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厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidization, anammox)是一种自养脱氮过程，相比于传统的硝化反硝化工艺，可大幅度减少曝气成本和碳源投加成本，是一种理想的新型脱氮工艺。然而，厌氧氨氧化菌易受环境因素影响，在外界刺激下容易产生胞外聚合物使污泥聚团上浮，进而流出反应器导致反应器内生物量减少，影响该工艺的氮去除效率[1-2]。
由于厌氧氨氧化微生物的生长进行得相对缓慢，提高anammox颗粒的机械强度和沉降速度对于更好地保持反应器中的污泥浓度至关重要。有研究表明，颗粒内部的传质限制和微生物的包裹作用使颗粒污泥的核心具有了产生无机沉淀的有利条件，而增大无机物含量可明显提高颗粒的沉降速度[3]。另外，对于anammox颗粒污泥，由anammox反应导致的pH梯度可为颗粒内部无机沉淀的聚集创造更有利的条件[4]。厌氧氨氧化颗粒的机械强度会因磷灰石的积累而增加，故发生颗粒破碎的机率更低，被从反应器中冲出的生物质也更少[5]。若能将无机沉淀与anammox颗粒污泥有机结合，则可同时提高anammox颗粒污泥的机械强度和沉淀性能，进而提高反应器运行的稳定性。
磷肥是现代农业维持粮食产量的重要支撑。随着人口的增加，农业生产对磷肥的需求也急剧增加。然而，据预测来自磷酸盐岩的磷可能会在50~100 a内枯竭。因此，开发磷肥新来源，实现磷的可持续利用十分必要[6]。其中，废水被认为是实现磷可持续利用的重要资源之一。全球生产的磷中大约有10%被排入废水[6]。通过聚磷菌(polyphosphate accumulating organisms，PAO)将废水中的磷以多聚磷酸盐的形式聚集在活性污泥中，或在流化床反应器中沉淀为磷酸钙(Cax(PO4)y)和磷酸铵镁(MgNH4PO4)颗粒，一系列的磷回收工艺已被研究者开发出来[7-9]。其中，流化床结晶作为一种有效的磷回收技术，具有较高的反应速率且能够产生较高品质的磷产品，已被用于处理不同种类的废水[10]。
结晶流化床反应器与颗粒污泥膨胀床有相似的构造及流态，为anammox工艺与磷结晶在同一反应器内的进行提供了可能。本研究借鉴了用于磷回收的结晶反应器的概念，并将其与anammox工艺集成，利用厌氧氨氧化和羟磷灰石(hydroxyapatite，HAP)结晶的共反应机制开发了一种可同时实现脱氮和回收磷的高效工艺，并且探究了其在不同温度条件下运行的稳定性，以期为利用anammox工艺实现磷回收提供参考。
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本研究中的生物反应装置如图1所示。该装置包含3个膨胀颗粒污泥床反应器。反应器的有效容积均为5 L。在连续实验中，合成废水被蠕动泵连续泵入反应器底部，从三相分离器流出的出水被蠕动泵再次循环至进水口。3个反应器(R1、R2、R3)的反应区均被水浴层覆盖，由恒温水循环器分别控制在35、25和15 °C。水浴层的外部覆盖遮光保温层，用以保持温度恒定，并避免光能自养生物的增殖。每天通过插入反应区内部的针式温度计对反应器的温度进行记录，以确保反应区的温度保持在设定温度范围(±1°C)内。反应器内产生的氮气由反应器顶部的三相分离器收集，并通过湿式气量表进行记录。在反应器运行的过程中，根据反应器的实际运行状况，通过向循环管中添加H2SO4溶液的方式调节反应系统的pH。反应器的侧面开有一系列等距(10 cm)的取样口，用以采取水样或者污泥样品。
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表1为本研究中各反应器在不同阶段的运行参数。在开始本实验之前，R1运行温度为35 °C，氮负荷为5 g·(L·d)−1，R2与R3均使用R1的颗粒污泥作为种泥，且均在35 °C、氮负荷10 g·(L·d)−1条件下稳定运行。进水设置的总氮与总磷均参照厌氧消化液的总氮与总磷。进水中亚硝态氮与氨氮的质量之比RIS设为1.0~1.32。R1的进水总磷维持在11.40 mg·L−1，R2与R3的进水总磷均维持在22.80 mg·L−1。3个反应器的进水Ca2+质量浓度均设为81.60 mg·L−1。参考文献[11]的研究结果，在进水中添加了其他矿物质成分和微量元素。
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每2 d从反应器中收集进水和出水样品，通过0.45 μm孔径的膜过滤器过滤，并在分析前储存在4°C的冰箱中。
NH+4 -N、NO−2 -N和NO−3 -N的质量浓度采用Agilent 7100毛细管电泳(CE)系统进行分析[11]。通过Agilent 720电感耦合等离子体发射光谱 (ICP-OES)系统分析总磷和其他无机元素。根据APHA标准方法[12]，液体样品用硝酸消解以去除有机物可能引起的干扰。消解的液体样品用Milli-Q水稀释，并通过ICP-OES分别在317.933、213.618 nm波长下检测Ca、P的浓度。每日用台式pH计(TOA，HM-30V)对水样pH进行监测。 -
为测试不同温度条件下的厌氧氨氧化比活性(specific anammox activity, SAA)，分别选取了3个反应器中的颗粒污泥作为种污泥，使用有效容积为120 mL的血清瓶，添加培养液至100 mL后置于恒温水浴震荡培养槽以110 r·min−1的震荡速度进行培养。为避免基质浓度不足及其浓度过高带来的抑制作用，活性实验中采用的总氮浓度为220 mg·L−1，其中氨氮的质量浓度为100 mg·L−1 、亚硝态氮的质量浓度为120 mg·L−1。在培养过程中，通过注射器定期计量并排出在血清瓶顶空部分积累的氮气，用于SAA计算。详细的活性实验流程参考文献[13]。所有的活性实验均进行3次重复。本研究使用Gompertz方程(式(1))对实验数据进行分析，拟合得出SAA。
式中：N代表产生的氮气体积，mL；P0代表氮气产生的潜力；Rmax代表最大氮气产生速度，mL·h−1；t为培养时间，h；λ代表迟滞期时间，h。
对SAA和温度之间的关系，分别使用Arrhenius方程(式(2))和CTMI模型(Cardinal temperature model with inflection)(式(3))进行拟合。
式中：k是速率常数，A是指前因子；Ea是反应的活化能，kJ·mol−1；R是通用气体常数；T是热力学温度，K。
式中：不同温度下的SAA在拟合中被用作μmax， g·(g·d)−1；Tmin和Tmax分别为可能的anammox反应的最低和最高温度，℃；Topt是SAA等于其最佳值μopt时的温度，℃。
颗粒污泥的沉降速度通过一系列的沉降实验进行测试。每组沉降实验均将颗粒污泥按照粒径分为不同组别，每个组别随机选取测试10~15个污泥颗粒。在1 m的沉降管中测试污泥颗粒的沉降速度，并根据粒径分布计算得到颗粒平均沉降速度。
各阶段稳定期的挥发性悬浮固体(volatile suspended solids，VSS)和总悬浮固体(total suspended solids，TSS)浓度根据APHA方法[12]进行分析。从TSS浓度中减去VSS以计算污泥中灰分的含量。污泥中的主要矿物种类使用OLYMPUS BTX Bench X射线衍射系统进行分析。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)的固定和杂交程序参考文献[14-15]进行。从反应器中取出anammox-HAP颗粒，用多聚甲醛固定，并嵌入O.C.T.化合物(Sakura Finetek，Torrance，CA)中过夜，然后用低温切片机(OSK 97LF509，Ogawa Seiki Co.，LTD，日本)制备厚度为 30 μm 的冷冻切片。之后将切片与16S rRNA靶向寡核苷酸探针Amx820进行杂交(该探针与Candidatus Kuenenia stuttgartiensis和Candidatus Brocadia anammoxidans特异性结合)，然后通过Carl Zeiss LSM 710 ZEN共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，confocal laser scanning microscope)对切片进行观察。
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分别探究了anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床在35、25、15 °C温度条件下的氮去除效果，结果如图2所示。在每个运行温度条件下，均通过提高进水总氮和缩短HRT的方式，逐步提高进水氮负荷。在35 °C和25 °C条件下，实验初始总氮负荷均设定为5 g·(L·d)−1；在15 °C的条件下，初始总氮负荷设为2.5 g·(L·d)−1。
在不同的氮负荷条件下，anammox-HAP型反应器均能表现出良好的总氮去除效率。根据文献[16]报道的厌氧氨氧化反应式(见式(4))，约有占总氮11%的氮会在anammox反应中被转化为硝态氮，故理论上anammox反应的最高总氮去除率约为89%。在3个不同温度条件下，本系统可分别实现(44.90±0.32)、(17.12±0.97)、(8.79±0.14) g·(L·d)−1的氮去除速率；同时，反应器的平均总氮去除率均达到85%以上；而在最高负荷下，反应器的平均总氮去除率分别为(89.79±0.66)%、(85.61±4.85)%、(87.92±1.38)%。
随着anammox进行，反应器中的氢离子被消耗。因此，在anammox工艺中，随着进水浓度和氮负荷的提高，反应器中的pH会逐渐升高[17]。在本研究的各反应器中，均出现了出水pH随进水氮负荷升高而逐渐升高的现象。pH对于anammox反应和HAP结晶反应均为重要影响因素。过高或过低的pH会导致游离氨或游离亚硝酸的积累，进而影响anammox工艺的脱氮性能。另外，较低的pH也不利于HAP结晶反应的进行。有研究表明，在pH为7的条件下，仅有25%的磷可通过Ca-P沉淀去除，但在pH为9的条件下，大约有80%的磷可被去除[18]。在本研究中，通过在回流管中添加H2SO4的方式，将反应器的pH控制在8.0~9.0，以同时满足anammox细菌及HAP结晶形成对pH的要求。
在35°C条件下，随着进水磷负荷的升高，反应器的磷去除速率也逐渐提高。在整个过程中，磷的去除效率保持在(71.61±6.82)%。与R1相比，在R2与R3中，随着磷负荷逐渐升高，磷的去除速率维持在相对稳定的水平。这导致在反应器运行后期，磷去除率逐渐降至40%以下。HAP结晶的形成受到多种因素的影响，如溶液中晶核的数量、溶液过饱和指数、Ca/P、温度等[19]。在本研究中，将R1的进水Ca/P设定为R2与R3的2倍，且R1的运行温度高于R2及R3。这些因素均可能导致在R2和R3中HAP结晶形成的驱动力弱于R1，进而造成磷去除率较低。
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现有报道的anammox菌种分属6个属，这些菌种的最适温度均为25~40 °C的中温范围[20-21]。随着运行温度从最适温度区间降低，反应器中的细菌活性也逐渐下降。据报道，anammox细菌的表观活化能约为55~80 kJ·mol−1，亦即若将35°C时细菌的活性作为参照，当反应器中的温度降为15 °C时，anammox的活性水平将低于35°C时活性的25%[13]。
为评估厌氧氨氧化工艺在不同温度下的最大脱氮能力，以及SAA对温度的响应，分别取在不同运行温度下(35、25、15 °C)驯化后得到的anammox污泥，并在摇床中测试了污泥在5~50 °C条件下的SAA，结果如图3所示。进行SAA测试时，R1已经在35 °C下运行了数年。R2和R3从R1接种，并已分别在25 °C和15 °C下运行了约半年。通过CTMI方程拟合，可发现在不同温度下培养的anammox污泥最高活性所在温度均为35~40 °C。本研究中厌氧氨氧化污泥的优势菌种为“Candidatus Kuenenia stuttgartiensis”，其最适温度与其他富含“Candidatus Kuenenia stuttgartiensis”的报告基本一致[20]。在所有3个实验中，温度对低于35 °C的SAA影响可用Arrhenius方程进行拟合，其决定系数(R2)超过0.98。这表示可使用最佳温度下的SAA准确预测较低温度下的SAA，从而评估厌氧氨氧化工艺在不同温度下的脱氮能力，以避免在温度降低或接种来自在不同温度下运行的其他反应器厌氧氨氧化污泥时负荷过载。
计算得到R1中anammox污泥的Ea为56.38 kJ·mol−1，在较低温度下培养的R2和R3中anammox污泥，其Ea分别增加到82.58 kJ·mol−1和75.67 kJ·mol−1。以35 °C作为参考温度，来自R1、R2和R3的污泥在20 °C下的SAA分别为35 °C条件下的37%、28%和27%。当温度为10 °C时，该值下降到14%、7%和7%。
在本研究的整个运行阶段，R1、R2、R3的最高单位生物量氮负荷分别达到(0.70±0.01)、(0.43±0.02)、(0.16±0.00) g·(g·d)−1。同时，在反应器外进行的SAA比活性测试中，3个反应器中的污泥活性分别达到了(0.85±0.04)、(0.45±0.00)、(0.13±0.04) g·(g·d)−1 。在anammox工艺中，SAA常被用来评价工艺的脱氮能力。在SAA实验中，通常会选取对anammox细菌最适宜的基质浓度及其他环境条件，故实际工况下反应器的脱氮能力往往会低于SAA实验中得到的最大活性[22]。本研究结果表明，在不同温度条件下，反应器的实际脱氮能力与SAA实验中得到的数值高度一致，在35°C与25°C条件下仅略低于SAA，在15°C条件下甚至略高于在反应器外测得的SAA。这表明在anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器中，anammox能够充分利用基质，脱氮能力较好。
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脱氮和磷回收的同步过程依赖于anammox-HAP复合颗粒污泥的形成。在反应器的稳定运行阶段，对反应器中颗粒的结构进行分析，结果如图4所示。通过横切面的观察，可很清楚地看到颗粒内形成了双层结构。颗粒中心是较为坚硬的无机核心，外部包裹的是较为柔软的鲜红色生物膜。在不同运行温度下，反应器中的颗粒污泥均保持了良好的结构稳定性。通过对颗粒污泥切片的FISH染色观察，结合Amx820探针(红色)的荧光强度可发现，细菌主要分布在颗粒外层200~500 μm。而在颗粒核心中，几乎没有观察到Amx820强度，即不含anammox细菌。此外，即使在颗粒的外层也可观察到明显的荧光强度差异。荧光仅在最外层厚度约为100 μm的生物膜中展现出较高强度，且随着厚度加深而明显降低。这表明尽管厌氧氨氧化颗粒可比絮状污泥聚集更多细菌，但过大的粒径不适合传质并限制了厌氧氨氧化细菌在颗粒更深部分的生长，故在长期运行过程中，需采取有效策略来控制颗粒污泥的粒度。
由于磷含量高，anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器中形成的污泥与普通污泥有很大不同，其微观形态和晶体特征如图5所示。根据前期研究[16]，磷在接近纯培养的anammox菌中的含量仅占1.40%。然而，在anammox-HAP型反应器中，磷含量可高达污泥干重的10%~15%[23]。通过对污泥样品的XRD进行分析，可发现污泥中的主要结晶成分为羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)。在本研究中，不同温度条件下的反应器内均可稳定形成类似结构的颗粒污泥。在较低的温度下，厌氧消化颗粒污泥会因丝状古菌的消失而分解[24]。而本研究结果表明，无机磷酸盐矿物核的形成增强了颗粒的强度并改善了生物质在反应器中的存在条件，使颗粒即使在低温下也能保持稳定。同时，在管道或反应器壁上并未观察到明显沉淀。这也进一步表明厌氧氨氧化生物膜与HAP形成之间存在共反应机制，HAP内核的形成高度依赖于anammox生物膜的存在。
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颗粒的粒径、密度、几何形状、表面电荷和亲水性/疏水性与沉降性均呈现出一定的相关性[25-26]。另外，根据斯托克斯定律，球体落入流体中的终端速度会受到球形颗粒半径和流体粘度的影响，同时颗粒和流体的质量密度也起着重要作用。此外，较低的温度条件下，水的密度及粘性均较大，会降低颗粒的沉降速度。在本研究中，同一运行温度条件下，流体的质量密度和粘度保持恒定，故颗粒的质量密度对相同尺寸颗粒的沉降速度起关键作用。
以R1的颗粒污泥沉降性能为例，在连续实验过程中，随着流入反应器的N/P增加，污泥平均VSS从(49.8±6.8) g·L−1增加到(62.1±1.1) g·L−1，平均TSS从(230.0±14.6) g·L−1降至(106.1±33.3) g·L−1。同时，污泥中的平均灰分含量从78.35%降低到39.72%，污泥中的平均磷含量从24.50 g·L−1逐渐降至9.67 g·L−1。随着颗粒污泥中灰分含量及磷含量的降低，颗粒的沉降速度也逐渐降低，如图6所示。灰分及磷含量与颗粒污泥的平均沉降速度之间呈明显的线性关系(R2>0.98)。
随着磷含量的减少，尽管颗粒的平均沉降速度从(306±27) m·h−1降至(167±18) m·h−1，但仍明显高于其他报道中50~110 m·h−1的沉降速度[25-26]。anammox-HAP颗粒污泥优良的沉降性能明显提高了反应器的生物量截留能力，进而保证了反应器稳定高效的脱氮性能。
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常规厌氧颗粒污泥的造粒被认为大致分为2个阶段：由于细菌粘附而形成前体，以及由前体逐渐形成颗粒。从胚胎颗粒形成到颗粒成熟的过程中，细菌分泌的胞外聚合物可保护颗粒免受剪切应力，并逐渐形成由不同细菌主导的多层结构[27]。本研究中无机物含量非常高的复合颗粒污泥含有较高含量的HAP，与常规厌氧颗粒污泥有明显差异，导致在这种情况下颗粒的形成机制与厌氧颗粒污泥的形成有所不同。根据颗粒的切面结构和微观形貌特征梳理出结合了生物矿物形成过程和常规厌氧颗粒形成过程的机制，过程如图7所示。
随着anammox细菌的代谢活动的进行，细胞附近会形成较高的pH。在具有高浓度Ca2+和
PO3−4 的水相(废水)中，磷酸钙溶液的过饱状态很容易在细胞壁附近发生，从而诱导晶核的形成和矿物的生长[28]。对本研究中的颗粒进行微观观察时发现，在细胞表面观察到了粗糙的褶皱沉淀(图5(b))。类似的结构也在碳酸盐磷灰石和磷酸钙的生物矿形成的其他研究中被发现[29-30]。伴随着细胞增殖和矿物质的生成，并在反应器水力剪切等的综合作用下，反应器内形成了由anammox生物质和主要成分为HAP的无机组分构成的颗粒污泥。另外，由于氨氮和亚硝氮进入anammox外层的生物膜时被anammox细菌利用，浓度会逐渐降低[31]，而且anammox反应会导致整个颗粒污泥核心的pH高于外部[4]。颗粒内侧较高的pH和底物浓度较低的环境会促进颗粒核心部位沉淀的生成以及厌氧氨氧化细胞的衰亡。在本研究中的颗粒横截面SEM图像中可观察到明显的蜂窝状结构，表明在细胞表面产生了生物诱导矿物，这也进一步应证了在颗粒形成过程中核心部位细胞逐渐衰亡的推测(见图5(a))。随着对环境条件的长期适应，反应器内最终会形成具有致密HAP内核和附着在外层的anammox生物膜的成熟颗粒。
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1) Anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器可在35、25、15 ℃时实现高负荷条件下的高效率脱氮，脱氮效率未受温度影响。
2)在不同温度条件下培养的anammox-HAP颗粒的活性最适温度为35~40 ℃，脱氮能力与温度之间的关系遵循Arrhenius方程。
3) Anammox-HAP颗粒污泥呈现明显的anammox生物膜附着于HAP内核的内外结构，且HAP的形成依赖于anammox生物膜的存在。Anammox-HAP颗粒污泥的沉降性能明显高于一般的厌氧以及anammox颗粒污泥，且与颗粒中所含磷含量呈线性关系。
Anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器的氮磷同步去除能力及污泥特性
Nitrogen and phosphorus removal capability of HAP-anammox granular sludge expanded bed reactor and sludge characteristics
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摘要: 为实现集成、高效的氮磷处理，提高厌氧氨氧化工艺的运行稳定性及功能集成性，搭建了一种新型的anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器。设置了3个不同温度条件下的反应器，通过控制进入反应器中的钙、磷元素，以及调控反应器pH，探究了膨胀床反应器对氮、磷的同步去除能力，并对污泥特性进行了分析。结果表明：anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器在35、25、15℃条件下均可稳定运行，并能分别实现(44.90±0.32)、(17.12±0.97)、(8.79±0.14 ) g·(L·d)−1的氮去除速率，且总氮去除率稳定维持在85%以上；磷元素以HAP核的形式聚集在anammox颗粒内部，可在随剩余污泥排出的同时进行回收；anammox-HAP反应器中颗粒污泥的沉降性能明显高于一般厌氧或anammox工艺中的颗粒污泥，并与颗粒中的磷含量正相关。本研究阐释了anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床反应器的特点，可为废水中氮磷的处理提供参考。
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关键词:
- 厌氧氨氧化 /
- 羟基磷灰石 /
- 脱氮 /
- 除磷 /
- anammox-HAP颗粒污泥
Abstract: To achieve integrated and efficient nitrogen and phosphorus treatment with improved operational stability and functional integration of the anammox process, a new type of HAP-anammox granular sludge expanded bed reactor was developed. The experiment set up three reactors under different temperature conditions. By controlling the calcium and phosphorous elements in the input of the reactor and adjusting the pH, simultaneous removal of nitrogen and phosphorous in the expanded bed reactor was achieved. The results showed that HAP-anammox granular sludge expanded bed reactor can be operated with stabilized performance at 35℃, 25℃, and 15℃, with the nitrogen removal rates of (44.90±0.32), (17.12±0.97), and (8.79±0.14) g·(L·d)-1, respectively. The total nitrogen removal rate was constantly maintained above 85%. The phosphorus element accumulates in the anammox granules as the core of HAP, which can be recovered from the excess sludge. The sedimentation performance of the granular sludge in the HAP-anammox reactor was remarkably higher than that of the conventional anammox granular sludge, and it was positively correlated with the phosphorus content in the granules. This study also characterized the HAP-anammox granular sludge expanded bed reactor, which can provide new insights for nitrogen and phosphorus removal in wastewater treatment. -
近年来，水体突发性重金属污染事故频发，严重威胁受污染流域附近的生态平衡和居民健康[1]。微生物燃料电池(MFC)传感器为水体突发性重金属污染的预警提供了一个新的思路[2-4]。水样中重金属物质的生物毒性会抑制MFC传感器阳极上电活性微生物的新陈代谢过程，宏观表现为MFC传感器输出电信号减弱，并可通过计算电信号抑制率(inhibition ratio，IR)进行量化分析[5-7]。MFC传感器在一定程度上具有能量自持、信号直观和自我修复等功能[8-10]，故在水体重金属物质的监测预警方面具有较好的实用性。
MFC传感器在应用于监测预警时，仍然存在2个问题。1)水样中存在的可生化降解有机物(biodegradable organic matter, BOM)会使MFC传感器监测预警信号出现假阴性问题。为了提高MFC传感器对水样中BOM波动的抗干扰能力，JIANG等[11]采用氧还原混合菌生物阴极作为MFC传感器的敏感元件来监测水样中的甲醛，相较于传统的生物阳极敏感元件可有效解决乙酸造成的假阴性问题，但仅可用于好氧水体的监测；SPURR等[12]构建了一种新型的三级MFC传感器，可定性地区分BOM含量下降和毒性物质抑制作用所导致的MFC传感器输出电信号减弱的情况。2)重金属毒性会给电活性微生物造成不可逆损伤[13-15]，使MFC传感器信号重现性变差。有研究[16-18]利用无机化合物(二氧化硅、碳酸钙、多层聚合电解质等)对电活性微生物活细胞个体进行包裹，以此维持反应器的长期稳定运行，但这些物质也会对微生物电化学传感器的输出电信号造成干扰。
针对上述MFC传感器监测假阴性问题和信号重现性差问题，本研究采取预先使阳极上的电活性微生物在监测时间内恰好处于营养饱和状态的方案，并采用监测时间内的库仑量(coulombic yield，CY)的抑制率作为预警信号指标，利用单室MFC搭建了单程连续流模式实时原位监测装置，以Cr(Ⅵ)为目标污染物，评估传感器的预警性能，分析外加不同浓度乙酸钠与不同种类外源BOM对Cr(Ⅵ)冲击预警稳定性的影响，探索MFC传感器对3次相同浓度Cr(Ⅵ)冲击的信号重现性，为MFC传感器实时原位监测水体重金属污染提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验试剂
本研究所用培养液为KCl 0.30 g·L−1、NH4Cl 0.31 g·L−1、NaH2PO4 4.68 g·L−1、Na2HPO4 8.66 g·L−1，微量元素12.50 mL·L−1和维生素5 mL·L−1。维生素所含试剂纯度为美国药典级USP(生工生物工程(上海)有限公司)，其余试剂为分析纯(国药)。铬源：重铬酸钾(K2CR2O7) 1 g·L−1，优级纯(国药)。碳源：乙酸钠(CH3COONa) 384.62 mg·L−1，纯度≥ 99%(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)。外源BOM：谷氨酸、乳酸、蔗糖和葡萄糖，质量浓度均为50 mg·L−1，分析纯(国药)。
1.2 MFC的搭建及运行
MFC装置采用有机玻璃板组装成单室构型，有效体积为7.07 cm3，阴阳极均为碳布(W0s1009, Phychemi Co. Ltd., China)材料。阴极碳布材料涂刷Pt/C(20% Pt, Alfa Aesar Co. Ltd., UK)制成催化层。阴阳极面积均为7.07 cm2，由钛丝相连，外接电阻为1 000 Ω。使用实验室长期稳定运行的MFC阳极出水作为菌种来源，按1∶1(出水∶培养液)制成接种液进行启动培养，每24 h更换1次接种液。在连续3个周期收集的库仑量误差为5%以内时，说明启动成功。实验期间，MFC传感器放置在30 ℃的恒温箱中，培养液和模拟重金属废水在进入MFC传感器之前均保持氮气曝气，蠕动泵(BT100-2J, Longer Precision Pump Co. Ltd., China)的流速为0.34 mL·min−1。在实际应用时，需根据水样中BOM的含量来混合配水和调整流速，以保持MFC传感器恰好为营养饱和状态。MFC传感器的输出电信号由信号采集器每隔5 min记录1次。
1.3 实验方案
为讨论单室MFC传感器在单程连续流进样条件下监测Cr(Ⅵ)冲击的检出限、灵敏度、最佳监测时间等性能参数，根据已有的研究方法[19]，本研究设置了5个Cr(Ⅵ)的质量浓度梯度，分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg·L−1，每个质量浓度梯度均设置3个平行样进行实验。监测完成后，进水立即更换为不含Cr(Ⅵ)的培养液，对受冲击后MFC传感器进行性能恢复。实验中，将MFC传感器输出电压降至小于基线电压40 mV时作为响应时刻。从响应时刻开始，分别计算1至6 h 6个时段的库仑量抑制率并分析拟合直线的斜率和拟合度R2。
为探究MFC传感器对BOM波动的抗干扰能力以及抵抗不可逆损伤的能力，首先设定进水Cr(Ⅵ)质量浓度为1 mg·L−1，设置4个乙酸钠质量浓度梯度，分别为384.62、480.77、576.92和961.54 mg·L−1，当阳极电活性微生物已经达到营养饱和状态后，探讨额外增加BOM对预警稳定性的影响；然后再设定模拟废水中乙酸钠质量浓度为384.62 mg·L−1及Cr(Ⅵ)为1 mg·L−1，配制分别含有谷氨酸、乳酸、蔗糖和葡萄糖这4种外源BOM的模拟废水，质量浓度均为50 mg·L−1，研究不同种类BOM对传感器预警稳定性的影响；最后使用MFC传感器对连续3次含有1 mg·L−1 Cr(Ⅵ)的模拟废水进行冲击预警。以上每次监测均设置3个平行样重复实验。
1.4 分析方法
库仑量(CY)计算方法见式(1)；抑制率(IR)计算方法见式(2)。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) 式中：QCY为收集的库仑量，C；I为输出电流，mA；U为输出电压，mV；Rext为外电阻，Ω；t为检测时间，s。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) 式中：R为抑制率；QCY0为重金属污染冲击前的基线库仑量；QCY1为重金属污染冲击后监测时段内的库仑量。
2. 结果与讨论
2.1 MFC传感器对不同Cr(Ⅵ)质量浓度冲击的响应
图1为MFC传感器对含有不同质量浓度Cr(Ⅵ)进水的监测电压曲线，设定水样中乙酸钠的质量浓度为384.62 mg·L−1。随着Cr(Ⅵ)质量浓度由0.2 mg·L−1逐渐上升到1 mg·L−1，MFC传感器响应时间逐渐缩短，电压降逐渐增大。当进水中未投加Cr(Ⅵ)时，MFC传感器输出基线电压为(586.55±1.36) mV；当进水中Cr(Ⅵ)质量浓度增至0.2 mg·L−1时，在长达10 h的运行中，MFC传感器稳定输出电压为(582.28± 4.27) mV，与基线电压相比，信号下降微弱；当进水中Cr(Ⅵ)质量浓度进一步增至0.4 mg·L−1时，MFC传感器的输出电压开始出现明显的下降趋势，故判定本研究中MFC传感器对于Cr(Ⅵ)的检出限为0.4 mg·L−1。
图 1 不同Cr(VI)质量浓度冲击的监测电压曲线Figure 1. Monitor voltage output of MFC sensors with different Cr(VI) concentrationsMFC传感器运行稳定后，将开始投加Cr(Ⅵ)到输出电压下降了40 mV的时间定义为响应时间。图2(a)反映了Cr(Ⅵ)质量浓度为0.4、0.6、0.8和1 mg·L−1冲击的响应时间，分别为7.04、4.13、2.79和2.13 h。可以看出，随着Cr(Ⅵ)质量浓度越高，MFC传感器预警响应越快。图2(b)为MFC传感器在5个质量浓度的Cr(Ⅵ)冲击后的电压恢复曲线。可以看出，当Cr(Ⅵ)质量浓度的监测区间在0.2 ~ 1 mg·L−1时， MFC传感器的输出电压均可在1 h内快速恢复活性。这表明阳极微生物活性未受到不可逆损害。
图 2 MFC传感器监测不同质量浓度 Cr(VI)的响应情况Figure 2. Monitoring response of MFC sensors to Cr(VI) at different mass concentrations2.2 Cr(Ⅵ)质量浓度与库仑量抑制率的剂量效应关系
剂量效应曲线可以用来评价MFC传感器的监测灵敏度以及毒性物质质量浓度与电信号抑制率之间的相关性，进而用于毒性物质的定量分析[20]。本研究中的剂量效应曲线是由各Cr(Ⅵ)质量浓度梯度与其库仑量抑制率进行线性拟合得出的不同时间段(1、2、3、4、5和6 h)下的拟合直线。拟合直线的斜率和拟合度(R2)分别代表MFC传感器的灵敏度以及Cr(Ⅵ)质量浓度与库仑量抑制率之间的共变趋势。对比不同时段拟合直线的斜率和R2，筛选出最佳监测时间。在实际使用中，可根据最佳监测时间对应的剂量效应曲线对Cr(Ⅵ)进行定量分析。
从MFC传感器监测各Cr(Ⅵ)质量浓度梯度冲击的响应时刻开始，分别计算6个时段(1、2、3、4、5和6 h)各自的库仑量抑制率，并做拟合直线得到斜率和R2，结果见图3。
图 3 不同时间各Cr(VI)质量浓度下的库仑量抑制率拟合直线Figure 3. Coulombic yield inhibition ratio fitting lines at different Cr(VI) concentrations and different time如图4(a)所示，当监测时间从1 h延长至4 h时，MFC传感器剂量效应曲线的R2不断增大，时间为1、2、3和4 h对应的 R2分别为0.41、0.65、0.76和0.94。这说明在3 h以内，MFC传感器的库仑量抑制率与模拟废水中Cr(Ⅵ)质量浓度之间的共变趋势较差。当监测时间为5 h和6 h时，对应的剂量效应曲线R2均为0.95。这说明4 h过后，MFC传感器的库仑量抑制率与模拟废水中Cr(Ⅵ)质量浓度之间的共变趋势趋于稳定，并且已经具有较好的共变趋势。如图4(b)所示，MFC传感器剂量效应曲线的斜率随监测时间的延长不断增大。这说明灵敏度会随监测时间的增加而不断升高，但考虑到MFC传感器预警监测的时效性，确定4 h为最佳的监测时间。在监测时间为4 h时， Cr(Ⅵ)质量浓度梯度0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg·L−1对应的库仑量抑制率分别为1.17%、3.60%、22.06%、24.84%和34.71%。值得注意的是，在监测时间为4 h时，剂量效应曲线斜率较低，仅为0.44。这说明MFC传感器的灵敏度较低，可以从传感器构型方面进行改进，如改变腔室体积[21]、外加电流或电压[22-23]、修饰电极[24]和优化流态分布[25]等。
图 4 不同时间库仑量抑制率拟合直线分析Figure 4. Analysis of fitted straight lines of coulomb inhibition rate at different time2.3 不同质量浓度乙酸钠对Cr(Ⅵ)冲击预警稳定性的影响
以乙酸钠为研究对象，设定Cr(Ⅵ)的质量浓度为1 mg·L−1，设置模拟废水中乙酸钠的质量浓度为384.62、480.77、576.92和961.54 mg·L−1，相对应的标准品五日生化需氧量值为200、250、300和500 mg·L−1。由图5可以看出，随着模拟废水中乙酸钠质量浓度的上升，MFC传感器的响应时间相应越长。
图 5 不同乙酸钠质量浓度下的Cr(Ⅵ)监测电压采集曲线Figure 5. Cr(Ⅵ) monitoring voltage output of MFC sensors at different sodium acetate concentrations如图6(a)所示，当乙酸钠质量浓度为384.62、480.77和576.92 mg·L−1时，MFC传感器响应时间分别为2.13、2.71和5.42 h。当乙酸钠质量浓度为961.54 mg·L−1时，在10 h内，MFC传感器稳定输出电压为(562.86±10.79) mV，与基线电压(574.27±2.05) mV相比，降幅微弱，无法产生有效的预警信号。
图 6 不同乙酸钠质量浓度下MFC传感器对Cr(VI)监测的响应情况Figure 6. Monitoring response of MFC sensors to Cr(VI) at different sodium acetate concentration图6(b)反映了在4 h的监测时间内，不同乙酸钠质量浓度下MFC传感器对含1 mg·L−1 Cr(Ⅵ)模拟废水预警的库仑量抑制率。可以看出，在乙酸钠质量浓度为384.62、480.77和576.92 mg·L−1时，库仑量抑制率分别为34.71%±1.65%、36.60%±3.82%和36.28%±10.64%。当模拟废水中乙酸钠的质量浓度为384.62~ 576.92 mg·L−1时，含有1 mg·L−1的Cr(Ⅵ)水样毒性预警受乙酸钠质量浓度变化影响较小。乙酸钠质量浓度越高，库仑量抑制率误差越大，这种误差可以通过增加平行监测传感器的数量来解决。当乙酸钠质量浓度达到961.54 mg·L−1时，含有1 mg·L−1的Cr(Ⅵ)水样的库仑量抑制率明显下降，仅为1.92%±0.36%。这说明当水样中BOM质量浓度过高时， MFC传感器监测灵敏度会下降。其原因可能是水样中添加过量的乙酸钠可以帮助电活性微生物抵抗重金属毒性带来的损伤，从而增加阳极微生物的产电稳定性[26]。另外，还有研究[27]发现，过量的营养基质会提高阳极生物膜的胞外聚合物，进而提高阳极微生物的抗毒性，造成检测库仑量抑制率降低。不过，这个现象也为重度损伤的MFC传感器的性能恢复和高质量浓度重金属污染监测预警提供了新思路。
2.4 不同种类BOM对Cr(Ⅵ)冲击预警稳定性的影响
以不同的外源BOM为研究对象(谷氨酸、乳酸、蔗糖和葡萄糖，质量浓度均为50 mg·L−1)，设定模拟废水中Cr(Ⅵ)质量浓度为1 mg·L−1、乙酸钠质量浓度为384.62 mg·L−1，研究不同的外源BOM对MFC传感器预警Cr(Ⅵ)冲击稳定性的影响。
如图7所示，对含有谷氨酸、乳酸和蔗糖的模拟废水进行Cr(Ⅵ)冲击预警时，MFC传感器均有明显的电压降反应，可以产生有效的预警信号，但对含有葡萄糖的模拟废水无明显的电压降。
图 7 不同外源BOM的监测电压采集曲线Figure 7. Monitor voltage output of MFC sensors at different external BOMs如图8(a)所示：MFC传感器对于含有谷氨酸、乳酸和蔗糖的模拟废水的响应时间相差较小，分别为3.72、3.00和4.86 h；MFC传感器对含葡萄糖的模拟废水在10 h监测过程内都没有响应。图8(b)反映了MFC传感器对含谷氨酸、乳酸、蔗糖和葡萄糖模拟废水的4 h监测库仑量抑制率。由图8(b)可以看出，抑制率分别为35.22%±6.51%、37.05%±3.74%、24.23%±1.90%和2.99%±2.63%。对于含有葡萄糖的模拟废水来说，本研究中的MFC传感器没能成功预警Cr(Ⅵ)冲击。其原因可能是葡萄糖可以将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)[28]，但这并不影响MFC传感器预警水样中真实Cr(Ⅵ)冲击的功能。
图 8 不同外源BOM下MFC传感器对Cr(VI)监测的响应Figure 8. Monitoring response of MFC sensors to Cr(VI) at different external BOMs2.5 MFC传感器对连续Cr(Ⅵ)冲击的响应
用Cr(Ⅵ)质量浓度为1 mg·L−1的模拟废水对MFC传感器进行连续3次冲击，前2次冲击结束后，均用培养液进行2 h的清洗和恢复。如图9所示，前2次冲击过后，MFC传感器的输出电压均可以迅速恢复，但并不能恢复到第1次冲击前(548.60± 1.17) mV的水平，输出电压为(532.51± 3.21) mV。在实际监测中，重新确定基线即可解决这个问题。由图10(a)可以看出，第2次和第3次冲击MFC传感器的响应时间分别为3.39 h和3.50 h，相比于第一次冲击的2.54 h稍微增加。其原因可能是，第1次冲击后阳极电活性微生物受到了一定程度的损伤，2 h的恢复时间还不足以使其完全恢复[29]。JIANG等[30]采用了阴极共享型的MFC传感器阵列，4个阳极通道可以在保证连续工作的同时，受损的阳极也能得到足够的恢复，共用一个阴极也确保了监测结果的平行性。由图10(b)可以看出，3次冲击MFC传感器的库仑量抑制率波动不大，分别为35.37%±3.21%、39.48%±0.95%和41.50%±4.24%，均可有效预警。这说明本研究中MFC传感器在达到营养饱和状态后再接受重金属毒性冲击的预警方法，可以有效减少阳极电活性微生物受到的不可逆损伤，MFC传感器能在冲击后快速恢复且预警信号具有较好的重现性。
图 9 连续3次Cr(VI)冲击的监测电压采集曲线Figure 9. Monitor voltage output of three consecutive Cr(VI) shocks
图 10 连续3次Cr(VI)冲击下MFC传感器的响应情况Figure 10. Monitoring response of MFC sensors to three consecutive Cr(VI) shocks3. 结论
1)在单程连续流进样模式下，单室MFC对Cr(Ⅵ)冲击预警的检出限为0.4 mg·L−1，最佳监测时间为4 h；在质量浓度为0.2 ~ 1 mg·L−1时，库仑量抑制率和Cr(Ⅵ)质量浓度具有较好的共变趋势，剂量效应曲线R2为0.94，且MFC传感器在监测结束后均可在1 h内恢复，说明本研究装置可有效预警重金属冲击。
2) 模拟废水中乙酸钠的质量浓度为384.62、480.77和576.92 mg·L−1时，MFC传感器预警1 mg·L−1 Cr(Ⅵ)的库仑量抑制率分别为34.71%±1.65%、36.60%±3.82%和36.28%±10.64%；设定乙酸钠浓度为384.62 mg·L−1，模拟废水中分别含有50 mg·L−1的谷氨酸、乳酸和蔗糖时，传感器对1 mg·L−1 Cr(Ⅵ)的库仑量抑制率分别为35.22%±6.51%、37.05% ±3.74%和24.23%±1.90%。2组实验结果表明MFC传感器能够在一定程度上抵抗水样中BOM的干扰。
3) MFC传感器对连续3次1 mg·L−1Cr(Ⅵ)冲击的库仑量抑制率分别为35.37%±3.21%、39.48%±0.95%和41.50%±4.24%，表明MFC传感器的信号重现性较好。
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图 2 Anammox-HAP颗粒污泥型膨胀床在不同温度条件下的氮磷去除效果
Figure 2. Nitrogen and phosphorus removal performance of anammox-HAP granular sludge expanded bed at different temperatures
图 4 反应器中（35℃）污泥的形态及anammox-HAP颗粒污泥的结构
Figure 4. Morphology of sludge in the reactor (35℃) and the structure of anammox-HAP granular sludge
图 5 anammox-HAP颗粒污泥的微观形态和晶体特征
Figure 5. Microscopic morphology and crystal characteristics of anammox-HAP granular sludge
图 6 污泥沉降性能与污泥灰分含量及磷含量的线性拟合
Figure 6. The correlation between sludge settling performance and sludge ash content and phosphorus content
图 7 推测的anammox-HAP颗粒的形成过程
Figure 7. Proposed formation process of HAP-anammox granules
表 1 不同阶段各反应器的运行参数
Table 1. Staged experimental operating conditions in each reactor
反应器编号 温度/°C 氮负荷/(g·(L·d)−1) 进水总氮 /(mg·L−1) 进水总磷 /(mg·L−1) 进水Ca2+ /(mg·L−1) RIS HRT /h R1 35 5 313 11.40 81.60 1.32 1.50 35 10 625 11.40 81.60 1.00 1.50 35 15 625 11.40 81.60 1.20 1.00 35 20 625 11.40 81.60 1.20 0.75 35 30 625 11.40 81.60 1.20 0.50 35 40 830 11.40 81.60 1.20 0.50 35 50 1 040 11.40 81.60 1.20 0.50 R2 25 5 625 22.80 81.60 1.20 3.00 25 7.5 937.5 22.80 81.60 1.20 3.00 25 11 1 375 22.80 81.60 1.20 3.00 25 16 1 500 22.80 81.60 1.20 2.25 25 20 1 500 22.80 81.60 1.20 1.80 R3 15 2.5 625 22.80 81.60 1.20 6.00 15 3.5 875 22.80 81.60 1.20 6.00 15 5 1 250 22.80 81.60 1.20 6.00 15 7.5 1 375 22.80 81.60 1.20 4.40 15 10 1 375 22.80 81.60 1.20 3.30 
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