叶,5—6月开黄色花[35]。实验所用黄菖蒲产自山东临沂,购买回幼苗后对其进行种植培养,使其适应生长环境。培养一段时间后,将植物移植到模型中。在移植到潮汐流-潜流人工湿地系统前,测量植物生物量,并选取相同高度的植物,测量其植物生物量和全氮含量。

    在实验期间,实验室温度为15—22 ℃,是黄菖蒲的适生环境,植物地上部分颜色鲜亮,整个实验期间没有枯黄和枯萎的现象,植物均保持着良好的生长状态(表4)。TF内黄菖蒲的长势表现最好,株高、重量和根长也在整个系统中表现最大。TF在进水和排水空置床体时,氧气会进入到装置内,提高了植物根系周边环境的氧浓度,有利于根部细胞的有氧呼吸,促进根部生长,在生长过程中吸收水中的营养物质,从而表现出良好的长势。相比TF,SF内黄菖蒲的长势较差,其原因是潜流的运行方式使得植物周围氧浓度低,不利于植物根部的生长,也说明黄菖蒲能够在人工湿地中成活且长势良好。

    黄菖蒲水生景观植物地上部分和地下部分的氮积累量均随着植物的生长而累积。人工湿地水生植物的氮积累量是评价水生植物对氮去除效果的重要指标[36]。TF–SF中黄菖蒲植物的氮积累量见表5。TF–SF中生长的黄菖蒲植物,对TN的累积作用以植株地上部分为主,黄菖蒲植物地上部分TN累积量占整株的42.74%—84.26%。研究表明,植物的收割方式由其体内营养物质的分配特点决定[37]。本研究结果表明,人工湿地植物内的氮可通过收割植物地上部分的方式来将氮移出人工湿地。其中,TF中黄菖蒲的地上部分TN累积量占整株比例为84.26%,SF中黄菖蒲的地上部分TN累积量占整株比例为77.64%。TF中种植的黄菖蒲植物氮积累量在相同生长时间内远大于SF,这与潮汐流人工湿地独特的运行方式密不可分。TF中充足的氧环境保障了植物根部细胞的有氧呼吸,使得植株生长健壮且生长迅速,表现出较高的植物生物量,从而具有较高的植物氮吸收量。

    表 4  潮汐-潜流人工湿地黄菖蒲植物生长状况
    Table 4.  The growth status of yellow calamus in TF–SF
    人工湿地Constructed wetland地上部分Aboveground地下部分Underground
    株高/cm Plant height鲜重/g Fresh weight干重/gDry weight根长/cm Root length鲜重/g Fresh weight干重/g Dry weight
    种植前36.38.530.9214.55.222.15
    潮汐流128.256.488.0823.819.403.00
    潜流74.232.035.1120.116.062.51
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    表 5  潮汐流-潜流人工湿地黄菖蒲植物氮积累量
    Table 5.  Nitrogen accumulation of acorus calamus in TF–SF
    人工湿地Constructed wetland植物生物量/g Plant biomass植物氮积累量/(mg·株−1)Plant nitrogen accumulation
    地上部分Aboveground地下部分Underground总净重Total net weight地上部分Aboveground地下部分Underground总净重Total net weight
    种植前0.922.153.0718.1724.3442.51
    潮汐流8.083.0011.08195.0536.44231.49
    潜流5.112.517.62111.1832.01143.20
     | Show Table
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    TF–SF的水力停留时间为11.95 h,运行周期为12 h时,对NH+4-N的去除大于TN,表明TF比SF对NH+4-N具有更高的去除量。在TF–SF中,TF为好氧环境,SF为以厌氧和缺氧为主的环境,整个组合人工湿地为硝化—反硝化组合,使系统表现出较强的脱氮效果。TF–SF中微生物群落具有较高的丰富度和多样性,且黄菖蒲植物的种植可改善基质微生物的丰富度和多样性,并发现微生物丰富度和多样性的改善促进了微生物的除氮作用,使TF–SF表现出较好的脱氮效果。TF–SF中富集不动杆菌属、硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属等优势硝化和反硝化菌属,这些菌属是人工湿地中主要的脱氮菌属,它们的增加是微生物氮去除率较高的原因。

    黄菖蒲能够在人工湿地中成活且长势良好,能够在我国华北地区种植。植物生物量直接影响植物体内氮积累量,植物的除氮效果优劣可直接通过生物量得出结论。在今后的人工湿地建造过程中,多选择像黄菖蒲这样的具有高生物量的植物种类,有利于水体净化效果的提高。黄菖蒲植物表现出较高的去除率与其发达的根系、试验期间生长量大有关,根系的分泌物有利于微生物的生长,促进降解物质的分泌,从而对水体中的氮具有较高的去除率。

    本研究采用TF和SF的组合形式,SF在除氮过程中未起到太大作用,是由于实验设置的水力停留时间太短,以及SF中的进水COD含量太低,不利于反硝化作用的进行。仍需继续研究来寻找TF、SF及多种组合方式的最优运行参数。在今后人工湿地的除氮实验中,应使进水的pH值控制在7.0—8.0,保证人工湿地系统的稳定除氮效果。

  • 图 1  铜绿微囊藻生长曲线

    Figure 1.  Microcystis aeruginosa growth curve

    图 2  铜绿微囊藻存活率变化

    Figure 2.  Changes in survival rate of Microcystis aeruginosa

    图 3  微囊藻生长曲线

    Figure 3.  Microcystis growth curve

    图 4  铜绿微囊藻生长曲线A.无添加 B.硫酸亚铁 C.DOM-Fe(<1KD ) D.DOM-Fe(1-3 KD) E.DOM-Fe(> 3KD)

    Figure 4.  Microcystis aeruginosa growth curve

    表 1  铜绿微囊藻的Fv/Fm

    Table 1.  Fv/Fm of Microcystis aeruginosa

    对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid对香豆酸P-coumaric acid水杨酸Salicylic acid咖啡酸Caffeic acid
    010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−60.3080.3100.2920.3020.0390.0000.3080.3100.3140.3240.0490.0000.3080.3090.0230.0140.0000.0000.3080.3310.2760.3600.0380.000
      注:0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度,表中数据是在微囊藻培养期结束时测得的Fv/Fm。
      Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four added phenolic acid concentrations. The data in the table are the Fv/Fm measured at the end of the Microcystis culture period.
    对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid对香豆酸P-coumaric acid水杨酸Salicylic acid咖啡酸Caffeic acid
    010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−60.3080.3100.2920.3020.0390.0000.3080.3100.3140.3240.0490.0000.3080.3090.0230.0140.0000.0000.3080.3310.2760.3600.0380.000
      注:0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度,表中数据是在微囊藻培养期结束时测得的Fv/Fm。
      Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four added phenolic acid concentrations. The data in the table are the Fv/Fm measured at the end of the Microcystis culture period.
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    表 2  铜绿微囊藻叶绿素含量(g·L-1

    Table 2.  Chlorophyll content of Microcystis aeruginosa

    对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid对香豆酸P-coumaric acid水杨酸Salicylic acid咖啡酸Caffeic acid
    010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−60.5681.0141.1380.7750.0000.0000.5680.7370.8620.5680.0000.0000.5680.7960.0090.0000.0000.0000.5682.0932.2011.3590.0000.000
      注:0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度,表中数据是微囊藻培养期结束时测得的叶绿素含量。
      Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four phenolic acid concentrations added. The data in the table is the chlorophyll content measured at the end of the Microcystis culture period.
    对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid对香豆酸P-coumaric acid水杨酸Salicylic acid咖啡酸Caffeic acid
    010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−60.5681.0141.1380.7750.0000.0000.5680.7370.8620.5680.0000.0000.5680.7960.0090.0000.0000.0000.5682.0932.2011.3590.0000.000
      注:0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度,表中数据是微囊藻培养期结束时测得的叶绿素含量。
      Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four phenolic acid concentrations added. The data in the table is the chlorophyll content measured at the end of the Microcystis culture period.
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    表 3  第11天不同试验组微囊藻浓度变化的相关性矩阵

    Table 3.  Correlation matrix of changes in the concentration of Microcystis in different test groups on the 11th day

    1_3Fe1_3ABCDEFGH
    1_310.9630.971−0.3580.4740.6570.2460.4610.9830.491
    Fe1_30.9631.001.000*−0.0950.2210.835−0.0220.6820.9960.707
    A0.9711.000*1.00−0.1260.2510.8180.0080.6590.999*0.685
    B−0.358−0.095−0.1261.00−0.9920.468−0.9930.663−0.1790.637
    C0.4740.2210.251−0.9921.00−0.3520.970−0.5630.302−0.534
    D0.6570.8350.8180.468−0.3521.00−0.5690.9720.7850.979
    E0.246−0.0220.008−0.9930.970−0.5691.00−0.7460.062−0.723
    F0.4610.6820.6590.6630.6630.972−0.7461.000.6180.999*
    G0.9830.9960.999*−0.1790.3020.7850.0620.6181.000.645
    H0.4910.7070.6850.637−0.5340.979−0.7230.999*0.6451.00
      注:*. 在 0.05 水平(双侧)上显著相关。Notes:*. Significant correlation at 0.05(bilateral) level.
    1_3Fe1_3ABCDEFGH
    1_310.9630.971−0.3580.4740.6570.2460.4610.9830.491
    Fe1_30.9631.001.000*−0.0950.2210.835−0.0220.6820.9960.707
    A0.9711.000*1.00−0.1260.2510.8180.0080.6590.999*0.685
    B−0.358−0.095−0.1261.00−0.9920.468−0.9930.663−0.1790.637
    C0.4740.2210.251−0.9921.00−0.3520.970−0.5630.302−0.534
    D0.6570.8350.8180.468−0.3521.00−0.5690.9720.7850.979
    E0.246−0.0220.008−0.9930.970−0.5691.00−0.7460.062−0.723
    F0.4610.6820.6590.6630.6630.972−0.7461.000.6180.999*
    G0.9830.9960.999*−0.1790.3020.7850.0620.6181.000.645
    H0.4910.7070.6850.637−0.5340.979−0.7230.999*0.6451.00
      注:*. 在 0.05 水平(双侧)上显著相关。Notes:*. Significant correlation at 0.05(bilateral) level.
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    表 4  第11天不同试验组铜绿微囊藻生长浓度变化的相关性矩阵

    Table 4.  Correlation matrix of growth concentration changes of Microcystis aeruginosa in different test groups on the 11th day

    ABCDE
    A1−.751.350−.167.770
    B−.7511−.881.776−.158
    C.350−.8811−.982−.327
    D−.167.776−.9821.500
    E.770−.158−.327.5001
      注:*. 在 0.05 水平(双侧)上显著相关. Notes:*. Significant correlation at 0.05(bilateral) level.
    ABCDE
    A1−.751.350−.167.770
    B−.7511−.881.776−.158
    C.350−.8811−.982−.327
    D−.167.776−.9821.500
    E.770−.158−.327.5001
      注:*. 在 0.05 水平(双侧)上显著相关. Notes:*. Significant correlation at 0.05(bilateral) level.
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-01
  • 录用日期:  2021-05-10
  • 刊出日期:  2022-06-27
刘洋, 黄玉冰, 赵甜甜, 向武. 典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104
引用本文: 刘洋, 黄玉冰, 赵甜甜, 向武. 典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104
LIU Yang, HUANG Yubing, ZHAO Tiantian, XIANG Wu. Algae availability of typical peat-derived iron phenol complexes: A study based on Microcystis aeruginosa[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104
Citation: LIU Yang, HUANG Yubing, ZHAO Tiantian, XIANG Wu. Algae availability of typical peat-derived iron phenol complexes: A study based on Microcystis aeruginosa[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2112-2120. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021030104

典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例

    通讯作者: E-mail: xiangw@cug.edu.cn
  • 中国地质大学(武汉),地球科学学院,武汉,430074
基金项目:
国家自然科学基金(41977263,41472316)资助.

摘要: 铁是影响水生态系统初级生产力的关键微量元素。泥炭沼泽普遍含有丰富的溶解有机质,其中酚酸类物质具有稳定的芳香环结构,与铁有较强的络合能力,提高了陆源溶解性铁向水生态系统的有效输出。泥炭沼泽源酚铁配合物的生物可利用性对藻类生长及铁的生物地球化学循环有重要影响。本文通过一系列培养试验,研究了泥炭源典型酚铁络合物的藻类可利用性及其影响因素。结果表明,4种酚酸对藻类生长的影响均呈现“低促高抑”的规律,从藻类生物量和叶绿素含量来看,抑藻效果从高到低:水杨酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>咖啡酸。当水杨酸浓度达到20 mg·L−1时,对藻类的光合作用抑制最强。对照试验表明,水杨酸络合态铁更难被藻类利用,这与其络合物稳定性较高有关。利用不同分子量段泥炭源DOM-Fe的培养试验显示,对藻类生长的促进作用从高到低依次为:>3 KD,1—3 KD,<1 KD。低分子量DOM(<1KD )络合态铁,由于其在培养体系中更加稳定,相对不易被藻类利用。

English Abstract

  • 铁是一种生物必须的营养元素,直接影响浮游植物的光合作用和碳水化合物形成,由于高含氧量和无机态铁的低溶解性,铁通常是制约HNLC海区(High nutrition low chlorophyll)初级生产力的关键微量元素[1-2]。大规模海洋施铁实验表明,水生态系统中生物可利用铁的增加可以显著提高浮游植物的生物量和光合作用率,从而提高初级生产力,并促使浮游植物的群落结构发生变化[3-7]。以往研究表明,光自养微生物对碳循环和全球气候起关键作用[8-9]。初级生产力的提高,深刻地影响着全球尺度的二氧化碳固定,对温室气体的控制具有重要意义。

    水生态系统中,99%溶解性铁(dissolved iron,DFe)与有机配体结合。尽管大部分有机络合态铁不能直接被藻类利用,但通过一些地球化学转化过程,可转变为生物可利用铁[10-11]。Blazevic等[12]研究发现,海洋中腐殖酸结合态铁可以发生光还原反应,进而提高铁的生物可利用性。沼泽性河流是海洋DFe的重要来源[13]。沼泽性河流中大量存在的溶解性有机碳(DOC, dissolved organic carbon)与铁离子形成有机络合物,使水中保持较高浓度DFe。有机质中羧基和酚羟基是与铁络合的主要官能团。泥炭源中的酚酸类物质,含有稳定的芳香环结构。部分酚酸与铁有较高的配合能力,这类物质的存在保护了长距离迁移的DFe,保证了陆源DFe向水生态系统的有效输出[14]

    泥炭沼泽中存在多种类型酚酸,前人在金川泥炭中检测出了9种酚酸,包括对-羟基苯甲酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸、对-香豆酸、没食子酸、原儿茶酸和咖啡酸,许多泥炭沼泽中都有这些酚酸的存在[14]。研究证实,酚酸等有机质可以和铁形成较为稳定的配合物,使其可以在淡水运输过程中迁移更长的距离[15]。其中,具有儿茶酚或者没食子酰基结构的原儿茶酸、没食子酸以及咖啡酸可以和Fe(Ⅱ)形成较为稳定的络合物,使得Fe(Ⅱ)在极易被氧化的碱性条件下也可以保存较长时间。而咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸以及龙胆酸还对Fe(Ⅲ)有着明显的还原作用,同样有助于这两种铁形态之间的平衡[16]

    植物或微生物分泌代谢物质对环境中其他植物或微生物体产生不利或有利的影响,这种作用称为化感作用。在化感作用过程中分泌的物质即被称为化感物质,自然界的化感物质种类非常丰富,主要包括酚酸类、苯醌类、倍半萜类、黄酮类等几大类物质[17]。迄今发现的化感物质几乎都是植物的次生代谢物质,分子量较小,结构简单,其中酚酸类物质是一类重要的次生代谢产物,也是研究较多,被证实是化感活性较强的一类物质[18]。酚酸具有一定生物毒性。目前对于酚酸抑藻的机制还不十分清楚,其抑制作用可能通过多种方式实现。研究表明,酚酸与蛋白质分子易遵循疏水键-氢键多点键合理论结合。在酚酸存在的情况下,藻细胞的胞外磷酸酶活性受到抑制,碱性磷酸酶活性的抑制使藻利用磷的能力下降。酚酸与细胞膜蛋白的结合,会破坏生物体细胞膜结构,使植物多酚物质进一步穿过细胞膜,进入细胞体内,从而改变微生物细胞酶活性,减少藻类对外源性蛋白质的利用,并通过对细胞外酶的抑制达到抑藻的目的[19]。另外,如果酚酸进入细胞体后,通过与金属离子发生络合反应,形成沉淀而破坏微生物的正常新陈代谢也是植物多酚抑藻的原因所在[20]。尽管酚酸存在生物毒性,但适量前提下,对藻类生长有积极作用[21]。泥炭源典型酚酸与铁的络合物是否对藻类利用铁有显著影响尚待进一步研究。因此,探究酚-铁配合物络合稳定性及其生物可利用性有助于进一步了解生物对铁的吸收,更好地理解全球铁碳耦合循环。

    铜绿微囊藻(microcystic aeruginosa) 是中国湖泊、水库及其他水域生态系统水体富营养化蓝藻水华的代表性藻类。本文铜绿微囊藻为培养对象,利用泥炭源典型酚酸及泥炭溶解有机质(DOM)开展了一系列培养试验,以期了解泥炭沼泽源酚酸以及酚-铁络合物对铜绿微囊藻生长的影响。

    • 试验所用铜绿微囊藻藻源,由中国科学院水生生物研究所提供,采用BG-11培养基培养。

      4种酚酸的配制:以1.7 g·L−1的浓度配制BG-11培养基,然后将对羟基苯甲酸、对香豆酸、水杨酸、咖啡酸加入,分别配制4份浓度为0.24 g·L−1的酚酸溶液。用0.22 μm滤膜在超净台中过滤,并用紫外光照射30 min,消除微生物的影响,现配现用。

      藻种培养条件:实验前5天,将铜绿微囊藻进行扩大培养。光照强度4000 lx;光暗比24 h∶0 h;温度(25±1)°C;每天摇动培养瓶5次,使藻类生长进入对数生长期。进入对数增长期后,取铜绿微囊藻各300 mL加入到1 L锥形瓶,再加入BG-11培养基100 mL进行驯化培养。

    • 由于对羟基苯甲酸和对香豆酸在泥炭中含量相对较高,水杨酸和咖啡酸和铁离子可以络合,实验选择这4种酚酸进行实验。

      使用细胞计数仪确定当前藻液浓度,并根据藻液浓度取一定量的处于对数生长期的藻液加入250 mL锥形瓶内,其中分别添加稀释了不同倍数的酚酸溶液,最后用培养基补足,使得锥形瓶内的液体总体积达到150 mL。每个锥形瓶内藻的初始密度为105 cell·mL−1,酚酸的最终浓度梯度分别为0、10、20、40、60、80 mg·L−1,每组3个平行,置于光照培养箱内。培养温度为(20±1)℃,光照强度为4000 lx,24 h光照,每天震荡3—5次。

    • 选用水杨酸和咖啡酸与铁形成络合物,探究酚铁对藻类生长的影响。实验选择的酚酸浓度为5×10−5 mol·L−1,铁浓度为1×10−6 mol·L−1,在此条件下酚酸浓度为铁浓度的50倍,可以有效保护体系中的二价铁。此外,由于泥炭沼泽中也普遍存在草酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸等无苯环的小分子有机酸,所以实验选择草酸、柠檬酸、乙酸作为干扰物质加入到酚铁体系中进行藻类的培养实验。

      藻类的培养实验分为10组,每组添加的物质如下:A.水杨酸+硫酸亚铁;B.咖啡酸+硫酸亚铁;C.水杨酸+草酸+硫酸亚铁;D.水杨酸+乙酸+硫酸亚铁;E.咖啡酸+草酸+硫酸亚铁;F.咖啡酸+乙酸+硫酸亚铁;G.水杨酸+柠檬酸+硫酸亚铁;H.咖啡酸+柠檬酸+硫酸亚铁;I.不添加酸和铁的对照组;J.只添加铁的对照组。

      以上试验均为期15 d,每隔48 h取样1次,记录藻细胞数量的变化,以及藻存活情况的变化和pH值的变化。培养周期结束后分别取10 mL和5 mL样品,测量样品中叶绿素a的含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm(最大光能转化效率)。其中Fv/Fm常用来表征叶绿素PsⅡ(低铁环境藻类光系统Ⅱ)反应中心内禀光能转换效率,反映当时所有的PsⅡ反应中心均处于开放态时最大光量子产量。

    • 为测藻细胞存活率及藻细胞数量,使用5-CFDA染色,具体操作方法如下:

      (1)用DMSO(二甲基亚砜)5-CFDA稀释至10 mmol·L−1。将99 μL已经配制好的BG-11培养基与1 μL的5-CFDA混合作为A液,摇晃10 s混匀;

      (2)将50 μL样品与50 μL A液混匀,用移液枪至少吹打10次;

      (3)在25℃条件下将上一步准备好的样品避光放置30 min;

      (4)用移液枪将待测样品吹打10次或摇晃,使藻细胞分散,然后用移液枪取20 μL加入计数板内。在计数板插入仪器之前,稳定1 min,使样品在其中稳定下来。

      将细胞染色后,使用细胞计数仪计数,并观察细胞的存活状态。

      测量样品叶绿素a的含量:

      (1)取藻液10 mL,4500 r·min-1离心15 min,去掉上层清液,将样品在4℃冰箱中放置1 d;

      (2)取出后迅速加入5 mL的90%热乙醇(80℃)于80℃的热水浴萃取2 min,再用超声处理10 min,放在暗处萃取4 h后,用0.22 μm的滤头过滤。用酶标仪于波长665 nm和750 nm处测吸光值,然后滴加1滴1 mol·L−1的盐酸酸化,于波长665 nm和750 nm处再测吸光值。计算公式为:

      其中,Chla乙醇为热乙醇法测定的叶绿素a含量(μg·L−1);E665是乙醇萃取液于波长665 nm的吸光值;E750是乙醇萃取液于波长750 nm的吸光值;A665为乙醇萃取液酸化后在665 nm处的吸光值;A750为乙醇萃取液在750 nm处的吸光值;V乙醇为乙醇萃取液的体积(mL),V样品为所取样品的体积(mL)。

      抑制率计算公式:IR=(1-N/N0×100%)抑制率为负值则有促进效果,抑制率为正则抑制。

    • 培养前准备:

      (1)提取泥炭中的DOM;

      (2)将样品通过H型阳离子柱交换柱,去除样品中存在的金属离子;然后将DOM样品按照<1 KDa,1—3 KDa,>3 KDa分成3份;

      (3)将3份样品中加入FeSO4,待稳定一段时间后,取10 mL加入培养基中,加入后Fe的浓度为5×10−6 mol·L−1

      铜绿微囊藻培养实验分为5组,每组3份平行,每组添加的物质如下:A.无添加;B.Fe,浓度为5×10−6 mol·L−1;C.DOM-Fe(<1 KDa),Fe浓度为5×10−6 mol·L−1;D.DOM-Fe(1—3 KDa),Fe浓度为5×10−6 mol·L−1;E.DOM-Fe(>3 KDa),Fe浓度为5×10−6 mol·L−1

      实验均为期15 d,每隔48 h取样1次,记录藻细胞数量的变化,以及藻存活情况的变化。

    • 在微囊藻培养体系中分别加入不同浓度四种酚酸溶液,经过14 d培养和检测,得到微囊藻-酚酸的生长曲线如图1所示。图1中A、B为不同浓度的对羟基苯甲酸和对香豆酸对微囊藻生长情况的影响。可以看出,当酚酸浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时,微囊藻的生长速率和最终达到的终点浓度明显高于控制组(0)抑制率为-23.5%—18%。从微囊藻浓度上来看,当酚酸浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时,生长情况比较接近,说明在此浓度下,这两种酚酸对微囊藻的生长有一定的刺激作用。在A、B组中当酚酸浓度超过20 mg·L−1时,藻液浓度和藻的生长速率明显低于控制组;当浓度增加到40 mg·L−1时,这两种酚酸对微囊藻的生长起到了明显的抑制作用,而对羟基苯甲酸的对微囊藻生长的抑制作用更加明显;浓度继续增加到60—80 mg·L−1时,微囊藻前4—5天略有增长,然后基本停止了增长,保持在3×106 cell·mL−1左右。对香豆酸60 mg·L−1组的藻数量略高于80 mg·L−1组。

      在C组水杨酸-微囊藻的实验中,水杨酸浓度为10 mg·L−1时,增长的速度与控制组接近,在8—10 d快速增长后,藻数量和控制组趋于一致。而当浓度大于10 mg·L−1时,都出现了明显的抑藻效果,抑制率约为80%。

      结合图2中存活率来看(从培养的第4天开始测微囊藻的存活率)当浓度为10 mg·L−1时,微囊藻的存活率都略低于控制组,差值在10%左右浮动,当浓度为20—40 mg·L−1,在开始计数时,藻类的存活率就已不同程度地低于控制组,并且A、C、D存活率在4—14 d整体处于下降的趋势,可以看出,水杨酸对微囊藻的抑制作用最强。

      表1是各组样品的Fv/Fm,最大光能转化效率Fv/Fm常用来表征叶绿素PsII反应中心内禀光能转换效率,反映当时所有的PsII反应中心均处于开放态时最大光量子产量。

      在非胁迫环境下,植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm变化极小,表现出稳定的特点,但在胁迫条件下,该参数明显下降[22]。Fv/Fm可作为植物受环境胁迫的响应指标[23]。控制组的Fv/Fm为0.308。一般情况下,微囊藻的Fv/Fm在0.3左右,当Fv/Fm过低表明藻类受到环境胁迫,PSII中心受到损伤进而降低光合作用效率。由表1可以看出,当水杨酸浓度大于20 mg·L−1时会对微囊藻的光合作用产生明显抑制,当各组酚酸浓度超过60 mg·L−1时,藻类基本停止了光合作用,这和前文中藻类的生物量变化和存活率相吻合。表2是各个组叶绿素含量的均值,数据表明:各组中相对低浓度的酚酸,不仅对藻类数量的增长有促进作用,也促进了叶绿素含量的增加。

    • 根据上述试验结果可以得出,当这4种典型泥炭源酚酸的浓度达10 mg·L−1时,从生物量、存活率以及光合作用强度来说对微囊藻的生长没有明显抑制作用。普遍认为,藻类吸收Fe主要是离子形态,而不是有机络合态Fe[24]。目前,仅观察到在产生铁载体的微生物中存在铁载体复合物的吸收及其在细胞中的还原[25]。已有研究发现,有机络合态铁中铁的释放途径不同。其中包括简单的配体-金属平衡(Ligand-Metal balance),平衡在初级生产者消耗铁后发生变化,促进铁从络合物中分离。另一个途径是基于配体的降解,这也导致了Fe和配体的分离。第三种可能是通过有机态铁的还原,降低配体对铁的亲和力,并导致Fe的释放。这个过程可能是由于络合物的自还原/氧化而发生的,这意味着配体氧化同时也释放产生Fe[26]。尤其是光还原分解对铁的生物利用度有很大影响,这一释放铁途径被称为AHS(aquatic humic substances)机制[12]

      图3是加入不同酸和Fe2+的微囊藻生长曲线。施加和不加Fe2+的对照试验表明,在培养1—9 d,两组生长速度以及生物量大致相同。在第9天后,施加Fe2+组的生长速度放缓,最终的藻密度低于对照组。图3表明在没有配体存在的情况下,加入一定量的铁对微囊藻生长促进作用不明显。同时,观察发现,在藻类指数生长阶段出现了较高的pH值(高达10.5),这与二氧化碳生物需求增加有关。在指数生长结束和平台期开始后,pH值略下降。在藻类生长平缓或生长不良的样品中,pH值无显著变化,pH值大多保持在6—8。

      能促进藻类生长的酚酸应当与三价铁有较高的亲和力,与二价铁有较低的亲和力[27]。试验表明,相对其他3种酚酸铁配合物体系,水杨酸铁不能有效地为微囊藻提供生物可利用性铁,这可能与水杨酸的稳定性较强有关[27]。对照表明,用咖啡酸处理的微囊藻生长良好,最高浓度达到2.19×107 cell·mL−1。这可能是咖啡酸中的儿茶酚基结构所引起的,并且有更高的氧化还原潜力,更容易将Fe从配合物中释放。Santana等 [28]的研究也证实了在生物条件下还原络合物的可能性。总体上,酚酸的加入提高了藻类对Fe的生物可利用率。

      图2显示藻类存活率从第10天开始明显下降,藻类计数可能包括了死藻,因此选择第11天数据进行显著性分析。结果表明(表3),在0.05的置信水平下,咖啡酸的加入对微囊藻生长有显著促进作用,而水杨酸在0.05的置信水平下,对微囊藻生长无显著促进作用。

    • 许多泥炭源有机质同时含有酚羟基和羧基,具有酚酸性质。但由于泥炭有机质组成复杂多样,现有技术尚不能有效分离不同性质有机化合物。因此,利用不同分子量段有机质与铁的络合物,开展藻类培养试验有助于客观评估泥炭源DOM-Fe的藻类可利用性。利用不同分子量段DOM-Fe,进行培养试验,铜绿微囊藻的生长情况如图4表4 结果表明,在0.05 的置信水平下,不同组之间差异不具统计显著性,但图4 还是反映出有机态铁对藻类生长的促进趋势.

      结果显示(图3图4),不同分子量结合态Fe均促进了铜绿微囊藻的生长,但影响程度不同。添加Fe后,铜绿微囊藻的生物量和控制组相比均有增加,微囊藻生长得到促进,最终达到107 cell·mL−1。其中,微囊藻在7—11 d增长最快;其次,对比生长终点可以发现不同DOM-Fe促进效果存在差异:E组>D组>C组>B组>A组>无Fe组;第三,添加DOM显著促进了藻的生长。研究表明,相对于Fe3+,藻类更倾向于利用Fe2+[29]。这是由于具有一定还原能力的DOM可以减缓二价铁的氧化[30],从而提高了藻类对铁的利用率。此外,不同分子量段DOM与Fe的络合稳定常数略有不同,较高分子量的DOM(>3 kD)与Fe的络合稳定常数较小[30],在光照或者其他条件下容易发生解离,产生易被藻类利用的Fe。而泥炭源低分子量DOM(<1 KD)络合态铁,由于其络合稳定的常数相对较高,在培养体系中更加稳定,相对不易被藻类利用。

    • (1)4种酚酸对藻类生长的影响均呈现“低促高抑”的规律。从藻类生物量和叶绿素含量来看,抑藻效果从高到低:水杨酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>咖啡酸;结合藻类的存活率,虽然低浓度酚酸刺激了藻类生物量的增长,但是也对藻类的生存产生了一定的负面影响:在添加10 mg·L−1酚酸的几组样品中,微囊藻的存活率都略低于控制组。

      (2)添加酚酸的藻类样品中,当水杨酸浓度达到20 mg·L−1时,Fv/Fm明显降低(0.3降低到0.02左右),而其它3种酚酸浓度达到60 mg·L−1才出现抑制,说明水杨酸抑制作用最强。

      (3)不同酚铁络合物的生物可利用性存在差异:相对咖啡酸和水杨酸,水杨酸络合态铁更难被藻类利用,除酚毒性效应外,还与其较高的络合稳定性有关。

      (4)泥炭源不同分子段DOM-Fe对藻类生长的促进作用从高到低依次为:>3 KD,1—3 KD,<1 KD。高分子段DOM(>3 kD)与Fe的络合稳定常数最小,在光照或者其他条件下容易发生解离,更易释放Fe而被藻类利用;泥炭源低分子量DOM(<1 KD)络合态铁,因其络合稳定常数相对较高,相对不易被藻类利用。

      致谢:感谢中国科学院水生生物研究所的大力支持。

    参考文献 (30)

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