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城市化持续快速的推进,导致了不透水面积显著增加,从而引发城市水文的变化,严重的影响了水质和径流状况[1-2]。由于大量的污染物随着雨水径流排放到水体,城市雨水已成为城市河湖水质恶化的主要污染源[3]。水生生态系统中过量的氮输入将导致水体富营养化,最终会改变生态群落结构,降低生境质量,增加“藻华”事件的发生率和持续时间[4-5]。人工湿地(CWs)污水处理技术具有建造成本投入低、设施后期维护便捷、景观效果明显等优点,被广泛用于各类型污水的小型化和分散化处理。
国内外对CWs的研究已经很多,对CWs的除氮技术也在逐渐优化,单纯的处理工艺往往导致人工湿地的除氮效果不好,潮汐流(TF)和潜流(SF)CWs组合形成的好氧和厌氧环境[6-7],有利于氮进行硝化和反硝化反应,从而达到对氮的去除,可防止处理后的污水排入环境导致水体“富营养化”。CWs中的氮通过植物的吸收作用、基质的过滤和吸附、氨挥发、微生物的氨化、硝化反硝化和厌氧氨氧化等方式被去除[8]。研究表明,填料基质和植物作用所做的贡献仅占CWs脱N量的20%—30%[9]。ZHANG等[10]研究发现,微生物参与的硝化反硝化作用是CWs去除废水中TN的主要途径,可占66.9%—80.5%。DU等[11]研究发现,植物种植增加了微生物的丰富度和生物多样性;同时,相关的反硝化属假单胞菌、不动杆菌、根瘤菌、芽孢杆菌和红假单胞菌丰度的增加,增强了微生物对氮的去除作用。HE等[12]研究发现,γ–变形菌、α–变形菌和β–变形菌是人工湿地基质中的主要细菌,并在减少硝酸盐和亚硝酸盐的功能上发挥了重要作用。但是,现有的研究缺少潮汐流人工湿地污染物的去除途径和微生物群落相结合的分析,以及植物的种植对微生物群落以及微生物氮净化作用的影响分析。
本研究构建潮汐流和潜流人工湿地组合,采用工业废弃物—赤泥制成的颗粒作为基质,种植黄菖蒲作为净水植物,分析该潮汐流-潜流人工湿地组合对氮的去除效果以及微生物群落的变化,探讨水生植物和微生物群落对氮去除效果的影响,以期为人工湿地强化脱氮提供科学依据。
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实验基质所用赤泥取自山西省吕梁市华兴铝业有限公司,取回后自然风干。将其研磨成粉,过100目筛,保存于干燥处。赤泥颗粒的具体实验方法:将过100目筛的赤泥和水泥粉末按照3∶7的比例混合,再加入2.5%的起泡剂,加入去离子水充分搅拌后放入模具中,放室温条件下养护24 h。自然晾干后取出赤泥块放于温度22℃、相对湿度≥ 90%的数控水泥砼标准养护箱中,28 d后取出,将其切割成粒径为10—20 mm的颗粒。
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本实验中人工湿地模型工艺组合(TF–SF)由潮汐流湿地单元(TF)和潜流湿地单元(SF)组成(图1)。在装置运行上,TF采用间歇进水和瞬间排水,SF采用瞬间进水和缓慢排水,并且进水和排水同时进行,以保证基质始终处于淹没状态。用两台蠕动泵控制TF单元进水,进出水方式为下行流,PLC时控器负责定时调控装置的进出水;SF单元采用上行流方式进水,进水由自吸水泵控制。在TF单元,自上而下取样(10—70 cm),SF单元自下而上取样(0—40 cm)。TF-SF由两个亚克力圆柱体组成。圆柱体直径为30 cm,高度为100 cm,体积约为70 L。装置的填料高65 cm(底部为Ф25—50 mm砾石,厚度为25 cm;中部为Ф10—20 mm赤泥颗粒,厚度为30 cm;上部Ф2—5 mm砾石,厚度为10 cm),在潮汐流人工湿地单元和潜流人工湿地单元最上部砾石层种植黄菖蒲水生景观植物。为了植被的光合作用,在两个湿地单元上均设有30 W的节能灯作为补充光照,灯光由PLC时控器定时调控,光照时间为每天的6:30—18:30。
TF单元运行方式为:瞬时进水0.33 h—反应期4.82 h—瞬时排水0.05 h—闲置期5.80 h,每个周期12 h,每天2个周期,每个周期处理水量为10 L。SF单元运行方式为:瞬间进水和缓慢排水,且进水和排水同时进行,处理水量为10 L,水力停留时间为11.95 h。2019年7月启动反应器,实验室温度为18—25 ℃,实验用水为人工模拟污水,由葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾配制,同时投加无水氯化钙、硫酸镁、FeSO4·7H2O等补充微量元素,污水pH为4.81—6.42。其他主要水质指标见表1。反应器进行为期2个月的微生物挂膜,直到出水稳定后,开始正式实验。
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CODcr、TN、
NH+4 -N、NO−3 -N等指标的测定按照国家环境总局编著的《水和废水监测分析方法(第四版)》[13]进行。 -
种植植物前,测定用于实验的植物生物量,供后续计算使用。植物高度在实验运行的全过程中进行长期测量,以观察植物长势,实验结束后,对湿地植物进行收割,分为地上、地下两部分,测定植物生物量、根长[14]。在实验的开始和结束时测定植物的湿重W1(g),挑选代表性的植株样品在105 ℃下干燥10 min,以灭活植物中酶的活性,然后在70 ℃下干燥12 h,测定干重W2(g),将植物粉碎成粉末(过40目筛),混合均匀并密封保存,采用H2SO4-H2O2溶液消解,采用半微量凯氏法测定植物全氮[14]。
植物氮积累量(PA),单位为mg·株−1,计算公式如下:
式中,PA为植物氮积累量(mg·株−1),PB为植物不同器官生物量(g·株−1),PC为植物不同器官全氮含量(mg·g−1)。
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通过OMEGA Soil DNA试剂盒提取基质中微生物DNA。使用通用细菌引物16S rRNA的5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3′和5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′(V3—V4区)对提取的DNA进行PCR扩增。PCR扩增条件:98 ℃(3 min)初始变性,然后进行25个循环,98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,最后5 min延伸至72 ℃。将所有序列读数聚类到操作分类单位(OTU)(相似性阈值为97%)。高通量测序服务由上海美吉生物平台提供(上海,中国)。
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实验数据使用Microsoft Excel 2010统计分析,数据图使用Origin 2015软件进行绘制。
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TF–SF的进水TN含量为15.12—26.54 mg·L−1,平均TN含量为21.52 mg·L−1(图2);潮汐流人工湿地单元(TF)出水的TN去除率为53.96%—76.22%,平均去除率为68.88%;TF–SF的出水TN去除率为57.52%—81.29%,平均去除率为68.99%。TF–SF进水的
NH+4 -N含量为13.51—27.09 mg·L−1,平均含量为21.86 mg·L−1;TF出水的NH+4 -N去除率为74.80%—87.26%,平均去除率为81.79%;TF–SF出水的NH+4 -N去除率为55.59%—78.59%,平均去除率为70.12%。在TF–SF中,SF对NH+4 -N的去除没有起到促进作用,反而其出水的NH+4 -N含量高于其进水。NH+4 -N和TN表现出相似的去除趋势,这是因为NH+4 -N是进水中氮的主要来源,NH+4 -N经过硝化-反硝化作用去除,说明人工湿地有较强的反硝化作用。TF的运行方式可将氧气带入装置,进而提高氮的去除效果。随着运行时间的增加,TF–SF的
NH+4 -N去除率越来越低。这是由于SF的运行方式为快速进水和缓慢排水,一直处于充满水的状态,其氧含量过低,硝化强度相比TF较低,仅发生在SF的上部;且基质对NH+4 -N的吸附作用,致使一部分NH+4 -N留存在SF中。随着运行时间的增加,NH+4 -N残留量越来越高,从而使得SF出水NH+4 -N含量越来越高。基于以上现象,应在装置运行一段时间后,进行停床处理,排空TF–SF内的水,使得系统内留存的氨氮能够与空气接触,减小TF–SF内NH+4 -N的留存量。另需对装置进行改良,对SF进水补充适量碳源,提高污水的停留时间,为该单元发挥反硝化作用提高能量。NH+4 -N为进水主要氮源形态,NO−3 -N是在硝化反应过程中生成的(图3)。TF–SF进水NO−3 -N含量为0—1.04 mg·L−1,平均值为0.50 mg·L−1;TF出水NO−3 -N含量为0—0.26 mg·L−1,平均值为0.12 mg·L−1;TF–SF出水的NO−3 -N含量为0—0.23 mg·L−1,平均含量为0.09 mg·L−1。在TF–SF中,TF和SF出水的NO−3 -N含量均很小,均低于1.0 mg·L−1,有些甚至浓度为零,整体呈不规律的变化。在TF–SF中,TF在第2天出水的NO−3 -N浓度明显增加,而SF中又降低,说明TF中发生了硝化反应,SF中发生了反硝化作用。在TF–SF运行的第4—10天和第16天,TF和SF出水浓度都低于进水,说明TF内发生了反硝化作用。在TF中,出水NO−3 -N含量低于进水,说明TF中发生了同步硝化—反硝化[15]。TF在充满水的状态下,NH+4 -N主要通过填料或生物膜的吸附作用被消耗;微生物的硝化作用主要发生在TF处于空置的状态时,此时大气中的O2进入基质的孔隙间,与基质表面的生物膜发生接触,此时NH+4 -N转化成NO−3 -N。与SF相比,TF单元表现出更好的
NO−3 -N去除效果。其原因是,在TF中,首先发生了除氮的第一步—硝化反应,生成了NO−3 -N,其中消耗了大部分可用碳源;在水进入到SF中,虽SF为缺氧和厌氧环境,有利于反硝化作用的发生,但因其可利用碳源含量少,缺少反硝化作用所需的能量。反硝化细菌多为异养细菌,污水中有机碳源的含量制约着反硝化细菌的生长繁殖,从而影响了反硝化作用,有机碳浓度较低会使NO3−-N的去除效果表现较差[16]。微生物吸收、基质过滤以及植物根系截留为人工湿地系统中有机物的主要去除途径,在对有机物的去除中,植物的贡献较小,可溶性有机物通过在淹水过程中与基质表面的微生物膜接触反应被消耗分解,不溶性有机物通过基质截留后在排空阶段、系统充氧时被微生物降解[17]。TF–SF进水的COD含量为304.72—1315.83 mg·L−1,平均含量为739.31 mg·L−1;TF出水的COD去除率为29.01%—78.91%,平均去除率为60.07%;TF–SF出水的COD去除率为38.43%—95.80%,平均去除率为67.12%(图4),说明TF–SF对有机物具有较好的去除效果。在TF–SF中,TF和SF都对有机物较好的去除。TF独特的间歇进水和瞬时排水的潮汐运行模式下,基质上附着的有机物在TF空置时被硝化作用利用,减少了COD含量。TF–SF进水的COD浓度变化较大,这是由于本实验进水配置采用葡萄糖作为碳源,4 d配置1次,葡萄糖在室温下易挥发[18],使得进水COD含量变化较大。
TF–SF中第2天的COD去除率较低,是因为TF–SF进水的COD含量较低,进水中可利用的碳源较低。然而,第2天的
NH+4 -N和TN的去除率却没有表现的很差,这是因为TF–SF刚培养完微生物,系统内能量充足,硝化反应所需能量系统内可提供,从而在进水COD含量较小的情况下也表现出较高的除氮效果。在TF–SF运行的第6—10天,SF对COD的去除发挥了一定作用,说明SF利用进水中的碳源发生了反硝化作用,使得装置的除氮效果表现较好。随着运行时间的增加,SF逐渐对COD的去除不发挥作用,且SF中COD的含量高于TF,可能是由于基质对有机物的吸附作用,部分COD残留在SF中,致使SF出水的COD含量高于其进水。对此,应延长水体在装置内的停留时间,以提高其除氮效果,保证其长时间的稳定运行。实验期间,进水和出水的pH、溶解氧(DO)的平均值如表2所示。与进水DO相比,在TF–SF中,TF和SF的出水DO浓度都下降了6.74—7.48 mg·L−1。这是因为微生物去除COD和氨氧化过程中消耗了水体中的DO。在TF中,好氧微生物利用进水中的溶解氧以及从大气携带进入的O2发生硝化反应,使得DO浓度降低;SF中的DO含量更低,说明SF单元为缺氧和厌氧环境,进行反硝化作用,可弥补TF由于氧含量高导致反硝化作用不好的缺点,可提高氮的去除率。
在TF和SF中,硝化反应和反硝化反应的进行需要一定的碱性环境来维持系统内pH的缓冲性能。由于赤泥呈强碱性(pH=10—12),本实验设计时将进水配置呈弱酸性。在前期的培养实验中,基质的碱性被进水中和,装置内呈弱酸环境(表2)。因此,不适合的pH环境减弱了基质表面微生物的活性,导致对氮的去除效果降低。在今后的研究中,需注意进水的pH值。
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TF–SF的微生物多样性和丰富度见表3,采用Alpha多样性分析方法对TF–SF中细菌的多样性进行分析。在TF–SF中,TF和SF的微生物测序中样本文库覆盖率均大于0.99,说明测序结果能够代表湿地的真实情况[19]。TF–10(即TF中10 cm处理深度)、TF–30(即TF中30 cm处理深度)和SF–60(即SF中60 cm处理深度)的Ace指数分别为1587.47、1514.32、1550.49,Chao指数分别为1556.43、1499.46和1526.75,TF–10和SF–60的Ace指数和Chao指数均大于TF–30;TF–10、TF–30和SF–60的Shannon指数分别为5.54、5.23和5.59,Simpson指数分别为0.0110、0.0189和0.0109,TF–10和SF–60的Shannon指数均大于TF–30,且TF–30的Simpson指数最大,因为TF–10和SF–60这两个取样点都在植物根系周围,说明人工湿地中种植植物可拥有更高的微生物群落丰富度和多样性,进而提高了人工湿地对氮的去除作用。植物根系分泌氧气和有机物,可促进微生物富集生长,所以种植植物可以提高微生物群落多样性。
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TF–SF中微生物独有和共有的OTU数目。从图5可知,在TF–SF中,TF–10、TF–30和SF–60检测到的细菌OTU数目分别为1381、1279和1428,说明相比于SF,TF的运行方式会使装置内细菌的种类减少,一些不能适应TF内部厌氧—好氧环境交替出现的菌群会逐渐消亡,最终留存下来的菌群成为优势菌群。TF–SF中共有的OTU有981个,分别占TF–10、TF–30和SF–60检测到的OTU数目的71.04%、76.70%和68.70%,说明TF–SF中,TF–10和TF–30微生物群落不同,这是因为TF中植物根系周围具有富集微生物的作用;TF–10和SF–60微生物群落不同,是因为TF和SF不同的运行方式致使其氧环境不同。
TF–SF微生物门(Phylum)水平组成见图6(a)。可将微生物检测频率>1%的菌门作为主要的菌门[20]。共发现有9个菌门,分别为Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Bacteroidota(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Patescibacteria(髌骨细菌门)、Acidobacteriota(酸杆菌门)、Nitrospirota(硝化螺旋菌门)、Myxococcota(粘球菌门),这9种菌门在TF-SF中3个取样点的相对丰度比例之和为94.35%—96.27%。
本研究中的主要优势菌门为变形菌门,其在生物脱氮的过程中具有重要作用,这与ZHANG等[21]、LI等[22]的研究结果一致,说明人工湿地基质具有相似的优势菌门。MIAO等[23]研究表明,变形菌门和厚壁菌门对反硝化作用有重要作用,硝化螺旋菌门含有丰富的硝化功能的菌属。变形菌门在TF–10、TF–30和SF–60的相对丰度分别为28.04%、30.12%和21.90%,厚壁菌门的相对丰度分别为7.68%、9.01%和3.73%,硝化螺旋菌门的相对丰度分别为1.22%、0.79%和2.22%,变形菌门和厚壁菌门在3个取样点的相对丰度表现为TF–30 > TF–10 > SF–60,这种趋势与各取样点的氮去除率一致。TF–30处变形菌门的相对丰度高于TF–10,但TF–30硝化螺旋菌门的相对丰度却低于TF–10,这是因为植物的种植改善了微生物的多样性。
TF–SF微生物纲(Class)水平组成见图6(b)。将微生物检测频率>1%的菌纲作为主要的菌纲,共发现15个菌纲。变形菌门中的γ–变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α–变形菌纲 (Alphaproteobacteria) 在TF–SF中3个取样点的相对丰度占比分别为14.89%—22.81%、7.01%—7.94%。γ–变形菌纲和α–变形菌纲均属于革兰氏阴性菌,说明TF–SF中的基质富集了革兰氏阴性菌,促进了系统中污染物的生物降解。LI等[24-25]发现γ–变形菌在去除
NO−3 -N和NO−2 -N方面具有重要作用。γ–变形菌纲在3个取样点的相对丰度表现为TF–30 > TF–10 > SF–60,这种趋势与各取样点的氮去除率一致。 -
有关研究表明,不动杆菌属(Acinetobacter)、硫杆菌属 (Thiobacillus)和索氏菌属(Thauera)等具有反硝化作用,参与氮的转化[26-28]。硝化杆菌属(Nitrobacter)和硝化螺菌属(Nitrospira)具有硝化功能[29-30],亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)具有氨氧化功能[31]。另外,YAO等[32]研究表明,不动杆菌可通过异养来转化氮硝化和好氧反硝化。
TF–SF微生物属(Genus)水平组成见图6(c)。其中检测出相对丰度大于0.5%的菌属有71个,包括不动杆菌属、硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属,以及其他未知属。TF–SF中硝化作用硝化螺菌属丰度(0.79%—2.22%)高于具有氨氧化细菌的亚硝化单胞菌属(0.12%—0.52%)。某些硝化螺菌属能将
NH+4 -N完全氧化成NO−3 -N,这可能是TF–SF有较好氨氮去除效果的原因[33]。硝化螺菌属是常见的亚硝酸盐氧化菌[34],在TF–10、TF–30和SF–60中的丰度分别为1.22%、0.79%和2.22%,TF–10和SF–60中的硝化螺菌属丰度均高于TF–30,说明植物的种植有利于基质表面NO2−-N的氧化,从而提高了氨氮的去除效果。不动杆菌属是丰度最高的异养反硝化菌属,在TN去除过程中具有重要作用。不动杆菌属在TF–10、TF–30和SF–60中的丰度分别为1.15%、1.38%和0.07%,TF–30处不动杆菌的丰度最高,且此处的氮去除效果最好,说明不动杆菌丰度的增加是微生物氮去除率较高的原因。
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黄菖蒲(学名:Iris pseudacorus L.)为鸢尾科、鸢尾属植物,为多年生湿生或挺水宿根草本植物,植株高大,根茎短粗,绿色长剑形叶,5—6月开黄色花[35]。实验所用黄菖蒲产自山东临沂,购买回幼苗后对其进行种植培养,使其适应生长环境。培养一段时间后,将植物移植到模型中。在移植到潮汐流-潜流人工湿地系统前,测量植物生物量,并选取相同高度的植物,测量其植物生物量和全氮含量。
在实验期间,实验室温度为15—22 ℃,是黄菖蒲的适生环境,植物地上部分颜色鲜亮,整个实验期间没有枯黄和枯萎的现象,植物均保持着良好的生长状态(表4)。TF内黄菖蒲的长势表现最好,株高、重量和根长也在整个系统中表现最大。TF在进水和排水空置床体时,氧气会进入到装置内,提高了植物根系周边环境的氧浓度,有利于根部细胞的有氧呼吸,促进根部生长,在生长过程中吸收水中的营养物质,从而表现出良好的长势。相比TF,SF内黄菖蒲的长势较差,其原因是潜流的运行方式使得植物周围氧浓度低,不利于植物根部的生长,也说明黄菖蒲能够在人工湿地中成活且长势良好。
黄菖蒲水生景观植物地上部分和地下部分的氮积累量均随着植物的生长而累积。人工湿地水生植物的氮积累量是评价水生植物对氮去除效果的重要指标[36]。TF–SF中黄菖蒲植物的氮积累量见表5。TF–SF中生长的黄菖蒲植物,对TN的累积作用以植株地上部分为主,黄菖蒲植物地上部分TN累积量占整株的42.74%—84.26%。研究表明,植物的收割方式由其体内营养物质的分配特点决定[37]。本研究结果表明,人工湿地植物内的氮可通过收割植物地上部分的方式来将氮移出人工湿地。其中,TF中黄菖蒲的地上部分TN累积量占整株比例为84.26%,SF中黄菖蒲的地上部分TN累积量占整株比例为77.64%。TF中种植的黄菖蒲植物氮积累量在相同生长时间内远大于SF,这与潮汐流人工湿地独特的运行方式密不可分。TF中充足的氧环境保障了植物根部细胞的有氧呼吸,使得植株生长健壮且生长迅速,表现出较高的植物生物量,从而具有较高的植物氮吸收量。
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TF–SF的水力停留时间为11.95 h,运行周期为12 h时,对
NH+4 -N的去除大于TN,表明TF比SF对NH+4 -N具有更高的去除量。在TF–SF中,TF为好氧环境,SF为以厌氧和缺氧为主的环境,整个组合人工湿地为硝化—反硝化组合,使系统表现出较强的脱氮效果。TF–SF中微生物群落具有较高的丰富度和多样性,且黄菖蒲植物的种植可改善基质微生物的丰富度和多样性,并发现微生物丰富度和多样性的改善促进了微生物的除氮作用,使TF–SF表现出较好的脱氮效果。TF–SF中富集不动杆菌属、硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属等优势硝化和反硝化菌属,这些菌属是人工湿地中主要的脱氮菌属,它们的增加是微生物氮去除率较高的原因。黄菖蒲能够在人工湿地中成活且长势良好,能够在我国华北地区种植。植物生物量直接影响植物体内氮积累量,植物的除氮效果优劣可直接通过生物量得出结论。在今后的人工湿地建造过程中,多选择像黄菖蒲这样的具有高生物量的植物种类,有利于水体净化效果的提高。黄菖蒲植物表现出较高的去除率与其发达的根系、试验期间生长量大有关,根系的分泌物有利于微生物的生长,促进降解物质的分泌,从而对水体中的氮具有较高的去除率。
本研究采用TF和SF的组合形式,SF在除氮过程中未起到太大作用,是由于实验设置的水力停留时间太短,以及SF中的进水COD含量太低,不利于反硝化作用的进行。仍需继续研究来寻找TF、SF及多种组合方式的最优运行参数。在今后人工湿地的除氮实验中,应使进水的pH值控制在7.0—8.0,保证人工湿地系统的稳定除氮效果。
潮汐流-潜流人工湿地对城市污染水体中氮的去除
Research on the removal effect of tidal flow–subsurface flow constructed wetland on nitrogen in urban polluted water
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摘要: 为了探索人工湿地对城市污染水体的除氮效果,构建潮汐流(TF)与潜流(SF)人工湿地模拟组合(TF–SF),探讨水生植物和微生物群落对氮的去除效果的影响。结果表明,TF–SF对氨氮和总氮都有较好的处理效果,去除率分别为55.59%—78.59%和57.52%—81.29%。黄菖蒲地上部分氮积累量分别为195.05、111.18 mg·株−1,地下部分氮积累量分别为36.44、32.01 mg·株−1,黄菖蒲对污染水体中的氮去除发挥着重要作用。高通量测序分析表明,TF中黄菖蒲根部表现出较高的微生物丰富度、多样性,不动杆菌属、硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属是人工湿地中主要的脱氮菌属,是氮去除的主要驱动者。
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关键词:
- 潮汐流-潜流人工湿地 /
- 脱氮 /
- 黄菖蒲 /
- 微生物群落
Abstract: In order to explore the nitrogen removal effect of tidal flow-subsurface flow constructed wetlands on urban polluted water bodies, a simulation combination of tidal flow (TF) and subsurface flow (SF) constructed wetlands (TF–SF) was constructed and to explore the influence of aquatic plants and microbial communities on the removal of nitrogen. The results show that TF–SF has a good treatment effect on ammonia nitrogen and total nitrogen, and the removal rates are 55.59%—78.59% and 57.52%—81.29%, respectively. The nitrogen accumulation in the ground part of the acorus calamus was 195.05 mg·plant−1 and 111.18 mg·plant−1, respectively, and the nitrogen accumulation in the underground part was 36.44 mg·plant−1 and 32.01 mg·plant−1, respectively. The acorus calamus played an important role in the removal of nitrogen in polluted waters. High-throughput sequencing analysis showed that the roots of acorus calamus showed high microbial richness and diversity in TF. Acinetobacter, Nitrospirillum, and Nitrosomonas are the main denitrifying bacteria in constructed wetlands, and they are also the main driver of nitrogen removal. -
随着我国污水处理规模的迅速发展,污泥产量也逐年剧增。截至2015年底,我国脱水污泥年产量超过3×107 t,预计2020年污泥产量将再增加1倍[1-2]。因此,污泥的处置是我国目前面临的一大难题。污泥堆肥可以杀死有害细菌,增加和稳定其中的腐殖质,降低所含重金属的毒性效应[3-4]。因此,腐熟污泥农用是一种消纳污泥的有效途径[5-6]。我国颁布的土地改良泥质、农用泥质和园林绿化泥质标准规定了污泥使用量、污泥累计使用量、连续使用年限和施用频率的要求,但针对腐熟污泥在具体土壤类型上如何施用并没有相关要求[7]。石灰性土壤作为广泛分布在我国干旱和半干旱地区的土壤类型,其碱性特征使其容易和重金属形成难溶性氢氧化物等沉淀[8]。因此,该类土壤对重金属污染表现出“不敏感性”特征,该特征极易导致污泥过量施用而造成土壤质量的降低[9]。
土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的成分,污泥施用造成土壤pH,阳离子交换量,电导率和团聚体稳定性等理化性质发生变化[10-13],这些变化又对土壤微生物活性、微生物种类、数量、分布等多样性产生影响[14-17]。其中需要关注的根际土壤微生物多样性是表征外源物质引起土壤质量变化的敏感指标[18],该多样性的变化值得重视。
已有研究[19]表明,石灰性土壤中微生物学特征及其微生物群落结构对调节土壤养分供应有重要作用,污泥添加同样会对石灰性土壤微生物量以及碳、氮等微生物学性质产生影响[20],且上述影响除与土壤性质和作物系统有关外[20-21],不同污泥的施用量和施用时期长短也是影响土壤微生物性质及其多样性的重要因素[22-24]。目前,污泥施用对根际和非根际石灰性土壤中细菌多样性差异的研究还较少,尤其是过量施用污泥对土壤微生物特征变化的影响尚缺乏研究。因此,开展不同用量腐熟污泥对石灰性土壤细菌多样性特征影响研究,可为其在石灰性土壤中施用的生物学质量评价和合理施用策略提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验地点和材料
实验地点位于河南省洛阳市(北纬34°41′,东经112°27′),该地区属于干旱半干旱气候,年均气温和降雨量分别为15.6 ℃和460 mm,土壤类型属于典型石灰性土壤,其基本理化性质和重金属含量如表1和表2所示。供试作物为夏玉米(夏玉米品种为郑丹958),夏玉米在每年6月种植,10月收获。
表 1 土壤和腐熟污泥基本理化性质Table 1. Basic physic-chemical properties of soil and compost sludge供试材料 有机质/% 总氮/(g·kg−1) 总磷/(g·kg−1) 总钾/(g·kg−1) pH 碱解氮/(g·kg−1) 有效磷/(g·kg−1) 有效钾/(g·kg−1) 土壤 0.54±0.03 0.48±0.03 0.78±0.04 1.94±0.19 8.01±0.03 0.032±0.002 0.015±0.001 0.031±0.002 污泥 41.64±3.55 20.23±2.67 10.21±0.60 2.21±0.04 8.04±0.02 2.047±0.01 0.058±0.002 0.110±0.003 注:数据为平均数和标准差分析。 表 2 污泥和土壤中重金属的含量Table 2. Heavy metals content of soil and compost sludge供试材料 Pb Zn Cu Cr Cd As Hg 土壤 2.35±0.36 53.98±2.46 52.79±1.89 76.43±0.82 0.49±0.01 28.05±1.12 0.029±0.001 污泥 5.53±0.23 269.08±9.33 206.39±9.01 173.99±10.5 1.19±0.16 48.08±2.23 0.035±0.001 注:数据为平均数和标准差分析。 供试污泥取自洛阳市某污泥处理厂,该污泥配以秸秆等辅料,按照秸秆与污泥重量比1∶5均匀混合,通过好氧高温堆肥后制得腐熟污泥,其重金属含量与《农用污泥中污染物控制标准》(GB 4284-2018)所规定的值相比,除As符合B级污泥限值外,其余重金属符合A级污泥限值。
1.2 实验设计
根据污泥的施用量不同,实验设置5个处理,分别为0、3.75、7.5、37.5、75 t·hm−2等5个污泥施用量。其中,5个污泥施用量分别对应非根际土壤样品为A01,A03,A05,A07,A09;对应的根际土壤样品为A02,A04,A06,A08,A10。污泥的施用量参考我国污泥土地利用标准(GJ/T 309-2009)进行设计,每个小区面积30 m2,随机排列,并重复3次。实验从2015年10月开始,连续2 a种植冬小麦-夏玉米,并且在冬小麦季把污泥和180、90、90 kg·hm−2的N,P2O5,KO2肥作为底肥一次性施入土壤,采用人工撒施和多次翻耕的方式使污泥和土壤均匀混合。期间进行正常的灌溉和管理。2017年10月,夏玉米收获后,采集0~20 cm非根际土壤(没有作物生长的0~20 cm表层土壤)和根际土壤(根际土壤采用“抖根法”,先将玉米根系从土壤中挖出,抖掉与根系结合松散的土壤,收集与根际紧密结合在0~4 mm范围的土壤作为根际土壤)。采集的新鲜土样分成2份,其中一份放入50 mL灭菌的离心管后,于−80 ℃冰箱保存用于细菌多样性分析;另一份风干用于测定土壤其他参数。
1.3 总DNA提取建库测序
微生物多样性分析主要是在编码核糖体RNA的核酸序列保守区开展研究,其中细菌主要基于的是16S保守区。本研究采用细菌16S rDNA(V3+V4)扩增利用的引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),通过PCR扩增后形成测序文库,然后利用Illumina HiSeq 2500进行测序,上述测序结果覆盖了土壤样品中98%以上细菌的真实组成,而且OTUs丰度稀释曲线随着测序量增加趋向平坦,说明测序数量足够,能够反应出样品中物种组成特征。
1.4 数据处理分析
根据PE reads之间的Overlap关系,将Hiseq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列Tags,同时对Reads的质量和Merge的效果进行质控过滤。使用FLASHE. v1.27、Trimmomatic. v0.33和Uchime v4.2等软件进行质控过滤后,得到优化序列(Tags);将优化序列进行聚类,划分OTU,并根据OTU的序列组成得到其物种分类;通过Alpha多样性分析研究样品内部的物种多样性,统计样品在97%相似度水平下的Ace、Chao、Shannon及Simpson指数;根据距离矩阵获得相应距离下的样品PCA(主成分分析);利用16S功能基因和冗余分析(RDA)分别对样品功能基因丰度和细菌群落组成与土壤参数之间的相关关系进行分析。
1.5 污泥和土壤性质的测定
供试污泥和采集的土壤样品风干过筛后分析以下指标:全氮,全磷,全钾、有机质、pH、电导率。上述指标测定方法参考文献中的方法[25]。重金属测定:取0.500 g通过100目筛样品,置于聚氟坩埚中,加入10 mL HF,8 mL HNO3和3 mL HClO4后静置12 h,以除去有机质和硅酸,然后在加热板上加热,温度逐渐升高至200 ℃,稳定温度加热至白烟产生且坩埚中残存少量浅白色黏稠状物质为止。完全冷却后,加2%的HNO3 2~3 mL溶解残存物质,用25 mL容量瓶定容待用,空白和标准样品同时消化,样品中的Zn、Cu、Pb、Cr、Cd利用等离子发射光谱法(美国,PE optima5300DV)测定。As采用双道原子荧光光度计(北京,吉田AFS-9120)测定。每个样品重复3次,使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 污泥施用对石灰性土壤化学特征影响
石灰性土壤的主要理化性质受污泥施用的影响如表3所示。随着污泥用量的增加,根际和非根际土壤pH呈现降低趋势,但土壤中电导率、有机质、总氮和总磷有明显增加的趋势。与对照相比,当污泥施用量超过7.5 t·hm−2时,污泥施用对上述参数的影响会显著增加。污泥施用也增加了土壤中Pb、Zn、Cu、Cr、Cd、As等重金属的含量,当污泥施用量为75 t·hm−2时,土壤中Zn、Cu、Cd的含量与其他处理相比具有显著差异(P<0.05),而土壤中As在7.5,37.5,75 t·hm−2的污泥施肥量条件下并没有显示出显著差异(P>0.05)。和非根际土壤相比,根际土壤中有机质、电导率、As含量高于对应样品中的非根际土壤含量。
表 3 污泥施用对非根际和根际土壤各参数影响Table 3. Effects of sludge application on parameters of non-rhizosphere and rhizosphere soil参数 非根际土壤 根际土壤 A01 A03 A05 A07 A09 A02 A04 A06 A08 A10 pH 8.18±0.02a 8.16±0.01a 8.13±0.01a 8.08±0.01b 7.96±0.02c 7.96±0.02a 7.95±0.01a 7.92±0.01ab 7.86±0.01b 7.76±0.02c EC/(μS·cm−1) 69.67±1.12d 74.00±1.00cd 76.67±1.15c 82.48±2.19b 92.33±2.31a 120.33±10.79c 124.67±3.06c 156±13.23b 175.33±13.05b 208.673±12.06a 有机质/(g·kg−1) 5.57±0.37b 5.80±0.02b 6.33±0.20b 9.54±0.41a 10.40±0.54a 8.48±0.32b 8.55±1.01b 10.00±0.69b 12.38±0.59a 14.11±1.36a 总氮/(g·kg−1) 0.49±0.02c 0.52±0.02c 0.64±0.01b 0.66±0.02b 0.83±0.03a 0.36±0.02c 0.40±0.02c 0.52±0.01b 0.55±0.04b 0.72±0.03a 总磷/(g·kg−1) 0.77±0.03d 0.79±0.02cd 0.88±0.04bc 0.90±0.02b 1.02±0.06a 0.64±0.03c 0.66±0.02c 0.73±0.04bc 0.76±0.02b 0.88±0.05a Pb/(mg·kg−1) 5.21±0.17c 5.51±0.12bc 5.67±0.16ab 5.89±0.14ab 6.00±0.16a 4.39±0.22c 4.65±0.14c 4.78±0.20bc 5.10±0.076ab 5.25±0.07a Zn/(mg·kg−1) 53.86±3.35d 57.95±2.97d 68.60±1.85c 83.73±3.26b 96.30±4.57a 50.67±2.7d 55.58±5.53d 65.85±2.28c 80.16±1.44b 93.83±2.61a Cu/(mg·kg−1) 54.19±4.03c 59.31±2.31c 84.03±4.58b 89.20±1.73b 115.77±4.51a 49.05±2.39c 52.96±2.96c 78.35±4.05b 81.72±3.17b 105.24±6.91a Cr/(mg·kg−1) 81.28±2.23c 86.83±1.54bc 91.86±2.66ab 92.15±2.24ab 94.96±4.48a 74.59±2.13b 78.93±1.44b 85.74±2.22a 88.14±1.82a 90.70±2.29a Cd/(mg·kg−1) 0.41±0.01d 0.43±0.01d 0.49±0.02c 0.60±0.02b 0.74±0.03a 0.36±0.01d 0.39±0.01cd 0.45±0.02c 0.56±0.03b 0.69±0.04a As/(mg·kg−1) 28.76±1.22c 32.37±1.65b 35.70±0.75a 36.17±0.39a 38.22±1.31a 33.73±5.83b 34.68±4.95b 41.05±3.76ab 43.42±2.89ab 46.94±1.76a Hg/(mg·kg−1) — — — — — — — — — — 注:数据为平均数和标准差分析,每行根际和非根际样品中不同小写字母表示各处理平均值具有显著差异(P<0.05),“—”表示未检出。 2.2 污泥施用对石灰性土壤细菌OTU丰度的影响
把序列之间相似性高于97%的Tags进行聚类,获得OTU。图1显示了各污泥施用水平下根际和非根际石灰性土壤OTU丰度(图1中不同小写字母表示各样品平均值具有显著差异(P<0.05))。非根际土壤样品中细菌的OTU丰度大小依次为A09 < A01 < A03 < A05 < A07。由此可见,当污泥施用量为3.75~37.5 t·hm−2时,非根际土壤中细菌OTU丰度随污泥施用量增加而增加;当污泥用量为75 t·hm−2时,样品A09中OTU的丰度与A03,A05,A07相比显著降低,并且低于A01丰度。根际土壤中细菌OTU的丰度大小顺序与非根际土壤有所不同,其OTU丰度依次为A10 < A08 < A02 < A04 < A06。由此可见,当污泥施用量在37.5 t·hm−2时,根际土壤中OTU丰度便开始降低,而且A10样品和其他各样品之间的OTU丰度相比具有显著差异。这说明污泥施用对根际土壤细菌OTU丰度的影响更加敏感,而且当污泥用量超过一定范围内会显著降低根际-非根际土壤细菌的OTU丰度。
Venn图可以表示不同样品之间共有、特有的OTU数目,直观地表现出个样品之间OTU的重合情况(图2)。结合OTU所代表的物种,可以找出不同样品中的共有微生物。不同样品用不同颜色表示,交叠部分数字为2个样品之间共有的OTU个数。非根际土壤样品A01、A03、A05、A07、A09中总OTU数量为1 896个,共有的数量为993个,占总数52.37%,各样品中特有OTU数量分别为4、11、11、9、12个。这说明污泥施用于石灰性土壤中,改变了非根际土壤中细菌OTU丰度,但随着污泥用量的增加其对土壤中特有微生物的数量影响不大。根际土壤中共有的OTU数量为882,占总共OTU数量1 895比例为46.54%,因此,污泥施用对根际土壤OTU的影响大于非根际土壤。其中A02、A04、A06、A08、A10样品中特有OTU数量分别为8、10、4、13、34个,除A08样品外,随着污泥用量的增加,根际土壤中各处理特有OTU的数量呈增加趋势。污泥用量在75 t·hm−2时,A10和A09样品中特有微生物数量多于其他样品,且根际土壤比非根际土壤增加了183%。
2.3 污泥施用对石灰性土壤细菌Alpha多样性的影响
石灰性土壤施用不同量污泥后,对细菌多样性指数(Shannon、Simpson)和丰富度指数(Ace,Chao)的影响如表4所示。在污泥施用量为75 t·hm−2的条件下,根际和非根际土壤的Shannon指数与其他各处理相比有显著差异(P<0.05),其他各处理之间无显著差异(P>0.05)。当污泥用量为3.2~37.5 t·hm−2时,同一污泥施用水平下,根际土壤的Shannon指数与非根际土壤无显著差异(P>0.05)。非根际和根际土壤的Simpson指数在污泥施用量为37.5 t·hm−2时最低,在污泥施用量为75 t·hm−2时最高,该指数值分别为0.004 2和0.003 2,0.009 4和0.009 8,说明37.5 t·hm−2的污泥施用量有利于细菌多样性指数的增加,当污泥用量达到75 t·hm−2时会显著降低细菌多样性。不同污泥施用量的Ace,Chao指数在非根际和根际土壤变化趋势一致,都是污泥施用量为75 t·hm−2时最小,说明75 t·hm−2的污泥施用量不但降低了细菌多样性指数,而且降低细菌的丰富度指数。此外,根际样品A02和A04的Ace,Chao指数比对应的非根际土壤高,但非根际样品A05,A07,A09的Ace,Chao指数大于对应的根际土壤,说明随着污泥施用量的增加会对根际细菌丰富度指数产生不利影响。
表 4 污泥施用对石灰性土壤细菌多样性和丰度影响Table 4. Effects of sludge application on bacterial diversity and abundance in calcareous soil污泥施用量/(t·hm−2) Shannon Simpson Ace Chao 非根际 根际 非根际 根际 非根际 根际 非根际 根际 0 (6.36±0.07)a (6.41±0.12)a (0.004 3±0.000 1)c (0.004 5±0.000 1)c (1 166.06±15.89)c (1 670.20±15.53)b (1 645.37±17.32)c (1 700.84±21.52)b 3.5 (6.38±0.04)a (6.39±0.07)a (0.005 1±0.000 1)b (0.004 8±0.000 2)c (1 727.57±17.55)b (1 754.11±18.59)a (1 750.75±21.00)b (1 759.19±20.59)a 7.5 (6.36±0.12)a (6.37±0.10)a (0.005 1±0.000 1)b (0.005 7±0.000 2)b (1 789.14±17.93)a (1 721.38±17.62)ab (1 785.98+18.95)ab (1 743.80±10.00)ab 37.5 (6.42±0.09)a (6.51± 0.09)a (0.004 2±0.000 1)c (0.003 2±0.000 1)d (1 825.15±26.45)a (1 758.09±29.94)a (1 822.54±9.85)a (1 779.62±22.39)a 75 (6.15±0.04)b (5.98±0.03)b (0.009 4±0.000 1)a (0.009 8±0.000 1)a (1 657.49±13.80)c (1 599.57±21.53)c (1 657.17±17.23)c (1 637.26±14.00)c 注:数据为平均数和标准差分析,每列中不同小写字母表示各处理平均值的显著性差异 (P<0.05)。 2.4 污泥施用对石灰性土壤细菌群落结构影响
PCA主成分分析可将样品细菌多样性差异反映在二维坐标图上,主成分轴用来解释差异的综合信息,第1主成分轴解释最多的差异,第2主成分轴解释第2多的差异。污泥施用后对石灰性土壤中根际和非根际土壤细菌主成分分析表明,随着污泥施用量的增加,土壤中各处理细菌群落结构距离越远,说明对其群落组成造成的差异越大。对非根际土壤细菌群落结构而言,主成分1的贡献率为56.48%,主成分2的贡献率为24.08%,两者累计为80.56%(图3)。在第1主成分轴(PC1)上,污泥施用后非根际石灰性土壤上细菌群落结构差异较大,且随着污泥用量的增加土壤中细菌群落结构差异变大。在第2主成分轴(PC2)上,污泥用量较低的A01和A03样品细菌群落结构相近,随着污泥用量增加A05,A07,A09样品之间细菌群落结构相近。
根际土壤细菌群落结构多样性的主成分1占66.15%,主成分2占23.36%,二者累计贡献率为89.51%。在第1主成分轴上A02、A04、A06、A08之间的差异较小,但与A10之间的差异最大。在第2主成分轴上,A02与A04之间的差异最小,与A10之间的差异最大。当污泥施用量增加时,在主成分1对根际土壤细菌会产生较大的影响,在主成分2对非根际土壤产生较大影响。
2.5 污泥施用对石灰性土壤细菌相对丰度的影响
根际和非根际土壤细菌在门水平分类上排名前10丰度的物种如图4所示。非根际土壤中细菌门类群集中于变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)(相对丰度>5%)。土壤中变形菌门和酸杆菌门细菌是土壤微生物的重要成员,在土壤物质循环和生态环境构建过程其道非常重要作用。其中,各处理变形菌门的丰度都超过48%,因为变形菌门适合养分含量高的土壤环境,且与土壤有机质和全氮含量显著相关[26]。污泥施用增加了土壤中有机质和养分(表3),使得变形菌门的丰度增量范围为1.63%~4.05%。污泥施用量在3.75~37.5 t·hm−2时拟杆菌门丰度增加明显,但污泥施用降低了酸杆菌门丰度(降低幅度为31.58%~34.59%)和放线菌门的丰度。同时,当污泥施用量为75 t·hm−2时,放线菌门的丰度降低达51.75%,这将不利于放线菌抵御病原菌和防治病害作用的发挥[27]。与非根际土壤相比较,根际土壤细菌在门水平上排名前10的种类相同,但其丰度有所变化,根际土壤中细菌门类群集中于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)。当污泥用量增加时,变形菌门丰度增加不明显。与对照相比,当污泥用量为75 t·hm−2时,拟杆菌门有明显的增加,丰度增加达1.45倍;酸杆菌门和放线菌门丰度降低49.74%和80.57%。其中酸杆菌门的降低不但与土壤pH的降低有关,还与污泥施用导致土壤氮素增加也有密切关系[28]。由此可见,随着污泥用量的增加,对根际和非根际土壤细菌门的丰度变化会产生不同影响。
2.6 污泥施用对石灰性土壤细菌功能影响
由上述研究结果可知,污泥施用量达75 t·hm−2时对根际和非根际土壤中细菌多样性产生较大影响。因此,通过KEGG(代谢途径分析数据库)分析空白对照和污泥施用量为75 t·hm−2的处理可知,污泥过量施用可造成根际和非根际土壤微生物群落功能基因在代谢途径上的差异。KEGG功能分析表明(见图5),2个处理的前十大比例的代谢途径相同,但污泥施用为75 t·hm−2时,明显降低了A09样品中碳水化合物代谢、脂类代谢、氨基酸代谢以及膜运输代谢功能,说明过量的污泥施用已经抑制了土壤系统中C、N的循环过程,并显著增加了代谢途径有辅酶因子和维生素代谢、核苷酸代谢、翻译和信号传导功能,而这些功能的增加可能源于放线菌门数量减少所带来的环境胁迫响应。样品A10的碳水化合物代谢、脂类代谢、能量代谢、外源性物质的生物降解和代谢以及膜运输代谢显著降低,但辅酶因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、翻译功能显著增加。不施用污泥时,样品A02与A01相比只有异源生物降解代谢,翻译,膜运输,信号传导功能增加,其余功能降低。上述代谢差异为判断污泥添加对土壤功能质量影响提供了依据。
2.7 石灰性土壤性质RDA分析及与多样性指数相关性
污泥施用不但对土壤理化性质变化产生影响,而且会造成重金属积累。因此,为了明确上述不同参数对细菌群落组成影响大小,本研究选择土壤pH、电导率(EC)、有机质(OM)、总氮(TN)、总磷(TP)以及污泥添加对重金属影响较为显著的Cd,Zn,Cu,Pb作为环境变量,通过冗余分析(RDA)探查上述参数与纲分类水平下非根际土样品(组1)和根际样品(组2)细菌群落组成的相关性(图6)。第1排序轴解释了细菌群落变化的34.03%,第2排序轴解释了细菌群落变化的20.73%,2个排序轴累积贡献率达54.76%。从图中可以看出,土壤TN、Cd、Cu、TP与细菌群落的相关性大,其中TN、Cd、Cu和土壤Shannon和Simpson多样性指数达到显著相关(表5),EC、Pb、Zn与细菌群落的关系次之,而土壤中pH和OM对细菌群落组成影响较小。上述结果的原因在于,3.5~37.5 t·hm−2的污泥施用量并没有对土壤pH和OM造成显著影响,但已明显影响了土壤中TN、TP、Cd、Cu等含量。
表 5 土壤参数与微生物多样性指数之间的相关分析Table 5. Correlation coefficients between soil properties and microbial diversity index多样性指数 pH 有机质 总氮 总磷 EC Pb Zn Cu Cd Shannon 0.428 −0.457 −0.635* −0.550 −0.343 −0.277 −0.591 −0.630* −0.648* Simpson −0.470 0.469 0.642* 0.550 0.324 0.255 0.601 0.667* 0.654* Ace 0.268 −0.175 −0.081 −0.029 2 −0.265 0.198 −0.052 −0.061 7 −0.134 Chao 0.244 −0.164 −0.183 −0.142 −0.195 0.098 −0.124 −0.149 7 −0.223 注:*显著相关 (P<0.05)。 3. 讨论
微生物多样性是土壤质量的重要参数,而且土壤微生物对其环境改变极为敏感,其多样性变化与土壤退化有密切关系[29]。适量地投放污泥有利于土壤质量的维持,但过量或长期施用污泥会导致土壤质量的降低。ANDRES等[30]通过向土壤中施用污泥,初始阶段均可增加土壤微生物生物量,但1 a以后污泥对土壤微生物活性已消失。长达30 a在大豆、生菜、芥菜上施用污泥的研究表明,污泥长期施用对土壤微生物有负面影响[31]。本研究连续2 a施用75 t·hm−2污泥后,根际和非根际土壤中细菌OTU丰度、多样性Shannon指数和丰富度Ace,Chao指数均会显著降低。因此,针对不同土壤类型开展污泥施用后的微生物多样性变化研究,并根据研究结果采取“隔年间歇式”污泥施用模式,可做到既利用了污泥养分,又能保证土壤质量。
有研究表明,土壤细菌群落多样性的变化与土壤pH、有机质、氮、磷有关,其中pH的变化被认为是影响土壤微生物多样性的主要因素[32-33]。和对照相比,研究中污泥用量为37.5 t·hm−2时,pH才有显著差异(表2),但由于石灰性土壤上pH变幅较小,使得其不是影响细菌多样性变化的一个重要因素,本研究的RDA分析也印证了该结论。由于重金属对细菌的毒害作用,会显著降低其多样性[34]。较高含量的Cu,Pb,Zn重金属污泥,施入土壤会造成土壤中微生物种群由细菌向真菌转化[35]。富含Zn的污泥施用于沙壤土中会导致了所有微生物群落结构的变化(即细菌,真菌,古生菌,放线菌和根瘤菌),其中真菌群落受其影响最大[36]。本研究污泥的施用虽然增加了土壤中重金属积累,但由于我国污泥重金属含量有降低趋势[37],以及石灰性土壤对重金属的“不敏感性”等原因,使得除Cd,Cu外,其他重金属和与细菌群落的相关性并不大。
选择根际土壤进行微生物多样性研究,更能灵敏地反映出外源物质施用对土壤质量的影响[38]。石灰性土壤上通过对细菌OTU丰度和PCA主成分分析,也表明污泥施用对根际土壤细菌的影响更敏感。另外,上述结果只是污泥连续施用2 a后的结论。为了更加全面的准确了解污泥对该类施用对该类土壤微生物多样性的影响,选择多年根际土壤中细菌和真菌的变化研究,才能准确评价污泥农用对微生物多样性的影响,同时也为推荐污泥施用量提供依据。
4. 结论
1)污泥在石灰性土壤上施用会改变根际和非根际土壤中细菌丰富度和多样性指数,而且在2 a连续施用量为37.5 t·hm−2的条件下,不利于根际土壤中细菌多样性增加。当污泥施用量达到75 t·hm−2时,会显著降低根际和非根际土壤中细菌的多样性指数。因此,考虑到根际微生物对外源物质响应的灵敏性,此类土壤中连续2 a的污泥施用量宜控制在37.5 t·hm−2以下。
2)污泥施用造成土壤理化性质的变化是影响土壤细菌群落变化的一个主要因素,另外重金属种类对微生物群落组成的影响也存在差异。本研究在2 a连续施用污泥后,土壤中TN、Cd和Cu是影响细菌群落的主要参数。
3)污泥施用量超过75 t·hm−2时,将会抑制根际和非根际土壤中C、N的循环代谢功能,降低酸杆菌门和放线菌门丰度。这说明此污泥施用量下,土壤质量已经开始下降。
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表 1 实验水质
Table 1. Experimental water quality
项目水质参数Project water quality parameters 初始浓度范围/(mg · L−1)Initial concentration range CODcr 304.72—902.62 -NNH+4 13.51—27.09 TN 15.12—26.54 -NNO−3 0.00—1.04 表 2 潮汐流-潜流人工湿地的进出水参数
Table 2. Water inlet and outlet parameters of TF–SF
组别Group pH DO / (mg·L−1) 进水 Inflow 5.74 8.62 TF出水 TF effluent 5.61 1.88 TF–SF出水 TF–SF effluent 5.82 1.14 表 3 潮汐流-潜流人工湿地微生物多样性和丰富度
Table 3. Microbial diversity and richness in samples of TF–SF
组别Group 测序数量 Sequence number 丰富度指数 Richness index 多样性指数Diversity index 覆盖率Fraction of Coverage Sequences Sobs Ace Chao Shannon Simpson Coverage TFCW-10 45744 1381 1587.47 1556.43 5.54 0.0110 0.994 TFCW-30 41302 1279 1514.32 1499.46 5.23 0.0189 0.993 SFCW-60 49453 1428 1550.49 1526.75 5.59 0.0109 0.996 表 4 潮汐-潜流人工湿地黄菖蒲植物生长状况
Table 4. The growth status of yellow calamus in TF–SF
人工湿地Constructed wetland 地上部分Aboveground 地下部分Underground 株高/cm Plant height 鲜重/g Fresh weight 干重/gDry weight 根长/cm Root length 鲜重/g Fresh weight 干重/g Dry weight 种植前 36.3 8.53 0.92 14.5 5.22 2.15 潮汐流 128.2 56.48 8.08 23.8 19.40 3.00 潜流 74.2 32.03 5.11 20.1 16.06 2.51 表 5 潮汐流-潜流人工湿地黄菖蒲植物氮积累量
Table 5. Nitrogen accumulation of acorus calamus in TF–SF
人工湿地Constructed wetland 植物生物量/g Plant biomass 植物氮积累量/(mg·株−1)Plant nitrogen accumulation 地上部分Aboveground 地下部分Underground 总净重Total net weight 地上部分Aboveground 地下部分Underground 总净重Total net weight 种植前 0.92 2.15 3.07 18.17 24.34 42.51 潮汐流 8.08 3.00 11.08 195.05 36.44 231.49 潜流 5.11 2.51 7.62 111.18 32.01 143.20 -
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