采用人工配制的模拟废水作为进水，模拟废水的NH₃-N、${\rm{NO}}_2^{-}$-N和无机碳源使用NH₄Cl、NaNO₂、NaHCO₃按需配置，其他组分包括27.2 mg·L⁻¹ KH₂PO₄、135.92 mg·L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、300 mg·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、570 mg·L⁻¹KCl以及1 mL·L⁻¹微量元素I和微量元素II。微量元素I包括5 g·L⁻¹ EDTA和5 g·L⁻¹ FeSO₄·7H2O；微量元素II包括15 g·L⁻¹ EDTA、0.014 g·L⁻¹ H₃BO₄、0.845 g·L⁻¹ MnCl₂·4H₂O、0.25 g·L⁻¹ CuSO₄·5H₂O、0.43 g·L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、0.19 g·L⁻¹ NiCl₂·6H₂O、0.16 g·L⁻¹ NaSeO₄·10H₂O、0.22 g·L⁻¹ NaMoO₄·2H₂O、0.24 g·L⁻¹ CoCl₂·6H₂O^[19]。接种污泥取自实验室培养的anammox种泥、反硝化污泥和硝化污泥，其悬浮固体质量浓度为(mixed liquor suspended solids, MLSS)分别为8 553、6 834和6 532 mg·L⁻¹，挥发性悬浮固体质量浓度(mixed liquid volatile suspended solids, MLVSS)分别为7 095、5 331和5 265 mg·L⁻¹。

本研究所用的实验装置如图1所示。实验所用的上流式厌氧污泥床反应器(up-flow anaerobic sludge bed，UASB)，反应器由圆柱形有机玻璃制成，内径为7 cm，高为30 cm，工作体积为1 L。反应器内混合液温度通过外置加热带控制，由底部进水，上部溢流出水，底部设置有回流管，部分出水可通过回流管进入反应器内，可通过调整回流液的流量调整反应器回流比(reflux ration, R)。

本研究设置3组实验：A组只接种 500 mg·L⁻¹的anammox污泥，作为空白组；B组接种500 mg·L⁻¹的anammox污泥和5 000 mg·L⁻¹的反硝化污泥；C组接种500 mg·L⁻¹的anammox污泥和5 000 mg·L⁻¹的硝化污泥(污泥质量浓度均以MLSS计)。在整个实验期间，控制3组反应器温度为(35±1) ℃，为了消除pH对反应器性能的影响，通过投加30 g·L⁻¹碳酸氢钠溶液调节系统pH至7.5~8.0。实验分为3个阶段：阶段I(1~54 d)，主要考察底物质量浓度对反应器脱氮效果的影响；阶段II(55~96 d)，主要考察在高负荷条件下，调整HRT和回流比对反应器脱氮效果的影响；阶段III(97~116 d)，通过降低进水负荷考察其对反应器脱氮性能恢复的影响。不同阶段的运行参数见表1。每天取进出水水样并检测水质变化。

MLSS、MLVSS、NH₃-N、${\rm{NO}}_2^{-}$-N和${\rm{NO}}_3^{-}$-N用国标法测定^[20]；COD使用快速测定仪(连华5B-3C，连华科技)测定；DO使用便携式溶解氧仪(HACH-HQ30，哈希水质分析仪器(上海)有限公司)测定和pH使用pH计(FE20K，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)测定；反应器中的游离氨(FA)和游离亚硝酸(FNA)的质量浓度分别按照式(1)和式(2)进行计算^[21]。

式中：${C_{{\rm{FA}}}}$为游离氨质量浓度，mg·L⁻¹；${C_{{\rm{FNA}}}}$为游离亚硝酸质量浓度，mg·L⁻¹；${C_{{\rm{N}}{{\rm{H}}_3} - {\rm{N}}}}$为氨氮质量浓度，mg·L⁻¹；${C_{{\rm{NO}}_2^ - - {\rm{N}}}}$为亚硝酸盐质量浓度，mg·L⁻¹；T为温度，℃。

取3组反应器中不同阶段混合液各 50 mL，8 000 r·min⁻¹下离心去除上清液，剩余固体用于微生物分析。依据 E.Z.N.A.®soil DNA kit 对样品进行 DNA 抽提，并使用凝胶电泳和NanoDrop2000检测提取DNA的质量和纯度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和806R(5’-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 对16S rRNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增。PCR扩增程序为：首先在95 ℃预变性3 min，然后在95 ℃变性30 s，在55 ℃退火30 s，在72 ℃延伸30 s，并执行27个循环，然后在72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存。每个样本3个重复。将同一样本的PCR扩增产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™ Fluorometer 对回收产物进行检测定量。最后通过Miseq PE300平台进行测序。

3个反应器的进出水氮素变化如图2所示。在第I阶段，在进水负荷相同的条件下，A组和B组的TN去除率随时间延长逐渐升高，在进水总氮质量浓度由200 mg·L⁻¹提高至600 mg·L⁻¹的过程中，2组的TN去除率整体呈现出逐渐升高的趋势。其中，B组的TN去除率最高，平均去除率可达70%左右；A组的TN平均去除率约为60%。这说明反硝化菌的存在有利于促进系统TN的去除。图3反映了3组反应器在脱氮过程中的总氮负荷率和总氮去除效率(NRR)的变化。在第I阶段(0~54 d)，在相同的NLR下，B组表现出最高的总氮去除效率，启动30 d后，B组的NRR达到了1.41 kg·(m³·d)⁻¹，相对于A组(0.97 kg·(m³·d)⁻¹)提高了31.2%。这同样说明反硝化菌的存在有利于TN的去除。XU等 ^[22]关于anammox污泥中anAOB和其他菌之间关系的研究结果也表明，反硝化菌Denitratisoma 的存在可提高anAOB活性。由此可推测，通过接种反硝化菌和anAOB可提高anAOB的活性。相对于A组和B组，C组的TN去除率最低(图2)，仅有40%左右，且在后期没有升高的趋势，C组的NRR仅有0.48 kg·(m³·d)⁻¹，低于空白组A组(50.5%)。这可能是由于硝化菌与anAOB存在底物竞争，不利于anAOB的富集增长，这与贾方旭等^[8]的研究结果相似。因此，C组运行40 d后停止运行，第II和III阶段主要对比A组和B组的脱氮效果。

在第II阶段(55~96 d)，升高进水NH₃-N和${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度至500 mg·L⁻¹，A组和B组的出水NH₃-N和${\rm{NO}}_2^{-}$-N波动较大。将HRT从8 h延长到9 h，同时升高回流比R为2，然而出水水质依然有波动，B组较A组波动较小；延长HRT为12 h后，出水水质有所好转，但90 d后依然有上升趋势。这充分证明，当进水总氮质量浓度升至1 000 mg·L⁻¹后，导致系统脱氮效果变差，也说明过高的进水负荷抑制anAOB活性。李媛^[23]也做了类似的研究，当进水总氮质量浓度由200 mg·L⁻¹升高到600 mg·L⁻¹、HRT由8 h缩短到6 h时，NRR迅速下降，NRR由1.2 kg·(m³·d)⁻¹下降到1.03 kg·(m³·d)⁻¹。

在第III阶段(97~116 d)，为了恢复系统的脱氮性能，提高系统的稳定性，分别降低进水NH₃-N和${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度至400 mg·L⁻¹，系统出水基本稳定，A组和B组的TN去除率稳定在80%以上，NRR维持在1.3 kg·(m³·d)⁻¹左右。这说明通过降低进水负荷能够缓解对anAOB的抑制，有助于系统脱氮性能的恢复。

图4反映了3组反应器脱氮过程中${\rm{NO}}_2^{-}$-N去除量(△${\rm{NO}}_2^{-}$-N)与NH₃-N去除量(△NH₃-N)的比值变化。A、B和C 3组反应器中${\rm{NO}}_2^{-}$-N去除量与NH₃-N去除量比例开始呈上升趋势，后续趋于稳定，基本保持在1.1左右。由厌氧氨氧化反应方程^[24-25]可知，在厌氧氨氧化稳定运行时，${\rm{NO}}_2^{-}$-N去除量与NH₃-N去除量的理论比值为1.32。本研究的NO₂⁻-N去除量与NH₃-N去除量的比值与理论值差异较小。其原因为：一是由于进水中含有一定量的溶解氧，会发生亚硝化和硝化作用，导致少量NH₃-N转化为${\rm{NO}}_2^{-}$-N或者${\rm{NO}}_3^{-}$-N；二是菌群在富集过程中可能会释放氧化剂^[26]。有研究表明，在低浓度厌氧氨氧化菌培养条件下，系统由于菌群浓度降低会产生氧化剂(超氧化物或羟基自由基)，导致中NH₃-N的消耗量增高^[27]。B组的${\rm{NO}}_2^{-}$-N去除量与NH₃-N去除量比例在20 d后基本保持稳定，而A组在30 d后才趋于稳定，C组持续表现出较大波动。这充分说明反硝化菌的存在有利于anammox的启动，使anammox在最短的时间内在反应器内起主导作用，而硝化菌与anAOB存在底物竞争，从而导致C组${\rm{NO}}_2^{-}$-N去除量与NH₃-N去除量比例持续处于较低水平，并且有较大波动，对于anammox的启动具有抑制作用。

游离氨(FA)和游离亚硝酸(FNA)的质量浓度对于anammox过程具有很大的影响^[20]。为了评估FNA和FA对anammox过程的影响，本研究计算了A组和B组anammox过程的FA和FNA，探究高负荷进水条件下anammox受抑制的机理。图5反映了A组和B组脱氮过程中FA和FNA的变化。A组和B组在整个anammox脱氮过程中FA的质量浓度低于30 mg·L⁻¹。已有研究^[22]表明，控制FA的质量浓度低于50 mg·L⁻¹对于anammox没有抑制作用。而在第II阶段，FNA的质量浓度已经达到0.05 mg·L⁻¹以上，甚至超过了0.1 mg·L⁻¹。anammox过程FNA质量浓度超过0.05 mg·L⁻¹对于anAOB具有明显的抑制作用^{[19, 28]}。这充分说明，当进水${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度达到500 mg·L⁻¹时，会导致FNA的质量浓度升高，当FNA的质量浓度超过0.05 mg·L⁻¹时，会抑制anAOB的活性。通过降低进水${\rm{NO}}_2^{-}$-N浓度，可使FNA低于0.05 mg·L⁻¹，进而使系统逐渐恢复。

为了进一部分解析A组和B组2种启动方式对anammox启动的差异以及氮素转化的规律，通过对启动30 d后A组和B组的进出水氮素指标核算系统的氮素转化，结果如图6所示。在进水NH₃-N为154.3 mg·L⁻¹，在${\rm{NO}}_2^{-}$-N为155.0 mg·L⁻¹的条件下，A组的总氮去除率达到52.2%，B组的总氮去除率达到76.2%，2组的总氮去除均是通过anammox实现的，B组比A组提高了24%。这充分说明，反硝化菌的存在有利于提高anAOB的活性。此结果与已有的研究结果一致^[20]。此外，A组有30.5 mg·L⁻¹的NH₃-N被氨氧化菌氧化成${\rm{NO}}_2^{-}$-N，同时有23.3 mg·L⁻¹的${\rm{NO}}_2^{-}$-N被亚硝酸盐氧化菌氧化成了${\rm{NO}}_3^{-}$-N。而B组中有仅有8.7 mg·L⁻¹的NH₃-N被氨氧化菌氧化成${\rm{NO}}_2^{-}$-N，0.2 mg·L⁻¹的${\rm{NO}}_2^{-}$-N被亚硝酸盐氧化菌氧化成了${\rm{NO}}_3^{-}$-N，硝化反应的占比远低于anammox。该结果说明，B组可为anAOB提供较好的启动环境，更大程度的避免硝化菌等其他杂菌的影响，使anAOB最短的时间在反应器内起主导作用，实现快速启动。

反应器anammox的启动过程是anAOB富集的过程。为了进一部分解析A组和B组接种方式对anAOB菌群丰度的影响，将A组和B组启动30 d后，取样进行高通量测序。细菌种群在属水平上的相对丰度如图7所示。2组反应器中主要的菌属为Candidatus Kuenenia, OLB13和Denitratisoma。其中Candidatus Kuenenia是anAOB，在A组中的丰度占比为19.8%，在B组中的丰度占比为28.1%，相对于A组提高了41%。这说明B组的接种方式有利于anAOB菌群丰度的提升，从而促进anAOB的活性。这也充分印证了在第2.1节中的推测。Denitratisoma是常见的反硝化菌属^[29]，在A组和B组中的丰度占比分别为7.3%和12.6%。ZHANG等^[30]的研究表明，Candidatus Kuenenia 的相对丰度与Denitratisoma 的相对丰度趋势具有一定的正相关性，说明 Candidatus Kuenenia与Denitratisoma 有很强的正相互作用，侧面验证了Denitratisoma的存在有利于体现Candidatus Kuenenia的活性。OLB13属于厌氧菌，是厌氧消化的核心微生物种群之一^[31-32]。已有研究^[12]表明，脱氮反应系统中OLB13和Denitratisoma的存在对于Candidatus Kuenenia 的活性表达具有积极作用。因此，通过反硝化菌和anAOB的同时接种可以为anAOB提供一种较好的增殖环境，从而有利于提高anAOB丰度，促进反应器anammox脱氮效率的提升。

1)向反应器中投加5 000 mg·L⁻¹反硝化污泥(以MLSS计)和500 mg·L⁻¹ anammox污泥(以MLSS计)进行接种，可以实现anammox的快速启动。启动30 d以后，总氮去除负荷可达1.41 kg·(m³·d)⁻¹以上。

2)进水${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度达到500 mg·L⁻¹时，会导致FNA质量浓度超过0.05 mg·L⁻¹，从而严重影响anAOB的活性，进而导致反应器出水水质波动；通过降低进水${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度可以使系统恢复。

3)本研究所用的脱氮系统中，主导anammox的anAOB为Candaditue Kuenenia，与单独接种anammox污泥相比，接种反硝化污泥和anammox污泥可使Candaditue Kuenenia的丰度提高40.0%，从而使反应器脱氮效率提高了31.2%。