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土霉素(oxytetracycline, OTC)属于四环素类抗生素。由于其抗菌谱广、价格低廉，OTC被广泛用于治疗人类和动物疾病。此外，OTC还可作为饲料添加剂用于促进动物生长发育。2013年，我国OTC的用量为1360 t，其中约86%的OTC被用于畜牧养殖业[1]。OTC在生物体内的代谢率较低，大部分以母体的形式随排泄物排出体外。调查表明，畜禽粪肥中普遍含有OTC[2-3]。在我国传统农业模式下，残留的OTC将通过粪污还田进入农田土壤。Zhang等[4]调查发现，长期施用粪肥的菜地土壤中OTC的平均含量为397.6 μg·kg−1。该值超过了兽药国际协调委员会(VICH)提出的土壤抗生素生态毒害效应触发值(100 μg·kg−1)，这对于土壤生态系统构成了潜在威胁。例如，OTC能杀死土壤中的部分微生物并干扰其在自然界物质循环中的作用；诱发产生OTC耐药细菌；沿食物链富集并毒害敏感性动植物等[5-7]。OTC造成的土壤环境污染及其生态毒害效应受到国际社会的广泛关注。
吸附是控制OTC在土壤-水界面转化的重要过程，它可以决定OTC的赋存形态，从而影响其在土壤中的迁移过程和生物有效性[8]。目前，关于OTC在土壤中吸附的研究已有大量报道[9-16]。这些研究表明，OTC主要通过疏水性分配、范德华力、离子交换、氢键、化学键、表面络合、孔道内扩散等吸附机制与土壤颗粒结合。OTC的吸附量与土壤理化性质密切相关，如粘土矿物含量高、有机质含量高、离子交换能力强的土壤对OTC的亲和力更强。此外，pH、离子强度、温度、共存离子和胶体等因素也会影响OTC在土壤中的吸附行为。上述研究成果为理解OTC在土壤中的环境行为提供了理论支撑。但是，现有的研究并没有考虑广泛存在于土壤中的微塑料对OTC吸附行为的影响。
微塑料是指“粒径小于5 mm的塑料类污染物”，它们广泛分布在海洋和陆地环境中[17-19]。其中，土壤是微塑料重要的长期储存库，每年排入土壤中的微塑料的量远大于海洋[20]。调查显示，在中国、澳大利亚、瑞士和智利的土壤中均可检测到微塑料，最高浓度为67.5 g·kg−1[21-24]。尽管目前关于国内农田土壤中微塑料污染调查的研究较少，但在采集的所有土壤样品中均可检测到微塑料，其最高丰度达到40000 N·kg−1[24-26]。这表明微塑料广泛存在于农田土壤中，且含量较高，是不应被忽视的一部分。
近期多项研究表明，微塑料可吸附水环境中的OTC。如张凯娜等[27]指出聚乙烯(PE)和聚苯乙烯(PS)微塑料可通过范德华力和微孔填充机制吸附OTC，且OTC的吸附量与盐度呈负相关；Zhang等[28]发现经过老化的PS对OTC的吸附量明显增强，主要吸附机制包括静电引力和氢键；此外，他们还指出腐殖酸能够促进PS对OTC的吸附。由于土壤颗粒与微塑料在理化性质上存在较大差异，二者对OTC的亲和力可能不同，当土壤受到微塑料污染时，其对OTC的吸附和固着能力可能受到较大影响。由此改变OTC的赋存形态及其迁移行为。
OTC在微塑料污染土壤中的吸附行为却未见报道，微塑料对于土壤吸附OTC的影响仍是未知的，这将限制人们准确评估土壤抗生素污染引发的毒性效应。鉴于此，本文选择土壤环境中常见的PE、PS和聚酰胺(PA)为典型微塑料[29-31]，以壤土为供试土壤；基于批实验初步研究3种微塑料对OTC在土壤中吸附行为的影响，并探究其影响机制，以期为后续深入研究微塑料污染土壤中抗生素的关键运移过程及机制奠定基础。
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OTC标准品(纯度≥98%)购自上海麦克林生化科技有限公司。甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)购自美国Tedia公司；实验用水为超纯水；无水氯化钙(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；聚丙烯离心管(15 mL)购自美国Corning公司；针头过滤器(0.22 μm)购自天津津腾实验设备有限公司。
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根据土壤质地，土壤一般分为砂质土、壤土和黏质土。其中，壤土的含沙量、粘土含量介于砂质土和黏质土之间。因此，本文选择土壤质地居中的壤土为供试土壤。在山东省烟台市某农田(121°25′34.12″E，37°35′9.56″N)通过对角线采样法采集表层土壤样品。将样品混匀后转移至实验室，冷冻干燥，用镊子挑出肉眼可辨的植物残体和沙砾；将剩余样品置于玛瑙研钵内研磨，过80目标准筛备用。供试土壤基本理化性质如表1所示。
本文选取广泛存在于土壤环境中的PE、PS和PA作为供试微塑料，3种微塑料样品均为白色粉末状，粒径<80目，购自上海阳励机电科技有限公司。利用60—300目的不锈钢标准土壤筛测量供试微塑料的粒径分布。利用扫描电镜(S-4800, 日本Hitachi公司)对微塑料表面形态进行表征。
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高效液相色谱仪(Primaide，日本Hitachi公司)、水浴恒温振荡器(SHZ-GW，常州朗越仪器制造有限公司)、冷冻干燥机(FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司)、分析天平(BSA224S，德国Sartorius集团)等。
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本文参照OECD(No. 106)标准开展批实验，分别研究OTC在土壤、微塑料及含有微塑料土壤中的吸附行为。土壤中微塑料的添加比例(10%，质量分数) 和投加方法(直接混合并充分搅匀)参照Hüffer等[32]的报道进行设置。
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称取(0.0500±0.0003) g土壤样品置于15 mL聚丙烯离心管中，或称取(0.0450±0.0003) g土壤样品和(0.0050±0.0002) g微塑料样品置于离心管中，用移液枪加入9.0 mL背景溶液(1.11 g·L−1 CaCl2)，然后加入1.0 mLOTC工作液(100 mg·L−1)。拧紧瓶盖后，将离心管置于水浴恒温振荡器中，于25℃条件下振荡，转速设置为210 r·min−1。分别在1.0、1.5、3.0、6.0、18、24、48、72 h进行取样，样品经0.22 μm滤膜过滤后，装入棕色进样瓶中保存，立即用高效液相色谱仪进行分析。每组实验设置3个平行。
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为研究OTC在土壤、微塑料、土壤和微塑料混合物上的等温吸附行为，分别称取(0.0500±0.0003) g土壤样品、(0.0500±0.0003) g微塑料样品、(0.0450±0.0003) g土壤样品和(0.0050±0.0002) g微塑料样品置于15 mL聚丙烯离心管中。将OTC的浓度梯度设置为1.0、5.0、10、15、20 mg·L−1，根据此浓度梯度，先用移液枪向离心管中加入适量背景溶液(1.11 g·L−1 CaCl2)，然后加入OTC工作液(100 mg·L−1)，使每个离心管中的溶液总体积为10 mL。拧紧瓶盖后，将离心管置于水浴恒温振荡器中，转速设置为210 r·min−1，于25℃条件下振荡。根据本文动力学吸附实验结果，OTC在土壤及微塑料和土壤混合物上的吸附时间设为24 h；根据文献报道[27-28]，将OTC在微塑料上的吸附时间设为48 h。样品经0.22 μm滤膜过滤后，装入棕色进样瓶中保存，立即用高效液相色谱仪进行分析。每组实验设置3个平行。分别设置只添加吸附剂(即土壤或微塑料或土壤与微塑料的混合物)或只添加OTC溶液的空白实验作为对照，以确定吸附剂中有无OTC析出以及实验过程中OTC的降解情况。
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溶液中的OTC利用高效液相色谱仪(Primaide, 日本Hitachi公司)进行检测。样品经WondaSil C18 Superb色谱柱(4.6 mm× 150 mm, 5.0 μm)进行分离。具体参数如下：流动相A为乙腈，流动相B体积分数为0.4%的乙酸溶液，二者的体积比为24:76；流速为1.0 mL·min−1；柱温设置为35℃，进样体积为20 μL；检测波长为355 nm。基于上述方法，OTC的保留时间为2.75 min，检出限为0.05 mg·L−1，标准曲线线性范围为0.2—20 mg·L−1 (R2>0.99)。
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为了降低不同组别移液过程中产生的误差，本文在实验过程中采用称重法进行校准，利用公式(1)计算OTC的吸附量。
式中，qe(mg·kg−1)为平衡时OTC的吸附量；C(mg·L−1)为OTC工作液的浓度；Ce(mg·L−1)为平衡时OTC的浓度；ρ1和ρ2(g·mL−1)分别为背景溶液和OTC工作液的密度；m(g)是吸附剂的质量；m0(g)是吸附剂和反应容器的质量和；m1(g)是加入背景溶液后反应容器的总质量(即m1=m0+m背景溶液)；m2(g)是加入OTC工作液后反应容器的总质量(即m2=m1+mOTC工作液)；Δ(mg·kg−1)为空白损失量。
为了揭示OTC在不同吸附剂上的吸附动力学行为，本文分别利用准一级动力学模型、准二级动力学模型和颗粒内扩散模型对吸附动力学实验数据进行拟合。3个模型的表达式如下：
式中，qt(mg·g−1)和qe(mg·g−1)分别为t时刻和平衡时OTC的吸附量；k1(h−1)和k2(g·(mg·h)−1)分别为准一级吸附速率常数和准二级吸附速率常数；ki(mg·(g·min0.5)−1)为颗粒内扩散速率常数；C为截距，用于表征液膜厚度。
分别利用Linear模型、Freundlich 模型、Temkin模型和D-R模型对等温吸附实验结果进行拟合。4种模型的表达式如下：
式中，qe(mg·g−1)和Ce(mg·L−1)分别为平衡时固相和液相中OTC的浓度；Kd(L·g−1)为分配系数；KF(L·g−1)为Freundlich分配系数；n为表征线性程度的参数；R(8.314 J·(mol·K−1) -1)为热力学常数；T(K)为反应温度；bT(kJ·mol−1)为Temkin常数；KT(L·g−1)为Temkin吸附常数；β(mol2·kJ−2)为吸附能常数。
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3种供试微塑料的粒径分布情况如图1所示。88.7%的PA的粒径介于160—250 μm范围内，84.1%的PS的粒径介于75—180 μm范围内，89.1%的PE的粒径介于75—160 μm范围内。总体而言，PE微塑料的粒径最小，其次是PS微塑料，PA微塑料的粒径相对较大。根据扫描电镜图（图2）可知，PA微塑料的表面粗糙，存在较多的孔隙结构；而PS和PE微塑料的表面相对光滑，孔隙结构较少。
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OTC在纯土壤及含10%微塑料土壤中的吸附动力学结果如图3所示。
OTC在纯土壤或含微塑料土壤上的吸附动力学过程可概括为3个阶段：(1)快速吸附阶段(0—6 h)，该阶段OTC在不同吸附剂上的吸附量约占其总吸附量的79%—86%；Sun等[33]指出，在实验起始阶段，OTC的浓度相对较高，由此产生了较强的驱动力，从而促进液相中的OTC分子向吸附剂表面移动；(2)缓慢吸附阶段(6—24 h)，随着吸附剂外表面活性吸附位点数量的减少及扩散阻力增加，OTC的吸附速率逐渐减缓[34-35]；(3)平衡阶段(24—72 h)，此时OTC在土壤或含微塑料土壤上的吸附量趋于平衡。总体上，向土壤中添加10%的微塑料并没有明显改变OTC的吸附趋势。
为进一步探讨微塑料对OTC吸附动力学行为的影响，利用准一级动力学模型和准二级动力学模型对OTC的吸附动力学结果进行了拟合，相关拟合参数如表2所示。根据相关系数(R2)可知，准一级动力学模型能够较好地拟合OTC在纯土壤上的吸附动力学过程，而OTC在含有微塑料土壤上的吸附动力学过程同时符合准一级动力学模型和准二级动力学模型，其中准二级动力学模型的拟合效果略优。但是，准一级动力学模型拟合得到的平衡吸附量(qe)更接近于实测值(qe,exp)。因此，本文根据准一级动力学模型的拟合结果进行讨论。相较于纯土壤，向土壤中加入微塑料后，土壤对OTC的吸附速率(k1)均略有增加(P>0.05)。同时，加入微塑料后，OTC的平衡吸附量(qe)较其在纯土壤中减少。
OTC在纯土壤或含微塑料土壤上的吸附过程可被拟合成三段曲线(图4)。第一阶段代表液膜扩散过程，在此阶段，OTC分子与吸附剂外表面的吸附位点结合[36]。当向土壤中加入微塑料后，土壤颗粒表面的液膜厚度(C)减小，OTC分子可更快到达吸附剂颗粒外表面。
因此，该阶段OTC在微塑料-土壤-水体系中的扩散速率参数(ki)比其在土壤-水体系中的大。第二阶段为颗粒表面的OTC进入颗粒内部孔道并进行扩散[35]。此阶段若吸附剂颗粒内部孔道越发达，则OTC分子扩散的阻力越小，即ki的值越大。如图4所示，OTC在含有PA微塑料土壤中的孔内扩散程度更大，其ki值明显(P<0.01)大于其它三组。如图2所示，PA微塑料表面粗糙，存在大量孔隙结构，而PE和PS微塑料表面较为光滑、完整。由第三段曲线拟合得到的扩散速率参数明显小于前两段，因为该阶段主要体现的是OTC到达吸附位点并发生吸附反应的过程[37]。在该阶段，加入微塑料后，OTC的扩散速率参数均减少。这可能是因为加入微塑料减少了土壤中的吸附位点，导致相同时间内OTC的吸附量减少，因此表征拟合曲线斜率的ki值减小。总体而言，OTC在土壤上的吸附速率受多个过程控制，而微塑料主要通过改变液膜厚度、颗粒内部孔道数量和吸附位点数量来影响土壤对OTC的吸附速率。
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OTC在土壤、含有微塑料土壤及微塑料中的吸附等温线如图5所示。本文分别利用Linear模型、Freundlich 模型、Temkin模型和D-R模型对实验数据进行拟合，相关拟合参数列于表3。对于OTC在土壤和含微塑料土壤中的吸附而言，3种非线性模型的拟合效果(R2=0.936—0.998)优于线性模型(R2=0.612—0.959)，且参数n的值介于0.581—0.667之间，说明OTC在土壤中的等温吸附呈非线性，这与文献报道的结果一致[38-39]。3种非线性模型中，Temkin模型的拟合效果最优，相关系数R2在0.993—0.998之间；其次为D-R模型和Freundlich模型。Temkin常数bT表征吸附能的变化，当bT>1时表示吸附为放热过程，当bT<1时表示吸附为吸热过程[40]。如表3所示，bT>1，根据该模型的假设，OTC在该土壤上的吸附为放热过程。另外，根据D-R模型的吸附能常数(β)可计算吸附平均自由能E(kJ·mol−1)(
E=1√2β )，当E的值介于0—8 kJ·mol−1时，表示物理吸附过程，当E的值介于8—16 kJ·mol−1时，表示化学吸附过程。根据表3中的β值计算得出，土壤和含微塑料土壤的E值为1.414—1.443 kJ·mol−1，表明OTC在土壤和含微塑料土壤中的吸附为物理吸附。相对而言，OTC在3种微塑料上的等温吸附更符合Freundlich模型，相关系数为0.738—0.981，表明该吸附过程趋于双分子层吸附且吸附位点分布不均[41]。
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通常，Kf值越大，表明吸附能力越强。如表3所示，含有微塑料土壤的Kf值小于纯土壤，表明加入微塑料后土壤对OTC的吸附能力减弱。此外，D-R模型的理论饱和吸附量(qm)的变化也印证了该结论，即加入微塑料后，qm的值减少(表3)。该结果与Hüffer等[32]的报道类似，他们发现PE微塑料能够降低土壤对阿特拉津和2,4-滴丁酸的吸附量。含有微塑料的土壤对抗生素、农药等有毒污染物的吸附能力下降意味着这些污染物的游离态比重将提高，这可能会增强这些有毒污染物的生物可利用性；同时，含微塑料的土壤对污染物的吸附能力降低为污染物向深层土壤迁移创造了条件，并可能增加其淋溶风险[32]。
如表3所示，含有PE和PS微塑料的土壤对OTC的吸附能力明显减弱，二者的Kf值相近，但明显小于纯土壤的Kf值(P<0.05)；而含有PA微塑料的土壤对OTC的吸附能力与纯土壤较为接近，表明向土壤中加入质量分数10%的PA不会明显改变土壤对OTC的吸附能力。由此可见，当向土壤中加入等量不同类型的微塑料后，其对OTC吸附量的抑制程度是不同的。这可能是因为不同类型的微塑料对OTC的吸附量不同。为了验证该结论，分别研究了OTC在3种微塑料上的等温吸附行为。如图5b所示，PE和PS对OTC的吸附量相近，但明显小于PA对OTC的吸附量。此外，Freundlich模型拟合结果显示，PA微塑料吸附OTC的能力(Kf =0.152 L·g−1)明显高于PE(Kf =0.103 L·g−1)和PS (Kf =0.110 L·g−1)，这与我们之前的研究结果一致，即PA对四环素的亲和力要强于PE和PS[42]。此结果归因于1) PA微塑料粗糙多孔的表面结构有利于OTC吸附；2) PA表面的酰胺基团可以与OTC的羧基形成氢键，从而增加OTC的吸附量。因此，PE和PS微塑料对OTC的亲和力较PA弱，导致PE和PS微塑料对土壤吸附OTC的抑制强于PA微塑料。
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现有研究[32, 43]指出，PE微塑料对阿特拉津、2,4-滴丁酸和镉的吸附量弱于土壤，向土壤中加入PE微塑料引发了稀释效应，即减少了土壤中的吸附位点，从而导致含有微塑料的土壤对这些污染物的吸附量降低。本文认为，这也是导致含有微塑料土壤对OTC吸附量降低的原因之一。对比可知，土壤对OTC的吸附能力(Kf =1.297 L·g−1)明显(P<0.01)强于3种微塑料(Kf =0.103—0.152 L·g−1)(表3)，表明加入微塑料在一定程度上减少了整体的吸附位点，从而导致OTC的吸附量减少。
OTC属于可解离化合物，即在不同pH下，其离子形态不同。因此，反应体系pH对OTC的吸附具有重要影响。为了探究微塑料是否会通过改变反应体系pH值而影响OTC的吸附量，本文分别测试了土壤-OTC溶液体系和土壤-微塑料-OTC溶液体系的pH值。如图6所示，加入质量分数10%的不同类型微塑料均导致反应体系的pH值增大。由于本文选用的供试土壤偏酸性，当加入微塑料后，土壤比重减少，导致整体的缓冲能力降低，因此土壤-微塑料-OTC溶液体系的pH值上升。另外，微塑料表面容易发生质子化[44]，这也会使溶液的pH增大。PA微塑料对体系的pH值影响最大，这可能与其特有的酰胺基结合氢离子有关。根据不同pH下OTC的形态分布特征[45]，在pH=5.0—7.0范围内，OTC主要呈现零价和负一价；且随着pH增加，零价态比例减少，负一价态比例增加。本实验中，反应体系的pH (5.55—6.53)大于供试土壤的电荷零点pHPZC(5.28)，因此供试土壤颗粒表面带负电荷。随着负一价OTC比例的增加，OTC分子与土壤颗粒间的静电斥力增强，不利于OTC的吸附。由此可知，3种微塑料可通过改变反应体系的pH值，间接影响OTC的吸附行为。
此外，微塑料也可能通过竞争吸附的方式减弱土壤对OTC的吸附能力。研究表明，微孔截留是微塑料颗粒滞留在多孔介质中的主要机制之一[46]，即微塑料可以进入土壤颗粒内部微孔。该过程将侵占OTC的扩散通道，从而导致OTC的吸附量下降。Luo等[47]研究发现，PS微球可通过静电引力和疏水性作用与土壤颗粒结合，这与OTC在土壤中吸附的机制相似。因此，微塑料也可能通过争夺土壤颗粒上的吸附位点来抑制OTC的吸附。
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本文通过批实验研究了PE、PS、PA 的3种微塑料对OTC在土壤中吸附行为的影响，主要得到以下结论：
(1)微塑料可通过改变液膜厚度、颗粒内部孔道数量和吸附位点数量等条件影响土壤对OTC的吸附动力学行为。但是，向土壤中添加质量分数10%的微塑料并不会显著(P>0.05)改变其对OTC的吸附速率。
(2)等温吸附实验结果表明，向土壤中添加质量分数10%的微塑料可导致其对OTC的吸附能力下降，但不同类型微塑料对土壤吸附OTC的抑制程度不同，这是因为不同微塑料对OTC的亲和力有所差异。
(3)微塑料影响土壤对OTC吸附的机制主要包括减少吸附位点(即稀释作用)和改变反应体系pH等。
未来，在揭示微塑料对土壤吸附污染物的影响方面仍需要开展大量研究，尤其需重点关注微塑料的含量、属性(如粒径、表面结构、老化程度等)、土壤理化性质及环境因素的影响，并探究关键影响机制。
微塑料对土壤吸附土霉素的影响初探
Influence of microplastics on sorption behaviors of oxytetracycline onto soils: A preliminary study
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摘要: 为揭示微塑料对土壤吸附抗生素的影响，以聚酰胺(PA)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)等3种微塑料和土霉素(OTC)为研究对象，通过批实验研究了OTC在土壤、添加微塑料的土壤及微塑料中的吸附行为。结果表明，微塑料可通过改变液膜厚度、内部孔道数量和吸附位点数量影响土壤对OTC的吸附动力学行为。Temkin模型能够较好地拟合OTC在土壤和含微塑料土壤上的吸附等温线，而OTC在微塑料上的等温吸附更符合Freundlich模型。向土壤中添加微塑料(质量分数10%)可抑制土壤对OTC的吸附，但不同类型微塑料对土壤吸附OTC的抑制程度不同，含有PE或PS的土壤对OTC的吸附量显著降低(P<0.05)，而添加等量PA的土壤对OTC的吸附量未明显减少(P>0.05)，这可能与3种微塑料对OTC的亲和力不同有关。3种微塑料对OTC的吸附能力(Kf=0.103—0.152 L·g−1)显著(P<0.01)弱于土壤(Kf=1.297 L·g−1)，因此向土壤中添加微塑料将减少吸附位点，从而导致OTC的吸附量减少；微塑料能改变反应体系的pH值，由此干扰OTC的形态分布，并间接影响OTC的吸附行为；此外，微塑料还可能通过侵占土壤颗粒内部孔道和竞争吸附位点的方式影响土壤对OTC的吸附。Abstract: In order to reveal the effects of microplastics on sorption behaviors of antibiotics onto soils, polyamide (PA), polyethylene (PE), polystyrene (PS), and oxytetracycline (OTC) were selected as the target, and batch experiments were conducted to investigate sorption of OTC onto the soil, soil containing 10% (mass fraction) of microplastics, and microplastics. Results show that microplastics could influence the sorption rate of OTC by altering the thickness of liquid film, the number of internal channels, and the number of sorption sites. The sorption isotherms of OTC onto the single soil and mixtures of soil and microplastics were in accordance with the Temkin model, while Freundlich model could fit the sorption isotherms of OTC onto microplastics well. Adding microplastics into the soil inhibited sorption of OTC. However, various types of microplastics have different inhibitory effects on OTC sorption. That is, the sorption capacity of soil containing PE or PS microplastics reduced significantly (P<0.05), while the soil containing the same amount of PA microplastics had similar sorption amount of OTC with the soil. This may be related to the different affinity of the three types of microplastics to OTC. Sorption amounts of OTC onto the three types of microplastics (Kf =0.103—0.152 L·g−1) were significantly (P<0.01) smaller than that onto the soil (Kf =1.297 L·g−1). Therefore, adding microplastics to the soil will reduce the overall sorption sites, which in turn will decrease the sorption capacity of the soil containing microplastics to OTC. Microplastics can alter the pH of the reaction system, which will affect speciation of OTC, thereby sorption of OTC is influenced. Further, the influencing mechanisms of microplastics on OTC sorption may also include competing sorption sites and occupying internal pores of soil particles.
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Key words:
- microplastics /
- oxytetracycline /
- soil /
- sorption /
- batch experiments
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羟基化多溴联苯醚（OH-PBDEs）是一类与母体多溴联苯醚（PBDEs）结构类似的化合物，由于其具有较强的内分泌干扰效应，因而受到了广泛的关注[1-3]. 研究表明，OH-PBDEs能够通过酶或者金属氧化物介导的氧化耦合反应发生转化[4-7]. 其中，由于酶介导氧化耦合反应能够生成土壤有机质等，因此在自然腐殖化过程中扮演者重要的角色[6, 8]. 在众多氧化酶中，漆酶是一组结合了多个铜原子的内源性多酚氧化酶，由多种真菌以及高等植物以胞外分泌物的形式产出，广泛存在于自然界中，因此漆酶介导的氧化耦合反应过程对有机污染物在环境中的迁移、转化过程起着重要的作用[6, 9].
漆酶作为氧化还原酶，可以直接氧化酚类污染物. 但是由于自身氧化还原电位较低（通常在0.5—0.8 V），导致其对于氧化还原电位高的物质氧化效果不够理想[10]. 例如，仅仅依靠反应体系中单一的漆酶无法完成木质素、多环芳烃等大分子的转化过程[11]. 研究发现一些小分子化合物可以充当介体，使得漆酶在介体的辅助作用下，通过介导电子的转移过程，生成具有较高氧化还原电位的活性物种，进而实现对其他非酚类物质的高效催化氧化[11-12]. 目前，常用的介体主要是人工合成介体，如2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HBT）、紫尿酸（VIO）、N-羟基-N-乙酰基-苯胺（NHA）等，其中ABTS是目前应用最广泛的介体[13-14]. 而漆酶与这些介体构成的系统成为漆酶-介体系统（laccase-mediator-system, LMS ），能够实现高效、快速的降解高氧化还原电位或不能进入漆酶活性中心的底物分子[11].
尽管对漆酶催化转化酚类化合物的动力学过程已经有了较好认识，但是这些认识主要集中在单一酶催化体系[9, 15]. 例如，已有研究报道了四溴双酚A、三氯生、对氨基苯酚、雌激素等微污染物在单一漆酶作用体系下的转化动力学过程[9, 15-17]. 然而，在实际环境中，无论是人工合成的介体还是天然的介体都将与漆酶形成LMS[11]. 此外，其他共存物质，如天然有机质，也将不可避免参与这些污染物的转化过程[18-19]. 因此，探究污染物在LMS中的动力学过程对认识其在真实自然环境下的转化过程十分重要. 然而，目前关于这一方面的仍然较为缺乏.
本研究选取3-OH-BDE-7为典型的OH-PBDEs，系统探究了3-OH-BDE-7在基于ABTS的LMS中的转化动力学过程，考察了ABTS投加量、漆酶投加量、pH值和温度对LMS介导3-OH-BDE-7转化过程的影响. 此外，还探究了天然有机质（natural organic matter, NOM）对LMS介导3-OH-BDE-7转化动力学过程的影响，并揭示了NOM抑制LMS转化3-OH-BDE-7的内在机制. 研究结果不仅对认识羟基化多溴联苯醚在自然环境中的转化过程具有重要意义，而且为合理设计基于LMS的废水处理工艺具有重要参考价值.
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 材料与试剂
漆酶（Laccase，分离自Trametes versicolor）、2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，纯度＞98%）、3-OH-BDE-7（纯度＞97%）购自美国Sigma-Aldrich公司. Suwannee天然有机质（natural organic matter，NOM购自国际腐殖质协会（IHSS）. 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自南京化学试剂有限公司. 有机试剂（甲醇、乙酸）均为色谱纯，购自Tedia公司. 其他实验室常用试剂为分析纯. 实验所用水均来自Milli-Q纯化系统的去离子水（18.25 MΩ·cm）.
1.2 漆酶活性的测定
漆酶的酶活性通过ABTS法测定[9]. 其中1个漆酶酶活性单位（U）定义为每分钟催化氧化1 μmol ABTS所需要的漆酶酶量. 具体测定反应体系如下：2.8 mL醋酸钠缓冲溶液（10 mmol·L−1，pH = 5.0）. 1 mL ABTS （20 mmol·L−1）溶液，以及0.1 mL稀释的漆酶储备溶液，反应启动后，通过紫外分光光度计（Cary 100，Varian，USA）监测溶液在420 nm的吸光度在3 min内随时间的变化，重复3次，取其斜率k的平均值。酶活性通过公式（1）计算可得[20].
漆酶酶活性(U⋅mL−1)=k(cm−1⋅min−1)×30/36((mmol⋅L−1)−1⋅min−1) (1) 1.3 LMS系统对3-OH-BDE-7的降解实验
LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的反应在8 mL玻璃反应管中进行. 反应体系设置如下：反应体系总体积为2.0 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2.0 μmol·L−1，初始漆酶活性设置为0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U·mL−1，ABTS的浓度分别设定为0、1.0、1.5、2.0、4.0 μmol·L−1. 反应溶液为10 mmol·L−1的磷酸钠缓冲溶液（pH=6.0）. 反应管置于恒温振荡培养箱中（转速为150 r·min−1），在不同的反应时间点（0、1、5、10、20、30、60 min）下将反应管从培养箱中取出，并向其中加入2 mL的甲醇终止反应. 取1 mL的反应液置于离心机进行离心，离心条件设置为：转速20000 r·min−1，离心时间10 min. 离心后，取上清液置于棕色液相小瓶中，用高效液相色谱分析测定上清液中剩余的3-OH-BDE-7浓度. 每个实验样品至少设置3个重复.
为探究溶液pH值和温度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响，使用同样的反应装置进行实验. 实验条件设置为：反应体系总体积为2 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2.0 μmol·L−1，初始漆酶活性为0.1 U·mL−1，ABTS的浓度为2.0 μmol·L−1. 溶液pH设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0. 反应温度控制在25 ℃，反应时间为60 min. 对于温度的影响，实验条件设置为：反应体系总体积为2 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2 μmol·L−1，初始漆酶活性为0.1 U·mL−1，ABTS的浓度为2.0 μmol·L−1，溶液pH控制在6.0，反应温度控制在4、10、25、35、45、55、65 ℃，反应时间为60 min. 反应结束后，按照以上步骤取样，并用高效液相色谱分析测定测定溶液中剩余的3-OH-BDE-7浓度. 每个实验样品至少设置3个重复.
为探究NOM对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响，使用同样的反应装置进行实验. 实验条件设置为：反应体系总体积为2 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2.0 μmol·L−1，初始漆酶活性为0.1 U·mL−1，ABTS的浓度为2.0 μmol·L−1，NOM的浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·L−1，溶液pH设置为6.0，温度控制在25 ℃. 在不同的反应时间点（0、1、5、10、20、30、60 min）下将反应管从培养箱中取出，按照以上步骤取样，并用高效液相色谱分析测定溶液中剩余3-OH-BDE-7的浓度. 每个实验样品至少设置3个重复.
1.4 分析方法
安捷伦高效液相色谱仪（HPLC，Agilent 1200）用以分离及定量检测溶液中3-OH-BDE-7的浓度. 具体分析测定条件如下：流动相为甲醇-水（85∶15，V∶V），流速设定为1 mL·min−1；Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4 mm, 5 μm） （安捷伦，美国）；检测器为可变波长扫描紫外检测器（VWD），检测波长为230 nm，进样量设置为20 μL，柱温为25 ℃. 降解产物的液相色谱-质谱联用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC/MS）分析条件：采用 Thermo LCQ 质谱检测器（Quest LCQ Duo, USA），通过XDB C18色谱柱（150 mm×4.6 mm, 5 µm）进行分离. 流动相组成为甲醇和水（85∶15，V∶V），流速设置为0.2 mL·min−1，进样量为10 µL. ESI源参数设置为：毛细管和锥管电压分别设置为4.5 kV和25 V，去溶剂和离子源温度设置为300 ℃ 和 120 ℃. N2作为雾化气和辅助气，流速分别为350 L·h−1和50 L·h−1.
2. 结果与讨论 （Results and discussion）
2.1 ABTS促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7
首先探究3-OH-BDE-7在只有漆酶存在下的降解过程，结果如图1A所示. 从图1可以看出，漆酶能够转化3-OH-BDE-7，且随着漆酶投加量的增加，3-OH-BDE-7的去除率也不断增加. 但是，即使当漆酶浓度增加到0.5 U·mL−1时，去除率依然只有~40%。此外，当漆酶含量从0.4 U·mL−1增加到0.5 U·mL−1时，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率只增加了2%左右. 这可能是由于漆酶自身氧化还原电位较低（通常在0.5—0.8V），导致其对于3-OH-BDE-7氧化效果较差[10]. 3-OH-BDE-7在介体ABTS存在下的降解动力学如图1A所示，在只有漆酶（0.1 U·mL−1）的反应体系中，反应60 min后，只有8.5%的 3-OH-BDE-7被去除. 而加入介体ABTS （2 μmol·L−1）后，3-OH-BDE-7的去除速率显著提高. 例如，反应30 min后，62.5%的3-OH-BDE-7被去除，而反应60 min后，3-OH-BDE-7去除率高达84.7%. 值得注意的是，在只含有介体ABTS的条件下，3-OH-BDE-7几乎不会被去除. 以上研究结果表明介体ABTS能够显著促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7.
图 1 （A）3-OH-BDE-7在不同浓度漆酶（无ABTS)下的去除率；（B）3-OH-BDE-7在不同反应条件下（只有ABTS、只有漆酶和漆酶+ABTS)的去除率；（C）漆酶在有无ABTS介体条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线实验条件：[Laccase]0=0.1 U·mL−1、[ABTS]=2.0 μmol·L−1Figure 1. （A）The removal of 3-OH-BDE-7 mediated by Laccase with different dosage； （B）3-OH-BDE-7 removal efficiencies at various reaction conditions （only ABTS, only Laccase and Laccase-ABTS)； （C）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal mediated by Laccase with and without the presence of ABTS Experimental condition: [Laccase]0=0.1 U·mL−1, [ABTS]=2.0 μmol·L−1此外，从图1A发现，随着反应的进行，溶液中的3-OH-BDE-7的浓度持续降低. 根据公式（2），以ln（C0/Ct）对反应时间作图，如图1B所示. 结果发现，无论是否存在ABTS，都呈线性关系，这说明3-OH-BDE-7的去除过程符合假一级反应动力学规律，之前的研究也发现了类似的酶催化反应的特征[9].
lnC0Ct=kobst (2) 式中，kobs为表观一级反应动力学常数，C0为底物起始浓度，Ct为反应t时刻后溶液中剩余的底物浓度，t为反应时间. 通过计算可知，只有漆酶存在的条件下，假一级动力学常数为0.0016 min−1；加入ABTS后，假一级动力学常数为0.0318 min−1. 因此，加入ABTS的漆酶体系催化氧化3-OH-BDE-7的速率约是单纯漆酶体系下的20倍.
ABTS促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7的作用机理如图2所示. 在只有漆酶的反应体系下，漆酶与氧气反应后形成氧化态漆酶，然后氧化态漆酶再对底物进行氧化. 而在介体存在情况下，介体首先被漆酶氧化形成活性高且具有一定稳定性的氧化态介体，氧化态介体再作为氧化剂去氧化底物. 因此，在本研究中，漆酶-ABTS介体系统催化氧化3-OH-BDE-7的机制为：ABTS优先于3-OH-BDE-7迅速与漆酶发生反应，产生ABTS+和ABTS++，然后ABTS+和ABTS++再高效催化氧化3-OH-BDE-7，与此同时自身被还原为ABTS[14].
图 2 漆酶直接（A）和间接（B）催化氧化反应示意图Figure 2. Schematic diagram of direct and indirect catalytic oxidation reaction by laccase2.2 ABTS浓度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
为进一步明确ABTS在反应体系中的作用，本文探究了不同浓度ABTS对漆酶催化氧化3OH-BDE-7的影响. 如图3A所示，随着ABTS投加量的增加，3-OH-BDE-7的去除率不断增加. 例如，当ABTS投加量为1 μmol·L−1时，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率为46%；而当ABTS投加量增加到4 μmol·L−1时，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率为高达97%. 尽管研究结果已经证明了ABTS能够显著促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7，但是仍然有必要定量评估3-OH-BDE-7在漆酶-ATBS介体系统下的去除动力学过程. 从图3B可以看出，3-OH-BDE-7的去除过程在不同ABTS投加量的条件下依然符合假一级动力学规律. 通常情况下，根据假一级动力学规律，在酶浓度一定的情况下，3-OH-BDE-7的反应速率仅和其自身浓度相关，而与溶液中的酶浓度无关，这符合酶作为催化剂的规律，同时也证明了酶活性在反应过程中保持稳定[15]. 但是在漆酶-介体系统下，3-OH-BDE-7的降解过程依然符合这一规律，这说明ABTS的加入并不改变酶催化氧化3-OH-BDE-7的特征规律. 此外，本文进一步分析了kobs与ABTS浓度之间的相关关系，结果如图2C所示. 在漆酶浓度固定的条件下，kobs与ABTS浓度之间具有较好的正相关关系. 考虑到漆酶-ABTS介体系统介导3-OH-BDE-7氧化的速率远远高于漆酶单独氧化3-OH-BDE-7的速率（图1）， 因此推测在ABTS存在下，漆酶-ABTS组成了新的催化活性中心，即ABTS将优先与漆酶发生反应产生ABTS+和ABTS++，然后ABTS+和ABTS++再介导3-OH-BDE-7的转化过程.
图 3 （A）ABTS投加浓度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响。（B）LMS在不同ABTS投加量条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线。（C）假一级动力学常数与ABTS投加量之间的关系Figure 3. （A）Influence of ABTS dosage on the removal of 3-OH-BDE-7. （B）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal at different ABTS dosages. （C）Relationship between pseudo first-order rate constants and ABTS dosage2.3 漆酶投加量对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
为了验证以上推测，本文进一步探究了在ABTS投加量固定的情况下，漆酶投加量对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响. 从图4A可以看出，在ABTS固定的情况下，随着漆酶投加量的增加，3-OH-BDE-7的去除率逐渐增加. 例如，当漆酶浓度为0.02 U·mL−1时，kobs为0.006 min−1；而当漆酶浓度增加到0.5 U·mL−1时，kobs增加到0.040 min−1. 此外，3-OH-BDE-7的去除过程仍然符合假一级动力学规律，这也验证了之前的推测.
图 4 （A）LMS在不同漆酶投加量条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线；（B）假一级动力学常数与漆酶投加量之间的关系Figure 4. （A）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal at different Laccase dosages； （B）Relationship between pseudo first-order rate constants and ABTS dosage本文进一步分析了kobs与酶活性之间的相关关系. 如图4B所示，在整个漆酶投加量范围内（0.02—0.5 U·mL−1），kobs与酶活性之间并不存在正相关关系，这明显不符合酶催化反应的特征. 基于对LMS系统的作用机理的分析，本文推测漆酶与介体ABTS之间存在一个最佳配比. 由于ABTS也是漆酶的一个潜在反应底物，因此ABTS的投加量并不是越多越好，这是因为过多的ABTS会跟底物形成竞争关系，从而导致底物的去除率降低. 本文进一步对实验数据进行了分段拟合，结果如图4B所示. 漆酶投加量在0—0.1 U·mL−1和0.1—0.5 U·mL−1范围内时，kobs分别与漆酶的活性均呈现出了较好的线性关系. 在第一阶段，即漆酶投加量在0—0.1 U·mL−1范围内时，漆酶含量是3-OH-BDE-7降解的主要限速因素，由于ABTS本身不与底物发生反应，因此随着酶浓度的增加3-OH-BDE-7的去除率快速增加. 而当漆酶投加量在0.1—0.5 U·mL−1范围内时，ABTS的含量是3-OH-BDE-7降解的主要限速因素，因为此时漆酶含量足够多，但是由于漆酶自身的氧化还原电位较低，导致其直接与3-OH-BDE-7反应的速率低，所以即使再增大漆酶投加量，3-OH-BDE-7的降解速率也不会增加太多. 综上所述，这些结果进一步证明了本文前面的假设，即ABTS优先于3-OH-BDE-7迅速与漆酶发生反应，产生ABTS+和ABTS++，形成新的催化活性物种去介导底物的去除过程.
2.4 pH和温度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
由图5A可以看出，在pH为4—7范围内，LMS体系对3-OH-BDE-7的去除率均可达80%以上，保持了较高水平. 当pH值增大或者减小时，3-OH-BDE-7的去除率都有所降低. 例如在pH为3和10的条件下，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率分别只有63%和35%. pH会影响漆酶的活性是因为反应介质的pH值影响漆酶表面的电化学特性或反应中心，不同的pH值能够影响漆酶的稳定性，从而进一步影响漆酶的活性. 通常情况下，每种漆酶都有自身适宜的pH值范围. 从图5B可以看出，本实验所用的漆酶活性的最佳pH值是5.0. 当溶液pH值高于或低于5.0时，漆酶的活性都显著降低. 例如当溶液pH值为3时，漆酶的活性相比于pH等于5.0时降低了36%. 然而从图5A的去除率上来看，3-OH-BDE-7的去除率在pH为3时只降低了约20%, 类似的现象在之前的研究中也有被发现[21]. 有研究表明在漆酶-ABTS介体系统下，起主要作用是ABTS++[14]，而ABTS++在酸性环境下更容易保持其稳定性. 这也就解释了为什么在pH为3时，酶活性降低了36%，而3-OH-BDE-7的去除率只降低了约20%. 此外，对比图5A和5B，可以发现ABTS介体的加入，可以缓解pH改变致酶失活而对降低对底物去除率的趋势. 因此，ABTS的加入扩大了漆酶催化氧化底物的pH适用范围.
图 5 （A）溶液pH对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响， （B）溶液pH对漆酶活性的影响，（C）温度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响， （D）温度对漆酶活性的影响Figure 5. （A）Influence of solution pH on the removal of 3-OH-BDE-7， （B）Influence of solution pH on the activity of Laccase ，（C）Influence of temperature on the removal of 3-OH-BDE-7， （D）Influence of temperature on the activity of Laccase温度也是影响酶活性的关键因素之一. 从图5C可以看出，本研究中LMS的反应最佳温度范围在25—35 ℃. 而当温度升高或者降低时，LMS对3-OH-BDE-7的去除率都显著降低. 例如，在温度为4 ℃时，3-OH-BDE-7去除率只有约20%. 通过对不同温度下酶活性的测定，可以发现本实验中所用的漆酶的最佳温度范围也在25—35 ℃. 此外，通过对比图5C和5D，可以发现不同温度下LMS对3-OH-BDE-7的去除率变化趋势与温度对酶活性的影响趋势基本一致，这说明ABTS的加入并不会改变漆酶催化氧化底物的温度适用范围.
2.5 NOM对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
NOM的主要成分是溶解性的腐殖质，广泛存在于多个环境介质中，例如自然水体和土壤中. 因此，酶催化氧化污染的动力学过程不可避免的受到NOM的影响[9, 18]. 本文进一步探究了不同浓度的NOM对漆酶-ABTS介体系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响. 从图6A可以看出，NOM的存在对LMS催化氧化3-OH-BDE-7具有一定的抑制作用，并且随着NOM浓度的增加，抑制程度越来越大. 木质素过氧化物酶（Lip）以及漆酶在催化去除雌激素和四溴双酚A的反应过程中也发现了类似的现象[9, 22]. 此外，3-OH-BDE-7的降解过程在NOM存在的情况下，同样呈现出假一级动力学规律，结果如图6B所示. 通过公式（2）计算可知，当NOM浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·L−1时，其kobs分别为0.0122、0.0082、0.0058、0.0047、0.0038 min−1.
图 6 （A）不同浓度NOM对LMS催化氧化3-OH-BDE-7的影响； （B）LMS在不同NOM投加量条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线； （C）NOM对漆酶活性的影响； （D）不同浓度NOM分别LMS下随时间的吸光度变化； （E）NOM的吸附作用对3-OH-BDE-7去除率的影响； （F）假一级动力学常数与NOM投加量之间的关系Figure 6. （A）Influence of NOM dosage on the removal of 3-OH-BDE-7；（B）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal at different NOM dosages； （C）Influence of NOM on the activity of laccase；（D）Time based UV absorbance of NOM treated by LMS；（E）The effect of NOM adsorption on the removal of 3-OH-BDE-7 mediated by LMS；（F）Relationship between pseudo first-order rate constants and NOM dosage有研究发现NOM中的羟基和羧基能和漆酶活性中心的铜离子发生配位反应，从而使得漆酶的活性降低[23]. 但是，本研究中NOM的存在对漆酶的活性并没有影响，如图6C所示，这与Xia等的研究结果一致，他们也发现腐殖酸并不会影响漆酶的活性[24]. 因此本实验中NOM对酶活性的影响不是其抑制作用的主要原因.
其次，NOM也可以作为底物，与酶发生反应，这主要是因为NOM分子结构中有许多酚类官能团[18]. 由于NOM对漆酶催化反应的影响主要取决于酚类官能团的含量及其周围的电子或空间微环境[24]. 因此，不同来源的NOM可能对酶催化反应表现出不同的影响. 例如，从泥炭中提取的NOM组分对漆酶反应具有一定的抑制作用，而来源于IHSS的NOM则对漆酶反应具有一定的促进作用[18]. 为探究本实验中NOM的LMS的影响，本文进一步利用紫外分光光度计表征了NOM在LMS下的吸光度变化. 如图6D所示，NOM的吸光度值并没有发生显著的变化，这表明NOM与LMS之间不发生反应，类似的现象在Lu等[25]的研究中也观测到. 此外，NOM也可能吸附3-OH-BDE-7，进而抑制其在LMS下的去除. 为探究NOM对3-OH-BDE-7的吸附作用对其去除率的影响，本文将NOM与3-OH-BDE-7先共同孵育24 h后，再进行降解实验，结果如图6E所示. 从图6E可以看出，共同孵育条件下3-OH-BDE-7的去除率与同时投加条件下的去除率并没有显著性差异，这说明NOM对3-OH-BDE-7的吸附作用并不是NOM抑制作用的主要原因.
有研究报道，腐殖质能够逆转漆酶介导的底物氧化过程[25]. 在漆酶催化氧化底物的过程中，分为两个阶段. 第一个阶段是底物（S）首先被酶氧化成活性自由基中间体（S*），第二个阶段是活性自由基中间体（S*）发生耦合进而生成耦合产物（P）. 这两个阶段很大程度上是不可逆的，然而在NOM存在的情况，生成的活性自由基中间体（S*）可能与NOM发生反应重新转化成底物（S）.
S+LMSk1→S∗ (3) S∗k2→P (4) S∗+NOMk3→S (5) d[S]dt=−k1[S]+k−1[S∗]CNOM (6) d[S∗]dt=k1[S]−k−1[S∗]CNOM−k2[S∗] (7) d[P]dt=k2[S∗] (8) 假设S*达到相对稳态，即ds/dt≈0，则根据公式，可知：
[S∗]=k1[S]k−1CNOM+k2 (9) 代入公式（8），可知
d[P]dt=k2k1[S]k−1CNOM+k2 (10) 假设S*的浓度非常小，并且变化慢，则产物的生成速率与反应物的消失速率近似相等. 则
d[S]dt=−d[P]dt=−k1k2[S]k−1CNOM+k2 (11) 因此，
kobs=k1k2k−1CNOM+k2 (12) 公式变换后，
1kobs=k−1k1k2CNOM+1k1 (13) 因此，1/kobs应该与NOM的浓度呈正相关,结果如图6E所示. 1/kobs与NOM的浓度之间具有较好的线性关系（R2=0.9990），这说明NOM可以与LMS中形成的底物有机自由基发生反应，使其返回到初始状态，所以NOM才表现出对3-OH-BDE-7转化的抑制作用.
2.6 3-OH-BDE-7的降解产物及降解路径
最后，利用LC-MS对3-OH-BDE-7在LMS下的中间产物进行了鉴定。通过分析LC-MS信息，并结合溴代待物的特征质谱图，识别出了3种降解产物，结果如图7A所示。根据鉴定到的中间产物，对3-OH-BDE-7的降解路径进行了推测，结果如图7B所示。在LMS作用下，3-OH-BDE-7失去一个电子生成3-OH-BDE-7自由基（R1）。3-OH-BDE-7自由基经过电荷重排后依次形成自由基R2和R3，R3中C—O断裂后生成自由基R4。路径1是自由基R4与水反应生成2,4-二溴酚（产物1）；路径2是自由基R1与自由基R2发生耦合反应1-（2,4-二苯氧基）-2,4-二溴苯甲醚（产物2）；路径3是两个自由基R4发生耦合反应生成1,3-二（2,4-二苯氧基）苯醚（产物3）。这与本课题组之前的研究结果类似，即漆酶催化反应过程中，生成的有机自由基容易发生耦合反应生成二聚物或者三聚物[9]。
图 7 （A）3-OH-BDE-7及其转化产物的LC-MS分析结果. （B）3-OH-BDE-7在漆酶/ABTS反应体系下可能的转化路径Figure 7. （A）Mass spectra of 3-OH-BDE-7 and its products resulting from LC-MS analysis. （B）Possible reaction pathways of 3-OH-BDE-7 in laccase/ABTS mediated reaction system3. 结论（Conclusion）
（1） ABTS能够显著促进漆酶催化氧化去除3-OH-BDE-7的速率. 加入ABTS （2 μmol·L−1）的漆酶体系催化氧化3-OH-BDE-7的速率约是单纯漆酶体系下的20倍.
（2） 当漆酶投加量固定时，随着ABTS浓度的增加，3-OH-BDE-7的去除率也不断提高，并且假一级动力学常数与ABTS的浓度呈正相关.
（3） 当ABTS投加量固定时，随着漆酶浓度的增加，尽管3-OH-BDE-7的去除率也不断提高，但是增加的程度在不断降低.
（4） ABTS的加入扩大了漆酶催化氧化3-OH-BDE-7的pH适用范围, 但是并不会改变漆酶催化氧化3-OH-BDE-7的温度适用范围.
（5） NOM能够抑制3-OH-BDE-7在LMS系统的降解，并且随着NOM浓度的增加，抑制作用逐渐增强. NOM抑制3-OH-BDE-7降解的主要原因是NOM能够淬灭催化反应过程中的底物有机自由基.
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图 2 供试微塑料的电镜扫描图
Figure 2. SEM micrographs of polyethylene (PE), polystyrene (PS), and polyamide (PA).
图 3 OTC在土壤及含微塑料土壤中的吸附动力学结果图中的曲线为准一级动力学模型拟合结果
Figure 3. Sorption kinetics of OTC onto soils or soils contained microplastics Solid lines are Pseudo-first-order kinetic model simulations.
图 4 OTC在土壤及含微塑料土壤上的吸附动力学结果（图中的三段曲线为颗粒内扩散模型拟合结果）
Figure 4. Sorption kinetics of OTC onto soils or soils contained microplastics（Solid lines are intraparticle diffusion model simulations）
图 5 OTC在土壤、含微塑料土壤及微塑料中的吸附等温线
Figure 5. Sorption isotherms of OTC onto soils, soils containing microplastics, and microplastics
表 1 供试土壤理化性质
Table 1. Physicochemical properties of the tested soil
pHpzc 有机质/(mg·g−1)Organic matter 阳离子交换量 /(cmol(+)·kg−1)Cation exchange capacity 颗粒组成/%Particle composition 黏粒Clay(<2 μm) 粉粒Silt(2—50 μm) 砂粒Sand(>50 μm) 5.28 12.3 12.4 20.16 33.60 46.24 
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表 2 准一级和准二级动力学模型拟合参数
Table 2. Fitting parameters of Pseudo-first-order and Pseudo-second-order kinetic models
吸附剂Sorbents q(e,exp)/(mg·g−1) 准一级动力学模型Pseudo-first-order kinetic model 准二级动力学模型Pseudo-second-order kinetic model qe/(mg·g−1) k1/h−1 R2 qe/(mg·g−1) k2/(g·(mg·h−1) -1) R2 土 1.832 1.848 0.226 0.902 1.879 0.665 0.773 土+PA 1.811 1.813 0.283 0.968 1.898 0.233 0.990 土+PS 1.803 1.787 0.371 0.974 1.871 0.295 0.982 土+PE 1.813 1.811 0.435 0.994 1.921 0.289 0.992
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表 3 等温吸附模型拟合参数
Table 3. Fitting parameters of models
吸附剂Sorbents Freundlich模型 D-R模型 Temkin模型 Linear模型 Kf/(L·g−1) n R2 qm/(mg·g−1) β/(mol2·kJ−2) R2 bT/(kJ·mol−1) KT/(L·g−1) R2 Kd/(L·g−1) R2 土 1.297 0.584 0.945 3.810 0.243 0.950 1.975 3.487 0.993 0.980 0.726 土+PA 1.257 0.665 0.963 3.193 0.250 0.936 2.053 3.457 0.997 0.710 0.612 土+PS 0.955 0.581 0.966 2.426 0.249 0.990 2.960 3.545 0.998 0.453 0.940 土+PE 0.981 0.667 0.971 2.311 0.240 0.983 2.849 3.580 0.996 0.388 0.959 PA 0.152 0.949 0.981 1.751 2.987 0.504 6.884 4.662 0.926 0.156 0.743 PS 0.110 0.368 0.738 0.236 0.044 0.267 72.68 122.1 0.466 0.021 0.754 PE 0.103 0.429 0.812 0.057 0.057 0.973 71.40 94.14 0.982 0.026 0.997
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[1] ZHANG Q Q, YING G G, PAN C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: Source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance [J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782. [2] ZHAO L, DONG Y H, WANG H. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China [J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(5): 1069-1075. doi: 10.1016/j.scitotenv.2009.11.014 [3] 张慧敏, 章明奎, 顾国平. 浙北地区畜禽粪便和农田土壤中四环素类抗生素残留 [J]. 生态与农村环境学报, 2008, 24(3): 69-73. doi: 10.3969/j.issn.1673-4831.2008.03.014 ZHANG H M, ZHANG M K, GUO G P. Residues of tetracyclines in livestock and poultry and agricultural soils from North Zhejiang Province [J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2008, 24(3): 69-73(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1673-4831.2008.03.014
[4] ZHANG H B, ZHOU Y, HUANG Y J, et al. Residues and risks of veterinary antibiotics in protected vegetable soils following application of different manures[J]. Chemosphere. 2016, 152(6): 229-237. [5] AHMED M B M, RAJAPAKSHA A U, LIM J E, et al. Distribution and accumulative pattern of tetracyclines and sulfonamides in edible vegetables of cucumber, tomato, and lettuce [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(2): 398-405. doi: 10.1021/jf5034637 [6] 曾巧云, 丁丹, 檀笑. 中国农业土壤中四环素类抗生素污染现状及来源研究进展 [J]. 生态环境学报, 2018, 27(9): 1774-1782. ZENG Q Y, DING D, TAN X. Pollution status and sources of tetracycline antibiotics in agricultural soil in China: A review [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2018, 27(9): 1774-1782(in Chinese).
[7] 仇天雷, 高敏, 韩梅琳, 等. 鸡粪堆肥过程中四环素类抗生素及抗性细菌的消减研究 [J]. 农业环境科学学报, 2015, 34(4): 795-800. doi: 10.11654/jaes.2015.04.027 QIU T L, GAO M, HAN M L, et al. Decreases of tetracyclines and antibiotics-resistant bacteria during composting of chicken manure [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2015, 34(4): 795-800(in Chinese). doi: 10.11654/jaes.2015.04.027
[8] WANG Y J, SUN R J, XIAO A Y, et al. Phosphate affects the adsorption of tetracycline on two soils with different characteristics [J]. Geoderma, 2010, 156(3/4): 237-242. [9] BAO Y Y, WAN Y, ZHOU Q X, et al. Competitive adsorption and desorption of oxytetracycline and cadmium with different input loadings on cinnamon soil [J]. Journal of Soils and Sediments, 2013, 13(2): 364-374. doi: 10.1007/s11368-012-0600-3 [10] LEE J, SEO Y, ESSINGTON M E. Sorption and transport of veterinary pharmaceuticals in soil-A laboratory study [J]. Soil Science Society of America Journal, 2014, 78(5): 1531-1543. doi: 10.2136/sssaj2013.11.0490 [11] 曹志磊, 俞花美, 葛成军, 等. 可溶性有机物对土霉素在土壤中吸附-解吸的影响 [J]. 热带作物学报, 2018, 39(4): 825-831. doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.034 CAO Z L, YU H M, GE C J, et al. Eeffects of dissolved organic matter on adsorption-desorption behavior of oxytetracycline in soil system [J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2018, 39(4): 825-831(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.034
[12] KOCAREK M, KODESOVA R, VONDRACKOVA L, et al. Simultaneous sorption of four ionizable pharmaceuticals in different horizons of three soil types [J]. Environmental Pollution, 2016, 218(11): 563-573. [13] PAN M, CHU L M. Adsorption and degradation of five selected antibiotics in agricultural soil [J]. Science of the Total Environment, 2016, 545-546(3): 48-56. [14] 石磊平, 蒋煜峰, 广阿龙, 等. 天然有机质对土霉素在西北灰钙土上吸附行为的影响 [J]. 环境科学研究, 2019, 32(9): 1584-1593. SHI L P, JIANG Y F, GUANG A L, et al. Effect of natural organic matter on adsorption behavior of oxytetracycline onto sierozem soils in Northwest China [J]. Research of Environmental Sciences, 2019, 32(9): 1584-1593(in Chinese).
[15] 鲍艳宇, 周启星, 张浩. 阳离子类型对土霉素在2种土壤中吸附-解吸影响 [J]. 环境科学, 2009, 30(2): 551-556. doi: 10.3321/j.issn:0250-3301.2009.02.040 BAO Y Y, ZHOU Q X, ZHANG H. Influences of cation species on adsorption and desorption of oxytetracycline in two typical soils of China [J]. Environmental Science, 2009, 30(2): 551-556(in Chinese). doi: 10.3321/j.issn:0250-3301.2009.02.040
[16] RABOLLE M, SPLIID N H. Sorption and mobility of metronidazole, olaquindox, oxytetracycline and tylosin in soil [J]. Chemoshpere, 2000, 40(7): 715-722. doi: 10.1016/S0045-6535(99)00442-7 [17] ROCHMAN C M. Microplastics research - from sink to source [J]. Science, 2018, 360(6384): 28-29. doi: 10.1126/science.aar7734 [18] 骆永明, 周倩, 章海波, 等. 重视土壤中微塑料污染研究 防范生态与食物链风险 [J]. 中国科学院院刊, 2018, 33(10): 1021-1030. LUO Y M, ZHOU Q, ZHANG H B, et al. Pay attention to research on microplastic pollution in soil for prevention of ecological and food chain risks [J]. Bulletin of Chinese Academy of Sciences, 2018, 33(10): 1021-1030(in Chinese).
[19] 李道季. 海洋微塑料污染研究现状及其应对措施建议 [J]. 环境科学研究, 2019, 32(2): 197-202. LI D J. Research advance and countermeasures on marine microplastic pollution [J]. Research of Environmental Sciences, 2019, 32(2): 197-202(in Chinese).
[20] NIZZETOO L, Langaas S, Futter M. Do microplastics spill on to farm soils? [J]. Nature, 2016, 537(7621): 488-488. [21] FULLER S, GAUTAM A. A procedure for measuring microplastics using pressurized fluid extraction [J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(11): 5774-5780. [22] SCHEURER M, BIGALKE M. Microplastics in Swiss floodplain soils [J]. Environmental Science & Technology, 2018, 52(6): 3591-3598. [23] CORRADINI F, EGUILUZ R, CASADO F, et al. Evidence of microplastic accumulation in agricultural soils from sewage sludge disposal [J]. Science of the Total Environment, 2019, 671(6): 411-420. [24] ZHANG G S, LIU Y F. The distribution of microplastics in soil aggregate fractions in southwestern China [J]. Science of the Total Environment, 2018, 642(11): 12-20. [25] LIU M T, LU S B, SONG Y, et al. Microplastic and mesoplastic pollution in farmland soils in suburbs of Shanghai, China [J]. Environmental Pollution, 2018, 242(11): 855-862. [26] LU X M, LU P Z, LIU X P. Fate and abundance of antibiotic resistance genes on microplastics in facility vegetable soil [J]. Science of the Total Environment, 2020, 709(3): 136276. [27] 张凯娜, 李嘉, 李晓强, 等. 微塑料表面土霉素的吸附-解吸机制与动力学过程 [J]. 环境化学, 2017, 36(12): 2531-2540. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2017032703 ZHANG K N, LI J, LI X Q, et al. Mechanisms and kinetics of oxytetracycline adsorption-desorption onto microplastics [J]. Environmental Chemistry, 2017, 36(12): 2531-2540(in Chinese). doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2017032703
[28] ZHANG H B, WANG J Q, ZHOU B Y, et al. Enhanced adsorption of oxytetracycline to weathered microplastic polystyrene: Kinetics, isotherms and influencing factors [J]. Environmental Pollution, 2018, 243(12): 1550-1557. [29] ZHOU Q, ZHANG H B, FU C C, et al. The distribution and morphology of microplastics in coastal soils adjacent to the Bohai Sea and the Yellow Sea [J]. Geoderma, 2018(7): 201-208. [30] LV W, ZHOU W Z, LU S B, et al. Microplastic pollution in rice-fish co-culture system: A report of three farmland stations in Shanghai, China [J]. Science of the Total Environment, 2019, 652(1): 1209-1218. [31] ZHOU Y F, LIU X N, WANG J. Characterization of microplastics and the association of heavy metals with microplastics in suburban soil of central China [J]. Science of the Total Environment, 2019, 694(12): 133798. [32] HUFFER T, METZELDER F, SIGMUND G, et al. Polyethylene microplastics influence the transport of organic contaminants in soil [J]. Science of the Total Environment, 2019, 657(3): 242-247. [33] SUN Y, YUE Q, GAO B, et al. Preparation of activated carbon derived from cotton linter fibers by fused NaOH activation and its application for oxytetracycline (OTC) adsorption [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2012, 368(1): 521-527. doi: 10.1016/j.jcis.2011.10.067 [34] JANG H M, YOO S, CHOI Y K, et al. Adsorption isotherm, kinetic modeling and mechanism of tetracycline on Pinus taeda-derived activated biochar [J]. Bioresource Technology, 2018, 259(7): 24-31. [35] HARJA M, CIOBANU G. Studies on adsorption of oxytetracycline from aqueous solutions onto hydroxyapatite [J]. Science of the Total Environment, 2018, 628/629(7): 36-43. [36] 王静, 朱晓丽, 韩自玉, 等. 3种典型多孔高温改性固废材料对磺胺二甲嘧啶的吸附特性 [J]. 环境科学, 2020, 41(3): 1319-1328. WANG J, ZHU X L, HAN Z Y, et al. Adsorption characteristics of sulfamethazine on three typical porous high-temperature modified solid waste materials [J]. Environmental Science, 2020, 41(3): 1319-1328(in Chinese).
[37] LU J B, XU K, LI W L, et al. Removal of tetracycline antibiotics from aqueous solutions using easily regenerable pumice: Batch and column study [J]. Water Quality Research Journal of Canada, 2018, 53(3): 143-155. doi: 10.2166/wqrj.2018.012 [38] 王东升, 张婷, 晁宇. 离子强度和离子类型对土霉素在草甸土中被吸附的影响 [J]. 生态环境学报, 2014, 23(5): 870-875. doi: 10.3969/j.issn.1674-5906.2014.05.022 WANG D S, ZHANG T, CHAO Y. Influence of different strength and species of cation on adsorption of oxytetracycline in meadow soils [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(5): 870-875(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1674-5906.2014.05.022
[39] 齐瑞环, 李兆君, 龙健, 等. 土壤粉碎粒径对土霉素在土壤中吸附的影响 [J]. 环境科学, 2011, 32(2): 589-595. QI R H, LI Z J, LONG J, et al. Effects of soil trituration size on adsorption of oxytetracycline on soils [J]. Environmental Science, 2011, 32(2): 589-595(in Chinese).
[40] HADI, M, SAMARGHANDI, M R, MCKAY, G. Equilibrium two-parameter isotherms of acid dyes sorption by activated carbons: study of residual errors[J]. Chemical Engineering Journal , 2010, 160(2): 408-416. [41] GUNAY A, ARSLANKAYA E, TOSUN İ. Lead removal from aqueous solution by natural and pretreated clinoptilolite: Adsorption equilibrium and kinetics [J]. Journal of Hazardous Materials, 2007, 146(1/2): 362-371. [42] LI J, ZHANG K N, ZHANG H. Adsorption of antibiotics on microplastics [J]. Environmental pollution, 2018, 237(6): 460-467. [43] ZHANG S, HAN B, SUN Y et al. Microplastics influence the adsorption and desorption characteristics of Cd in an agricultural soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 388(4): 121775. [44] WANG F, SHIH K M, LI X Y. The partition behavior of perfluorooctanesulfonate(PFOS) and perfluorooctanesulfonamide(FOSA) on microplastics [J]. Chemosphere, 2015, 119(2): 841-847. [45] 张翠, 胡学锋, 骆永明. 模拟太阳光下水中土霉素的光化学降解 [J]. 环境化学, 2016, 35(3): 430-438. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2016.03.2015101303 ZHANG C, HU X F, LUO Y M. Aqueous photodegradation of oxytetracycline under simulated sunlight irradiation [J]. Environmental Chemistry, 2016, 35(3): 430-438(in Chinese). doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2016.03.2015101303
[46] TORKZABAN S, BRADFORD S A, van GENUCHTEN M T, et al. Colloid transport in unsaturated porous media: The role of water content and ionic strength on particle straining [J]. Journal of Contaminant Hydrology, 2008, 96(1): 113-127. [47] LUO Y Y, ZHANG Y Y, XU Y B, et al. Distribution characteristics and mechanism of microplastics mediated by soil physicochemical properties [J]. Science of the Total Environment, 2020, 726(7): 138389. -
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