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铁是一种生物必须的营养元素，直接影响浮游植物的光合作用和碳水化合物形成，由于高含氧量和无机态铁的低溶解性，铁通常是制约HNLC海区（High nutrition low chlorophyll）初级生产力的关键微量元素[1-2]。大规模海洋施铁实验表明，水生态系统中生物可利用铁的增加可以显著提高浮游植物的生物量和光合作用率，从而提高初级生产力，并促使浮游植物的群落结构发生变化[3-7]。以往研究表明，光自养微生物对碳循环和全球气候起关键作用[8-9]。初级生产力的提高，深刻地影响着全球尺度的二氧化碳固定，对温室气体的控制具有重要意义。
水生态系统中，99%溶解性铁（dissolved iron，DFe）与有机配体结合。尽管大部分有机络合态铁不能直接被藻类利用，但通过一些地球化学转化过程，可转变为生物可利用铁[10-11]。Blazevic等[12]研究发现，海洋中腐殖酸结合态铁可以发生光还原反应，进而提高铁的生物可利用性。沼泽性河流是海洋DFe的重要来源[13]。沼泽性河流中大量存在的溶解性有机碳（DOC, dissolved organic carbon）与铁离子形成有机络合物，使水中保持较高浓度DFe。有机质中羧基和酚羟基是与铁络合的主要官能团。泥炭源中的酚酸类物质，含有稳定的芳香环结构。部分酚酸与铁有较高的配合能力，这类物质的存在保护了长距离迁移的DFe，保证了陆源DFe向水生态系统的有效输出[14]。
泥炭沼泽中存在多种类型酚酸，前人在金川泥炭中检测出了9种酚酸，包括对-羟基苯甲酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸、对-香豆酸、没食子酸、原儿茶酸和咖啡酸，许多泥炭沼泽中都有这些酚酸的存在[14]。研究证实，酚酸等有机质可以和铁形成较为稳定的配合物，使其可以在淡水运输过程中迁移更长的距离[15]。其中，具有儿茶酚或者没食子酰基结构的原儿茶酸、没食子酸以及咖啡酸可以和Fe（Ⅱ）形成较为稳定的络合物，使得Fe（Ⅱ）在极易被氧化的碱性条件下也可以保存较长时间。而咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸以及龙胆酸还对Fe（Ⅲ）有着明显的还原作用，同样有助于这两种铁形态之间的平衡[16]。
植物或微生物分泌代谢物质对环境中其他植物或微生物体产生不利或有利的影响，这种作用称为化感作用。在化感作用过程中分泌的物质即被称为化感物质，自然界的化感物质种类非常丰富，主要包括酚酸类、苯醌类、倍半萜类、黄酮类等几大类物质[17]。迄今发现的化感物质几乎都是植物的次生代谢物质，分子量较小，结构简单，其中酚酸类物质是一类重要的次生代谢产物，也是研究较多，被证实是化感活性较强的一类物质[18]。酚酸具有一定生物毒性。目前对于酚酸抑藻的机制还不十分清楚，其抑制作用可能通过多种方式实现。研究表明，酚酸与蛋白质分子易遵循疏水键-氢键多点键合理论结合。在酚酸存在的情况下，藻细胞的胞外磷酸酶活性受到抑制，碱性磷酸酶活性的抑制使藻利用磷的能力下降。酚酸与细胞膜蛋白的结合，会破坏生物体细胞膜结构，使植物多酚物质进一步穿过细胞膜，进入细胞体内，从而改变微生物细胞酶活性，减少藻类对外源性蛋白质的利用，并通过对细胞外酶的抑制达到抑藻的目的[19]。另外，如果酚酸进入细胞体后，通过与金属离子发生络合反应，形成沉淀而破坏微生物的正常新陈代谢也是植物多酚抑藻的原因所在[20]。尽管酚酸存在生物毒性，但适量前提下，对藻类生长有积极作用[21]。泥炭源典型酚酸与铁的络合物是否对藻类利用铁有显著影响尚待进一步研究。因此，探究酚-铁配合物络合稳定性及其生物可利用性有助于进一步了解生物对铁的吸收，更好地理解全球铁碳耦合循环。
铜绿微囊藻（microcystic aeruginosa） 是中国湖泊、水库及其他水域生态系统水体富营养化蓝藻水华的代表性藻类。本文铜绿微囊藻为培养对象，利用泥炭源典型酚酸及泥炭溶解有机质（DOM）开展了一系列培养试验，以期了解泥炭沼泽源酚酸以及酚-铁络合物对铜绿微囊藻生长的影响。
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试验所用铜绿微囊藻藻源，由中国科学院水生生物研究所提供，采用BG-11培养基培养。
4种酚酸的配制：以1.7 g·L−1的浓度配制BG-11培养基，然后将对羟基苯甲酸、对香豆酸、水杨酸、咖啡酸加入，分别配制4份浓度为0.24 g·L−1的酚酸溶液。用0.22 μm滤膜在超净台中过滤，并用紫外光照射30 min，消除微生物的影响，现配现用。
藻种培养条件：实验前5天，将铜绿微囊藻进行扩大培养。光照强度4000 lx；光暗比24 h∶0 h；温度（25±1）°C；每天摇动培养瓶5次，使藻类生长进入对数生长期。进入对数增长期后，取铜绿微囊藻各300 mL加入到1 L锥形瓶，再加入BG-11培养基100 mL进行驯化培养。
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由于对羟基苯甲酸和对香豆酸在泥炭中含量相对较高，水杨酸和咖啡酸和铁离子可以络合，实验选择这4种酚酸进行实验。
使用细胞计数仪确定当前藻液浓度，并根据藻液浓度取一定量的处于对数生长期的藻液加入250 mL锥形瓶内，其中分别添加稀释了不同倍数的酚酸溶液，最后用培养基补足，使得锥形瓶内的液体总体积达到150 mL。每个锥形瓶内藻的初始密度为105 cell·mL−1，酚酸的最终浓度梯度分别为0、10、20、40、60、80 mg·L−1，每组3个平行，置于光照培养箱内。培养温度为（20±1）℃，光照强度为4000 lx，24 h光照，每天震荡3—5次。
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选用水杨酸和咖啡酸与铁形成络合物，探究酚铁对藻类生长的影响。实验选择的酚酸浓度为5×10−5 mol·L−1，铁浓度为1×10−6 mol·L−1，在此条件下酚酸浓度为铁浓度的50倍，可以有效保护体系中的二价铁。此外，由于泥炭沼泽中也普遍存在草酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸等无苯环的小分子有机酸，所以实验选择草酸、柠檬酸、乙酸作为干扰物质加入到酚铁体系中进行藻类的培养实验。
藻类的培养实验分为10组，每组添加的物质如下：A.水杨酸+硫酸亚铁；B.咖啡酸+硫酸亚铁；C.水杨酸+草酸+硫酸亚铁；D.水杨酸+乙酸+硫酸亚铁；E.咖啡酸+草酸+硫酸亚铁；F.咖啡酸+乙酸+硫酸亚铁；G.水杨酸+柠檬酸+硫酸亚铁；H.咖啡酸+柠檬酸+硫酸亚铁；I.不添加酸和铁的对照组；J.只添加铁的对照组。
以上试验均为期15 d，每隔48 h取样1次，记录藻细胞数量的变化，以及藻存活情况的变化和pH值的变化。培养周期结束后分别取10 mL和5 mL样品，测量样品中叶绿素a的含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm（最大光能转化效率）。其中Fv/Fm常用来表征叶绿素PsⅡ（低铁环境藻类光系统Ⅱ）反应中心内禀光能转换效率，反映当时所有的PsⅡ反应中心均处于开放态时最大光量子产量。
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为测藻细胞存活率及藻细胞数量，使用5-CFDA染色，具体操作方法如下：
（1）用DMSO（二甲基亚砜）5-CFDA稀释至10 mmol·L−1。将99 μL已经配制好的BG-11培养基与1 μL的5-CFDA混合作为A液，摇晃10 s混匀；
（2）将50 μL样品与50 μL A液混匀，用移液枪至少吹打10次；
（3）在25℃条件下将上一步准备好的样品避光放置30 min；
（4）用移液枪将待测样品吹打10次或摇晃，使藻细胞分散，然后用移液枪取20 μL加入计数板内。在计数板插入仪器之前，稳定1 min，使样品在其中稳定下来。
将细胞染色后，使用细胞计数仪计数，并观察细胞的存活状态。
测量样品叶绿素a的含量：
（1）取藻液10 mL，4500 r·min-1离心15 min，去掉上层清液，将样品在4℃冰箱中放置1 d；
（2）取出后迅速加入5 mL的90%热乙醇（80℃）于80℃的热水浴萃取2 min，再用超声处理10 min，放在暗处萃取4 h后，用0.22 μm的滤头过滤。用酶标仪于波长665 nm和750 nm处测吸光值，然后滴加1滴1 mol·L−1的盐酸酸化，于波长665 nm和750 nm处再测吸光值。计算公式为：
其中，Chla乙醇为热乙醇法测定的叶绿素a含量（μg·L−1）；E665是乙醇萃取液于波长665 nm的吸光值；E750是乙醇萃取液于波长750 nm的吸光值；A665为乙醇萃取液酸化后在665 nm处的吸光值；A750为乙醇萃取液在750 nm处的吸光值；V乙醇为乙醇萃取液的体积（mL），V样品为所取样品的体积（mL）。
抑制率计算公式：IR=（1-N/N0×100%）抑制率为负值则有促进效果，抑制率为正则抑制。
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培养前准备：
（1）提取泥炭中的DOM；
（2）将样品通过H型阳离子柱交换柱，去除样品中存在的金属离子；然后将DOM样品按照<1 KDa，1—3 KDa，>3 KDa分成3份；
（3）将3份样品中加入FeSO4，待稳定一段时间后，取10 mL加入培养基中，加入后Fe的浓度为5×10−6 mol·L−1。
铜绿微囊藻培养实验分为5组，每组3份平行，每组添加的物质如下：A．无添加；B．Fe，浓度为5×10−6 mol·L−1；C．DOM-Fe（<1 KDa），Fe浓度为5×10−6 mol·L−1；D．DOM-Fe（1—3 KDa），Fe浓度为5×10−6 mol·L−1；E．DOM-Fe（>3 KDa），Fe浓度为5×10−6 mol·L−1。
实验均为期15 d，每隔48 h取样1次，记录藻细胞数量的变化，以及藻存活情况的变化。
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在微囊藻培养体系中分别加入不同浓度四种酚酸溶液，经过14 d培养和检测，得到微囊藻-酚酸的生长曲线如图1所示。图1中A、B为不同浓度的对羟基苯甲酸和对香豆酸对微囊藻生长情况的影响。可以看出，当酚酸浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时，微囊藻的生长速率和最终达到的终点浓度明显高于控制组（0）抑制率为-23.5%—18%。从微囊藻浓度上来看，当酚酸浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时，生长情况比较接近，说明在此浓度下，这两种酚酸对微囊藻的生长有一定的刺激作用。在A、B组中当酚酸浓度超过20 mg·L−1时，藻液浓度和藻的生长速率明显低于控制组；当浓度增加到40 mg·L−1时，这两种酚酸对微囊藻的生长起到了明显的抑制作用，而对羟基苯甲酸的对微囊藻生长的抑制作用更加明显；浓度继续增加到60—80 mg·L−1时，微囊藻前4—5天略有增长，然后基本停止了增长，保持在3×106 cell·mL−1左右。对香豆酸60 mg·L−1组的藻数量略高于80 mg·L−1组。
在C组水杨酸-微囊藻的实验中，水杨酸浓度为10 mg·L−1时，增长的速度与控制组接近，在8—10 d快速增长后，藻数量和控制组趋于一致。而当浓度大于10 mg·L−1时，都出现了明显的抑藻效果，抑制率约为80%。
结合图2中存活率来看（从培养的第4天开始测微囊藻的存活率）当浓度为10 mg·L−1时，微囊藻的存活率都略低于控制组，差值在10%左右浮动，当浓度为20—40 mg·L−1，在开始计数时，藻类的存活率就已不同程度地低于控制组，并且A、C、D存活率在4—14 d整体处于下降的趋势，可以看出，水杨酸对微囊藻的抑制作用最强。
表1是各组样品的Fv/Fm，最大光能转化效率Fv/Fm常用来表征叶绿素PsII反应中心内禀光能转换效率，反映当时所有的PsII反应中心均处于开放态时最大光量子产量。
在非胁迫环境下，植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm变化极小，表现出稳定的特点，但在胁迫条件下，该参数明显下降[22]。Fv/Fm可作为植物受环境胁迫的响应指标[23]。控制组的Fv/Fm为0.308。一般情况下，微囊藻的Fv/Fm在0.3左右，当Fv/Fm过低表明藻类受到环境胁迫，PSII中心受到损伤进而降低光合作用效率。由表1可以看出，当水杨酸浓度大于20 mg·L−1时会对微囊藻的光合作用产生明显抑制，当各组酚酸浓度超过60 mg·L−1时，藻类基本停止了光合作用，这和前文中藻类的生物量变化和存活率相吻合。表2是各个组叶绿素含量的均值，数据表明：各组中相对低浓度的酚酸，不仅对藻类数量的增长有促进作用，也促进了叶绿素含量的增加。
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根据上述试验结果可以得出，当这4种典型泥炭源酚酸的浓度达10 mg·L−1时，从生物量、存活率以及光合作用强度来说对微囊藻的生长没有明显抑制作用。普遍认为，藻类吸收Fe主要是离子形态，而不是有机络合态Fe[24]。目前，仅观察到在产生铁载体的微生物中存在铁载体复合物的吸收及其在细胞中的还原[25]。已有研究发现，有机络合态铁中铁的释放途径不同。其中包括简单的配体-金属平衡（Ligand-Metal balance），平衡在初级生产者消耗铁后发生变化，促进铁从络合物中分离。另一个途径是基于配体的降解，这也导致了Fe和配体的分离。第三种可能是通过有机态铁的还原，降低配体对铁的亲和力，并导致Fe的释放。这个过程可能是由于络合物的自还原/氧化而发生的，这意味着配体氧化同时也释放产生Fe[26]。尤其是光还原分解对铁的生物利用度有很大影响，这一释放铁途径被称为AHS（aquatic humic substances）机制[12]。
图3是加入不同酸和Fe2+的微囊藻生长曲线。施加和不加Fe2+的对照试验表明，在培养1—9 d，两组生长速度以及生物量大致相同。在第9天后，施加Fe2+组的生长速度放缓，最终的藻密度低于对照组。图3表明在没有配体存在的情况下，加入一定量的铁对微囊藻生长促进作用不明显。同时，观察发现，在藻类指数生长阶段出现了较高的pH值（高达10.5），这与二氧化碳生物需求增加有关。在指数生长结束和平台期开始后，pH值略下降。在藻类生长平缓或生长不良的样品中，pH值无显著变化，pH值大多保持在6—8。
能促进藻类生长的酚酸应当与三价铁有较高的亲和力，与二价铁有较低的亲和力[27]。试验表明，相对其他3种酚酸铁配合物体系，水杨酸铁不能有效地为微囊藻提供生物可利用性铁，这可能与水杨酸的稳定性较强有关[27]。对照表明，用咖啡酸处理的微囊藻生长良好，最高浓度达到2.19×107 cell·mL−1。这可能是咖啡酸中的儿茶酚基结构所引起的，并且有更高的氧化还原潜力，更容易将Fe从配合物中释放。Santana等 [28]的研究也证实了在生物条件下还原络合物的可能性。总体上，酚酸的加入提高了藻类对Fe的生物可利用率。
图2显示藻类存活率从第10天开始明显下降，藻类计数可能包括了死藻，因此选择第11天数据进行显著性分析。结果表明（表3），在0.05的置信水平下，咖啡酸的加入对微囊藻生长有显著促进作用，而水杨酸在0.05的置信水平下，对微囊藻生长无显著促进作用。
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许多泥炭源有机质同时含有酚羟基和羧基，具有酚酸性质。但由于泥炭有机质组成复杂多样，现有技术尚不能有效分离不同性质有机化合物。因此，利用不同分子量段有机质与铁的络合物，开展藻类培养试验有助于客观评估泥炭源DOM-Fe的藻类可利用性。利用不同分子量段DOM-Fe，进行培养试验，铜绿微囊藻的生长情况如图4。表4 结果表明，在0.05 的置信水平下，不同组之间差异不具统计显著性，但图4 还是反映出有机态铁对藻类生长的促进趋势.
结果显示（图3和图4），不同分子量结合态Fe均促进了铜绿微囊藻的生长，但影响程度不同。添加Fe后，铜绿微囊藻的生物量和控制组相比均有增加，微囊藻生长得到促进，最终达到107 cell·mL−1。其中，微囊藻在7—11 d增长最快；其次，对比生长终点可以发现不同DOM-Fe促进效果存在差异：E组>D组>C组>B组>A组>无Fe组；第三，添加DOM显著促进了藻的生长。研究表明，相对于Fe3+，藻类更倾向于利用Fe2+[29]。这是由于具有一定还原能力的DOM可以减缓二价铁的氧化[30]，从而提高了藻类对铁的利用率。此外，不同分子量段DOM与Fe的络合稳定常数略有不同，较高分子量的DOM（>3 kD）与Fe的络合稳定常数较小[30]，在光照或者其他条件下容易发生解离，产生易被藻类利用的Fe。而泥炭源低分子量DOM（<1 KD）络合态铁，由于其络合稳定的常数相对较高，在培养体系中更加稳定，相对不易被藻类利用。
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（1）4种酚酸对藻类生长的影响均呈现“低促高抑”的规律。从藻类生物量和叶绿素含量来看，抑藻效果从高到低：水杨酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>咖啡酸；结合藻类的存活率，虽然低浓度酚酸刺激了藻类生物量的增长，但是也对藻类的生存产生了一定的负面影响：在添加10 mg·L−1酚酸的几组样品中，微囊藻的存活率都略低于控制组。
（2）添加酚酸的藻类样品中，当水杨酸浓度达到20 mg·L−1时，Fv/Fm明显降低（0.3降低到0.02左右），而其它3种酚酸浓度达到60 mg·L−1才出现抑制，说明水杨酸抑制作用最强。
（3）不同酚铁络合物的生物可利用性存在差异：相对咖啡酸和水杨酸，水杨酸络合态铁更难被藻类利用，除酚毒性效应外，还与其较高的络合稳定性有关。
（4）泥炭源不同分子段DOM-Fe对藻类生长的促进作用从高到低依次为：>3 KD，1—3 KD，<1 KD。高分子段DOM（>3 kD）与Fe的络合稳定常数最小，在光照或者其他条件下容易发生解离，更易释放Fe而被藻类利用；泥炭源低分子量DOM（<1 KD）络合态铁，因其络合稳定常数相对较高，相对不易被藻类利用。
致谢：感谢中国科学院水生生物研究所的大力支持。
典型泥炭源酚铁络合物的藻类可利用性——以铜绿微囊藻为例
Algae availability of typical peat-derived iron phenol complexes: A study based on Microcystis aeruginosa
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摘要: 铁是影响水生态系统初级生产力的关键微量元素。泥炭沼泽普遍含有丰富的溶解有机质，其中酚酸类物质具有稳定的芳香环结构，与铁有较强的络合能力，提高了陆源溶解性铁向水生态系统的有效输出。泥炭沼泽源酚铁配合物的生物可利用性对藻类生长及铁的生物地球化学循环有重要影响。本文通过一系列培养试验，研究了泥炭源典型酚铁络合物的藻类可利用性及其影响因素。结果表明，4种酚酸对藻类生长的影响均呈现“低促高抑”的规律，从藻类生物量和叶绿素含量来看，抑藻效果从高到低：水杨酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>咖啡酸。当水杨酸浓度达到20 mg·L−1时，对藻类的光合作用抑制最强。对照试验表明，水杨酸络合态铁更难被藻类利用，这与其络合物稳定性较高有关。利用不同分子量段泥炭源DOM-Fe的培养试验显示，对藻类生长的促进作用从高到低依次为：>3 KD，1—3 KD，<1 KD。低分子量DOM（<1KD ）络合态铁，由于其在培养体系中更加稳定，相对不易被藻类利用。Abstract: Iron is a key trace element that affects the primary productivity of aquatic ecosystems. Pealands are generally rich in dissolved organic matter. Among them, phenolic acids have a stable aromatic ring structure and have a high complexing ability with iron, which improves the effective output of terrestrial dissolved iron to the water ecosystem. The bioavailability of the peat-derived phenol-iron complex has an important impact on the growth of algae and the biogeochemical cycle of iron. In this paper, through a series of culture experiments, the algae availability and influencing factors of typical phenolic iron complexes from peat sources were studied. The results show that the effects of the four phenolic acids on the growth of algae present the law of “low concentration promotes, and high concentration inhibits”. From the perspective of algal biomass and chlorophyll content, the algae inhibitory effect is from high to low: salicylic acid>p-hydroxybenzoic acid> To coumaric acid>caffeic acid. When the concentration of salicylic acid reaches 20 mg·L−1, the photosynthesis inhibition of algae is the strongest. Control experiments show that the iron in the complexed form of salicylic acid is more difficult to be used by algae, which is related to the higher stability of the complex. Cultivation experiments using peat DOM-Fe of different molecular weights showed that the promotion of algae growth from high to low was: >3 KD, 1—3 KD, <1 KD. Low molecular weight DOM (<1 KD) complexed iron, because it is more stable in the culture system, is relatively difficult to be used by algae.
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Key words:
- peat /
- phenolic acid /
- iron /
- microcystic aeruginosa /
- bioavailability
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随着我国污水处理规模的迅速发展，污泥产量也逐年剧增。截至2015年底，我国脱水污泥年产量超过3×107 t，预计2020年污泥产量将再增加1倍[1-2]。因此，污泥的处置是我国目前面临的一大难题。污泥堆肥可以杀死有害细菌，增加和稳定其中的腐殖质，降低所含重金属的毒性效应[3-4]。因此，腐熟污泥农用是一种消纳污泥的有效途径[5-6]。我国颁布的土地改良泥质、农用泥质和园林绿化泥质标准规定了污泥使用量、污泥累计使用量、连续使用年限和施用频率的要求，但针对腐熟污泥在具体土壤类型上如何施用并没有相关要求[7]。石灰性土壤作为广泛分布在我国干旱和半干旱地区的土壤类型，其碱性特征使其容易和重金属形成难溶性氢氧化物等沉淀[8]。因此，该类土壤对重金属污染表现出“不敏感性”特征，该特征极易导致污泥过量施用而造成土壤质量的降低[9]。
土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的成分，污泥施用造成土壤pH，阳离子交换量，电导率和团聚体稳定性等理化性质发生变化[10-13]，这些变化又对土壤微生物活性、微生物种类、数量、分布等多样性产生影响[14-17]。其中需要关注的根际土壤微生物多样性是表征外源物质引起土壤质量变化的敏感指标[18]，该多样性的变化值得重视。
已有研究[19]表明，石灰性土壤中微生物学特征及其微生物群落结构对调节土壤养分供应有重要作用，污泥添加同样会对石灰性土壤微生物量以及碳、氮等微生物学性质产生影响[20]，且上述影响除与土壤性质和作物系统有关外[20-21]，不同污泥的施用量和施用时期长短也是影响土壤微生物性质及其多样性的重要因素[22-24]。目前，污泥施用对根际和非根际石灰性土壤中细菌多样性差异的研究还较少，尤其是过量施用污泥对土壤微生物特征变化的影响尚缺乏研究。因此，开展不同用量腐熟污泥对石灰性土壤细菌多样性特征影响研究，可为其在石灰性土壤中施用的生物学质量评价和合理施用策略提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验地点和材料
实验地点位于河南省洛阳市(北纬34°41′，东经112°27′)，该地区属于干旱半干旱气候，年均气温和降雨量分别为15.6 ℃和460 mm，土壤类型属于典型石灰性土壤，其基本理化性质和重金属含量如表1和表2所示。供试作物为夏玉米(夏玉米品种为郑丹958)，夏玉米在每年6月种植，10月收获。
表 1 土壤和腐熟污泥基本理化性质Table 1. Basic physic-chemical properties of soil and compost sludge供试材料 有机质/% 总氮/(g·kg−1) 总磷/(g·kg−1) 总钾/(g·kg−1) pH 碱解氮/(g·kg−1) 有效磷/(g·kg−1) 有效钾/(g·kg−1) 土壤 0.54±0.03 0.48±0.03 0.78±0.04 1.94±0.19 8.01±0.03 0.032±0.002 0.015±0.001 0.031±0.002 污泥 41.64±3.55 20.23±2.67 10.21±0.60 2.21±0.04 8.04±0.02 2.047±0.01 0.058±0.002 0.110±0.003 注：数据为平均数和标准差分析。 | Show Table
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表 2 污泥和土壤中重金属的含量Table 2. Heavy metals content of soil and compost sludge供试材料 Pb Zn Cu Cr Cd As Hg 土壤 2.35±0.36 53.98±2.46 52.79±1.89 76.43±0.82 0.49±0.01 28.05±1.12 0.029±0.001 污泥 5.53±0.23 269.08±9.33 206.39±9.01 173.99±10.5 1.19±0.16 48.08±2.23 0.035±0.001 注：数据为平均数和标准差分析。 | Show TableDownLoad:
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供试污泥取自洛阳市某污泥处理厂，该污泥配以秸秆等辅料，按照秸秆与污泥重量比1∶5均匀混合，通过好氧高温堆肥后制得腐熟污泥，其重金属含量与《农用污泥中污染物控制标准》(GB 4284-2018)所规定的值相比，除As符合B级污泥限值外，其余重金属符合A级污泥限值。
1.2 实验设计
根据污泥的施用量不同，实验设置5个处理，分别为0、3.75、7.5、37.5、75 t·hm−2等5个污泥施用量。其中，5个污泥施用量分别对应非根际土壤样品为A01，A03，A05，A07，A09；对应的根际土壤样品为A02，A04，A06，A08，A10。污泥的施用量参考我国污泥土地利用标准(GJ/T 309-2009)进行设计，每个小区面积30 m2，随机排列，并重复3次。实验从2015年10月开始，连续2 a种植冬小麦-夏玉米，并且在冬小麦季把污泥和180、90、90 kg·hm−2的N，P2O5，KO2肥作为底肥一次性施入土壤，采用人工撒施和多次翻耕的方式使污泥和土壤均匀混合。期间进行正常的灌溉和管理。2017年10月，夏玉米收获后，采集0~20 cm非根际土壤(没有作物生长的0~20 cm表层土壤)和根际土壤(根际土壤采用“抖根法”，先将玉米根系从土壤中挖出，抖掉与根系结合松散的土壤，收集与根际紧密结合在0~4 mm范围的土壤作为根际土壤)。采集的新鲜土样分成2份，其中一份放入50 mL灭菌的离心管后，于−80 ℃冰箱保存用于细菌多样性分析；另一份风干用于测定土壤其他参数。
1.3 总DNA提取建库测序
微生物多样性分析主要是在编码核糖体RNA的核酸序列保守区开展研究，其中细菌主要基于的是16S保守区。本研究采用细菌16S rDNA(V3+V4)扩增利用的引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，通过PCR扩增后形成测序文库，然后利用Illumina HiSeq 2500进行测序，上述测序结果覆盖了土壤样品中98%以上细菌的真实组成，而且OTUs丰度稀释曲线随着测序量增加趋向平坦，说明测序数量足够，能够反应出样品中物种组成特征。
1.4 数据处理分析
根据PE reads之间的Overlap关系，将Hiseq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列Tags，同时对Reads的质量和Merge的效果进行质控过滤。使用FLASHE. v1.27、Trimmomatic. v0.33和Uchime v4.2等软件进行质控过滤后，得到优化序列(Tags)；将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类；通过Alpha多样性分析研究样品内部的物种多样性，统计样品在97%相似度水平下的Ace、Chao、Shannon及Simpson指数；根据距离矩阵获得相应距离下的样品PCA(主成分分析)；利用16S功能基因和冗余分析(RDA)分别对样品功能基因丰度和细菌群落组成与土壤参数之间的相关关系进行分析。
1.5 污泥和土壤性质的测定
供试污泥和采集的土壤样品风干过筛后分析以下指标：全氮，全磷，全钾、有机质、pH、电导率。上述指标测定方法参考文献中的方法[25]。重金属测定：取0.500 g通过100目筛样品，置于聚氟坩埚中，加入10 mL HF，8 mL HNO3和3 mL HClO4后静置12 h，以除去有机质和硅酸，然后在加热板上加热，温度逐渐升高至200 ℃，稳定温度加热至白烟产生且坩埚中残存少量浅白色黏稠状物质为止。完全冷却后，加2%的HNO3 2~3 mL溶解残存物质，用25 mL容量瓶定容待用，空白和标准样品同时消化，样品中的Zn、Cu、Pb、Cr、Cd利用等离子发射光谱法(美国，PE optima5300DV)测定。As采用双道原子荧光光度计(北京，吉田AFS-9120)测定。每个样品重复3次，使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 污泥施用对石灰性土壤化学特征影响
石灰性土壤的主要理化性质受污泥施用的影响如表3所示。随着污泥用量的增加，根际和非根际土壤pH呈现降低趋势，但土壤中电导率、有机质、总氮和总磷有明显增加的趋势。与对照相比，当污泥施用量超过7.5 t·hm−2时，污泥施用对上述参数的影响会显著增加。污泥施用也增加了土壤中Pb、Zn、Cu、Cr、Cd、As等重金属的含量，当污泥施用量为75 t·hm−2时，土壤中Zn、Cu、Cd的含量与其他处理相比具有显著差异(P<0.05)，而土壤中As在7.5，37.5，75 t·hm−2的污泥施肥量条件下并没有显示出显著差异(P>0.05)。和非根际土壤相比，根际土壤中有机质、电导率、As含量高于对应样品中的非根际土壤含量。
表 3 污泥施用对非根际和根际土壤各参数影响Table 3. Effects of sludge application on parameters of non-rhizosphere and rhizosphere soil参数 非根际土壤 根际土壤 A01 A03 A05 A07 A09 A02 A04 A06 A08 A10 pH 8.18±0.02a 8.16±0.01a 8.13±0.01a 8.08±0.01b 7.96±0.02c 7.96±0.02a 7.95±0.01a 7.92±0.01ab 7.86±0.01b 7.76±0.02c EC/(μS·cm−1) 69.67±1.12d 74.00±1.00cd 76.67±1.15c 82.48±2.19b 92.33±2.31a 120.33±10.79c 124.67±3.06c 156±13.23b 175.33±13.05b 208.673±12.06a 有机质/(g·kg−1) 5.57±0.37b 5.80±0.02b 6.33±0.20b 9.54±0.41a 10.40±0.54a 8.48±0.32b 8.55±1.01b 10.00±0.69b 12.38±0.59a 14.11±1.36a 总氮/(g·kg−1) 0.49±0.02c 0.52±0.02c 0.64±0.01b 0.66±0.02b 0.83±0.03a 0.36±0.02c 0.40±0.02c 0.52±0.01b 0.55±0.04b 0.72±0.03a 总磷/(g·kg−1) 0.77±0.03d 0.79±0.02cd 0.88±0.04bc 0.90±0.02b 1.02±0.06a 0.64±0.03c 0.66±0.02c 0.73±0.04bc 0.76±0.02b 0.88±0.05a Pb/(mg·kg−1) 5.21±0.17c 5.51±0.12bc 5.67±0.16ab 5.89±0.14ab 6.00±0.16a 4.39±0.22c 4.65±0.14c 4.78±0.20bc 5.10±0.076ab 5.25±0.07a Zn/(mg·kg−1) 53.86±3.35d 57.95±2.97d 68.60±1.85c 83.73±3.26b 96.30±4.57a 50.67±2.7d 55.58±5.53d 65.85±2.28c 80.16±1.44b 93.83±2.61a Cu/(mg·kg−1) 54.19±4.03c 59.31±2.31c 84.03±4.58b 89.20±1.73b 115.77±4.51a 49.05±2.39c 52.96±2.96c 78.35±4.05b 81.72±3.17b 105.24±6.91a Cr/(mg·kg−1) 81.28±2.23c 86.83±1.54bc 91.86±2.66ab 92.15±2.24ab 94.96±4.48a 74.59±2.13b 78.93±1.44b 85.74±2.22a 88.14±1.82a 90.70±2.29a Cd/(mg·kg−1) 0.41±0.01d 0.43±0.01d 0.49±0.02c 0.60±0.02b 0.74±0.03a 0.36±0.01d 0.39±0.01cd 0.45±0.02c 0.56±0.03b 0.69±0.04a As/(mg·kg−1) 28.76±1.22c 32.37±1.65b 35.70±0.75a 36.17±0.39a 38.22±1.31a 33.73±5.83b 34.68±4.95b 41.05±3.76ab 43.42±2.89ab 46.94±1.76a Hg/(mg·kg−1) — — — — — — — — — — 注：数据为平均数和标准差分析，每行根际和非根际样品中不同小写字母表示各处理平均值具有显著差异(P<0.05)，“—”表示未检出。 | Show TableDownLoad:
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2.2 污泥施用对石灰性土壤细菌OTU丰度的影响
把序列之间相似性高于97%的Tags进行聚类，获得OTU。图1显示了各污泥施用水平下根际和非根际石灰性土壤OTU丰度(图1中不同小写字母表示各样品平均值具有显著差异(P<0.05))。非根际土壤样品中细菌的OTU丰度大小依次为A09 < A01 < A03 < A05 < A07。由此可见，当污泥施用量为3.75～37.5 t·hm−2时，非根际土壤中细菌OTU丰度随污泥施用量增加而增加；当污泥用量为75 t·hm−2时，样品A09中OTU的丰度与A03，A05，A07相比显著降低，并且低于A01丰度。根际土壤中细菌OTU的丰度大小顺序与非根际土壤有所不同，其OTU丰度依次为A10 < A08 < A02 < A04 < A06。由此可见，当污泥施用量在37.5 t·hm−2时，根际土壤中OTU丰度便开始降低，而且A10样品和其他各样品之间的OTU丰度相比具有显著差异。这说明污泥施用对根际土壤细菌OTU丰度的影响更加敏感，而且当污泥用量超过一定范围内会显著降低根际-非根际土壤细菌的OTU丰度。
图 1 污泥施用对非根际和根际土壤OTU丰度影响Figure 1. Effects of sludge application on OTU abundance in non-rhizosphere and rhizosphere soilVenn图可以表示不同样品之间共有、特有的OTU数目，直观地表现出个样品之间OTU的重合情况(图2)。结合OTU所代表的物种，可以找出不同样品中的共有微生物。不同样品用不同颜色表示，交叠部分数字为2个样品之间共有的OTU个数。非根际土壤样品A01、A03、A05、A07、A09中总OTU数量为1 896个，共有的数量为993个，占总数52.37%，各样品中特有OTU数量分别为4、11、11、9、12个。这说明污泥施用于石灰性土壤中，改变了非根际土壤中细菌OTU丰度，但随着污泥用量的增加其对土壤中特有微生物的数量影响不大。根际土壤中共有的OTU数量为882，占总共OTU数量1 895比例为46.54%，因此，污泥施用对根际土壤OTU的影响大于非根际土壤。其中A02、A04、A06、A08、A10样品中特有OTU数量分别为8、10、4、13、34个，除A08样品外，随着污泥用量的增加，根际土壤中各处理特有OTU的数量呈增加趋势。污泥用量在75 t·hm−2时，A10和A09样品中特有微生物数量多于其他样品，且根际土壤比非根际土壤增加了183%。
图 2 污泥施用后非根际和根际土壤细菌的Venn图Figure 2. Venn diagram of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil after sludge application2.3 污泥施用对石灰性土壤细菌Alpha多样性的影响
石灰性土壤施用不同量污泥后，对细菌多样性指数(Shannon、Simpson)和丰富度指数(Ace，Chao)的影响如表4所示。在污泥施用量为75 t·hm−2的条件下，根际和非根际土壤的Shannon指数与其他各处理相比有显著差异(P<0.05)，其他各处理之间无显著差异(P>0.05)。当污泥用量为3.2～37.5 t·hm−2时，同一污泥施用水平下，根际土壤的Shannon指数与非根际土壤无显著差异(P>0.05)。非根际和根际土壤的Simpson指数在污泥施用量为37.5 t·hm−2时最低，在污泥施用量为75 t·hm−2时最高，该指数值分别为0.004 2和0.003 2，0.009 4和0.009 8，说明37.5 t·hm−2的污泥施用量有利于细菌多样性指数的增加，当污泥用量达到75 t·hm−2时会显著降低细菌多样性。不同污泥施用量的Ace，Chao指数在非根际和根际土壤变化趋势一致，都是污泥施用量为75 t·hm−2时最小，说明75 t·hm−2的污泥施用量不但降低了细菌多样性指数，而且降低细菌的丰富度指数。此外，根际样品A02和A04的Ace，Chao指数比对应的非根际土壤高，但非根际样品A05，A07，A09的Ace，Chao指数大于对应的根际土壤，说明随着污泥施用量的增加会对根际细菌丰富度指数产生不利影响。
表 4 污泥施用对石灰性土壤细菌多样性和丰度影响Table 4. Effects of sludge application on bacterial diversity and abundance in calcareous soil污泥施用量/(t·hm−2) Shannon Simpson Ace Chao 非根际 根际 非根际 根际 非根际 根际 非根际 根际 0 (6.36±0.07)a (6.41±0.12)a (0.004 3±0.000 1)c (0.004 5±0.000 1)c (1 166.06±15.89)c (1 670.20±15.53)b (1 645.37±17.32)c (1 700.84±21.52)b 3.5 (6.38±0.04)a (6.39±0.07)a (0.005 1±0.000 1)b (0.004 8±0.000 2)c (1 727.57±17.55)b (1 754.11±18.59)a (1 750.75±21.00)b (1 759.19±20.59)a 7.5 (6.36±0.12)a (6.37±0.10)a (0.005 1±0.000 1)b (0.005 7±0.000 2)b (1 789.14±17.93)a (1 721.38±17.62)ab (1 785.98+18.95)ab (1 743.80±10.00)ab 37.5 (6.42±0.09)a (6.51± 0.09)a (0.004 2±0.000 1)c (0.003 2±0.000 1)d (1 825.15±26.45)a (1 758.09±29.94)a (1 822.54±9.85)a (1 779.62±22.39)a 75 (6.15±0.04)b (5.98±0.03)b (0.009 4±0.000 1)a (0.009 8±0.000 1)a (1 657.49±13.80)c (1 599.57±21.53)c (1 657.17±17.23)c (1 637.26±14.00)c 注：数据为平均数和标准差分析，每列中不同小写字母表示各处理平均值的显著性差异 (P<0.05)。 | Show TableDownLoad:
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2.4 污泥施用对石灰性土壤细菌群落结构影响
PCA主成分分析可将样品细菌多样性差异反映在二维坐标图上，主成分轴用来解释差异的综合信息，第1主成分轴解释最多的差异，第2主成分轴解释第2多的差异。污泥施用后对石灰性土壤中根际和非根际土壤细菌主成分分析表明，随着污泥施用量的增加，土壤中各处理细菌群落结构距离越远，说明对其群落组成造成的差异越大。对非根际土壤细菌群落结构而言，主成分1的贡献率为56.48%，主成分2的贡献率为24.08%，两者累计为80.56%(图3)。在第1主成分轴(PC1)上，污泥施用后非根际石灰性土壤上细菌群落结构差异较大，且随着污泥用量的增加土壤中细菌群落结构差异变大。在第2主成分轴(PC2)上，污泥用量较低的A01和A03样品细菌群落结构相近，随着污泥用量增加A05，A07，A09样品之间细菌群落结构相近。
图 3 非根际和根际土壤细菌的主成分分析Figure 3. Principal component analysis of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil根际土壤细菌群落结构多样性的主成分1占66.15%，主成分2占23.36%，二者累计贡献率为89.51%。在第1主成分轴上A02、A04、A06、A08之间的差异较小，但与A10之间的差异最大。在第2主成分轴上，A02与A04之间的差异最小，与A10之间的差异最大。当污泥施用量增加时，在主成分1对根际土壤细菌会产生较大的影响，在主成分2对非根际土壤产生较大影响。
2.5 污泥施用对石灰性土壤细菌相对丰度的影响
根际和非根际土壤细菌在门水平分类上排名前10丰度的物种如图4所示。非根际土壤中细菌门类群集中于变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)(相对丰度>5%)。土壤中变形菌门和酸杆菌门细菌是土壤微生物的重要成员，在土壤物质循环和生态环境构建过程其道非常重要作用。其中，各处理变形菌门的丰度都超过48%，因为变形菌门适合养分含量高的土壤环境，且与土壤有机质和全氮含量显著相关[26]。污泥施用增加了土壤中有机质和养分(表3)，使得变形菌门的丰度增量范围为1.63%～4.05%。污泥施用量在3.75～37.5 t·hm−2时拟杆菌门丰度增加明显，但污泥施用降低了酸杆菌门丰度(降低幅度为31.58%～34.59%)和放线菌门的丰度。同时，当污泥施用量为75 t·hm−2时，放线菌门的丰度降低达51.75%，这将不利于放线菌抵御病原菌和防治病害作用的发挥[27]。与非根际土壤相比较，根际土壤细菌在门水平上排名前10的种类相同，但其丰度有所变化，根际土壤中细菌门类群集中于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)。当污泥用量增加时，变形菌门丰度增加不明显。与对照相比，当污泥用量为75 t·hm−2时，拟杆菌门有明显的增加，丰度增加达1.45倍；酸杆菌门和放线菌门丰度降低49.74%和80.57%。其中酸杆菌门的降低不但与土壤pH的降低有关，还与污泥施用导致土壤氮素增加也有密切关系[28]。由此可见，随着污泥用量的增加，对根际和非根际土壤细菌门的丰度变化会产生不同影响。
图 4 门水平上非根际和根际土壤细菌的相对丰度Figure 4. Relative abundance of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil at phylum level2.6 污泥施用对石灰性土壤细菌功能影响
由上述研究结果可知，污泥施用量达75 t·hm−2时对根际和非根际土壤中细菌多样性产生较大影响。因此，通过KEGG(代谢途径分析数据库)分析空白对照和污泥施用量为75 t·hm−2的处理可知，污泥过量施用可造成根际和非根际土壤微生物群落功能基因在代谢途径上的差异。KEGG功能分析表明(见图5)，2个处理的前十大比例的代谢途径相同，但污泥施用为75 t·hm−2时，明显降低了A09样品中碳水化合物代谢、脂类代谢、氨基酸代谢以及膜运输代谢功能，说明过量的污泥施用已经抑制了土壤系统中C、N的循环过程，并显著增加了代谢途径有辅酶因子和维生素代谢、核苷酸代谢、翻译和信号传导功能，而这些功能的增加可能源于放线菌门数量减少所带来的环境胁迫响应。样品A10的碳水化合物代谢、脂类代谢、能量代谢、外源性物质的生物降解和代谢以及膜运输代谢显著降低，但辅酶因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、翻译功能显著增加。不施用污泥时，样品A02与A01相比只有异源生物降解代谢，翻译，膜运输，信号传导功能增加，其余功能降低。上述代谢差异为判断污泥添加对土壤功能质量影响提供了依据。
图 5 非根际和根际土壤细菌KEGG功能分析Figure 5. Analysis of KEGG function of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil2.7 石灰性土壤性质RDA分析及与多样性指数相关性
污泥施用不但对土壤理化性质变化产生影响，而且会造成重金属积累。因此，为了明确上述不同参数对细菌群落组成影响大小，本研究选择土壤pH、电导率(EC)、有机质(OM)、总氮(TN)、总磷(TP)以及污泥添加对重金属影响较为显著的Cd，Zn，Cu，Pb作为环境变量，通过冗余分析(RDA)探查上述参数与纲分类水平下非根际土样品(组1)和根际样品(组2)细菌群落组成的相关性(图6)。第1排序轴解释了细菌群落变化的34.03%，第2排序轴解释了细菌群落变化的20.73%，2个排序轴累积贡献率达54.76%。从图中可以看出，土壤TN、Cd、Cu、TP与细菌群落的相关性大，其中TN、Cd、Cu和土壤Shannon和Simpson多样性指数达到显著相关(表5)，EC、Pb、Zn与细菌群落的关系次之，而土壤中pH和OM对细菌群落组成影响较小。上述结果的原因在于，3.5～37.5 t·hm−2的污泥施用量并没有对土壤pH和OM造成显著影响，但已明显影响了土壤中TN、TP、Cd、Cu等含量。
图 6 土壤细菌群落与土壤性质的RDA分析Figure 6. RDA analysis of soil bacterial community and soil properties注：图中不同形状和颜色的符号表示污泥施用处理的细菌群落；箭头表示环境因子，箭头连线的长度带表某个环境因子与群落分布间相关程度的大小，箭头越长，说明相关性越大，反之越小；细菌群落与环境因子之间的夹角代表细菌群落与环境因子之间正负相关关系，锐角表示正相关，钝角表示负相关，直角表示不相关。表 5 土壤参数与微生物多样性指数之间的相关分析Table 5. Correlation coefficients between soil properties and microbial diversity index多样性指数 pH 有机质 总氮 总磷 EC Pb Zn Cu Cd Shannon 0.428 −0.457 −0.635* −0.550 −0.343 −0.277 −0.591 −0.630* −0.648* Simpson −0.470 0.469 0.642* 0.550 0.324 0.255 0.601 0.667* 0.654* Ace 0.268 −0.175 −0.081 −0.029 2 −0.265 0.198 −0.052 −0.061 7 −0.134 Chao 0.244 −0.164 −0.183 −0.142 −0.195 0.098 −0.124 −0.149 7 −0.223 注：*显著相关 (P<0.05)。 | Show TableDownLoad:
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3. 讨论
微生物多样性是土壤质量的重要参数，而且土壤微生物对其环境改变极为敏感，其多样性变化与土壤退化有密切关系[29]。适量地投放污泥有利于土壤质量的维持，但过量或长期施用污泥会导致土壤质量的降低。ANDRES等[30]通过向土壤中施用污泥，初始阶段均可增加土壤微生物生物量，但1 a以后污泥对土壤微生物活性已消失。长达30 a在大豆、生菜、芥菜上施用污泥的研究表明，污泥长期施用对土壤微生物有负面影响[31]。本研究连续2 a施用75 t·hm−2污泥后，根际和非根际土壤中细菌OTU丰度、多样性Shannon指数和丰富度Ace，Chao指数均会显著降低。因此，针对不同土壤类型开展污泥施用后的微生物多样性变化研究，并根据研究结果采取“隔年间歇式”污泥施用模式，可做到既利用了污泥养分，又能保证土壤质量。
有研究表明，土壤细菌群落多样性的变化与土壤pH、有机质、氮、磷有关，其中pH的变化被认为是影响土壤微生物多样性的主要因素[32-33]。和对照相比，研究中污泥用量为37.5 t·hm−2时，pH才有显著差异(表2)，但由于石灰性土壤上pH变幅较小，使得其不是影响细菌多样性变化的一个重要因素，本研究的RDA分析也印证了该结论。由于重金属对细菌的毒害作用，会显著降低其多样性[34]。较高含量的Cu，Pb，Zn重金属污泥，施入土壤会造成土壤中微生物种群由细菌向真菌转化[35]。富含Zn的污泥施用于沙壤土中会导致了所有微生物群落结构的变化(即细菌，真菌，古生菌，放线菌和根瘤菌)，其中真菌群落受其影响最大[36]。本研究污泥的施用虽然增加了土壤中重金属积累，但由于我国污泥重金属含量有降低趋势[37]，以及石灰性土壤对重金属的“不敏感性”等原因，使得除Cd，Cu外，其他重金属和与细菌群落的相关性并不大。
选择根际土壤进行微生物多样性研究，更能灵敏地反映出外源物质施用对土壤质量的影响[38]。石灰性土壤上通过对细菌OTU丰度和PCA主成分分析，也表明污泥施用对根际土壤细菌的影响更敏感。另外，上述结果只是污泥连续施用2 a后的结论。为了更加全面的准确了解污泥对该类施用对该类土壤微生物多样性的影响，选择多年根际土壤中细菌和真菌的变化研究，才能准确评价污泥农用对微生物多样性的影响，同时也为推荐污泥施用量提供依据。
4. 结论
1)污泥在石灰性土壤上施用会改变根际和非根际土壤中细菌丰富度和多样性指数，而且在2 a连续施用量为37.5 t·hm−2的条件下，不利于根际土壤中细菌多样性增加。当污泥施用量达到75 t·hm−2时，会显著降低根际和非根际土壤中细菌的多样性指数。因此，考虑到根际微生物对外源物质响应的灵敏性，此类土壤中连续2 a的污泥施用量宜控制在37.5 t·hm−2以下。
2)污泥施用造成土壤理化性质的变化是影响土壤细菌群落变化的一个主要因素，另外重金属种类对微生物群落组成的影响也存在差异。本研究在2 a连续施用污泥后，土壤中TN、Cd和Cu是影响细菌群落的主要参数。
3)污泥施用量超过75 t·hm−2时，将会抑制根际和非根际土壤中C、N的循环代谢功能，降低酸杆菌门和放线菌门丰度。这说明此污泥施用量下，土壤质量已经开始下降。
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图 4 铜绿微囊藻生长曲线A.无添加 B.硫酸亚铁 C.DOM-Fe（<1KD ） D.DOM-Fe（1-3 KD） E.DOM-Fe（> 3KD）
Figure 4. Microcystis aeruginosa growth curve
表 1 铜绿微囊藻的Fv/Fm
Table 1. Fv/Fm of Microcystis aeruginosa
对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid 对香豆酸P-coumaric acid 水杨酸Salicylic acid 咖啡酸Caffeic acid 010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−6 0.3080.3100.2920.3020.0390.000 0.3080.3100.3140.3240.0490.000 0.3080.3090.0230.0140.0000.000 0.3080.3310.2760.3600.0380.000 注：0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度，表中数据是在微囊藻培养期结束时测得的Fv/Fm。 Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four added phenolic acid concentrations. The data in the table are the Fv/Fm measured at the end of the Microcystis culture period.
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表 2 铜绿微囊藻叶绿素含量（g·L-1）
Table 2. Chlorophyll content of Microcystis aeruginosa
对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid 对香豆酸P-coumaric acid 水杨酸Salicylic acid 咖啡酸Caffeic acid 010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−6 0.5681.0141.1380.7750.0000.000 0.5680.7370.8620.5680.0000.000 0.5680.7960.0090.0000.0000.000 0.5682.0932.2011.3590.0000.000 注：0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度，表中数据是微囊藻培养期结束时测得的叶绿素含量。 Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four phenolic acid concentrations added. The data in the table is the chlorophyll content measured at the end of the Microcystis culture period.
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表 3 第11天不同试验组微囊藻浓度变化的相关性矩阵
Table 3. Correlation matrix of changes in the concentration of Microcystis in different test groups on the 11th day
1_3 Fe1_3 A B C D E F G H 1_3 1 0.963 0.971 −0.358 0.474 0.657 0.246 0.461 0.983 0.491 Fe1_3 0.963 1.00 1.000* −0.095 0.221 0.835 −0.022 0.682 0.996 0.707 A 0.971 1.000* 1.00 −0.126 0.251 0.818 0.008 0.659 0.999* 0.685 B −0.358 −0.095 −0.126 1.00 −0.992 0.468 −0.993 0.663 −0.179 0.637 C 0.474 0.221 0.251 −0.992 1.00 −0.352 0.970 −0.563 0.302 −0.534 D 0.657 0.835 0.818 0.468 −0.352 1.00 −0.569 0.972 0.785 0.979 E 0.246 −0.022 0.008 −0.993 0.970 −0.569 1.00 −0.746 0.062 −0.723 F 0.461 0.682 0.659 0.663 0.663 0.972 −0.746 1.00 0.618 0.999* G 0.983 0.996 0.999* −0.179 0.302 0.785 0.062 0.618 1.00 0.645 H 0.491 0.707 0.685 0.637 −0.534 0.979 −0.723 0.999* 0.645 1.00 注：*. 在 0.05 水平（双侧）上显著相关。Notes：*. Significant correlation at 0.05（bilateral） level.
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表 4 第11天不同试验组铜绿微囊藻生长浓度变化的相关性矩阵
Table 4. Correlation matrix of growth concentration changes of Microcystis aeruginosa in different test groups on the 11th day
A B C D E A 1 −.751 .350 −.167 .770 B −.751 1 −.881 .776 −.158 C .350 −.881 1 −.982 −.327 D −.167 .776 −.982 1 .500 E .770 −.158 −.327 .500 1 注：*. 在 0.05 水平（双侧）上显著相关. Notes：*. Significant correlation at 0.05（bilateral） level.
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