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氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinolones，FQs)是指具有4-氧代喹啉-6-氟-3-羧基结构的一类药物总称。FQs具有抗菌谱广、杀菌能力强、耐药发生率低、体内分布广、组织浓度高、半衰期长、价格低廉等特点，被广泛应用于水产品、畜禽类及人类疾病预防和治疗过程中，是当前应用最广泛的抗生素类药物之一[1-2]。近年来，随着FQs使用量的不断增加，在地表水[3-4]、饮用水[5-6]、污水处理厂[7-11]以及河流沉积物[12-13]中检出FQs的报道越来越多。因FQs可诱导产生耐药性菌株，破坏微生态平衡，故其在环境中的残留及潜在风险受到国内外学者的普遍关注[14-15]。
随着养殖业的迅猛发展，为追求利益最大化，养殖业开始出现养殖密度过高、喂食量过度、有效隔离空间不足、流行病愈加频繁等问题。为预防及治疗流行病和促进畜禽、鱼及贝类的生长，养殖人员将FQs添入饲料中，以致养殖业出现抗生素应用不合理、消耗过量的现状[16]。使用后的FQs一般只有20%~30%被利用和吸收，其余FQs以母体化合物或代谢物形式排出体外[17]，造成养殖场周边及流域环境的FQs污染[18-19]。因此，养殖废水成为FQs进入环境的重要来源之一。目前，虽然国内外已有很多学者对环境[3-11]、饲料[20-21]、食品[22-23]、水产品[24-25]等领域中的FQs开展了相关研究，但这些研究所关注的FQs类的化合物相对较少，很难满足环境中FQs的检测需求。本研究针对养殖废水中可能存在的17种FQs，通过优化前处理和仪器分析条件，实现了对养殖废水中17种FQs的同时检测，为养殖废水中FQs的污染特征研究提供了一种快速、准确的测定方法。此外，还应用本研究所建立的方法对广州某水产养殖场养殖废水中17种FQs的残留量进行了检测。
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标准贮备液：17种FQs(氟罗沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、马波沙星、洛美沙星、奥比沙星、二氟沙星、沙拉沙星、加替沙星、莫西沙星、氟甲喹和那氟沙星)，1种替代物(诺氟沙星-d5)及3种进样内标(环丙沙星-d8、13C3-氟甲喹和恩诺沙星-d5)的贮备液均购自天津阿尔塔公司，溶剂为甲醇，质量浓度均为100 mg·L−1，在−20 ℃下避光保存，使用时用甲醇将混标稀释成不同浓度的标准工作液。
实验试剂和材料：甲醇(中国上海，霍尼韦尔贸易有限公司)，甲酸(中国北京，迪马科技有限公司)；盐酸(中国衡阳，凯信化工试剂有限公司)，氨水(中国天津，光复精细化工研究所)。Oasis HLB 固相萃取柱(6 mL，500 mg，美国，Waters公司)；CORTECS® C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 µm，美国，waters公司)；0.45 μm玻璃纤维膜、2 mL注射器、0.22 μm聚四氟乙烯滤膜(中国广州，国凌仪器有限公司)。
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Fotector plus(PFCs)高通量全自动固相萃取仪(中国厦门，睿科集团股份有限公司)；Agilent 1260 Infinity快速液相色谱(美国，安捷伦科技有限公司)- AB 4000 Qtrap三重四级杆串联质谱(美国，AB SCIEX公司)；MGS-2200氮吹浓缩仪(日本，EYELA公司)；SCQ-1000C超声波清洗仪(中国上海，声彦超声波仪器有限公司)。
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量取1 000 mL的水样，用0.45 μm 的聚四氟乙烯滤膜除去水中悬浮颗粒物，加入5%甲醇溶液(体积比)，用盐酸调节pH至2.0，并加入20 ng替代物(诺氟沙星-d5)，以8-12 mL·min−1的流速匀速通过活化后的HLB固相萃取柱。HLB柱依次用6 mL甲醇、6 mL水及6 mL 盐酸水溶液(pH=2)淋洗活化。样品富集完成后，用6 mL 5%甲醇溶液(体积比)淋洗小柱，干燥25 min，再用9 mL 0.1%甲酸甲醇以1 mL·min−1 的速度洗脱小柱，洗脱液收集于试管中。洗脱液经浓缩装置浓缩至尽干，加入10 ng进样内标(恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8和13C3-氟甲喹)，最后用0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵水溶液和甲醇混合溶液(体积比为1∶1)定容至1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜，待测。
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色谱柱：Waters CORTECS® C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 µm)，流动相为0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵水溶液(A相)和甲醇(B相)，流速为0.5 mL·min−1，柱温为40 ℃，进样体积为5 μL。正离子模式下梯度洗脱程序：0~1 min为20%B；1~11 min为20%-40%B；11~14 min为40%-95% B；14~17 min为95%B；17.0~17.1 min为95%-20%B，每个梯度完成后平衡2.9 min。
离子源为电喷雾电离源，气帘气压力为0.17 MPa，雾化气压力为0.41 MPa，辅助气压力为0.41 MPa，正离子模式下离子源电压为5 500 V，去溶剂温度为550 ℃，检测方式为多反应离子扫描模式。
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1)样品pH的优化。pH可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度，从而影响回收效果。为了考察不同pH对17种FQs的回收效果，本研究采集9份1 000 mL水样，将3份pH调至2.0，3份pH调至4.0，3份pH调至6.0，加标浓度均为20 ng·L−1。如图1所示，当样品的pH调节至2.0时，17种FQs的平均回收率为71.3%-87.2%，RSD为3.6%~11.5%；但当样品的pH调节至4.0和6.0时，依诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及莫西沙星回收率明显下降，均低于60%，RSD为1.3%~11.5%。这可能是因为氟喹诺酮类抗生素的酸度系数(pKa)普遍在4.0~7.0，当样品的pH小于其酸度系数(pKa)2个单位以上时，99%的目标化合物呈中性，有效增强目标化合物在吸附剂上的保留，从而提高回收率。因此，本研究最终选择将水样pH调节至2.0进行富集。
2)固相萃取柱的选择。目前国内外报道的常用于水样中抗生素测定的固相萃取小柱主要有C18柱和HLB柱。为了考察HLB柱和C18柱对17种FQs的萃取效率，本研究做了对比实验。如图2 所示，HLB柱对17种FQs的平均回收率为71.3%~87.2%，显著高于C18柱。这可能与各萃取柱萃取原理有关。有研究表明[26]，C18柱是按照疏水非极性作用机理进行萃取，较为适合lgKow≥2.5的非极性到中等极性的化合物的萃取。而FQs为亲水性化合物，其lgKow≤2.0，因此，不适宜用C18柱萃取。HLB柱的填料为亲水亲酯型聚合物，比较适合FQs的保留。因此，本研究最终选用HLB柱对环境水样中17种FQs进行富集。
3)上样速度的优化。上样速度是SPE条件优化的一个重要参数。一般来说，上样速度越慢，回收率越高，但样品的预处理时间相对较长；而上样速度过快，固相萃取小柱对目标化合物的吸附往往不充分，容易造成回收率偏低。为筛选出高效、快捷的前处理条件，本研究比较了不同上样速度对17种FQs萃取回收效果的影响。如图3所示，当上样速度为4、8和12 mL·min−1时，对17种FQs平均回收率基本没有影响，说明目标化合物很容易吸附在固相萃取小柱上。在节约时间的同时，考虑到当样品中FQs浓度较高时，上样速度过快可能导致目标物富集效果变差，故本研究最终选择的上样流速为8~12 mL·min−1。
4)洗脱溶剂的选择。为了考察不同洗脱溶剂对17种FQs的洗脱效果，本研究对比了0.1%甲酸甲醇和纯甲醇2种洗脱溶剂。如图4所示。其中用0.1%甲酸甲醇溶液洗脱的平均回收率为79.6%~100%，相对偏差为0.7%~7.4%；而用甲醇洗脱的平均回收率为72.6%~92.7%，相对偏差为3.2%~13.6%。虽然0.1%甲酸甲醇略优于甲醇，但2种洗脱溶剂对17种FQs的回收率均大于70%，因此，上述2种洗脱溶剂均可作为17种FQs的洗脱溶剂。
5)洗脱溶剂用量优化。为获取最佳的洗脱溶剂体积，在选定0.1%甲酸甲醇溶液作为洗脱溶剂后，将9份1 000 mL水样(加标质量浓度为20 ng·L−1)平均分成3组，分别对比了3、6和9 mL洗脱体积对17种FQs的回收效果。如图5所示，当洗脱量为3 mL时，那氟沙星和氟甲喹的平均回收率很低，均小于10%，其他目标化合物的平均回收率均在70%以上；当洗脱量为6 mL和9mL时，大部分目标已经被洗脱，且各目标化合物的平均回收率均在80%以上。考虑到养殖废水基质较为复杂，洗脱量较少可导致部分目标化合物未能完全洗脱，回收效果变差，故本研究选取9 mL作为最佳洗脱量。
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1)色谱柱的选择。FQs多为两性物质，具有一定的水溶性，不同的色谱柱对其分离影响较大。本研究考察了多种常用的C18反相色谱柱对17种FQs的分离效果，如Kinetex-C18®(100 mm×3.0 mm×2.6 μm)(A柱)、XTEERRA-C18® MS C18 (100 mm×2.1 mm×3.5 μm)(B柱)和CORTECS® C18(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)(C柱)。如图6所示(进样浓度为20 μg·L−1)，使用A柱分离17 种FQs时，出现峰形拖尾现象；使用B柱分离FQs时，莫西沙星和那氟沙星等目标物的色谱峰展宽严重；而使用C柱分离17 种FQs时，不仅分离效果好，峰形对称，而且响应强度也相对较高。因此，本研究选择C柱对17种FQs进行分离。
2)流动相组分优化。确定色谱柱后，为更好的分离各种目标物并获取满意的峰型，本研究对流动相组分进行了优化。首先，比较了不同有机相(甲醇和乙腈)对目标化合物的分离效果。结果表明，使用甲醇时，基线相对较低，并且对目标化合物具有更好的分离效果，因此，确定甲醇为有机相。因在流动相中加入适当的有机酸或缓冲盐可增强目标物的离子化效率，增强分析方法的灵敏度，所以在确定有机相为甲醇后，又比较了不同有机酸、缓冲盐对灵敏度的影响，包括5 mmol·L−1乙酸铵、0.1%甲酸水及0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵等。如图7所示，0.1%甲酸−5 mmol·L−1甲酸铵和甲醇作为流动相时，峰型最好，灵敏度最高，信号强度最强。
3)洗脱梯度优化。经反复优化洗脱梯度程序后，最终选择1.4.1节所述的洗脱梯度。在选定的洗脱梯度下，所有组分均在20 min以内出峰，且分离效果最为佳，具体色谱图见图8(进样浓度为100 μg·L−1)。
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配制质量浓度为1.0 mg·L−1的FQs、内标化合物和替代物的混合标准溶液，在正离子模式下，用直接注射进样方式扫描并优化母离子/子离子特征离子对，及相应的锥孔电压、碰撞电压等其他参数，利用获取的全部特征离子及离子间的丰度比进行定性分析，以丰度最高的特征离子响应与浓度的关系进行定量分析，质谱优化参数结果如表1所示。
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1)方法的线性关系、检出限和定量限。将17种FQs的200 μg·L−1 标准溶液按梯度稀释，梯度浓度分别为0.5、1、2、5、10、 20、50、100 μg·L−1。用已优化好的色谱条件和质谱条件进行测定，内标法定量。以17种FQs的质量浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，17种FQs在0.5-100 μg·L−1内线性关系良好，R2>0.99。根据环境监测分析方法标准制修订技术导则[27]，对大约检出限为3-5倍浓度的样品进行7次平行测定，计算测定结果的标准偏差(SD)。其方法检出限(LOD)为3.143倍的SD，定量限(LOQ) 为4倍的 LOD。根据计算结果，LOD为0.08-0.3 ng·L−1，LOQ为0.32-1.2 ng·L−1。
2)加标实验结果。用超纯水进行空白基质加标回收实验，加标质量浓度分别设置为10 ng·L−1和90 ng·L−1，每个浓度水平做6个重复样品，同时设置6个空白样品。按第1.4节中的步骤对样品进行处理，以考察方法的总体回收率、重现性是否达到检测分析要求。如表2所示，当添加量为10 ng·L−1时，17种FQs的平均回收率为58.6%~104.2%，RSD为2.9%~19.3%；当添加量为90 ng·L−1时，平均回收率为65.3%~91.0 %，RSD为2.1%~18.6%。此外，本研究还以养殖废水为基质，设置了6个基质加标实验，加标质量浓度为20 ng·L−1。结果如表3所示，17种FQs的平均回收率为47.8%~118.7%，RSD为3.0%~18.6%。本方法的空白和基质加标回收结果与美国 EPA1694 [28]相当，但与其他几种FQs相比，莫西沙星、达氟沙星和依诺沙星的RSD值相对偏高。这可能是由于现有的富集和净化手段未能有效去除水样的背景干扰，在运用正离子扫描模式时，这些背景会增强或减弱目标化合物的电离结果，进而影响仪器测定结果的准确性，造成方法重现性较差，RSD偏高。
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为验证本研究建立的检测分析方法，按照《污水监测技术规范》(HJ91.1-2019)[29]中的样品采集规定，采集了广州某水产养殖场的养殖废水并进行了测定。样品采集后，立即用盐酸调节pH至2.0±0.5，4 ℃以下避光运送至实验室。测定结果表明：采集的养殖废水共检测出9种FQs，其中莫西沙星为2.34 ng·L−1，氟甲喹为0.96 ng·L−1，马波沙星为0.24 ng·L−1，氧氟沙星为9.36 ng·L−1，恩诺沙星为1.13 ng·L−1，达氟沙星为5.96 ng·L−1，培氟沙星为2.20 ng·L−1，环丙沙星为0.53 ng·L−1，依诺沙星为3.48 ng·L−1。
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1)通过优化固相萃取条件、色谱分离条件、质谱检测参数，建立了一种快速、准确测定养殖废水中17种FQs的固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱法。该方法通过特征碎片离子和色谱保留时间定性，通过特征准分子离子定量，方法检出限为0.08~0.3 ng·L−1；空白加标平均回收率为58.6%~104.2%，RSD为2.1%~19.3%(n=6)；基质加标平均回收率为47.8%~118.7%，RSD小于20%(n=6)，满足养殖废水中17种FQs残留分析的要求。
2)所采集的广州某养殖场的养殖废水样品中，含有多种不同含量的氟喹诺酮类抗生素，其中氧氟沙星检出浓度最高(9.36 ng·L−1)，达氟沙星次之(5.96 ng·L−1)。
固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱测定养殖废水中17种氟喹诺酮类抗生素
Determination of 17 fluoroquinolones antibiotics in aquaculture wastewater using LC-MS/MS coupled with solid phase extraction
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摘要: 采用固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱(SPE-LC-MS/MS)技术，建立了养殖废水中17种氟喹诺酮类抗生素(FQs)的测定方法。水样在采用固相萃取法富集前，先用 0.45 μm 的聚四氟乙烯滤膜过滤，而后加入5%甲醇(体积比)，用盐酸溶液将水样pH调节至2.0±0.5，经固相萃取柱富集，最后用9 mL 0.1%甲酸甲醇洗脱。以C18柱为分离柱，0.1%甲酸−5 mmol·L−1 甲酸铵水溶液和甲醇为流动相，采用液相色谱－三重四极杆串联质谱多反应监测离子模式(MRM)对目标化合物进行了检测和分析。在优化实验条件下，17种FQs的线性范围为0.50 -100 μg·L−1时，目标化合物峰面积与内标物质峰面积之比与质量浓度的线性关系良好(R2>0.99)，方法检出限为0.08-0.3 ng·L−1。在加标量为0.01 μg·L−1和0.09 μg·L−1时，空白加标的平均回收率为58.6%-104.2% 和65.3%-91.0%，相对标准偏差(RSD)在2.1%-19.3%(n=6)。以养殖废水为基质，17种FQs的加标回收率在47.8%-118.7%，RSD小于20%(n=6)。应用该方法测定了广州某水产养殖场的养殖废水。结果表明，氧氟沙星检出浓度最高(9.36 ng·L−1)，达氟沙星次之(5.96 ng·L−1)。该方法快速、准确，可适用于养殖废水中17种FQs的测定。Abstract: A method was developed for the determination of 17 target fluoroquinolones antibiotics (FQs) in aquaculture wastewater by liquid chromatography/tandem triple quadruple bar mass spectrometry (LC-MS/MS), coupled with solid phase extraction (SPE). Before solid phase extraction, samples were filtered by 0.45 μm polytetrafluoroethylene filter membrane, and then 5% methanol (V:V) was added in filtrate and the pH was adjusted to 2.0 with HCl solution. The analytes were efficiently extracted by SPE column and eluted by 9 mL 0.1% formic acid methanol. The separation was performed on a reverse-phase Cl8 column using a mobile phase consisting of 0.1% formic acid-5mmol·L−1 ammonium formate aqueous solution and methanol. All analytes were quantified by LC-MS /MS under multi-reaction monitoring (MRM) mode. Under the optimal conditions, the calibration curves of all 17 targets were linear in the range of 0.5-100μg·L−1 with the correlation coefficients more than 0. 99. The limits of detection (MDL) were 0.08~0.3 ng·L−1.The average recovery rates were in the ranges of 58.6%~104.2% and 58.0%~107.8% and relative standard deviations (RSDs) ranged from 2.1% to 19.3% (n=6) with two spiked levels of 0.01 and 0.09 μg·L−1, respectively. The average recoveries of 17 FQs in the aquaculture wastewater samples were 47.8%~118.7% with RSDs<20% (n=6). A sample of aquaculture wastewater collected from an aquaculture farm in Guangzhou was detected with this method. The results showed that the ofloxacin had the highest detection concentration (9.36 ng·L−1.) in the sample, followed by danofloxacin (5.96 ng·L−1). This method was simple, rapid and accurate, and could be used to detect 17 FQs residues in aquaculture wastewater．
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长期以来，水环境问题一直备受关注，《2018年中国生态环境状况公报》显示，我国地表水中Ⅳ、Ⅴ类水质占22.3%，劣Ⅴ类占6.7%；浅层地下水中Ⅳ类占29.2%，Ⅴ类占46.9%，其中，氮磷污染物超标问题较为严重[1-2]。因此，高效脱氮除磷依然是我国当前污水处理领域的研究热点。市政污水处理主要采用以絮状活性污泥法为核心的传统生物脱氮除磷工艺，存在处理能力低、占地面积大、运行成本高等问题[3]。如何提高传统活性污泥法的效率，如何在较小的范围内实现更高的污水处理效率、同时降低能耗，已成为目前全球范围内污水处理领域所面临的共性技术难题。
好氧颗粒污泥(AGS)技术起源于20世纪90年代末期[4]，是当前最具应用价值的污水生物处理新技术之一。AGS是由微生物在特定水力条件下自凝聚形成的颗粒状活性污泥，具有沉降性能好、处理负荷高等优点[5-6],脱氮除磷原理与絮状污泥类似，即通过硝化-反硝化过程脱氮，通过聚磷菌(PAOs)的释磷和吸磷过程除磷。但AGS由于自身特殊的结构使得其自表面向内部存在溶解氧梯度，由此构建了明显的好氧区、缺氧区和厌氧区，硝化菌、反硝化菌和PAOs等功能菌群沿径向分布于不同层级，从而实现在同一反应器中进行同步硝化反硝化脱氮除磷[7-8]。好氧颗粒污泥系统一池式的反应理念和较高的污泥浓度可以降低20%~25%的运行费用，23%~40%的电耗和50%~75%的构筑物占地面积[9]，同时减少化学药剂的消耗量[10-11]。目前，该技术被荷兰DHV公司初步在工程中应用，据报道[12]，在世界范围内已有30多座好氧颗粒污泥厂在运行。
然而，中国生活污水水质和欧美等国家具有显著的差别，我国生活污水普遍呈现出低碳氮比和低COD特点。据统计[13]，在全国127个污水处理厂中，大多数水厂原水BOD5/TN<2.59，80%的污水处理厂BOD5/TN<3.6，仅有10%的污水处理厂BOD5/TN>4。一般将COD低于200 mg·L−1，C/N低于8的污水成为低碳氮比污水[14]。据报道[15]，世界范围内市政污水处理厂的典型进水C/N在10.5~12.6，COD值也显著高于中国的市政污水。因此，该技术在中国的推广应用还未获得实质性的突破。
目前，利用AGS处理生活污水的研究大多以实验室配水为基质，无法完全模拟生活污水的典型特征[16-17]，而利用好氧颗粒污泥处理低碳氮比实际生活污水的研究较少，限制了AGS技术的进一步推广与应用。本研究利用AGS技术处理实际低碳氮比生活污水，研究了AGS的形成过程、N和P等污染物的同步去除过程和去除效率，可为该技术在中国的推广应用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验装置和运行方式
本研究采用SBR(序批式活性污泥法)作为实验装置，反应器整体为有机玻璃结构，外设循环水浴夹套，通过循环水浴装置保证冬季反应器温度不低于25 ℃。反应器内径为800 mm，高为1 400 mm，其中有效水深高度为1 200 mm。在运行过程中，SBR由PLC自动控制，气泵和微孔曝气头供气，由转子流量计控制器量，通过蠕动泵进出水，装置如图1所示。
反应器运行过程包括进水、厌氧循环、曝气、沉淀、出水5个阶段。在反应器运行的过程中，随着沉降时间的缩短，逐渐调整运行工况，增加排水比，并逐步缩短反应时间以增加周期数，反应器运行工况如表1所示。
表 1 不同阶段反应器运行工况Table 1. Reactor operation conditions at different stages运行时间/d 日负荷/(kg·(kg·d)-1) 排水比 沉降时间/min 1~10 0.12~0.15 0.45 30~15 10~20 0.15~0.2 0.5~0.7 15~10 20~80 0.2~0.35 0.7 10~7 80~140 0.1~0.25 0.75 9~5 140~180 0.25~0.35 0.75 4~2.5 | Show Table
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1.2 接种污泥与实验用水
本实验接种污泥取自济南某市政污水处理厂的曝气池，该厂采用A/A/O工艺，实验启动时的污泥接种浓度(MLSS)为5 400 mg·L−1。原水采自污水处理厂集水井，原水水质：COD 300~500 mg·L−1；氨氮40~70 mg·L−1；TN 50~80 mg·L−1；TP 4~7 mg·L−1。
1.3 分析方法
实验过程中所使用的主要分析仪器包括：Hach DR1900分光光度计；HachDRB200快速消解仪；WTW Multi 3630 IDS便携水质监测仪。
2. 结果与讨论
2.1 污泥沉降性能变化
系统污泥浓度与沉降性能变化情况如图2所示。由图2(a)可见，反应器启动接种污泥浓度为5 500 mg·L−1。随着反应器的运行，采取不断缩短沉降时间的方式培养AGS，由此不断排出沉降性较差的污泥。在运行初期，由于污泥被筛选淘汰，污泥浓度整体上呈小幅下降趋势，7 d后微生物量开始缓慢增长，污泥浓度逐渐提升。在反应器运行至40 d左右时，由于当地进入多雨季节，雨水随管网汇入污水中，进水污染物浓度下降，反应器中生物量出现短暂的降低，但MLSS基本保持在4 000 mg·L−1以上，系统可稳定运行。在夏季结束后，原水中基质浓度开始升高，加之进水量的增大，在短时间内污泥浓度得到快速提升，絮状污泥一度获得一定竞争优势，随后又被逐渐筛选出体系之外。在反应器运行第80天后，继续降低沉降时间，污泥MLSS和MLVSS基本稳定在4 000~5 000 mg·L−1和3 000~4 000 mg·L−1；而有研究[18-19]表明，较高进水浓度(人工模拟废水)可使反应器污泥浓度达7 000~10 000 mg·L−1。由于实际生活污水COD值和C/N低，会导致生物量增值受限，从而维持相对低的污泥浓度[20]。
图 2 污泥浓度与沉降性能的变化Figure 2. Change of sludge concentration and settling property during the operation污泥容积指数(SVI)能综合反映沉降与污泥浓度之间的关系。由图2(b)可见，从SV5、SV30及SVI在好氧颗粒污泥形成过程总体上均呈下降趋势，接种絮状污泥SV5和SV30分别为95%和70%，在30 d后SV5与SV30差别明显缩小，系统沉降时间已由启动时26 min下降至8 min。相比其他利用实际污水培养好氧颗粒污泥的研究，在无外加药同时能够保持较高生物量的前提下，取得了更好的沉降性改善结果[21]。一般认为，实际污水培养好氧颗粒污泥所需的时间要大于人工配水(约30 d)[22]；但实验过程中，以实际污水为基质所实现的颗粒化速度与人工配水培养所需的时间相比并无较大差距。反应器运行至100 d后，二者数值上已无显著差别。一般污泥的SV5与SV30相差小于10%时，可认为反应器内颗粒污泥占主导。反应器中污泥SVI值整体呈下降趋势，最终稳定在40~50 mL·g−1左右；而一般活性污泥的SVI为90~150 mL·g−1。由此可见，实际生活污水培养的好氧颗粒污泥具有良好沉降性能。
2.2 污泥形态与粒径变化
图3为反应器不同运行阶段污泥外观的变化情况。由图3可以看出，随着反应器的运行，在污泥中颗粒的比例逐渐增大，且颗粒粒径逐渐增大，呈现出与接种初期污水处理厂絮状污泥完全不同的形态。随着沉降时间的缩短，沉降性较差的污泥随出水排至反应器外，而反应器中沉降性较好的污泥则被逐渐筛选，从絮状演化为不规则的小颗粒，进而继续增大，最终形成饱满紧致、椭球形、边缘清晰的颗粒污泥。
图4给出了培养过程中颗粒污泥粒径的变化情况，颗粒粒径及不同粒径的分布情况由Malvern Panalytical Mastersizer 2000 激光粒度仪测得。在反应器启动阶段，接种絮状污泥平均粒径为80.5 μm。随着反应器的运行，颗粒粒径逐渐增大，50 d后平均粒径增至378.3 μm，运行至80 d，污泥平均粒径为434.3 μm，粒径在500 μm以上的颗粒污泥约占总量的39.0%；在120 d左右，体系已基本处于稳定状态，此时颗粒污泥平均粒径为599.5 μm，基本实现完全颗粒化；反应器运行至150 d，体系中粒径超过500 μm 的颗粒污泥约占56.9%，可见颗粒污泥已占主导。
2.3 污染物去除情况
实验考察了反应器COD与TN的去除情况，反应器对碳和氮的去除效果见图5。进水取自城市生活污水处理厂集水井，在运行过程中，反应器进水碳氮比基本在2~6，属于典型的低C/N污水[3]。由图5可见，反应器启动初期受雨季影响，进水COD值总体上呈下降趋势，而出水COD值可基本保持在50 mg·L−1以下，平均去除率为89.5%，满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A标准，达标时间占比为98.9%。从整个运行过程的数据可见，除启动阶段及80 d左右因水质突变引起系统不稳定之外，反应器出水总氮基本能达到一级A标准，平均脱氮效率为78.5%，达标时间占比91.2%，而氨氮的时间天数高于98%。相较而言，传统活性污泥处理工艺在处理低C/N污水处理过程中，常需额外添加碳源以保证出水总氮达标，但添加碳源会导致运行成本和污泥产量增加，此外硝化液回流也会导致能耗增高以及占地面积增大。而好氧颗粒污泥系统以SBR为基础，利用更简单、紧凑的工艺模式，以不添加碳源的实际污水为基质，在跨越了从春季至秋季、从旱季至雨季的整个运行过程中，所达到的处理效率充分体现出好氧颗粒污泥技术在处理低C/N污水所具有的独特优势。
反应器除磷情况如图6所示。在反应器运行的前期阶段，除磷效果一直不理想，前80 d，除磷效率仅为42%，这是由于有机质浓度过低，致使聚磷菌在前期并未占据优势造成的结果。颗粒污泥在形成的过程中，需要保证存在周期性的“饥饿期”与“盛宴期”来刺激活性污泥在表面分泌胞外聚合物(EPS)来促进其团聚，并最终形成颗粒[7]。在进水之后，由于饥饿期的存在，大量碳源进入体系的瞬间即被各类微生物吸附或吸收。在这个阶段，如果聚磷菌不能获得足够的碳源作为营养物质，则会降低后续吸磷效率。而过量的排泥虽然能够提高除磷效率，但会造成生物量的损失，对体系中微生物种群的构建起到不良的影响。反应器运行90 d后，系统内颗粒污泥逐渐占据优势，除磷效果有所提高，此时反应器出水总磷基本可控制在2 mg·L−1左右。随着体系的进一步稳定，开始强化对污泥龄的把控，将其控制在7~12 d，除磷效果得以提升。130 d后，出水总磷可以保持在1 mg·L−1左右，甚至0.5 mg·L−1以下，达到一级A标准规定，这一阶段平均除磷率在70%以上。
2.4 反应周期内脱氮除磷过程
将反应器的运行模式分为进水、厌氧循环、曝气、沉淀4个阶段。在反应过程中，自进水后每隔20 min取样一次，经定性滤纸过滤掉悬浮物及少量污泥后，测定水中各污染物指标的浓度，同时在取样时记录取样口附近电极的pH、DO、Eh。不同运行阶段典型周期内污染物浓度与水质参数变化情况如图7所示。在反应器启动后，随着系统内污泥的不断筛选和淘洗，反应器中的微生物群落组成开始发生变化，其污染物降解过程也随之改变。由图7(a)可见，在接种后10 d，由于沉降性能较差的污泥被不断排出，污泥龄处在一个较小的范围内(7~10 d)，此时系统除磷能力较好。但脱氮效率则很不理想，随着反应的进行，总氮在曝气100 min内没有明显的降低，氨氮和部分有机氮转化为硝态氮和亚硝态氮后积累在体系中，直至氨氮几乎被代谢完毕。这一阶段体系中无法发生同步硝化反硝化作用，出水总氮也超过20 mg·L−1。
图 7 不同运行阶段典型周期内污染物浓度的变化Figure 7. Variations of pollutant concentrations in the typical periods at different stages在反应器运行60 d时，颗粒污泥在体系中占据主导地位。由图7(c)可见，在单个周期内，总氮随时间整体呈下降趋势，同步硝化反硝化作用已经开始显现，但在好氧过程中微生物对溶解氧的利用率不高，溶解氧浓度也处在一个较高的水平(图7(d))。在这一阶段，颗粒污泥逐渐架构自身微生物群落结构，因此，在低C/N进水的前提下，脱氮除磷存在明显的竞争，此时聚磷菌在竞争中处于劣势，厌氧阶段释磷量较低，故好氧段吸磷效果并不出色，出水总磷为2.4 mg·L−1，除磷效率较差。当反应器运行至180 d时，如图7(e)所示，此时各项运行参数接近稳定，系统中污泥处于完全颗粒化的状态，且颗粒的群落构建基本满足脱氮除磷要求。在这一阶段，能够观察到磷量明显，且系统除磷效果良好，出水总磷为0.9 mg·L−1。同时系统中总氮整体呈下降趋势，硝酸盐积累量很低，同步硝化反硝化作用明显，出水总氮为9.5 mg·L−1，可实现总氮达标出水。
根据生物脱氮原理，在硝化过程中，微生物将消耗碱度，从而引起pH降低；在反硝化过程中则会生成碱度，导致pH回升。颗粒污泥自身拥有特殊的外部好氧-内部缺氧的结构，能够保证在曝气阶段，外部好氧层进行硝化反应的同时内部仍然能够保持缺氧状态，通过反硝化作用将NOx-N转化为氮气，实现同步硝化反硝化[7]。另外，由于外部水体为有氧环境，且水体中存在大量的氨氮，硝化速度与反硝化速度很难达成同步。在曝气阶段初期，硝化速度大于反硝化速度，此时系统的pH开始下降，溶解氧开始提升。在曝气过程中，由于微生物不断消耗溶解氧，溶解氧不会快速到达饱和水平，直至水体内氨氮与COD近乎被氧化完全，此时好氧菌代谢程度降低，溶解氧再无大量消耗，因此，曝气阶段后期溶解氧有一个明显的陡增。同时由于硝化作用接近完全，反硝化速率将超过硝化速率，碱度开始被补偿，故pH出现一回升过程，pH的拐点以及DO的陡增点可以作为硝化作用接近结束的指示指标。
在整个体系中，由于多种物质以及不同的生化反应同时存在，因此，所测得的Eh不应简单视为一个热力学概念或某种氧化物(还原物)的浓度指标，而是整个体系所处的氧化还原状态的综合指标。Eh的大小往往与体系中不同功能菌代谢有关，一般来说，有机物氧化过程常发生在−50~200 mV，反硝化过程则发生在−50~50 mV，厌氧释磷过程发生在−200~0 mV[23]。在有机物被氧化的过程中，还原性物质不断被消耗，Eh有所升高，特别是有机物基本氧化完全，DO浓度大幅提高，此时Eh也会有进一步的跃升。此外，在硝化过程中，
NH+4−N 不断被氧化为氧化态的NO−x−N ，导致体系的Eh也会升高；在相应的在反硝化过程中，NO−x−N 被不断还原为N2，Eh则会降低。如图7(b)和图7(d)所示，在这一阶段，由于前一周期系统曝气阶段DO浓度较高，致使进水完成后余留溶解氧将原水中的NH+4−N 以及少量有机物氧化，Eh在厌氧阶段呈上升状态，此后由于溶解氧耗尽，产生的NO−3−N 又被迅速还原，因而上升的趋势有所减弱。这一特殊过程的出现造成碳源在这一阶段被大量消耗，聚磷菌未能得到充足的碳源，故其释磷效果较差，进而影响了好氧吸磷过程。在曝气阶段，DO浓度迅速升高，Eh也随之升高。因此，Eh的变化是系统中正在发生的各生化反应的综合体现，不正常的Eh变化对系统运行状况是否正常具有重要的指示性作用。3. 结论
1)以低C/N市政污水为基质，在不添加碳源的前提下，可以培养出成熟的好氧颗粒污泥，通过合理调控运行工艺参数能够实现高效脱氮除磷过程。
2)好氧颗粒污泥与普通活性污泥对氮的降解过程有明显区别，其特殊的理化性质能保证以同步硝化反硝化的方式高效处理低C/N污水。
3)好氧颗粒污泥体系中DO、pH、Eh的大小及其变化趋势对系统运行调控及状态变化具有指示性作用。
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图 1 水样pH对目标物质回收率的影响
Figure 1. Effect of pH of water sample on the recovery of target compounds
图 2 萃取柱对目标物质回收率的影响
Figure 2. Effect of SPE cartridge on the recovery of target compounds
图 3 不同上样速度对目标物质回收率的影响
Figure 3. Effect of different sample loading rate on the recovery of target compounds
图 4 洗脱溶剂对目标物质回收率的影响
Figure 4. Effect of elution solvent on the recovery of target compounds
图 5 洗脱溶剂用量对目标物质回收率的影响
Figure 5. Effect of elution solvent volume on the recovery of target compounds
图 6 不同色谱柱下各组分色谱图
Figure 6. Total ion chromatograms of the target compounds on different chromatogram column
图 7 不同流动相下各组分色谱图
Figure 7. Total ion chromatograms of the target compounds on different mobile phase
图 8 各目标化合物、替代物及进样内标总离子流色谱图
Figure 8. Total ion chromatograms of the target compounds, substitutes and internal standard
表 1 目标化合物、替代物及内标物的多离子反应监测条件
Table 1. The operating parameters of the target compounds, substitutes and internal standard
化合物 质荷比 (m/z) 电压/V 定量内标 母离子 定量离子 定性离子 锥孔电压 碰撞电压 氟甲喹 262.1 202 244.1 56 27/45 13C3-氟甲喹 诺氟沙星 320.2 276.2 233.1 101 25/35 环丙沙星d8 依诺沙星 321.1 303.1 232.1 61 29/49 环丙沙星d8 环丙沙星 332.1 314.1 288.1 81 29/27 环丙沙星d8 培氟沙星 334.2 316 290.1 76 29/27 环丙沙星d8 洛美沙星 352.2 308.2 265.1 91 25/33 恩诺沙星-d5 达氟沙星 358.2 340.2 82.1 76 33/73 恩诺沙星-d5 恩诺沙星 360.2 316.1 245.1 76 27/37 恩诺沙星-d5 那氟沙星 361.2 343.2 283.1 85 35/50 13C3-氟甲喹 氧氟沙星 362.2 318.2 261.1 76 27/39 恩诺沙星-d5 马波沙星 363.1 72.1 320.1 80 46/23 环丙沙星d8 氟罗沙星 370.1 326.1 269.1 76 27/37 恩诺沙星-d5 加替沙星 376.2 332.2 261 81 27/41 恩诺沙星-d5 沙拉沙星 386.1 342.1 299.1 106 27/39 恩诺沙星-d5 奥比沙星 396 352 295.2 80 24/32 恩诺沙星-d5 二氟沙星 400.2 356.2 299.1 81 29/39 恩诺沙星-d5 莫西沙星 402.2 384.2 358.2 76 31/29 环丙沙星d8 诺氟沙星-d5 325.2 281.2 238.1 86 25/35 环丙沙星d8 恩诺沙星-d5 365.2 321.2 347.2 81 29/31 — 环丙沙星-d8 340.2 322.1 296.1 91 31/27 — 13C3-氟甲喹 265.1 247.1 205.1 46 25/45 — 注：表中“/”前后是母离子/定量离子和母离子/定性离子优化后的碰撞电压
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表 2 17 种FQs化合物的纯水加标回收率(n = 6)及相对标准偏差
Table 2. Recovery rate (n = 6) and RSD of 17 fluoroquinolones antibiotics in pure water
化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 莫西沙星 10 65.7 8.6 恩诺沙星 10 80.1 14 90 73.5 4.7 90 78.3 2.8 二氟沙星 10 63.9 7.8 达氟沙星 10 80.6 19.3 90 69.1 2.1 90 78.9 2.6 奥比沙星 10 95.6 7.1 洛美沙星 10 96.2 3 90 91 6.8 90 88.8 3.8 沙拉沙星 10 58.6 7.1 培氟沙星 10 89.2 12.6 90 65.3 4.8 90 89 4.7 加替沙星 10 85.4 2.9 环丙沙星 10 79.7 9.5 90 84 4.1 90 81.5 2.5 氟罗沙星 10 94.4 7.2 依诺沙星 10 77 9.2 90 90.3 10.8 90 78.5 18.6 马波沙星 10 93.4 3.7 诺氟沙星 10 83.1 4.3 90 87.8 7.8 90 75.9 6.4 氧氟沙星 10 104.2 6.8 氟甲喹 10 86.2 11.4 90 90.4 5.3 90 78 5.8 那氟沙星 10 76.6 12.1 90 78.7 7.3
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表 3 17 种FQs化合物的养殖废水加标回收率(n = 6)及相对标准偏差
Table 3. Recovery rate (n = 6) and RSD of 17 fluoroquinolones antibiotics in aquaculture wastewater
化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 化合物 添加质量浓度/(ng·L−1) 平均回收率/% RSD/% 莫西沙星 20 85.7 18.6 恩诺沙星 20 66.4 11.3 二氟沙星 20 47.8 11.6 达氟沙星 20 70.8 12.3 奥比沙星 20 59.7 12.6 洛美沙星 20 62.8 10.2 沙拉沙星 20 50.1 14.6 培氟沙星 20 118.7 11.2 加替沙星 20 56.8 13.4 环丙沙星 20 82.7 8.9 氟罗沙星 20 75 8.4 依诺沙星 20 94.4 11.2 马波沙星 20 95.7 12 诺氟沙星 20 54.1 10 氧氟沙星 20 83.4 11 氟甲喹 20 104.8 3 那氟沙星 20 100.4 3.2
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