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酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系

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刘闪, 曹星星, 吴攀, 杨诗笛, 张涛, 廖路. 酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
引用本文: 刘闪, 曹星星, 吴攀, 杨诗笛, 张涛, 廖路. 酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
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LIU Shan, CAO Xingxing, WU Pan, YANG Shidi, ZHANG Tao, LIAO Lu. Relationship between bacterial diversity and environmental factors in reservoirs and their inflow basins under the influence of acid mine drainage[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
Citation: LIU Shan, CAO Xingxing, WU Pan, YANG Shidi, ZHANG Tao, LIAO Lu. Relationship between bacterial diversity and environmental factors in reservoirs and their inflow basins under the influence of acid mine drainage[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
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酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系

  • 1.

    贵州大学资源与环境工程学院，贵阳，550025

  • 2.

    贵州大学喀斯特地质资源与环境教育部重点实验室，贵阳，550025

  • 3.

    沈阳农业大学农学院，沈阳，110161

    • 通讯作者: Tel：13885030478, E-mail: pwu@gzu.edu.cn; 
  • 基金项目:
    国家自然科学基金（U1612442），贵州省科技计划项目（黔科合平台人才[2016]5664，黔科合[2016]支撑2835）和贵州省人才基地项目（RCJD2018-21）资助.

Relationship between bacterial diversity and environmental factors in reservoirs and their inflow basins under the influence of acid mine drainage

  • 1.

    College of Resources and Environmental Engineering in Guizhou, Guiyang, 550025, China

  • 2.

    Key Laboratory of Karst Geological and Environment, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang, 550025, China

  • 3.

    College of Agriculture, Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110161, China

    • Corresponding author: WU Pan, pwu@gzu.edu.cn ; 
  • Fund Project: National Natural Science Foundation of China (U1612442), Guizhou Science and Technology Plan Project (Guizhou Science and Technology Cooperation Platform Talents [2016]5664, Guizhou Science and Technology Cooperation [2016] Support 2835) and Guizhou Talent Base Project (RCJD2018-21)

摘要

  • 摘要: 为了解酸性矿山废水排水处沿流域至水库底层水体细菌群落结构的沿程变化，探索其环境影响因素．采用高通量测序技术并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，对2019年9月采集受酸性矿山废水（acid mine drainage，AMD）影响的12个水样进行研究．结果表明，入库流域水样中细菌群落多样性变化趋势不明显，从表层至底层细菌多样性不断升高．在门水平上受AMD影响的细菌主要由变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes，0.21%—12.96%）、厚壁菌门（Firmicutes，0.15%—14.48%）和放线菌门（Actinobacteria，0.06%—4.64%）构成。其中，变形菌门中的α-变形菌纲（Alphaproteobacteria，2.42%—61.99%）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria，1.29%—63.53%）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，6.41%—63.09%）为优势菌类．从不同空间位置浮游细菌群落组成来看，不动杆菌属（Acinetobacter）在受AMD影响流域上游至水库底层水样中均占较大比例，为2.13%—57.84%，假单胞菌属（Pseudomonas，3.86%—12.29%）、铁细菌属（Ferrovum，0.97%—13.21%）和拟杆菌属（Bacteroides，0.01%—5.02%）是上游水样中的优势菌属，噬氢菌属（Hydrogenophaga，0—5.94%）、盖氏铁柄杆菌属（Gallionella，1.45%—11.91%）和新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium，0—5.34%）是中游占比较大的菌属，红细菌属（Rhodobacter，12.73%—57.52%）是下游水样和水库水样中的优势细菌．造成AMD影响下不同位点处水体浮游细菌群落组成差异的环境因子各不相同，入库流域水体细菌群落主要受NH+4-N、总磷（TP）和SO2−4影响，Mg2+和As3+也与入库流域水体中细菌多样性存在一定相关关系，水库水体中细菌群落主要受水温（T）影响．研究结果将有助于为酸性矿山废水微生物资源及生态环境的研究提供理论依据．
    Abstract: To understand the changes in bacterial community structure along the watershed to the bottom of the reservoir at the acid mine drainage and to explore the environmental impact factors. Twelve water samples affected by acid mine drainage (AMD) were collected in September 2019 using high-throughput sequencing technology and principal component analysis (PCA). The results showed that the trend of bacterial community diversity in the water samples from the inlet basin was not obvious, and the bacterial diversity increased from the surface to the bottom layer. The bacteria affected by AMD at the phylum level were mainly Proteobacteria, Bacteroidetes (0.21%—12.96%), Firmicutes (0.15%—14.48%), and Actinobacteria( 0.06%—4.64%). Of these, the phylum Alphaproteobacteria (2.42%—61.99%), the phylum Betaproteobacteria (1.29%—63.53%) and the phylum Gammaproteobacteria (6.41%—63.09%) were the dominant bacterial groups. In terms of the composition of the planktonic bacterial community at different spatial locations, Acinetobacter(2.13%—57.84%), Pseudomonas(3.86%—12.29%), Ferrobacter(0.97%—13.21%), and Bacteroides (0.01%—5.02%) were the most abundant species in the water samples from the upstream to the bottom of the reservoirs affected by AMD. Pseudomonas (3.86%—12.29%), Ferrovum (0.97%—13.21%) and Bacteroides (0.01%—5.02%) were the dominant genera in the upstream water samples, Hydrogenophaga (0—5.94%), Gallionella (1.45%—11.91%) and Novosphingobium(0—5.34%) were the dominant genera in the midstream, and Rhodobacter(12.73%—57.52%) were the dominant bacteria in the downstream water samples and in the reservoir water samples. The environmental factors leading to the difference in the composition of the planktonic bacterial community at different sites under the influence of AMD are different, NH+4-N, total phosphorus (TP) and SO2−4 were the main factors affecting the bacterial community in the inflow basin. Mg2+ and As3+ also had a certain correlation with the bacterial diversity in the inflow basin, and bacterial community in reservoir water is mainly affected by water temperature (T). The results of the study will help to provide a theoretical basis for the study of the microbial resources and ecological environment of acid mine wastewater.

  • 随着我国工业化和城市化的迅速发展，能源消耗日益增长，城市人口迅速膨胀，机动车保有量激增，导致NOx、一氧化碳（CO）和VOCs等臭氧（O3）前体物排放量不断增加[1-4]，O3逐渐成为我国城市环境空气的主要污染物，严重威胁了人类健康和植物生长[5]，也引起了众多学者的广泛关注. 近年来，大量研究围绕光化学烟雾和臭氧污染展开，结果表明，在短期内排放源大致不变的情况下，气象条件是影响臭氧污染最重要的因素，臭氧污染典型气象条件表现为太阳辐射强、气温高、相对湿度适宜、地面小风速及特定的风向[6-9].

    宁夏回族自治区地处中国西北部内陆，气候干燥、太阳辐射强，日照时间长[10]，为臭氧前体物的转化提供了有利的气象条件，加之近年来，受城市化及宁东能源化工基地（简称“宁东基地”）污染排放影响，造成宁夏臭氧污染天气频发. 特别是2017年银川市日最大8小时浓度（O3−8 h）值超出二级标准，达到轻度及以上污染达48 d，臭氧污染引起了自治区政府及相关部门高度重视. 近年来，学者们对银川市臭氧污染及气象条件特征等方面开展了分析研究[11-14]，结果表明，银川市臭氧浓度日变化呈单峰性，午后易出现臭氧超标，臭氧浓度与紫外辐射强度和气温呈正相关、与相对湿度呈负相关. 目前，对宁夏其它地市的臭氧污染的气象条件特征研究较少，宁夏臭氧污染预报预警技术支撑薄弱. 按中国气象局要求，从2018年起，每年5—9月全国各省市开展臭氧污染气象条件等级预报业务，但由于缺乏技术支撑，目前宁夏臭氧污染气象条件等级预报业务也仅是以经验为主，随意性大，精细化程度不够，预报服务效果不理性.

    本文针对宁夏臭氧污染现状及臭氧污染等级客观精细化预报服务业务需求，利用环境和气象数据，采用相关性分析和概率统计方法，从臭氧污染高影响气象因子着手，在分析各地市臭氧污染气象条件特征基础上，综合考虑各气象因子对臭氧生成的贡献大小，建立宁夏臭氧污染气象条件评价指标体系；基于评分及预报效果检验评估结果，参照《全国臭氧气象预报业务规范》，建立臭氧污染气象条件指数预报模型和等级预报标准. 研究结果将为宁夏臭氧污染气象条件客观化精细化预报提供技术支撑，实现臭氧污染气象条件定量化精细化监测，为宁夏各地市臭氧污染预报预警及科学应对臭氧污染提供技术支撑和决策参考.

    1.   实验部分（Experimental section）

    1.1   数据来源

    环境空气质量数据来源于宁夏回族自治区生态环境监测站提供的2017—2020年宁夏五地市（银川市、石嘴山市、吴忠市、中卫市、固原市）18个环境空气质量国控监测点及宁东基地5个区控监测点O3质量浓度逐小时数据和城市O3−8 h数据. 同期气象数据来源于宁夏气象信息中心，为距离环境监测点最近的自动气象站逐小时气温、相对湿度、风速、风向、总云量、降水等，其中，2017—2019年总云量资料为银川市、中卫市和固原市气象站保留3次人工观测的中午14时总云量数据，用于臭氧污染气象条件指数预报模型建立；另外，还使用了风云4号卫星反演的2020年五地市及宁东地区总云量资料，用于指数预报模型预报效果检验评估. 宁夏行政区划及环境空气监测站点和气象观测站点位置见图1.

    图 1  宁夏环境空气自动监测站点和气象观测站点分布
    Figure 1.  Distribution of ambient air automatic monitoring stations and meteorological observation stations in Ningxia
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    1.2   分析方法

    臭氧超标率（E）定义：根据《环境空气质量指数（AQI）技术规定》（HJ 633—2012）臭氧二级标准为1 h平均浓度大于200 μg·m−3.

    E=t1t×100%  (1)

    式（1）中，t1是某个时间段内臭氧浓度超出200 μg·m−3的时次，t是总时次，E为臭氧超标率.

    太阳辐射强度是影响臭氧浓度变化的重要原因之一，太阳辐射强弱又与温度有关[15]，因此分析温度对臭氧污染的影响非常重要. 本文参考相关文献[16]，统计不同度区间的臭氧平均浓度和超标率，分别将气温与其他气象因子联立，统计联立后的臭氧平均浓度和超标率，即以气温为参照，研究其他气象因子对臭氧平均浓度和超标率的影响，从而确定所有气象因子的影响权重，最后得出指数预报模型及等级预报分级标准.

    2.   结果与讨论（Results and discussion）

    2.1   气象因子与臭氧浓度的关联性分析

    研究表明，臭氧是二次污染物，主要来源于挥发性有机物（VOCs）和氮氧化物（NOx）的光化学反应[17-18]。本文选取了白天的臭氧浓度和气象要素进行相关性分析，结果表明，各地臭氧浓度与气温均呈明显正相关，相关系数为0.64—0.72；与相对湿度均呈较明显负相关，相关系数−0.36—−0.55；与风速呈弱正相关，相关系数0.11—0.32. 由于风向用0—360数值表示，如：北风用0标记，东风用90标记；总云量用0—10的整数数据标记，如晴天无云标记为0，满天云系标记为10成云；宁夏全年降水过程较少，无降水或微量降水自动气象观测均标记为0，而臭氧浓度数值变化范围较大，因此，臭氧浓度与风向、总云量和降水量的相关性不明显（见表1）.

    表 1  宁夏五地市及宁东基地气象要素与臭氧浓度相关系数
    Table 1.  Correlation coefficients of meteorological elements and ozone concentration in five cities of Ningxia and Ningdong base
    站点Station气温Temperature湿度Humidity风速Wind speed风向Wind direction云量Cloud cover降水量Precipitation
    银川0.67−0.360.180.013−0.022−0.039
    石嘴山0.71−0.490.24−0.018−0.0210.041
    吴忠0.69−0.420.230.015−0.101−0.059
    中卫0.71−0.490.24−0.102−0.0260.026
    固原0.64−0.550.32−0.0320.025−0.132
    宁东0.72−0.420.110.011−0.011−0.021
    全区平均0.69−0.460.22−0.019−0.026−0.031
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    2.2   气象因子对臭氧浓度的影响

    为进一步探讨气象要素变化对臭氧浓度的影响，通过对2017—2019年宁夏5个地市及宁东基地臭氧浓度和超标率进行分类统计发现，气温、相对湿度、风速、云量、降水等气象要素对臭氧浓度和超标率都有影响. 各地臭氧浓度和超标率均随气温升高而升高，气温超过30℃时，各地平均臭氧浓度和超标率分别为130.3—184.0 μg·m−3、0.1 %—19.2%. 各地臭氧浓度和超标率均随湿度增大而减小，较干燥的环境（相对湿度≤55%）臭氧浓度和超标率相对较高，各地分别为95.1—134.7 μg·m−3、0.1%—6.0%，相对湿度在55%以上时臭氧浓度和超标率较低. 风速小于1 m·s−1时，各地臭氧浓度和超标率均较低，风速在2—3 m·s−1之间时，臭氧浓度和超标率相对较高，各地分别为96.2—124.2 μg·m−3、0.2%—4.9%，风速在5 m·s−1及以上时，臭氧浓度也较高，但不易出现超标. 不同风向下各地臭氧浓度和超标率无明显变化. 云量对臭氧影响表现为：云量在0—3成的晴天各地臭氧平均浓度和超标率均较高，分别为112.4—149.0 μg·m−3、0.9%—7.9%，云量在4—10成的多云或阴天较低. 降水对臭氧浓度和超标率也有一定影响，无雨时臭氧浓度和超标率分别为102.8—135.8 μg·m−3、0.5%—3.0%，小时雨量大于1 mm，臭氧浓度明显降低，除银川超标率为1.6 %外，其它地市未出现臭氧浓度超标.

    2.3   气象因子联合对臭氧浓度的影响

    为了突出温度对臭氧浓度的影响并兼顾考虑其它气象因子的影响，以银川市为例，对气象因子联合对臭氧浓度的影响进行分析. 结果表明，当气温在30℃以上，相对湿度在15%—55%之间，臭氧浓度和超标率均较高，分别在149.7—189.2 μg·m−3、8.2%—23.9%之间；湿度大于55%，臭氧浓度和超标率相对较低（见图2）. 云量对于臭氧浓度和超标率的影响也与温度密切相关，阴天臭氧浓度和超标率均较低；当气温在30℃以上，云量在0—3成的晴好天气，臭氧浓度和超标率均增大，分别在202.1—218.9 μg·m−3、12.5%—19.2%之间（见图3）. 风速对于臭氧浓度的影响，在不同的温度区间下表现也不一样，温度在25℃以下，臭氧浓度相对较低，不会引起臭氧超标，当温度大于30℃，风速在2—3 m·s−1之间时，臭氧浓度和超标率均明显增大，分别在157.0—171.0 μg·m−3、10.8%—23.1%之间，风速在5 m·s−1及以上时，臭氧浓度也较高，但不易出现超标（见图4）. 风向对臭氧超标率的影响也与温度密切相关，温度在25℃以下，不同风向下的臭氧超标率都很小，当气温在30℃以上，不同风向下的臭氧浓度和超标率都较大，分别在152.1—179.8 μg·m−3、9.4%—29.5%之间（图略），进一步说明温度是影响臭氧浓度的最主要因子，风向对臭氧浓度影响较小.

    图 2  气温与湿度联合对臭氧浓度及超标率的影响
    Figure 2.  The combined effect of temperature and humidity on ozone concentration and over standard rate
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    图 3  气温与云量联合对臭氧浓度及超标率的影响
    Figure 3.  The combined effect of air temperature and cloud cover on ozone concentration and over standard rate
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    图 4  气温与风速联合对臭氧浓度及超标率的影响
    Figure 4.  The combined effect of temperature and wind speed on ozone concentration and over standard rate
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    分析结果表明，气温超过30℃时，当相对湿度在15%—55%之间、云量小于3成、风速在2—3 m·s−1之间时，臭氧浓度和超标率均较高.

    2.4   臭氧污染气象条件评分体系建立

    从以上分析看，温度是臭氧污染的高敏感的气象因子[19]，臭氧浓度和超标率随着气温升高而明显升高，相对湿度、云量、风速对臭氧浓度的影响也较为明显，降水也有一定影响，但宁夏属于干旱少雨地区，全年各地降水次数少，同时降雨时气温也相对较低，湿度也较大，这两个气象要素也可间接代表降水对臭氧浓度影响，风向对臭氧浓度和超标率的影响不明显.

    基于上述分析结果，选取气温、相对湿度、云量、风速做为臭氧污染气象条件评价气象因子，将温度作为臭氧污染的高敏感的气象因子，综合考虑五地市及宁东地区不同温度区间的臭氧浓度和超标率大小进行气温基础（Ts）评分，平均浓度越大、超标率越高，评分愈大. 评分规则为：臭氧平均浓度在80 μg·m−3以下得0分，80—100 μg·m−3得1分，100—120 μg·m−3得2分，以此类推，浓度每增加20 μg·m−3增加1分；超标率为0时得0分，0—2%得1分，2%—4%得2分，以此类推，超标率每增加2%增加1分，各地市气温基础分为臭氧浓度和超标率得分的平均值（见表2）. 从表2可看出，银川市、石嘴山市、吴忠市、中卫市、固原市、宁东气温基础分最高值分别为8分、8分、5分、4分、3分、5分，南北差异较大，由于银川市和石嘴山市是宁夏臭氧污染最严重的区域，臭氧浓度高，易出现臭氧超标[13]，气温基础分较高；而固原市臭氧浓度为全区最低，且不易出现臭氧超标，气温基础分最低，评分结果符合宁夏臭氧污染实际状况.

    表 2  气温基础分（Ts）
    Table 2.  Basic temperature score （Ts）
    站点Station 气温/℃ Temperature
    T< 2020≤T<2525≤T<3030≤T<3333≤T<35T≥ 35
    银川平均浓度/（μg·m−3）70.899.7133.4159.4165.5184.0
    超标率（E）/%0.00.34.210.812.819.2
    气温基础分（Ts）013568
    石嘴山平均浓度/（μg·m−3）76.4104.9132.9157.1167.0181.1
    超标率（E）/%0.00.01.510.312.118.6
    气温基础分（Ts）012568
    吴忠平均浓度/（μg·m−3）67.591.9121.8141.3143.5150.4
    超标率（E）/%0.00.10.72.86.510.8
    气温基础分（Ts）012345
    中卫平均浓度/（μg·m−3）71.4101.8122.9138.2143.0144.5
    超标率（E）/%0.00.00.20.73.16.5
    气温基础分（Ts）012234
    固原平均浓度/（μg·m−3）69.6101.9118.8130.3144.7
    超标率（E）/%0.00.00.00.12.1
    气温基础分（Ts）01123
    宁东平均浓度/（μg·m−3）74.499.4121.1141.2144.4165.8
    超标率（E）/%0.00.10.42.26.28.1
    气温基础分（Ts）012345
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    以银川市为例，基于上述分析并结合相关研究成果[13-14]，气温与相对湿度联合评分结果（见表3），表明了在同样的气温条件下，不同湿度对臭氧形成贡献不一样，例如温度在33—35℃之间时，相对湿度在15%—55%之间，评分为8分，大于气温基础分6分，说明该等级下相对湿度在15%—55%之间对臭氧的生成有促进作用；温度在33—35℃之间时，相对湿度≥65%，评分为5分，小于气温基础分6分，说明该等级下湿度≥65%对臭氧浓度有削弱作用. 参考相关文献[16]，各气象因子单独评分为气温与其它气象因子联合评分减去气温基础分.

    表 3  气温与相对湿度联合评分
    Table 3.  Combined scores of temperature and relative humidity
    相对湿度（Rhs）/%Relative humidity气温/℃Temperature
    T＜2020≤T＜2525≤T＜3030≤T＜3333≤T＜35T≥35
    Rh<15013679
    15≤Rh<250137810
    25≤Rh<350137810
    35≤Rh<450137810
    45≤Rh<55013568
    55≤Rh<65013568
    65≤Rh<75013457
    Rh≥75013457
    气温基础分（Ts）013568
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    银川市相对湿度单独评分：将气温与相对湿度联合评分减去气温基础分得到相对湿度单独评分（见表4）. 从表4可看出，湿度对臭氧浓度的作用，正值表示对臭氧生成有促进作用，负值表示对臭氧的生成有减弱作用. 气温超过30℃时，相对湿度在15%—55%之间，最有利臭氧生成，相对湿度超过65%以上时，不利于臭氧的生成.

    表 4  单独评分（联合评分−气温基础分）
    Table 4.  Individual scores （joint score-basic temperature score）
    气象要素Meteorological element气温/℃ Temperature
    T＜2020≤T＜2525≤T＜3030≤T＜3333≤T＜35T≥35
    相对湿度/% Rh<15000111
    15≤Rh<25000222
    25≤Rh<35000222
    35≤Rh<45000222
    45≤Rh<55000000
    55≤Rh<65000000
    65≤Rh<75000−1−1−1
    Rh≥75000−1−1−1
    总云量/成 0—3000111
    4—7000000
    8—10000−1−1−1
    风速/（m·s−1）V<1000000
    1≤V<2000111
    2≤V<3000111
    3≤V<4000000
    4≤V<5000−1−1−1
    V≥5000−1−1−1
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    银川市云量单独评分：将气温与云量联合评分减去气温基础分得到云量单独评分（见表4）. 从表4可看出云量对臭氧浓度的作用，正值表示对臭氧生成有促进作用，负值表示对臭氧的生成有减弱作用. 气温超过30℃时，云量小于3成，最有利臭氧生成，云量超过8成，不利于臭氧的生成.

    银川市风速单独评分：将气温与风速联合评分减去气温基础分得到风速单独评分（见表4）. 从表4可看出风速对臭氧浓度的作用，正值表示对臭氧生成有促进作用，负值表示对臭氧的生成有减弱作用. 当气温超过30℃时，风速1—3 m·s−1最有利于臭氧生成，风速大于4 m·s−1不利于臭氧的生成.

    由于气象因子对各地市臭氧浓度的影响较一致，气温基础分差异较大，气温与其它气象因子联合评分也会有明显差异，但两者的差值一致，所以各地市除气温外的其它气象因子单独评分均采用表4评分结果.

    另外，由于宁夏属于高海拔、高辐射地区，五地市及宁东代表站海拔高度在1110.9—1753 m之间，海拔高度最低为银川市，海拔高度最高为固原市，地势南高北低，南北差异明显. 研究也表明，随着海拔高度增加，近地面紫外辐射强度也增加[20]，而太阳紫外线辐射强度与臭氧浓度呈正比[13-14]. 从表2也可看出，宁夏自北向南臭氧超标率明显降低，但臭氧浓度降低不明显，由于无紫外线辐射强度客观预报模式产品，为使臭氧污染气象条件指数预报模型算法实现业务化，且突出紫外线辐射对臭氧浓度影响，将海拔高度引入评分体系（Hbs）. 综合考虑宁夏各地下垫面特征、污染排放特征等，评分规则为：海拔高度在1500 m以下，评分为0分，超过1500 m评分为1分.

    2.5   臭氧污染气象条件预报模型及分级标准

    综合各气象因子并考虑太阳辐射对臭氧污染的影响，将海拔高度引入预报评价模型，给出的宁夏臭氧污染气象条件指数（OPMCI）预报模型为:

    OPMCI＝Ts＋Rhs＋Cls＋WSs＋Hbs (2)

    式（2）中，Ts为各地市气温基础评分，Rhs为相对湿度单独评分，Cls为总云量单独评分，WSs为风速单独评分，Hbs为海拔高度评分.

    根据宁夏臭氧污染气象条件指数OPMCI总评分，参照《全国臭氧气象预报业务规范》，将OPMCI从小到大分为1—6级，从不易臭氧污染到极易臭氧污染，建立了臭氧污染气象条件指数预报模型和等级预报标准. 从2017—2020年宁夏各地市臭氧污染状况看，污染级别为轻度及以下，出现4级中度臭氧污染的天数也较少，未出现5级及以上重度臭氧污染. 为建立与宁夏臭氧污染实际情况相适应且对臭氧污染预报有指导意义的气象条件等级预报标准，等级预报分级标准评分区间的划分预留了5级评分，排除了6级预报结果（见表5）.

    表 5  臭氧污染气象条件预报分级标准及等级描述
    Table 5.  Classification standards and descriptions of meteorological conditions for ozone pollution
    臭氧污染气象条件指数OPMCI总评分Classification standards and descriptions of meteorological等级Grade描述Description
    ≤2分1级很不利于臭氧生成
    3—5分2级不利于臭氧生成
    6—8分3级较利于臭氧生成
    9—10分4级有利于臭氧生成
    11—12分5级非常有利于臭氧生成
    >12分6级极有利于臭氧生成
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    2.6   预报效果检验评估

    基于臭氧污染气象条件评分标准、指数预报模型及等级预报分级标准，对2020年5—9月宁夏五地市及宁东基地进行逐时臭氧污染气象条件等级预报，统计了不同等级下的臭氧浓度和超标率. 并依据《环境空气质量指数（AQI）技术规定》（HJ 633—2012），对2020年5—9月宁夏五地市及宁东基地臭氧浓度进行了分级. 结果表明，银川市、石嘴山市臭氧污染气象条件等级预报为1—5级，吴忠市、中卫市、宁东基地为1—3级，固原市为1—2级，且气象条件等级越高，各地臭氧浓度和超标率也越大（见图5）. 臭氧污染气象条件等级预报与臭氧污染等级相一致的准确率银川市为77.4%、石嘴山市为87.9%、吴忠市为89.5%、中卫市为93.4%、固原市为99.9%、宁东基地为92.1% ，各地臭氧污染气象条件等级预报与臭氧浓度实际等级较为一致，其中，银川市等级预报准确率最低，固原市最高，也说明了银川市作为宁夏首府城市，随着城市人口增多，汽车保有量增大，本地及其周边污染企业臭氧前体物的排放和输送，加之有利于臭氧浓度升高的气象条件对臭氧污染的影响较大，而固原市为宁夏经济最不发达地区，人口和污染企业少、海拔高、辐射强，气象条件对臭氧污染的影响较大. 检验评估结果符合宁夏臭氧污染实际情况，指数预报模型算法及等级预报分级标准可为宁夏臭氧污染气象条件客观精细化预报业务提供技术支撑，对臭氧污染预报有指导意义.

    图 5  臭氧污染气象条件等级预报效果检验评估
    Figure 5.  Inspection and evaluation of the forecast effect of ozone pollution meteorological conditions
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    3.   结论（Conclusion）

    （1）宁夏各地市臭氧浓度与气温均呈明显正相关，相关系数为0.64—0.72，臭氧浓度和超标率随着气温升高而明显升高；与相对湿度呈较明显负相关，相关系数−0.36—−0.55，相对湿度≤55%的较干燥的环境臭氧浓度和超标率相对较高；与风速呈弱正相关，相关系数0.11—0.32，风速在2—3 m·s−1之间时，臭氧浓度和超标率较高；与风向的相关性不明显，不同风向下的臭氧浓度和超标率变化不明显；与总云量相关性也不明显，但总云量在3成及以下时，臭氧浓度和超标率较大.

    （2）选取气温、相对湿度、总云量、风速作为臭氧污染气象条件预报的评价因子，并将海拔高度引入预报评价模型，间接表征了太阳辐射对臭氧浓度的影响，建立了宁夏臭氧污染气象条件指数预报模型；考虑宁夏臭氧污染的实际状况，建立了宁夏臭氧污染气象条件预报分级标准.

    （3）预报效果检验评估结果表明，各地臭氧污染气象条件等级预报与臭氧浓度实际等级较为一致，且气象条件等级越高，各地臭氧浓度和超标率也越大. 指数预报模型算法及等级预报分级标准可为宁夏臭氧污染气象条件客观精细化预报业务提供技术支撑，对臭氧污染预报有指导意义.

  • 图 1  研究区地质环境及采样位置分布图

    Figure 1.  Map of geological environment and sampling sites in the study area

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    图 2  水体浮游细菌群落香农指数变化

    Figure 2.  Shannon index changes of phytoplankton bacterial community in water

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    图 3  不同样品中细菌门水平（a）与属水平（b）上细菌群落结构与分布

    Figure 3.  Structure and distribution of bacterial community at both phylum level （a） and genus level （b） in different samples

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    图 4  门水平（a）及属水平（b）细菌群落多样性与环境因子的PCA分析

    Figure 4.  PCA analysis of bacterial community diversity and environmental factors at phylum level （a） and genus level （b）

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    表 1  各水库水体主要理化参数

    Table 1.  Physicochemical parameters of the reservoir water

    pHEC/（μS·cm−1）Eh/mVDO/（mg·L−1）T/℃NH+4-N/（mg·L−1）TN/（mg·L−1）TP/（mg·L−1）DOC/（mg·L−1）SO2−4/（mg·L−1）
    QSZ-13.511271.00460.707.4420.400.981.804.882.481065.65
    QSZ-23.741106.00404.507.2421.200.861.515.861.13960.02
    QSZ-34.02909.00382.407.1922.300.851.541.611.061022.80
    QSZS4.78598.00328.807.1123.800.070.870.020.69543.27
    QSZM4.60580.00325.107.0323.400.131.020.021.00555.40
    QSZB4.75557.00261.506.7923.100.591.020.031.38364.87
    MJT-13.821638.00417.207.1421.400.852.110.031.271570.19
    MJT-26.731421.00-7.107.0421.301.062.900.081.391112.73
    MJT-36.561132.0028.606.7524.800.931.970.032.241042.56
    MJTS6.131177.00174.706.8423.000.571.020.020.87718.66
    MJTM5.701211.00243.306.3322.300.351.090.011.04812.42
    MJTB4.241301.00353.805.3621.800.955.140.040.94832.39
    TFe/（mg·L−1）Mn2+/（μg·L−1）K+/（mg·L−1）Na+/（mg·L−1）Mg2+/（mg·L−1）Cu2+/（μg·L−1）Zn2+/（μg·L−1）Pb2+/（μg·L−1）As3+/（μg·L−1）Cr2+/（μg·L−1）
    QSZ-14.883.612.9818.1862.1934.11166.0243.590.631.41
    QSZ-25.862.153.4034.2438.1621.26202.3234.270.581.58
    QSZ-31.611.703.1327.5031.0227.29286.3244.850.262.15
    QSZS0.071.122.4715.0417.2823.07415.9125.930.221.89
    QSZM0.081.163.0415.7816.656.0677.939.190.150.60
    QSZB1.261.133.1215.5215.7812.61110.8231.650.540.44
    MJT-15.106.564.619.5066.7243.39239.2080.705.351.84
    MJT-25.163.293.3456.4461.0218.69196.7383.180.591.94
    MJT-31.231.463.3359.0846.7122.08119.9744.810.201.03
    MJTS0.11.834.4069.2441.168.2488.5967.660.140.65
    MJTM0.071.894.6069.8043.807.0174.9012.670.070.83
    MJTB0.092.063.4575.9246.4422.16107.7657.230.4016.11
    pHEC/（μS·cm−1）Eh/mVDO/（mg·L−1）T/℃NH+4-N/（mg·L−1）TN/（mg·L−1）TP/（mg·L−1）DOC/（mg·L−1）SO2−4/（mg·L−1）
    QSZ-13.511271.00460.707.4420.400.981.804.882.481065.65
    QSZ-23.741106.00404.507.2421.200.861.515.861.13960.02
    QSZ-34.02909.00382.407.1922.300.851.541.611.061022.80
    QSZS4.78598.00328.807.1123.800.070.870.020.69543.27
    QSZM4.60580.00325.107.0323.400.131.020.021.00555.40
    QSZB4.75557.00261.506.7923.100.591.020.031.38364.87
    MJT-13.821638.00417.207.1421.400.852.110.031.271570.19
    MJT-26.731421.00-7.107.0421.301.062.900.081.391112.73
    MJT-36.561132.0028.606.7524.800.931.970.032.241042.56
    MJTS6.131177.00174.706.8423.000.571.020.020.87718.66
    MJTM5.701211.00243.306.3322.300.351.090.011.04812.42
    MJTB4.241301.00353.805.3621.800.955.140.040.94832.39
    TFe/（mg·L−1）Mn2+/（μg·L−1）K+/（mg·L−1）Na+/（mg·L−1）Mg2+/（mg·L−1）Cu2+/（μg·L−1）Zn2+/（μg·L−1）Pb2+/（μg·L−1）As3+/（μg·L−1）Cr2+/（μg·L−1）
    QSZ-14.883.612.9818.1862.1934.11166.0243.590.631.41
    QSZ-25.862.153.4034.2438.1621.26202.3234.270.581.58
    QSZ-31.611.703.1327.5031.0227.29286.3244.850.262.15
    QSZS0.071.122.4715.0417.2823.07415.9125.930.221.89
    QSZM0.081.163.0415.7816.656.0677.939.190.150.60
    QSZB1.261.133.1215.5215.7812.61110.8231.650.540.44
    MJT-15.106.564.619.5066.7243.39239.2080.705.351.84
    MJT-25.163.293.3456.4461.0218.69196.7383.180.591.94
    MJT-31.231.463.3359.0846.7122.08119.9744.810.201.03
    MJTS0.11.834.4069.2441.168.2488.5967.660.140.65
    MJTM0.071.894.6069.8043.807.0174.9012.670.070.83
    MJTB0.092.063.4575.9246.4422.16107.7657.230.4016.11
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    表 2  水样浮游细菌多样性统计

    Table 2.  Diversity statistics of planktonic bacteria in water samples

    样品编号Sample序列数ReadsOTUsOUT numbersShannon指数Shannon indexACE指数ACE indexChao1指数Chao1 indexCoverage 指数Coverage indexSimpson指数Simpson index
    QSZ-17555946465.257323.346842.280.970.04
    QSZ-28352145803.367783.596938.250.970.18
    QSZ-311076964394.4210697.989660.640.970.10
    QSZS9756912661.853038.802118.580.990.35
    QSZM8644215812.033479.422452.010.990.36
    QSZB6494747435.556974.326426.880.970.05
    MJT-18353850005.216871.026298.860.980.03
    MJT-26129364446.569651.258682.000.960.01
    MJT-38540723112.674234.923799.550.990.17
    MJTS9522122342.645055.193582.340.990.15
    MJTM9007233723.116062.155366.320.980.16
    MJTB8287831394.465826.374539.250.980.08
    样品编号Sample序列数ReadsOTUsOUT numbersShannon指数Shannon indexACE指数ACE indexChao1指数Chao1 indexCoverage 指数Coverage indexSimpson指数Simpson index
    QSZ-17555946465.257323.346842.280.970.04
    QSZ-28352145803.367783.596938.250.970.18
    QSZ-311076964394.4210697.989660.640.970.10
    QSZS9756912661.853038.802118.580.990.35
    QSZM8644215812.033479.422452.010.990.36
    QSZB6494747435.556974.326426.880.970.05
    MJT-18353850005.216871.026298.860.980.03
    MJT-26129364446.569651.258682.000.960.01
    MJT-38540723112.674234.923799.550.990.17
    MJTS9522122342.645055.193582.340.990.15
    MJTM9007233723.116062.155366.320.980.16
    MJTB8287831394.465826.374539.250.980.08
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-02-22
  • 录用日期:  2021-04-08
  • 刊出日期:  2022-06-27
刘闪, 曹星星, 吴攀, 杨诗笛, 张涛, 廖路. 酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
引用本文: 刘闪, 曹星星, 吴攀, 杨诗笛, 张涛, 廖路. 酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系[J]. 环境化学, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
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LIU Shan, CAO Xingxing, WU Pan, YANG Shidi, ZHANG Tao, LIAO Lu. Relationship between bacterial diversity and environmental factors in reservoirs and their inflow basins under the influence of acid mine drainage[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
Citation: LIU Shan, CAO Xingxing, WU Pan, YANG Shidi, ZHANG Tao, LIAO Lu. Relationship between bacterial diversity and environmental factors in reservoirs and their inflow basins under the influence of acid mine drainage[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(6): 2121-2132. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021022205
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酸性矿山排水影响下水库及其入库流域水体细菌多样性与环境因子的关系

    通讯作者: Tel：13885030478, E-mail: pwu@gzu.edu.cn; 
  • 1. 贵州大学资源与环境工程学院，贵阳，550025
  • 2. 贵州大学喀斯特地质资源与环境教育部重点实验室，贵阳，550025
  • 3. 沈阳农业大学农学院，沈阳，110161
  • 收稿日期:  2021-02-22
  • 录用日期:  2021-04-08
  • 网络出版日期:  2022-06-23
基金项目:
国家自然科学基金（U1612442），贵州省科技计划项目（黔科合平台人才[2016]5664，黔科合[2016]支撑2835）和贵州省人才基地项目（RCJD2018-21）资助.

摘要: 为了解酸性矿山废水排水处沿流域至水库底层水体细菌群落结构的沿程变化，探索其环境影响因素．采用高通量测序技术并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，对2019年9月采集受酸性矿山废水（acid mine drainage，AMD）影响的12个水样进行研究．结果表明，入库流域水样中细菌群落多样性变化趋势不明显，从表层至底层细菌多样性不断升高．在门水平上受AMD影响的细菌主要由变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes，0.21%—12.96%）、厚壁菌门（Firmicutes，0.15%—14.48%）和放线菌门（Actinobacteria，0.06%—4.64%）构成。其中，变形菌门中的α-变形菌纲（Alphaproteobacteria，2.42%—61.99%）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria，1.29%—63.53%）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，6.41%—63.09%）为优势菌类．从不同空间位置浮游细菌群落组成来看，不动杆菌属（Acinetobacter）在受AMD影响流域上游至水库底层水样中均占较大比例，为2.13%—57.84%，假单胞菌属（Pseudomonas，3.86%—12.29%）、铁细菌属（Ferrovum，0.97%—13.21%）和拟杆菌属（Bacteroides，0.01%—5.02%）是上游水样中的优势菌属，噬氢菌属（Hydrogenophaga，0—5.94%）、盖氏铁柄杆菌属（Gallionella，1.45%—11.91%）和新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium，0—5.34%）是中游占比较大的菌属，红细菌属（Rhodobacter，12.73%—57.52%）是下游水样和水库水样中的优势细菌．造成AMD影响下不同位点处水体浮游细菌群落组成差异的环境因子各不相同，入库流域水体细菌群落主要受NH+4-N、总磷（TP）和SO2−4影响，Mg2+和As3+也与入库流域水体中细菌多样性存在一定相关关系，水库水体中细菌群落主要受水温（T）影响．研究结果将有助于为酸性矿山废水微生物资源及生态环境的研究提供理论依据．

English Abstract

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  • 酸性矿山废水（AMD）是含硫的矿物在氧气和水共同作用下，经风化、淋溶和微生物共同作用而形成[1]．酸性矿山废水具有 低pH 值，高电导率，硫酸盐和重金属浓度高的特点[2]，这对大多数生物来说都是难以生存的极端环境[3-5]，然而这种极端环境胁迫下的独特生境却孕育着大量的微生物。大部分酸性矿山废水未经处理便直接排放到自然环境中，该环境下的微生物可以反过来影响外界水环境，微生物与水体的密切联系使得酸性废水水体生态修复成为可能．贵州省煤矿矿山规模偏小，分布面广，导致废水排放分散、持久，对山区水环境的污染相当严重[6]．因此研究酸性矿山废水影响下环境中微生物群落结构特征及其与环境因子的关系具有重要意义．

    微生物在水生生态系统中起着重要作用，其中浮游细菌扮演着多重角色（分解者、转化者、储存者和生产者）[7]，与自然界中的碳、氮、磷、硫和微量元素铁等循环关系密切[8]，在自然环境的自净过程中占有重要地位，是控制水生生态过程的关键因子，微生物食物网的关键组成部分[9]．目前，越来越多的研究开始关注水体中的浮游细菌及其与环境因子之间的关系．研究者在国内外对不同纬度、不同大小的湖、库水体细菌群落结构组成开展了大量的研究工作[10-15]，但主要集中在中性或碱性水库，对酸性水库细菌群落结构组成的研究鲜见报道. 目前在国际上，美国、西班牙、英国和法国等几个国家对AMD微生物多样性的研究得最广泛、最深入，其中最典型的两个研究样地为美国的IronMountain和西班牙的Tinto River. 然而，这些研究主要是基于湖库或者河流单一水生态系统的浮游细菌群落的调查，而对湖库及流域细菌群落结构和多样性的系统性调查研究还较为不足．浮游细菌与环境因子之间的关系较为复杂, 但在高通量测序技术的支撑下，能更加真实地揭示原位环境中微生物群落的复杂性和多样性[16]，该方法摆脱了传统分离培养方法不能完整反映生态系统全部信息的束缚，逐渐成为各类环境中微生物群落结构和多样性研究的常用手段．

    基于此，本研究选取贵州省兴仁市受矿区污染的青树子和马家屯水库及其入库流域作为研究区域，该区属亚热带温和湿润季风气候区，年均降水量约为1400 mm，年均气温为22.1 ℃．青树子水库（E：105°13'53.1''，N：25°23'12.7''，H：1371.8 m）及其入库流域，马家屯水库（E：105°08′35.3″，N：25°22′36.3″，H：1434 m）及其入库流域，它们的空间距离相对较近，地质背景条件相对一致（图1），特别是有含煤地层（P3l）的出露．该地区目前有一定规模的煤矿开采活动，矿山排出的酸性废水使得流域及水库水体产生不同程度的酸化．从上游到下游再从水库表层至底层进行系统采样，从水平空间再到垂向空间，调查不同污染梯度水体中细菌群落多样性的差异，使用MiSeq测序技术分析16S rDNA的丰度和多样性，并结合水质理化因子分析和主成分分析（PCA）对引起细菌群落结构和多样性变化的主要胁迫因子进行甄别，探讨了酸性废水影响下水库及入库流域水体中细菌群落结构特征及其影响因素，拓展了对酸性矿山废水污染环境中细菌群落多样性的了解．

    • 1.   材料与方法（Materials and Methods）

      1.1.   采样点设置及样品采集

    • 水样采集于2019年9月，自流域上游至水库库底，共设置12个采样点，采样点分布见图1。青树子水库（QSZ水库）各垂直采样点为青树子水库表层（QSZS）、青树子水库中层（QSZM）和青树子水库底层（QSZB），其入库流域青树子流域（QSZ流域）上中下游采样点分别为QSZ-1、QSZ-2和QSZ-3，马家屯水库（MJT水库）各垂直采样点为马家屯水库表层（MJTS）、马家屯水库中层（MJTM）和马家屯水库底层（MJTB），其入库流域马家屯流域（MJT流域）上中下游采样点分别为MJT-1、MJT-2和MJT-3．

      水库表层水样采自水面约5—15 cm处，中层水样采自水库深约7 m（青树子水库库深11.5 m，马家屯水库库深13.5 m）处，水库底部水样采至底泥上部。用有机玻璃容器采集 2 L 水样并混合均匀后，分装在预先灭菌的0.5 L 聚氯乙烯瓶中，分别用于理化指标和分子生物学分析测定．现场用滤膜（0.45 μm）过滤原水存储于50 mL离心管中，用于阴、阳离子和溶解性有机碳（DOC）测试，加入硝酸保存阳离子样品，加入磷酸保存DOC样品．再取1.5 L原水存储于已灭菌处理的聚乙烯瓶中，而后用0.22 μm（Milipore，美国）无菌微孔滤膜过滤水样，用以收集细菌，并将滤膜置于无菌离心管于干冰筒中低温（约–20 ℃）保存，运回实验室后进行后续处理．

      • 1.2.   样品理化性质的测定

    • 水体温度（T）、pH、溶解氧（DO）和氧化还原电位（ORP）等参数在现场用多参数水质测定仪（Multi3630，德国WTW）测定．存储于500 mL棕色聚氯乙烯瓶中的水样总氮（TN）、氨氮（NH+4-N）、总磷（TP）依据《水和废水监测分析方法》（第四版）[17]测定．存储于50 mL离心管中的水样K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Mn2+、总铁（TFe）采用原子吸收测定（AFS-8510，美国赛默飞世尔），采用电感耦合等离子质谱仪测定（ICP-MS，美国赛默飞世尔）As3+、Cu2+、Pb2+、Cr2+，SO2−4使用离子色谱仪（ICS-1100，美国）测定，采用TOC分析仪（Analytikjena，德国）测定水体中DOC．

      • 1.3.   样品微生物分析

    • 冷冻保存的滤膜用无菌剪刀剪碎后采用E.Z.N.A Water DNA Kit基因组DNA试剂盒（Omega，USA）提取总DNA．测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行，对微生物组总DNA提取，目标片段PCR扩增，扩增区域为标准细菌16S V3-V4，使用测试公司提供的通用引物341F（5'- CCTACGGGNGGCWGCAG–3'）及805R（5'- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'），产物回收纯化、荧光定量及Illumina MiSeq高通量测序．

      • 1.4.   数据处理与分析

    • 将Illumina MiSeq 测序得到的下机数据（Raw Data）进行处理得到Tags序列，并与数据库（Silva：http://www.arb-silva.de/）进行对比分析，检测并去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据（Effective Tags）．本文以 OTU 为单位，利用 Mothur（v1.30.1）软件进行群落多样性指标的统计分析；采用QIIME（v1.8.0）对生物信息学进行分析，根据序列的相似度，将序列归为多个OTU（operational taxonomic unit）；为了得到每个 OTU 对应的物种分类信息，采用RDP classifier 贝叶斯算法分类学分析在 97%相似水平的 OTU代表序列，并统计各个分类水平每个样品的群落组成；采用主成分分析 （Principal component analysis，PCA）方法，运用 CANOCO（Version 5.0）软件解析浮游细菌群落与水质之间的关系，采用蒙特卡洛置换检验（Monte Carlopermutation text）统计环境因子与细菌群落的相关性[18-19]．

    2.   结果与讨论（Results and discussion）

      2.1.   水体理化性质分析

    • 水样的基本理化性质见表1．不同空间位点水体理化特征呈现不同变化趋势．受AMD影响的水库及入库流域水体中，pH在上游至下游整体呈增加趋势，水库表层至底层整体为下降趋势．其中QSZ流域水体pH值为3.51—4.02，QSZ水库水体pH值为4.60—4.78，水质为酸性．MJT流域水体pH为3.82—6.56， MJT水库水体pH值为4.24—6.13，水质酸性较弱．水温T在上游至下游逐渐增高，水库表层至底层逐渐降低，QSZ流域水体温度从上游20.4℃增加到下游22.3 ℃，QSZ水库水体温度从表层23.8 ℃降低至底层23.1 ℃，而MJT流域水体温度从上游21.3 ℃升高到下游24.8 ℃，MJT水库水体温度从表层23 ℃降低到底层21.8 ℃．EC、Eh、DO上游至下游逐渐下降，水库表层至底层EC、Eh变化趋势不明显，DO逐渐下降．

      TN、TP、NH+4-N、DOC营养物质在流域中变化趋势不明显，从水库表层至底层浓度逐渐增加，且在水库水体中的浓度整体低于入库流域水体，可能是因为河流是一个动态的水体，其水的流动性较湖库要高，水体的营养盐分布更为均质．其中，在QSZ-1和MJT-2处各营养物质浓度值均较大，TN、TP、NH+4-N、DOC营养物质分别为QSZ-1（1.80、4.88、0.98、2.48 mg.L−1），MJT-2（2.90、0.08、1.06、1.39 mg.L−1），且QSZ-2位点处TP达到最大值为5.86 mg.L−1．可能是因为水体中有大量生活垃圾倾倒和生活污水排放，从而导致了局部污染的急剧增加．整个沿程变化水体中各金属离子（Mg2+、Mn2+、As3+、K+、Na+、Cr2+、Cu2+、Pb2+）浓度均较低，流域水体中最大值低于250 mg.L−1，其中Mg2+、Mn2+、As3+上游至下游浓度逐渐降低，水库水体中各金属离子浓度无明显变化趋势，且各金属离子含量均低于100 mg·L−1．SO42–离子浓度在流域水体中的浓度要高于水库水体中，在QSZ-1和MJT-1处达最大值，分别为1065.65 mg.L−1和1570.19 mg.L−1．

      • 2.2.   细菌群落多样性

    • QSZ区域和MJT区域各选择6个代表性样点进行细菌群落结构多样性分析．表2为各水样有效序列数目、操作分类单位（OTUs）数目、多样性指数（Shannon、ACE、Chao1、Simpson）以及覆盖度指数（Coverage）．QSZ水库及入库流域水样的高通量测序共得到518807条高质量序列，MJT水库及入库流域水样共获得498409条高质量序列．所有水样的覆盖度均在96%以上，说明测序深度可以较好的反映水体中浮游细菌的多样性和群落特征．以97%相似度划分，QSZ区域共得到23255个OTUs，每个水样平均OTUs数目为3876，MJT区域共得到22500个OTUs，单个水样平均OTUs数目为3750．可以看出两个区域的细菌群落多样性差异不明显．其中，QSZ区域OTU数目排在前两位的样品是QSZ-3和QSZB，最少的为QSZS，MJT区域中MJT-2是OTU数目最多的样品，最少的为MJTS．

      Shannon指数和Simpson指数反映细菌多样性，Shannon指数值越大，群落多样性越高，Simpson指数所表现的多样性与Shannon指数相反．ACE指数和Chao1指数可估计细菌丰富度，其值越大，细菌丰富度越高．QSZ-3、QSZB和MJT-2的Shannon指数、ACE指数、Chao1指数值均较大，表明青树子流域下游、青树子水库底部以及马家屯水库中游采样点处的细菌丰富度与多样性均处于较高水平，而QSZS和MJTS的Shannon指数、ACE指数、Chao1指数值均偏小，表明青树子水库表层与马家屯水库表层采样点处的细菌丰富度与多样性水平均较低．水库水样OTUs和Shannon指数呈现出QSZS<QSZM<QSZB、MJTS<MJTM<MJTB的规律（图2）。

      从水库表层到底层该段生态系统所承受的环境压力逐渐减小．而从流域上游到下游由于人类活动影响较为明显导致该段生态系统所承受的环境压力大小没有明显变化趋势。因此，从上游至水库底部，除在水库底部外，细菌群落多样性在流域水样中要高于水库水样，在流域中变化趋势不明显，但水库水样从表层至底层细菌多样性不断增加．表层光照时间充足，有利于浮游植物的生长，叶绿素含量高，使其对水体营养物质消耗，随着深度的增加，光照不足造成 BOD5 和叶绿素 a含量下降[20]，底层水体营养物质更加丰富，为底层微生物提供了适宜的生存条件，从而浮游细菌多样性的垂直分布底层大于表层，造成微生物群落的空间差异性．Humayoun等[21]通过克隆文库法, 同样发现湖泊中好氧层和厌氧层间细菌多样性呈现显著差异, 细菌多样性在表层水体中较低．这可能与有机质沉降和水—底界面物质交换有关[22]，这种作用的结果使得底层水体有机碳（POC）含量增高，从而使得底层细菌多样性高于表层．本研究中随着水深的增加，氮磷等营养物质含量和细菌多样性也在增大，且显示水库表层细菌香农指数最低，这与Humayoun等的研究结果相似．

      • 2.3.   细菌群落组成

    • QSZ区域所有水样浮游细菌共检测到37个门，MJT区域水样共检测到35个门，两个区域水体中相对丰度最高的4个门为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes，QSZ：1.47％—12.96％，MJT：0.21％—11.81％）（下同）、厚壁菌门（Firmicutes，0.15％—14.48％，0.28％—10.57％）和放线菌门（Actinobacteria，0.06％—4.64％，0.89％—3.63％）（图3a），Proteobacteria中相对丰度占比较高的是α-变形菌纲（Alphaproteobacteria，2.70％—61.99％，2.97—57.15％）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria，2.14％—63.53％，1.29％—42.67％）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，9.39％—63.09％，6.41％—45.32％）．其中，Alphaproteobacteria相对丰度在两个区域呈现相同的变化规律，从上游至下游依次升高，且水库中层相对丰度最高，QSZM 为61.99％，MJTM为 57.15％，底层最低，QSZB为41.60％，MJTB为40.97％．Betaproteobacteria相对丰度在QSZ流域上游<中游<下游，而在MJT流域为上游>中游>下游，水库水样底层相对丰度高于表层和中层，QSZB为12.02％，MJTB为16.68％．Gammaproteobacteria相对丰度在QSZ流域中游达最高值，为63.09％，在MJT流域下游达最高值，为44.44％，水库表层至底层相对丰度依次降低．Bacteroidetes、Firmicutes在QSZ-1达QSZ区域最高值，分别为12.96％和14.48％，在MJT-2达MJT区域最高值，分别为11.81％和10.57％，水库表层至底层，相对丰度依次增加. Actinobacteria相对丰度在上游至下游依次降低，水库表层至底层依次增加．

      研究结果发现，水体中的浮游细菌在门水平主要由Proteobacteria（Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria）、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria组成，这与大量研究地表水细菌群落结构的文献相似[23-26]．Proteobacteria通常是水环境中主要的细菌类群，包含了光营养性、化能自养型和化能异养型细菌，这类细菌在水环境中普遍存在[27-28]，也是本研究中的优势门．不同的变形菌亚类在不同空间位置呈现不同的变化趋势．Alphaproteobacteria相对丰度从上游至下游依次升高．Betaproteobacteria广泛分布于淡水湖泊中，是迄今为止被研究最多的细菌种群之一[29]，其在淡水湖中的大量存在与它们对生物可利用性元素含量变化的快速响应能力有关[30]．Gammaproteobacteria作为Proteobacteria占比较大的组分之一，对有机化合物的降解起着重要的作用[31]．Gammaproteobacteria在青树子流域中游和马家屯流域下游的相对丰度明显高于其他样品．有研究表明，Gammaproteobacteria通常存在于农业活动或者有机污染的地区[32]．可能这两个位点较高的无机营养盐含量使得其相对丰度达到了最大值．Bacteroidetes和Firmicutes相对丰度在水库水体中随着深度的增加而升高. Actinobacteria相对丰度呈现出上游>中游>下游，底层>中层>表层的变化趋势，该类菌大部分属于异养型细菌，能分解多种有机物[33]，本研究中氮磷含量在入库流域和水库底部水体中较高，可导致其水体中的Actinobacteria繁殖量增加[34]，这可能是该菌类相对丰度在流域上游和水库底部较高的原因．

      在属水平上，QSZ区域共检测出525个类群，相对丰度大于1％的有19个．MJT区域共检测出592个类群，相对丰度大于1％的有34个（图3b）．QSZ区域排名前五的是红细菌属（Rhodobacter，0.01％—57.52％）、不动杆菌属（Acinetobacter，3.89％—57.84％）、盖氏铁柄杆菌属（Gallionella，0—38.45％）、假单胞菌属（Pseudomonas，0.28％—14.31％）和铁细菌属（Ferrovum，0.68％—5.04％）．MJT区域排名前五的除Rhodobacter（0.22％—37.15％）、Acinetobacter，（2.13％—31.29％）、Gallionella（0—16.08％）和Ferrovum（0.01％—13.21％）外，还有甲基孢囊菌属（Methylocystis，0.02％—31.86％）．QSZ区域上游水体细菌相对丰度较高（大于5％）的类群是Acinetobacter（21.69％）、Pseudomonas（12.29％）和Bacteroides（5.02％），中游水体相对丰度较高的是Acinetobacter（57.84％）和Gallionella（11.91％），下游水体相对丰度较高的是Gallionella（38.45％），水库表层水体中丰度较高的是Rhodobacter（55.96％）、Acinetobacter（19.75％）和Ferrovum（5.04％），中层水体中丰度较高的是Rhodobacter（57.52％）、Acinetobacter（16.49％）和Pseudomonas（14.31％），底层水体中丰度较高的是Rhodobacter（19.77％）．而MJT区域上游水体细菌相对丰度较高（大于5％）的类群有Acinetobacter（17.09％）、Gallionella（16.08％）和Ferrovum（13.21%），中游水体中相对丰度较高的类群有噬氢菌属（Hydrogenophaga，5.94％）、新鞘脂菌属（Novosphingobium，5.34％），下游水体中相对丰度较高的类群有Rhodobacter（12.73％）、Acinetobacter（31.29％）、Methylocystis（31.86％）、军团菌（Legionella，7.62％），水库表层水体中相对丰度较高的类群有Rhodobacter（23.59％）、Acinetobacter（27.95％）、Methylocystis（21.33％）、Legionella（7.05％），中层水体中相对丰度较高的类群有Rhodobacter（37.15％）、Acinetobacter（22.65％）、Methylocystis（13.58％），底层水体中相对丰度较高的类群有Rhodobacter（28.57％）．因此，受AMD影响的水库水体及其入库流域水体中，Acinetobacter自流域上游到水库底层均占较大比例，上游水体优势菌属有Pseudomonas、Ferrovum、Bacteroides ，中游水体优势菌属有Hydrogenophaga、Gallionella、Novosphingobium，而Rhodobacter是下游及水库水体中的优势菌属．

      在属水平，优势类群主要有Rhodobacter、Acinetobacter、Gallionella、Pseudomonas、Ferrovum．Acinetobacter在受AMD影响的上游至水库底层水样中均占较大比例，Pseudomonas、Ferrovum和Bacteroides是上游水样中的优势菌属，Hydrogenophaga、Gallionella、Novo sphingobium是中游占比较大的菌属，Rhodobacter是水库下游、水库水样中的优势细菌．Rhodobacter能够通过光合作用进行生长代谢，CO2 和氮的固定，在水生生态系统的碳、氮循环中发挥重要作用[35-36]．水库属于封闭型区域，外源营养盐供给较少，水体营养盐成为浮游细菌生长的限制因子，细菌的自养过程逐步扮演相对重要的角色，因而光合细菌相对丰度较入库流域水体增高．Bacteroides类群中的微生物广泛分布于厌氧环境中，并具有降解一系列复杂有机高分子的能力，包括碳水化合物及蛋白质[37]．Wang 等[38]的研究表明城市段河流中Bacteroidetes 丰度较高的原因可能与居住区未经处理的排放废水中含有硝酸盐、氨、粪便等污染物有关．本研究中Bacteroidetes在青树子上游和马家屯中游处相对丰度达最大值，与该处附近有居民生活污水的排放有关，且水库底层丰度高于表层和中层，随着深度的增加，水库底部不断形成的拥有丰富有机物的厌氧环境使得Bacteroidetes适宜生存，相对丰度增加．Pseudomonas作为受AMD影响流域中游处的优势菌属之一，还是一种反硝化聚磷菌，在磷的转化和循环过程中也有重要作用．美国威斯康星大学 McLellan等[39]研究组通过比较分析污水细菌群落的宏基因组数据研究发现，Acinetobacter是污水细菌群落的核心类群，罗宁等[40]研究发现该菌属没有反硝化聚磷作用，但能在好氧条件下吸磷，而在青树子流域上游和中游水体总磷含量分别高达4.88 mg.L−1和5.86 mg.L−1，远高于地表水Ⅴ类水标准（0.4 mg.L−1），如此高的磷含量为Pseudomonas和Acinetobacter在该位点的代谢作用提供了较好的反应条件．

      • 2.4.   环境因子对细菌群落的影响

    • 将细菌群落的Shannon指数、Simpson 指数和Chao1指数与水环境因子进行PCA分析（图4a），并通过蒙特卡洛显著性检验（Monte Carlopermutation text）进行统计，用箭头表示细菌群落与环境指标，箭头连线的长度表示细菌群落相对丰度与该环境指标相关系数的大小．结果表明，上中下游水体采样点主要集中在排序轴右侧，浮游细菌物种多样性主要与NH4+-N（F=8.3，P=0.032）、T（F=7.0，P=0.02）显著相关，均在P<0.05水平，解释度分别为45.3%、41.2%．因此，NH+4-N是显著影响流域水体细菌群落的环境因子，而T对水库水体细菌群落显著影响．对属水平优势细菌与水环境因子进行PCA分析（图4b），由图可知，上、中、下游水体采样点主要集中在排序轴左侧，蒙特卡洛显著性检验表明，NH+4-N（F=6.4，P=0.002）、SO2−4（F=3.6，P=0.026）、TP（F=2.9，P=0.03）是显著影响上下游水体中浮游细菌群落的环境因子，解释度分别为39.2%、33.4%、26.4%，T（F=2.6，P=0.048）是显著影响水库水体细菌群落的环境因子，解释度为20.5%，其中NH+4-N在P<0.01水平上显著影响，SO2−4、TP、T在P<0.05水平上显著影响．综上可知，受AMD影响的入库流域水体中NH+4-N、TP和SO2−4是驱动细菌群落空间变异的主要因子，受AMD影响水库水体中水温T是主要的驱动因素．此外，Mg2+、As3+对入库流域水体细菌群落也存在一定影响，但未达统计学显著水平．

      越来越多的研究表明, 温度是影响湖泊细菌群落结构和组成的关键因子之一[41-42]，而本研究结果也表明水温Ｔ是受AMD影响水库水体中浮游细菌群落结构的重要调节因素．该结论与 Humayoun等研究结果相似，不同深度的湖泊微生物多样性，下层水样比上层水样高，这可能是由于库底缺氧、低温所造成的[43]．李玉华等[44]在研究松花湖水体垂向空间细菌的多样性时也发现，从表层至底层随着水温T的降低，细菌群落多样性随之升高．由于本研究中的AMD环境与其余类似生态系统相比，上游有大量生活污水和垃圾的倾排，环境相对温和，致使入库流域的水体中细菌主要受氮磷的影响程度较大，其水体中的有效磷足以维持光自养生物的生长．有研究表明无机营养物可能是微生物生长的限制因子，其中尤其以磷含量对水体中微生物数量的影响最为明显[45]，这种限制在AMD水体中可能会加剧，因为磷通常会与铁和铝羟化物在AMD环境中共沉淀[46]．由于在低pH条件下抑制硝化作用，以氨形式存在的氮在AMD水体中也较充足[47]．因此，高磷和高氮可能是主导该研究受AMD影响较为严重的入库流域水体中微生物群落变化的主要原因．PCA分析表明SO2−4浓度对流域水体中细菌群落结构造成了显著影响，在本文水体理化性质分析中可知在流域水体中SO2−4浓度高于水库水体，因此，SO2−4同样对AMD影响的河流浮游细菌起到了不可忽略的作用，Zhang等[48]在研究博斯腾湖细菌群落时空变化时发现，高浓度的SO2−4提供了良好的营养条件，从而促进细菌的生长．此外，Mg2+、AS3+也与入库流域水体中的细菌群落产生了影响，但影响程度小于SO2−4，AMD生态系统中的微生物能够将重金属吸收到细胞内或吸收到细胞外多糖上[49]，从而降低了重金属的溶解度，有利于其他原生微生物的生长．因此，浮游细菌群落特征不是由单一的某种环境因子决定的，而是由不同环境因子综合调控．

    3.   结论（Conclusions）

    • 研究结果不但帮助人们系统地认识了AMD环境中细菌多样性，还有利于了解细菌在AMD环境中的适应机制和生存状态，以期为酸性矿山废水区域的生态恢复提供理论基础．主要结论如下：

      （1）受AMD影响下，入库流域水体中的细菌群落多样性无明显变化趋势，水库水体中细菌群落多样性由表层至底层逐渐增多．

      （2）在门水平，受AMD影响水库及其入库流域水体中主要的细菌门类有Proteobacteria（Alphaproteobacteria纲、Betaproteobacteria纲和Gammaproteobacteria纲）、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria．Alphaproteobacteria相对丰度从上游至下游依次升高．Betaproteobacteria在水库底层水体中相对丰度达最大值，而Gammaproteobacteria相对丰度随着水库深度的增加而降低．Bacteroidetes、Firmicutes在水库水体中随着深度的增加相对丰度升高．Actinobacteria相对丰度上游至下游逐渐降低，水库水体中表层至底层逐渐增高．在属水平，受AMD影响水库及其入库流域水体中优势类群主要有Rhodobacter、Acinetobacter、Gallionella、Pseudomonas、Ferrovum．Acinetobacter在上游至水库底层水样中均占较大比例，Pseudomonas、Ferrovum、Bacteroides是上游水样中的优势菌属，Hydrogenophaga、Gallionella、Novosphingobium在中游占比较大，Rhodobacter是下游水样及水库水样中的优势细菌．

      （3）NH+4-N、TP和SO2−4是主导受AMD影响下入库流域水体中细菌群落结构变化的环境因子，水温T对受AMD影响水库水体中细菌群落造成了显著影响，此外，Mg2+、As3+对入库流域水体细菌群落也存在一定影响．

    参考文献 (49)

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