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氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinolones，FQs)是指具有4-氧代喹啉-6-氟-3-羧基结构的一类药物总称。FQs具有抗菌谱广、杀菌能力强、耐药发生率低、体内分布广、组织浓度高、半衰期长、价格低廉等特点，被广泛应用于水产品、畜禽类及人类疾病预防和治疗过程中，是当前应用最广泛的抗生素类药物之一[1-2]。近年来，随着FQs使用量的不断增加，在地表水[3-4]、饮用水[5-6]、污水处理厂[7-11]以及河流沉积物[12-13]中检出FQs的报道越来越多。因FQs可诱导产生耐药性菌株，破坏微生态平衡，故其在环境中的残留及潜在风险受到国内外学者的普遍关注[14-15]。
随着养殖业的迅猛发展，为追求利益最大化，养殖业开始出现养殖密度过高、喂食量过度、有效隔离空间不足、流行病愈加频繁等问题。为预防及治疗流行病和促进畜禽、鱼及贝类的生长，养殖人员将FQs添入饲料中，以致养殖业出现抗生素应用不合理、消耗过量的现状[16]。使用后的FQs一般只有20%~30%被利用和吸收，其余FQs以母体化合物或代谢物形式排出体外[17]，造成养殖场周边及流域环境的FQs污染[18-19]。因此，养殖废水成为FQs进入环境的重要来源之一。目前，虽然国内外已有很多学者对环境[3-11]、饲料[20-21]、食品[22-23]、水产品[24-25]等领域中的FQs开展了相关研究，但这些研究所关注的FQs类的化合物相对较少，很难满足环境中FQs的检测需求。本研究针对养殖废水中可能存在的17种FQs，通过优化前处理和仪器分析条件，实现了对养殖废水中17种FQs的同时检测，为养殖废水中FQs的污染特征研究提供了一种快速、准确的测定方法。此外，还应用本研究所建立的方法对广州某水产养殖场养殖废水中17种FQs的残留量进行了检测。
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标准贮备液：17种FQs(氟罗沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、马波沙星、洛美沙星、奥比沙星、二氟沙星、沙拉沙星、加替沙星、莫西沙星、氟甲喹和那氟沙星)，1种替代物(诺氟沙星-d5)及3种进样内标(环丙沙星-d8、13C3-氟甲喹和恩诺沙星-d5)的贮备液均购自天津阿尔塔公司，溶剂为甲醇，质量浓度均为100 mg·L−1，在−20 ℃下避光保存，使用时用甲醇将混标稀释成不同浓度的标准工作液。
实验试剂和材料：甲醇(中国上海，霍尼韦尔贸易有限公司)，甲酸(中国北京，迪马科技有限公司)；盐酸(中国衡阳，凯信化工试剂有限公司)，氨水(中国天津，光复精细化工研究所)。Oasis HLB 固相萃取柱(6 mL，500 mg，美国，Waters公司)；CORTECS® C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 µm，美国，waters公司)；0.45 μm玻璃纤维膜、2 mL注射器、0.22 μm聚四氟乙烯滤膜(中国广州，国凌仪器有限公司)。
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Fotector plus(PFCs)高通量全自动固相萃取仪(中国厦门，睿科集团股份有限公司)；Agilent 1260 Infinity快速液相色谱(美国，安捷伦科技有限公司)- AB 4000 Qtrap三重四级杆串联质谱(美国，AB SCIEX公司)；MGS-2200氮吹浓缩仪(日本，EYELA公司)；SCQ-1000C超声波清洗仪(中国上海，声彦超声波仪器有限公司)。
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量取1 000 mL的水样，用0.45 μm 的聚四氟乙烯滤膜除去水中悬浮颗粒物，加入5%甲醇溶液(体积比)，用盐酸调节pH至2.0，并加入20 ng替代物(诺氟沙星-d5)，以8-12 mL·min−1的流速匀速通过活化后的HLB固相萃取柱。HLB柱依次用6 mL甲醇、6 mL水及6 mL 盐酸水溶液(pH=2)淋洗活化。样品富集完成后，用6 mL 5%甲醇溶液(体积比)淋洗小柱，干燥25 min，再用9 mL 0.1%甲酸甲醇以1 mL·min−1 的速度洗脱小柱，洗脱液收集于试管中。洗脱液经浓缩装置浓缩至尽干，加入10 ng进样内标(恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8和13C3-氟甲喹)，最后用0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵水溶液和甲醇混合溶液(体积比为1∶1)定容至1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜，待测。
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色谱柱：Waters CORTECS® C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 µm)，流动相为0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵水溶液(A相)和甲醇(B相)，流速为0.5 mL·min−1，柱温为40 ℃，进样体积为5 μL。正离子模式下梯度洗脱程序：0~1 min为20%B；1~11 min为20%-40%B；11~14 min为40%-95% B；14~17 min为95%B；17.0~17.1 min为95%-20%B，每个梯度完成后平衡2.9 min。
离子源为电喷雾电离源，气帘气压力为0.17 MPa，雾化气压力为0.41 MPa，辅助气压力为0.41 MPa，正离子模式下离子源电压为5 500 V，去溶剂温度为550 ℃，检测方式为多反应离子扫描模式。
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1)样品pH的优化。pH可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度，从而影响回收效果。为了考察不同pH对17种FQs的回收效果，本研究采集9份1 000 mL水样，将3份pH调至2.0，3份pH调至4.0，3份pH调至6.0，加标浓度均为20 ng·L−1。如图1所示，当样品的pH调节至2.0时，17种FQs的平均回收率为71.3%-87.2%，RSD为3.6%~11.5%；但当样品的pH调节至4.0和6.0时，依诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及莫西沙星回收率明显下降，均低于60%，RSD为1.3%~11.5%。这可能是因为氟喹诺酮类抗生素的酸度系数(pKa)普遍在4.0~7.0，当样品的pH小于其酸度系数(pKa)2个单位以上时，99%的目标化合物呈中性，有效增强目标化合物在吸附剂上的保留，从而提高回收率。因此，本研究最终选择将水样pH调节至2.0进行富集。
2)固相萃取柱的选择。目前国内外报道的常用于水样中抗生素测定的固相萃取小柱主要有C18柱和HLB柱。为了考察HLB柱和C18柱对17种FQs的萃取效率，本研究做了对比实验。如图2 所示，HLB柱对17种FQs的平均回收率为71.3%~87.2%，显著高于C18柱。这可能与各萃取柱萃取原理有关。有研究表明[26]，C18柱是按照疏水非极性作用机理进行萃取，较为适合lgKow≥2.5的非极性到中等极性的化合物的萃取。而FQs为亲水性化合物，其lgKow≤2.0，因此，不适宜用C18柱萃取。HLB柱的填料为亲水亲酯型聚合物，比较适合FQs的保留。因此，本研究最终选用HLB柱对环境水样中17种FQs进行富集。
3)上样速度的优化。上样速度是SPE条件优化的一个重要参数。一般来说，上样速度越慢，回收率越高，但样品的预处理时间相对较长；而上样速度过快，固相萃取小柱对目标化合物的吸附往往不充分，容易造成回收率偏低。为筛选出高效、快捷的前处理条件，本研究比较了不同上样速度对17种FQs萃取回收效果的影响。如图3所示，当上样速度为4、8和12 mL·min−1时，对17种FQs平均回收率基本没有影响，说明目标化合物很容易吸附在固相萃取小柱上。在节约时间的同时，考虑到当样品中FQs浓度较高时，上样速度过快可能导致目标物富集效果变差，故本研究最终选择的上样流速为8~12 mL·min−1。
4)洗脱溶剂的选择。为了考察不同洗脱溶剂对17种FQs的洗脱效果，本研究对比了0.1%甲酸甲醇和纯甲醇2种洗脱溶剂。如图4所示。其中用0.1%甲酸甲醇溶液洗脱的平均回收率为79.6%~100%，相对偏差为0.7%~7.4%；而用甲醇洗脱的平均回收率为72.6%~92.7%，相对偏差为3.2%~13.6%。虽然0.1%甲酸甲醇略优于甲醇，但2种洗脱溶剂对17种FQs的回收率均大于70%，因此，上述2种洗脱溶剂均可作为17种FQs的洗脱溶剂。
5)洗脱溶剂用量优化。为获取最佳的洗脱溶剂体积，在选定0.1%甲酸甲醇溶液作为洗脱溶剂后，将9份1 000 mL水样(加标质量浓度为20 ng·L−1)平均分成3组，分别对比了3、6和9 mL洗脱体积对17种FQs的回收效果。如图5所示，当洗脱量为3 mL时，那氟沙星和氟甲喹的平均回收率很低，均小于10%，其他目标化合物的平均回收率均在70%以上；当洗脱量为6 mL和9mL时，大部分目标已经被洗脱，且各目标化合物的平均回收率均在80%以上。考虑到养殖废水基质较为复杂，洗脱量较少可导致部分目标化合物未能完全洗脱，回收效果变差，故本研究选取9 mL作为最佳洗脱量。
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1)色谱柱的选择。FQs多为两性物质，具有一定的水溶性，不同的色谱柱对其分离影响较大。本研究考察了多种常用的C18反相色谱柱对17种FQs的分离效果，如Kinetex-C18®(100 mm×3.0 mm×2.6 μm)(A柱)、XTEERRA-C18® MS C18 (100 mm×2.1 mm×3.5 μm)(B柱)和CORTECS® C18(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)(C柱)。如图6所示(进样浓度为20 μg·L−1)，使用A柱分离17 种FQs时，出现峰形拖尾现象；使用B柱分离FQs时，莫西沙星和那氟沙星等目标物的色谱峰展宽严重；而使用C柱分离17 种FQs时，不仅分离效果好，峰形对称，而且响应强度也相对较高。因此，本研究选择C柱对17种FQs进行分离。
2)流动相组分优化。确定色谱柱后，为更好的分离各种目标物并获取满意的峰型，本研究对流动相组分进行了优化。首先，比较了不同有机相(甲醇和乙腈)对目标化合物的分离效果。结果表明，使用甲醇时，基线相对较低，并且对目标化合物具有更好的分离效果，因此，确定甲醇为有机相。因在流动相中加入适当的有机酸或缓冲盐可增强目标物的离子化效率，增强分析方法的灵敏度，所以在确定有机相为甲醇后，又比较了不同有机酸、缓冲盐对灵敏度的影响，包括5 mmol·L−1乙酸铵、0.1%甲酸水及0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵等。如图7所示，0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵和甲醇作为流动相时，峰型最好，灵敏度最高，信号强度最强。
3)洗脱梯度优化。经反复优化洗脱梯度程序后，最终选择1.4.1节所述的洗脱梯度。在选定的洗脱梯度下，所有组分均在20 min以内出峰，且分离效果最为佳，具体色谱图见图8(进样浓度为100 μg·L−1)。
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配制质量浓度为1.0 mg·L−1的FQs、内标化合物和替代物的混合标准溶液，在正离子模式下，用直接注射进样方式扫描并优化母离子/子离子特征离子对，及相应的锥孔电压、碰撞电压等其他参数，利用获取的全部特征离子及离子间的丰度比进行定性分析，以丰度最高的特征离子响应与浓度的关系进行定量分析，质谱优化参数结果如表1所示。
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1)方法的线性关系、检出限和定量限。将17种FQs的200 μg·L−1 标准溶液按梯度稀释，梯度浓度分别为0.5、1、2、5、10、 20、50、100 μg·L−1。用已优化好的色谱条件和质谱条件进行测定，内标法定量。以17种FQs的质量浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，17种FQs在0.5-100 μg·L−1内线性关系良好，R2>0.99。根据环境监测分析方法标准制修订技术导则[27]，对大约检出限为3-5倍浓度的样品进行7次平行测定，计算测定结果的标准偏差(SD)。其方法检出限(LOD)为3.143倍的SD，定量限(LOQ) 为4倍的 LOD。根据计算结果，LOD为0.08-0.3 ng·L−1，LOQ为0.32-1.2 ng·L−1。
2)加标实验结果。用超纯水进行空白基质加标回收实验，加标质量浓度分别设置为10 ng·L−1和90 ng·L−1，每个浓度水平做6个重复样品，同时设置6个空白样品。按第1.4节中的步骤对样品进行处理，以考察方法的总体回收率、重现性是否达到检测分析要求。如表2所示，当添加量为10 ng·L−1时，17种FQs的平均回收率为58.6%~104.2%，RSD为2.9%~19.3%；当添加量为90 ng·L−1时，平均回收率为65.3%~91.0 %，RSD为2.1%~18.6%。此外，本研究还以养殖废水为基质，设置了6个基质加标实验，加标质量浓度为20 ng·L−1。结果如表3所示，17种FQs的平均回收率为47.8%~118.7%，RSD为3.0%~18.6%。本方法的空白和基质加标回收结果与美国 EPA1694 [28]相当，但与其他几种FQs相比，莫西沙星、达氟沙星和依诺沙星的RSD值相对偏高。这可能是由于现有的富集和净化手段未能有效去除水样的背景干扰，在运用正离子扫描模式时，这些背景会增强或减弱目标化合物的电离结果，进而影响仪器测定结果的准确性，造成方法重现性较差，RSD偏高。
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为验证本研究建立的检测分析方法，按照《污水监测技术规范》(HJ91.1-2019)[29]中的样品采集规定，采集了广州某水产养殖场的养殖废水并进行了测定。样品采集后，立即用盐酸调节pH至2.0±0.5，4 ℃以下避光运送至实验室。测定结果表明：采集的养殖废水共检测出9种FQs，其中莫西沙星为2.34 ng·L−1，氟甲喹为0.96 ng·L−1，马波沙星为0.24 ng·L−1，氧氟沙星为9.36 ng·L−1，恩诺沙星为1.13 ng·L−1，达氟沙星为5.96 ng·L−1，培氟沙星为2.20 ng·L−1，环丙沙星为0.53 ng·L−1，依诺沙星为3.48 ng·L−1。
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1)通过优化固相萃取条件、色谱分离条件、质谱检测参数，建立了一种快速、准确测定养殖废水中17种FQs的固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱法。该方法通过特征碎片离子和色谱保留时间定性，通过特征准分子离子定量，方法检出限为0.08~0.3 ng·L−1；空白加标平均回收率为58.6%~104.2%，RSD为2.1%~19.3%(n=6)；基质加标平均回收率为47.8%~118.7%，RSD小于20%(n=6)，满足养殖废水中17种FQs残留分析的要求。
2)所采集的广州某养殖场的养殖废水样品中，含有多种不同含量的氟喹诺酮类抗生素，其中氧氟沙星检出浓度最高(9.36 ng·L−1)，达氟沙星次之(5.96 ng·L−1)。
固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱测定养殖废水中17种氟喹诺酮类抗生素
Determination of 17 fluoroquinolones antibiotics in aquaculture wastewater using LC-MS/MS coupled with solid phase extraction
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摘要: 采用固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱(SPE-LC-MS/MS)技术，建立了养殖废水中17种氟喹诺酮类抗生素(FQs)的测定方法。水样在采用固相萃取法富集前，先用 0.45 μm 的聚四氟乙烯滤膜过滤，而后加入5%甲醇(体积比)，用盐酸溶液将水样pH调节至2.0±0.5，经固相萃取柱富集，最后用9 mL 0.1%甲酸甲醇洗脱。以C18柱为分离柱，0.1%甲酸−5 mmol·L−1 甲酸铵水溶液和甲醇为流动相，采用液相色谱－三重四极杆串联质谱多反应监测离子模式(MRM)对目标化合物进行了检测和分析。在优化实验条件下，17种FQs的线性范围为0.50 -100 μg·L−1时，目标化合物峰面积与内标物质峰面积之比与质量浓度的线性关系良好(R2>0.99)，方法检出限为0.08-0.3 ng·L−1。在加标量为0.01 μg·L−1和0.09 μg·L−1时，空白加标的平均回收率为58.6%-104.2% 和65.3%-91.0%，相对标准偏差(RSD)在2.1%-19.3%(n=6)。以养殖废水为基质，17种FQs的加标回收率在47.8%-118.7%，RSD小于20%(n=6)。应用该方法测定了广州某水产养殖场的养殖废水。结果表明，氧氟沙星检出浓度最高(9.36 ng·L−1)，达氟沙星次之(5.96 ng·L−1)。该方法快速、准确，可适用于养殖废水中17种FQs的测定。Abstract: A method was developed for the determination of 17 target fluoroquinolones antibiotics (FQs) in aquaculture wastewater by liquid chromatography/tandem triple quadruple bar mass spectrometry (LC-MS/MS), coupled with solid phase extraction (SPE). Before solid phase extraction, samples were filtered by 0.45 μm polytetrafluoroethylene filter membrane, and then 5% methanol (V:V) was added in filtrate and the pH was adjusted to 2.0 with HCl solution. The analytes were efficiently extracted by SPE column and eluted by 9 mL 0.1% formic acid methanol. The separation was performed on a reverse-phase Cl8 column using a mobile phase consisting of 0.1% formic acid-5mmol·L−1 ammonium formate aqueous solution and methanol. All analytes were quantified by LC-MS /MS under multi-reaction monitoring (MRM) mode. Under the optimal conditions, the calibration curves of all 17 targets were linear in the range of 0.5-100μg·L−1 with the correlation coefficients more than 0. 99. The limits of detection (MDL) were 0.08~0.3 ng·L−1.The average recovery rates were in the ranges of 58.6%~104.2% and 58.0%~107.8% and relative standard deviations (RSDs) ranged from 2.1% to 19.3% (n=6) with two spiked levels of 0.01 and 0.09 μg·L−1, respectively. The average recoveries of 17 FQs in the aquaculture wastewater samples were 47.8%~118.7% with RSDs<20% (n=6). A sample of aquaculture wastewater collected from an aquaculture farm in Guangzhou was detected with this method. The results showed that the ofloxacin had the highest detection concentration (9.36 ng·L−1.) in the sample, followed by danofloxacin (5.96 ng·L−1). This method was simple, rapid and accurate, and could be used to detect 17 FQs residues in aquaculture wastewater．
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随着社会经济的发展，柴油的使用量增加，但是柴油在生产、运输、装卸、加工及使用过程中的泄露会对土壤环境造成一定的污染，直接或间接地危害人类的生命与健康[1-2]。因此，解决柴油污染土壤问题已成为世界各国所共同面临的问题[3]。
目前，针对柴油污染土壤修复的方法主要包括机械、物理、化学和生物修复方法等[4]。其中，机械、物理、化学修复方法具有费用高、容易产生二次污染等不足[5-7]。而生物修复技术是一种高效、环境友好、低成本的技术，能够将柴油等污染物通过微生物代谢转化成无毒的终产物[8-9]，因而被广泛应用于修复柴油污染土壤之中[10]。刘沙沙等[11]已成功利用醋酸钙不动杆菌降解柴油以及污染物，经过62 d的生物修复实验，柴油去除率为69.8%。然而，柴油组成的复杂性决定了其降解需要有不同菌株的参与[12]，TAO等[13]研究了土著细菌联合体与外源芽孢杆菌(Bacillus subtilis)共同培养降解原油的实验，细菌群落分析结果表明，在确定的共培养条件下，细菌多样性降低，降解效率提高，同时证明芽孢杆菌对长链烷烃有很好的降解效果。
大量的研究证明，微生物在修复有机物污染土壤的过程中具有良好的应用前景，但目前对于构建微生物菌群的研究较少，本研究从柴油污染土壤中筛选、分离出能够降解柴油污染物的微生物，采用组合实验构建优势菌群，探究了其柴油生物降解特性，研究分析了该菌群中各菌种之间的互作机制，为构建降解柴油的菌群提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器与原料
紫外分光光度计(UV-2102C，中国上海)，GC-MS(Agilent6890/5975I，安捷伦)，台式高速冷冻离心机(H-2050R，中国长沙)，恒温振荡培养箱(HZQ-X160，中国太仓)。实验所用试剂均为分析纯。
柴油污染土壤取自上海金山卫金山大道城河路；柴油为市售0#柴油(密度：0.84 kg·L−1)；菌种：实验所用菌种均为从柴油污染土壤样品中筛选分离得到。
1.2 实验方法
1)微生物菌种生物量的测定方法。将菌落接种于灭菌的种子培养基中，每2 h取样，采用分光光度计在波长600 nm下测定吸光度值，绘制柴油降解细菌的生长曲线。
2)微生物菌种对柴油降解能力的测定方法。残余柴油浓度采用分光光度法[14]进行测定。菌株对柴油的降解能力采用柴油降解率表示。降解率计算公式如式(1)所示。
R=C0−CtC0×100% (1) 式中：R为柴油降解率；C0为柴油的初始浓度，mg·mL−1；Ct为柴油的降解过程测定浓度，mg·mL−1。
3)微生物高效降解柴油的条件优化实验。以构建好的柴油污染物降解菌群为研究对象，考察了初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、初始柴油浓度(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL·L−1)、初始接种量(体积比5.0%、10.0%、15.0%)对柴油降解率和细菌生物量的影响结果。在30 ℃，150 r·min−1条件下培养5 d，定时取样并测定其中的柴油降解率以及生物量的变化，每组实验重复3次，取其平均值。
4)微生物多样性测试。将培养24 h的菌群混合液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，柴油浓度为7.0 mL·L−1，pH=7.0，在30 ℃，150 r·min−1条件下培养，14 d后，将混合菌进行收集，离心弃上清液，收集菌体，测试微生物多样性，该工作由上海美吉医药科技有限公司完成。
5)微生物降解柴油产物的检测。将筛选获得的高效单菌种分别接种到种子培养基中，培养24 h后，离心收集菌体，稀释使其OD600=1.50，并按照最佳的体积比混合后接种于无机盐培养基中，以不加细菌为对照组，柴油浓度为7.0 mL·L−1，在30 ℃、150 r·min−1的恒温振荡培养箱中培养14 d。然后将培养基取出加入1∶1(体积比)硫酸5.0 mL酸化水样，继续加入0.2 g·L−1的氯化钠破乳[15]，然后加入石油醚20.0 mL(60~90 ℃)超声10 min。将上述溶液8 000 r·min−1离心10 min，将上清液转移至另一干净的三角瓶中，下层溶液倒入原三角瓶并用石油醚重新提取1次。合并2次提取液，过膜，利用GC-MS测定培养基内降解产物组成及含量。
6)微生物降解十五烷产物的检测。将本研究所构建的混合菌群接种于添加了十五烷(7.0 mL·L−1)的无机盐培养基中，在30 ℃、150 r·min−1的振荡箱里培养14 d，分别取降解3、6、14 d的培养液，按照上述方法处理并检测。
2. 结果与讨论
2.1 柴油降解菌的富集驯化结果
从柴油污染土壤中筛选获得4株具有较强柴油降解能力的菌株，其菌落形态和柴油降解能力结果见表1。
表 1 菌株的菌落形状及柴油降解能力Table 1. Colony shape and diesel degradability of strains菌株号 菌落形态 菌体形态 菌落颜色 降解率/% 1# 菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱褶 杆状 白色 27.0 2# 菌落透明、光滑、有光泽 球形 白色 29.0 3# 菌落微黄、表面光滑、边缘整齐 杆状 微黄色 32.0 4# 菌落淡红色、湿润、不规则 杆状 淡红色 35.0 | Show Table
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2.2 高效降解菌的初步鉴定
微生物初步鉴定结果如表2所示。通过16S rRNA测序结果可知，1#、2#、3#、4#菌株分别与Bacillus sp. VOC18、Enterococcus faecalis、Lysinibacillus、Rhodococcus equi有97%、98%、99%、99%的相似性。本研究分别对1#、2#、3#、4#菌株命名为Bacillus sp. VOC18-L1，Enterococcus faecalis-L2，Lysinibacillus-L3，Rhodococcus equi-L4(简称L1，L2，L3和L4)。
表 2 4种柴油降解菌株的生理生化实验结果Table 2. Physiological and biochemical characteristics of four diesel degrading bacteria实验类型 菌株号 1# 2# 3# 4# 淀粉水解实验 − − − − 明胶实验 + − + + 尿素实验 − + − − 甲基红实验 + − + + V-P实验 + − + − 吲哚实验 − − − − 柠檬酸盐实验 − − − − 硫化氢实验 − − − + 触酶实验 − + − + 葡萄糖发酵实验 + − + + 乳糖发酵实验 − − − − 木糖发酵实验 − − − − 麦芽糖发酵实验 + − + + 蔗糖发酵实验 + − − − 注：“+”表示显阳性，“−”表示显阴性。 | Show TableDownLoad:
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2.3 菌株的生长曲线分析结果
每种菌的生长曲线如图1所示。由图1可知，4种细菌在24 h均进入指数生长阶段，在该阶段，微生物生长速度快，活性较强，因此，后续实验均采用培养24 h的菌液为接种液。
图 1 柴油降解菌L1、L2、L3和L4的生长曲线Figure 1. Growth curves of diesel oil degrading bacteria L1, L2, L3 and L42.4 菌群构建的结果分析
菌群构建的结果如表3所示。由表3可知，编号11的菌群组合在5 d内对柴油的降解率最高，可达到39.6%，这可能是由于不同菌种之间的协同作用，使得混合培养的菌群对于柴油污染物的降解效果要优于单菌，因此，选用该混合菌群作为最佳降解菌群进行后续的研究。
表 3 菌种组合对柴油降解效率的实验结果Table 3. Experimental results of degradation efficiency of diesel oil by species strain combination编号 组合 降解率/% 1 L1+L2 20.9 2 L1+L3 26.2 3 L1+L4 26.1 4 L2+L3 25.8 5 L2+L4 30.9 6 L3+L4 29.3 7 L1+L2+L3 23.5 8 L1+L2+L4 31.5 9 L1+L3+L4 25.0 10 L2+L3+L4 21.1 11 L1+L2+L3+L4 39.6 12 空白 10.9 | Show TableDownLoad:
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2.5 柴油降解菌群的混合配比及降解柴油的条件优化
1)采用正交实验法确定柴油降解菌群的最佳菌种混合比例。菌群中各菌种的相对含量对柴油等有机物的降解效率有显著的影响。因此，本研究通过正交实验研究了不同混合比例的菌种对柴油降解效率的影响关系，结果如表4所示。由表4可知，降解效果最好的菌种比例为L1∶L2∶L3∶L4=3∶1∶3∶4，在5 d时，降解柴油效率为52.5%，本研究将此比例的微生物组合命名为OCDL-3134。由于该菌群中的每种细菌都具有特定的作用，因此，柴油降解效率明显得到提高[16-17]。然而，将培养了14 d的微生物进行多样性分析结果如图2所示，由图2可以看出，OCDL-3134经过14 d的培养后，菌种之间的比例变为2∶6∶5∶1，这说明在降解过程中，4种菌根据环境的变化发挥着协同作用，并自行调整他们之间的相对丰度，以实现充分利用柴油污染物的目的。此时L2和L3菌种变为优势菌种，说明在培养后期，L2和L3菌种发挥了重要作用，这与其自身的功能是相一致的。同时也表明确定各种微生物的初始接种比例的菌群构建方案具有一定的合理性。有研究[18]表明，一旦长链烷烃耗尽，就会缺乏碳源和能量用于其生长，而由长链烷烃降解形成的短链烃类化合物则被其他菌种继续代谢利用而进一步降解。
表 4 4种柴油降解菌的接种比例和对应的柴油降解效率表Table 4. Inoculation ratio of four diesel oil degrading bacteria and their diesel oil biodegradation efficiency接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 3∶3∶1∶2 16.5 2∶4∶3∶2 14.8 1∶1∶1∶1 39.3 4∶1∶4∶2 18.5 2∶1∶2∶3 15.3 2∶2∶1∶4 15.7 4∶4∶1∶3 21.4 4∶3∶2∶4 19.1 3∶4∶2∶1 15.6 1∶2∶2∶2 25.5 2∶3∶4∶1 13.7 3∶1∶3∶4 52.5 1∶4∶4∶4 22.3 3∶2∶4∶3 13.2 1∶3∶3∶3 13.1 4∶2∶3∶1 11.7 | Show TableDownLoad:
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图 2 OCDL-3134降解柴油14 d后的菌群结构示意图Figure 2. Analysis of microbial community structure of OCDL-3134 for diesel oil degradation after 14 d2)初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。环境pH可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变营养物质的可给性和有害物质的毒性。本研究探讨了初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。由图3(a)可知，当环境pH过高或过低时，会对微生物产生抑制，这可能是由于此条件严重影响了细菌利用柴油的能量和物质代谢进程，从而影响菌体生长，因此会显著降低柴油的生物降解效率。当pH为7.0时，OCDL-3134对柴油降解的效率达到最佳，此时生物量也达到最高，如图3(b)所示。因此，OCDL-3134对柴油的降解效率和生物量的最佳初始pH均为7.0。
图 3 初始pH对OCDL-3134的柴油降解效率和细菌生物量影响Figure 3. Effect of initial pH on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass3)柴油浓度对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。柴油浓度是微生物代谢过程的一个重要因素，对微生物降解性能有一定影响[19]。柴油浓度较低时，碳源不足，细菌生长缓慢，对柴油降解效果不佳。随着柴油浓度的增加，碳源可以满足微生物生长，微生物的降解效果也随之增大。但随着柴油浓度继续增加，柴油降解菌的活性受到抑制，同时培养基表面形成一层油膜，使得溶液内的溶解氧浓度降低，抑制微生物的生长繁殖，从而影响对柴油的降解。如图4(a)所示，随着柴油浓度的增大，微生物的柴油降解率呈先上升后下降的趋势，在柴油浓度为7.0 mL·L−1时，降解效果最好，达到50.0%以上。同时，图4(b)为初始柴油浓度对生物量的影响结果，随着柴油初始浓度的增加，生物量呈先增后降的趋势，结果表明OCDL-3134在初始柴油浓度为7.0 mL·L−1时生物量最佳。
图 4 初始柴油浓度对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响Figure 4. Effect of initial diesel oil concentration on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass4)接种量对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。如图5所示，接种量在体积比为10.0%时，微生物对柴油的降解率较高。此后，再增加接种量反而导致新增细胞减少，进而使菌株整体活性下降，降解柴油的后劲不足。15.0%的接种量虽然生物量最多，但由于微生物大量繁殖，造成菌株集中，短时间内消耗了培养基中大量营养成分，不利于新菌株的持续生长，从而影响了菌株对柴油的降解率，因此，根据实验结果最佳接种量为10.0%。
图 5 接种量对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响Figure 5. Effect of inoculation on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134and bacteria biomass2.6 菌群OCDL-3134降解柴油及十五烷过程中的产物分析
1)菌群OCDL-3134降解柴油过程中的产物分析。各单菌种和OCDL-3134对柴油降解的产物结果如图6所示。图6(a)是原始柴油的组分，由此可知，原始柴油的组分非常复杂，主要包括C13~C24的烷烃。图6(b)是L1培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，L1对短链烷烃降解效果好，推测可能是由于该菌在生长代谢过程中产生了相应的表面活性剂[13]，促进了微生物与柴油的接触，从而对短链烷烃具有较好的降解效果；图6(c)是L2培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，整体烃类的含量降低。该菌株具有利用该有机物代谢产酸的能力[20]，可以将柴油降解的一些产物分解成小分子的酸，因此，在柴油降解过程中发挥着重要作用；图6(d)是L3培养14 d后的产物。与图6(a)对比可发现，短链以及长链烷烃的含量菌有所减少。该菌能够在好氧条件下代谢简单的碳水化合物，因此，在小分子烃类物质的降解过程具有重要作用，同时在柴油降解的后期可能会具有重要贡献，这一点与图3的结果是一致的；图6(e)是L4培养14 d后产物，与图6(a)对比可发现，整体的烃类含量降低，而环苜蓿烯的含量也有明显的下降。有研究[20]表明，该菌株的主要特性是能够有效降解芳香烃，因此，对于柴油中芳香烃的降解具有重要作用。
图 6 L1、L2、L3、L4和OCDL-3134降解柴油的产物气相色谱图Figure 6. Gas chromatographic charts of products from diesel oil degradation by L1, L2, L3, L4 and OCDL-3134综上所述，L1、L2、L3、L4对柴油污染物中的有机烃类物质具有一定的降解效果，并且不同的菌种对不同链长的烃类物质降解效果也有显著差异。然而，L1、L2、L3、L4却不能将柴油完全降解。而L1、L2、L3、L4混合形成的菌群OCDL-3134对柴油降解效果显著，如图6(f)所示，相同时间内，柴油几乎被完全降解，转化成无毒无害的酸类小分子、二氧化碳和水。这表明混合菌对柴油的降解效率显著优于单菌株。
2)菌群OCDL-3134降解十五烷过程中的产物分析。使用GC-MS检测了以柴油作为碳源的微生物降解的产物，实验结果表明，混合菌群对柴油的降解效果显著优于单菌种的效果。对此已有大量研究[21]证明了微生物对柴油等有机污染物的降解作用，但是生物降解长链烷烃的机理研究报道并不多见，而且对其降解途径也缺乏了解。由于柴油属于混合物，且主要的烷烃为十五烷和十六烷，因此，本研究选择十五烷作为研究对象，初步探讨微生物降解十五烷的机理，如图7所示。由图7(a)可知，第3天样品中的主要成分是十五烷，这表明在前3 d菌种要先适应新环境，降解效率低。而到第6天，OCDL-3134中的各菌种在协同作用下将十五烷降解为C13H28、C13H26O2等化合物，如图7(b)所示。据报道[15]，微生物对直链烷烃最常见的降解途径为烷烃末端氧化，微生物攻击直链烷烃的末端甲基，由加氧酶、脱氢酶、水化酶等混合功能氧化酶催化，生成伯醇，再进一步氧化为醛和脂肪酸，脂肪酸接着通过氧化进一步代谢，被彻底氧化成二氧化碳和水。如图7(c)所示，在第15天，十五烷以及产物被OCDL-3134彻底降解为水和二氧化碳等小分子物质。
图 7 OCDL-3134降解十五烷在不同时间的产物气相色谱图Figure 7. Gas chromatographic charts of degradation of pentadecane by OCDL-3134 at different time3) OCDL-3134降解柴油过程中细菌代谢功能的预测。图8是从KEGG数据库中获得的代谢丰度图，碳水化合物代谢的丰度最好，表明微生物一开始是对柴油的代谢，而氨基酸的代谢功能丰度是其次的，可能发挥的作用是对中间代谢产物脱氨基，从而进一步代谢成醛、酮、酸等小分子物质，因此，细菌首先利用柴油，并将柴油分解成中间代谢产物，然后经过代谢途径分解成酸类小分子物质。其他的代谢途径如能量代谢、辅因子和维生素的代谢、核酸代谢等也参与进来，最终一起合作完成降解柴油的任务。而且可以发现，4种菌种的异质降解和代谢丰度较好，这一代谢丰度说明微生物具有增强降解柴油的能力，这与TAO等[13]的研究结果相一致，但由于是混合菌，故不能判断是哪一种菌种产生的作用。代谢功能预测进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优于单种菌种。
图 8 OCDL-3134代谢柴油的功能预测Figure 8. Metabolic function prediction of OCDL-3134 metabolizing diesel3. 结论
1)通过排列组合的方式将筛选出的微生物菌种进行组合，得出高效柴油降解菌群OCDL-3134，通过正交实验得出它们之间接种量最优比例为3∶1∶3∶4，同时对混合菌柴油降解性能进行优化，实验测得微生物降解柴油的最优条件为pH=7.0，初始柴油的浓度为7.0 mL·L−1，初始接种量为10.0%，在此优化条件下，测得第14天柴油的最佳降解率为89.0%，这说明所筛选的混合菌种具有较高的应用价值。
2)通过GC-MS检测和微生物多样性功能预测分析证明了微生物对柴油以及十五烷的协同作用高于单菌株的降解效果，4种菌种之间存在协同作用，能够将长链烷烃降解为短链烷烃和小分子物质，并获得自身生长与代谢的能源和碳源。KEGG数据库中获得的代谢丰度图也进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优单种菌种。
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图 1 水样pH对目标物质回收率的影响
Figure 1. Effect of pH of water sample on the recovery of target compounds
图 2 萃取柱对目标物质回收率的影响
Figure 2. Effect of SPE cartridge on the recovery of target compounds
图 3 不同上样速度对目标物质回收率的影响
Figure 3. Effect of different sample loading rate on the recovery of target compounds
图 4 洗脱溶剂对目标物质回收率的影响
Figure 4. Effect of elution solvent on the recovery of target compounds
图 5 洗脱溶剂用量对目标物质回收率的影响
Figure 5. Effect of elution solvent volume on the recovery of target compounds
图 6 不同色谱柱下各组分色谱图
Figure 6. Total ion chromatograms of the target compounds on different chromatogram column
图 7 不同流动相下各组分色谱图
Figure 7. Total ion chromatograms of the target compounds on different mobile phase
图 8 各目标化合物、替代物及进样内标总离子流色谱图
Figure 8. Total ion chromatograms of the target compounds, substitutes and internal standard
表 1 目标化合物、替代物及内标物的多离子反应监测条件
Table 1. The operating parameters of the target compounds, substitutes and internal standard
化合物 质荷比 (m/z) 电压/V 定量内标 母离子 定量离子 定性离子 锥孔电压 碰撞电压 氟甲喹 262.1 202 244.1 56 27/45 13C3-氟甲喹 诺氟沙星 320.2 276.2 233.1 101 25/35 环丙沙星d8 依诺沙星 321.1 303.1 232.1 61 29/49 环丙沙星d8 环丙沙星 332.1 314.1 288.1 81 29/27 环丙沙星d8 培氟沙星 334.2 316 290.1 76 29/27 环丙沙星d8 洛美沙星 352.2 308.2 265.1 91 25/33 恩诺沙星-d5 达氟沙星 358.2 340.2 82.1 76 33/73 恩诺沙星-d5 恩诺沙星 360.2 316.1 245.1 76 27/37 恩诺沙星-d5 那氟沙星 361.2 343.2 283.1 85 35/50 13C3-氟甲喹 氧氟沙星 362.2 318.2 261.1 76 27/39 恩诺沙星-d5 马波沙星 363.1 72.1 320.1 80 46/23 环丙沙星d8 氟罗沙星 370.1 326.1 269.1 76 27/37 恩诺沙星-d5 加替沙星 376.2 332.2 261 81 27/41 恩诺沙星-d5 沙拉沙星 386.1 342.1 299.1 106 27/39 恩诺沙星-d5 奥比沙星 396 352 295.2 80 24/32 恩诺沙星-d5 二氟沙星 400.2 356.2 299.1 81 29/39 恩诺沙星-d5 莫西沙星 402.2 384.2 358.2 76 31/29 环丙沙星d8 诺氟沙星-d5 325.2 281.2 238.1 86 25/35 环丙沙星d8 恩诺沙星-d5 365.2 321.2 347.2 81 29/31 — 环丙沙星-d8 340.2 322.1 296.1 91 31/27 — 13C3-氟甲喹 265.1 247.1 205.1 46 25/45 — 注：表中“/”前后是母离子/定量离子和母离子/定性离子优化后的碰撞电压
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表 2 17 种FQs化合物的纯水加标回收率(n = 6)及相对标准偏差
Table 2. Recovery rate (n = 6) and RSD of 17 fluoroquinolones antibiotics in pure water
化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 莫西沙星 10 65.7 8.6 恩诺沙星 10 80.1 14 90 73.5 4.7 90 78.3 2.8 二氟沙星 10 63.9 7.8 达氟沙星 10 80.6 19.3 90 69.1 2.1 90 78.9 2.6 奥比沙星 10 95.6 7.1 洛美沙星 10 96.2 3 90 91 6.8 90 88.8 3.8 沙拉沙星 10 58.6 7.1 培氟沙星 10 89.2 12.6 90 65.3 4.8 90 89 4.7 加替沙星 10 85.4 2.9 环丙沙星 10 79.7 9.5 90 84 4.1 90 81.5 2.5 氟罗沙星 10 94.4 7.2 依诺沙星 10 77 9.2 90 90.3 10.8 90 78.5 18.6 马波沙星 10 93.4 3.7 诺氟沙星 10 83.1 4.3 90 87.8 7.8 90 75.9 6.4 氧氟沙星 10 104.2 6.8 氟甲喹 10 86.2 11.4 90 90.4 5.3 90 78 5.8 那氟沙星 10 76.6 12.1 90 78.7 7.3
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表 3 17 种FQs化合物的养殖废水加标回收率(n = 6)及相对标准偏差
Table 3. Recovery rate (n = 6) and RSD of 17 fluoroquinolones antibiotics in aquaculture wastewater
化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 莫西沙星 20 85.7 18.6 恩诺沙星 20 66.4 11.3 二氟沙星 20 47.8 11.6 达氟沙星 20 70.8 12.3 奥比沙星 20 59.7 12.6 洛美沙星 20 62.8 10.2 沙拉沙星 20 50.1 14.6 培氟沙星 20 118.7 11.2 加替沙星 20 56.8 13.4 环丙沙星 20 82.7 8.9 氟罗沙星 20 75 8.4 依诺沙星 20 94.4 11.2 马波沙星 20 95.7 12 诺氟沙星 20 54.1 10 氧氟沙星 20 83.4 11 氟甲喹 20 104.8 3 那氟沙星 20 100.4 3.2
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