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碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响

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付昆明, 杨宗玥, 刘凡奇, 仇付国, 曹秀芹. 碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
引用本文: 付昆明, 杨宗玥, 刘凡奇, 仇付国, 曹秀芹. 碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
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FU Kunming, YANG Zongyue, LIU Fanqi, QIU Fuguo, CAO Xiuqin. Effect of carbon sources on nitrogen removal in denitrification process of rural wastewater[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
Citation: FU Kunming, YANG Zongyue, LIU Fanqi, QIU Fuguo, CAO Xiuqin. Effect of carbon sources on nitrogen removal in denitrification process of rural wastewater[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
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碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响

  • 北京建筑大学，城市雨水系统与水环境教育部重点实验室，中-荷污水处理技术研发中心，北京 100044

    • 作者简介: 付昆明(1981—)，男，博士，副教授。研究方向：污水自养脱氮技术等。E-mail：fukunming@163.com
    通讯作者: 付昆明, E-mail: fukunming@163.com ; 
  • 基金项目:
    北京建筑大学市属高校基本科研业务费专项(X18214)

  • 中图分类号: X703

Effect of carbon sources on nitrogen removal in denitrification process of rural wastewater

  • Sino-Dutch R&D Center for Future Wastewater Treatment Technologies, Key Laboratory of Urban Storm Water System and Water Environment, Ministry of Education, Beijing University of Civil Engineering and Architecture, Beijing 100044, China

    • Corresponding author: FU Kunming, fukunming@163.com ; 

摘要

  • 摘要: 针对农村污水普遍存在碳源不足的问题，研究了不同碳源种类对反硝化脱氮过程的影响。选用SBR，以乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖为碳源，分别控制COD∶N值为4.5、5、6.5、6.5，对反应器脱氮速率以及氮素指标变化规律进行了研究。结果表明：投加乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖时，其平均反硝化速率分别为0.050、0.031、0.034、0.026 g·(g·h)−1；有机物结构越复杂，意味着代谢过程越复杂，反硝化所需时间亦相对延长；投加乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖时，当硝酸盐基本被完全消耗时，分别于第50、70、70、70 min时反应器中亚硝酸盐积累量达到了最大值；以葡萄糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率为42.5%；而以乙酸钠和乙醇为碳源时，最大亚硝酸盐积累率次之，分别为23.2%和19.5%；以蔗糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率最小，仅为7.0%。以上研究结果可为低浓度农村污水处理过程中针对外加碳源种类的选择提供参考。
    Abstract: Aiming at the common problems of insufficient carbon source in rural domestic wastewater, the effects of different organic carbon sources in denitrification process were studied. SBR reactor was used to study its denitrification rate and variation of nitrogen element indices when sodium acetate, ethanol, glucose and sucrose were taken as carbon sources and COD/N value was controlled at 4.5, 5, 6.5 and 6.5, respectively. The results showed that when sodium acetate, ethanol, glucose or sucrose were added, the average denitrification rates were 0.050, 0.031, 0.034 and 0.026 g·(g·h)−1, respectively. The more complex the organic structure, the more complex the metabolic process and the longer the time required for denitrification. When sodium acetate, ethanol, glucose, or sucrose were added and the nitrate was completely consumed, the nitrite accumulation reached the maximum value at 50, 70, 70 and 70 min, respectively. When glucose was used as the carbon source, the maximum nitrite accumulation rate was 42.5%. When sodium acetate or ethanol were used as the carbon source, the maximum nitrite accumulation rate were 23.2% and 19.5%, respectively. When sucrose was used as the carbon source, the maximum nitrite accumulation rate was the smallest with a value of 7.0%. The results of this study can provide a reference for the selection of external carbon sources in the process of low-concentration rural sewage treatment.

  • 纳米氧化锌(ZnO nanoparticles，ZnO NPs)具有催化活性、强氧化性和高稳定性，广泛应用于半导体、染料、塑料添加剂、化妆品等许多领域[1]。在ZnO NPs系列产品的生命周期中，其不可避免地会进入生态系统[2]，由其引发的生物安全性问题，引起了学者们的广泛关注[3]。近年来，在土壤、污水和污泥中均发现了ZnO NPs的存在。GOTTSCHALK等[4]通过建模模拟得出，欧洲和美国水环境中的ZnO NPs质量浓度分别为0.432 mg·L−1和0.3 mg·L−1，已达到损害水体生物的阈值。部分进入环境中的ZnO NPs最终会进入到污水处理系统中[5]。因此，有必要了解ZnO NPs对污水生物处理运行效果的影响。

    人工湿地(constructed wetlands，CWs)具有运行成本低、无二次污染、景观价值高等优点，已广泛应用于污水处理中[6-7]。然而，在其长期运行过程中，基质表面会堆积大量的难降解有机物和微生物分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，同时EPS会吸附无机颗粒和有机物并形成致密的堵塞层，造成CWs的堵塞[8]。有研究表明，ZnO NPs溶解产生的Zn2+以及NPs的内化会损伤细胞[9-10]，且其粒径越小，生物毒性越强[11]，会刺激微生物产生更多的EPS[12]。EPS亲水组分可通过吸附ZnO NPs，降低其对微生物的生物毒性[13-14]。然而，大量的EPS粘附于基质表面，可能会降低基质层孔隙率[15-16]，从而降低CWs的使用寿命。目前，有关ZnO NPs的粒径效应对CWs性能及堵塞的影响尚缺乏系统的研究，并且ZnO NPs的粒径与微生物相对丰度的关系尚未明确。

    针对上述问题，本研究考察了3种不同粒径(15 nm、50 nm和90 nm)的ZnO NPs对CWs性能、渗透系数及EPS产量和特性的影响，探讨了微生物群落结构和多样性对不同粒径ZnO NPs的响应，以期为CWs的稳定运行提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   ZnO NPs悬浊液配制

    称取0.5 g ZnO NPs(表1)于1 L超纯水中，用磁力搅拌器混合搅拌30 min后，装入棕色试剂瓶中。在25 ℃下，超声1 h[17]，制得ZnO NPs悬浊液。使用前，悬浊液需超声1 h(25 ℃，500 W，40 kHz)，防止ZnO NPs团聚。

    表 1  ZnO NPs基本参数
    Table 1.  Basic parameters of ZnO NPs
    粒径/nm颜色、状态纯度/%比表面积/(m2·g−1)生产厂家
    15白色粉末99.9110南京埃普瑞纳米材料有限公司
    50淡黄色/白色粉末99.815~30杭州万景新材料有限公司
    90淡黄色/白色粉末99.810~20杭州万景新材料有限公司
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    1.2   实验装置

    构建4组实验室规模的水平潜流人工湿地系统(horizontal subsurface flow constructed wetland，HSFCWs)，具体构造见图1。CWs反应器为PP材质(长、宽、高分别为26.5、26.5、37 cm)自下而上分别为2 cm细沙、17 cm砾石(粒径约10~30 mm)、细丝网(80 目)、8 cm 细沙和9株高约30 cm、生长状态均一的香蒲。为保证实验结果稳定可靠，在种入反应器前，先将香蒲放入内有1/4浓度的霍格兰氏植物培养液的塑料箱中，在25 ℃下培养驯化10 d左右。

    图 1  实验装置构造示意图
    Figure 1.  Schematic of CWs
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    1.3   接种污泥和进水水质

    分别以乙酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾作为碳源、氮源和磷源配制人工污水，其COD、TN和TP分别约为216.00、11.10和3.84 mg·L−1。配水中添加1.00 mL·L−1微量元素，包括0.83 mg·L−1 KI、6.20 mg·L−1 硼酸、22.30 mg·L−1 MnSO4、8.60 mg·L−1 ZnSO4、0.025 mg·L−1 CuSO4、0.025 mg·L−1 CoCl2、5.56 g·L−1 FeSO4·7H2O和7.46 g·L−1 EDTA。使用1 mol·L−1盐酸或氢氧化钠调节进水pH在7.4左右。反应器进水为下进上出，水力停留时间(HRT)为2 d。

    在填充到反应器前，利用青岛市李村河污水处理厂二沉池回流污泥作为接种污泥对砾石进行挂膜。将砾石没入污泥中，闷曝3 d，然后以人工污水作为进水，连续运行15 d左右。待砾石表面附着生物膜后，将其填入反应器内，每日投配定量人工污水。在运行过程中，测定COD、TP、NH+4-N和TN等指标。反应器达到稳定去除效果10 d后，开始在进水中投加ZnO NPs。ZnO NPs的环境本底值约为1.00 mg·L−1，考虑到ZnO NPs在环境中累积且不易降解的情况，本实验投加的ZnO NPs质量浓度为10.00 mg·L−1。反应器设置1组对照，即CW-对照(不投加ZnO NPs)和3组实验组，包括CW-15(15 nm ZnO NPs)、CW-50(50 nm ZnO NPs)和CW-90(90 nm ZnO NPs)。

    1.4   水质指标测定方法

    实验期间，每隔1 d对4个反应器的进出水进行取样，利用重铬酸钾法测定COD，纳氏试剂分光光度法测定NH+4-N，碱性过硫酸钾消解法测定TN和钼锑抗分光光度法测定TP[18]。

    1.5   水力传导性测量方法

    CWs反应器连续进水，并处于饱和状态。采用常水头渗透系数法[19]，测定CWs整体基质层的渗透系数，根据式(1)进行计算。

    K=QLA(ΔH+L)t (1)

    式中：K为渗透系数，cm·s−1；Q为单位时间水渗透量，mL·s−1；ΔH为水头损失，cm，ΔH=H1−H2；A为过水断面面积，cm2；L为渗透路径长度，cm；t为实验持续时间，s。

    1.6   EPS提取和分析方法

    1) EPS提取和测定。待反应器停止运行后，从CWs顶部基质层收集20.0 g填料，用100 mL的NaCl(0.9%)溶液冲洗后，将得到的滤液倒入已灼烧至恒重的坩埚中在105 ℃下蒸干，然后再放入马弗炉在600 ℃下烧灼3 h，最后等坩埚冷却至恒重后测定堵塞物的质量。EPS采用改进的加热法进行提取[20]，取40 mL的堵塞物混合液于4 000 r·min−1离心5 min，倒掉上清液后加入NaCl(0.05%，70 ℃)溶液至40 mL，混匀后于4 000 r·min−1离心10 min，所得上清液用0.45 µm的聚醚砜膜过滤后即为疏松附着型胞外聚合物(loosely bound EPS，LB-EPS)；取LB-EPS离心后的沉淀物，加入NaCl(0.05%，60 ℃)溶液至40 mL，充分混合后在100 ℃下加热30 min，于4 000 r·min−1离心10 min，所得上清液用0.45 µm的聚醚砜膜过滤后即为紧密结合型胞外聚合物(tightly bound EPS，TB-EPS)。LB-EPS和TB-EPS中蛋白质(proteins，PN)和多糖(polysaccharides，PS)的含量分别通过Folin比色法[21]和蒽酮-硫酸比色法[22]测定。

    2)三维荧光光谱分析。采用荧光分光光度计(日立F-4600)测定LB-EPS和TB-EPS的三维荧光激发发射矩阵光谱(3D-EEM)。以蒸馏水作为空白对照，测定参数设置如下：激发波长(Ex)为200~400 nm，扫描间隔5 nm；发射波长(Em)为200~500 nm，扫描间隔为5 nm；激发光和发射光的狭缝均为10 nm，扫描速度为2 400 nm·min−1[23]。

    1.7   16S rRNA高通量测序及结果分析

    实验结束后，采集每个反应器不同高度的基质约100.00 g，混合后放入磷酸盐缓冲溶液中(10 mmol·L−1 Na2HPO4，8.50 g·L−1 NaCl)，在超声波清洗机中(KQ-500B)处理5 min，然后涡漩1 min，将微生物从填料表面分离到溶液中。经离心处理后，微生物样品送往上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina MiSeq/NovaSeq高通量测序。

    1.8   数据分析

    实验数据统计分析采用SPSS 23.0软件进行方差齐性检验和单因素方差分析(采用邓肯多量程检验，P<0.05视为具有显著性差异)；采用Canoco 5软件进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)研究微生物群落和环境因子之间的关系；采用Matlab 2018a软件绘制3D-EEM光谱图，去除拉曼散射和瑞利散射，并进行归一化处理；采用OriginLab 2021和R语言(4.0.4)绘图及数据分析。

    2.   结果与讨论

    2.1   ZnO NPs粒径对CWs处理性能的影响

    系统稳定运行45 d后，在进水中投加10.00 mg·L−1不同粒径的ZnO NPs悬浊液。如图2(a)所示，在投加10.00 mg·L−1不同粒径的ZnO NPs前，CW-对照、CW-15、CW-50和CW-90对COD的去除率分别为88.70%、91.40%、92.47%和95.01%；投加ZnO NPs 39 d后，与不加ZnO NPs的空白对照组相比，CW-15、CW-50和CW-90对COD的平均去除率均有不同程度的下降，分别为8.73%、7.55%和6.97%。这表明较小粒径的ZnO NPs对COD的去除产生较明显的抑制作用。其原因可能归结于以下2点：ZnO NPs(10.00 mg·L−1)释放出的Zn2+离子具有生物毒性，导致异养微生物对COD的去除率下降[24]；小粒径ZnO NPs与微生物细胞具有更大的接触面积[25]，对异养微生物的生物代谢抑制更加明显，从而降低COD的去除率。

    图 2  不同粒径的ZnO NPs短期暴露对CWs COD、NH+4-N、TN和TP去除效果的影响
    Figure 2.  Effect of short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes on COD, NH+4-N, TN, and TP removal by CWs
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    如图2(b)所示，在投加ZnO NPs 28 d后，CW-15、CW-50和CW-90对NH+4-N的去除率呈降低趋势。与空白对照组相比，CW-15、CW-50和CW-90对NH+4-N的去除率分别下降了21.96%、17.75%和15.34%。CWs对NH+4-N的去除主要在微生物吸收消耗有机营养物的硝化过程中，随着系统进入堵塞阶段，好氧环境受抑制(堵塞后DO在0.08~0.21 mg·L−1)，硝化细菌的活性降低，不利于NH+4-N的去除。

    如图2(c)所示，投加ZnO NPs后，CW-对照、CW-15、CW-50和CW-90对TN的去除率呈现先增加后降低的趋势。这可能是因为：反应前期ZnO NPs释放的低浓度的Zn2+会提高厌氧氨氧化菌(anaerobic-oxidizing bacteria，AOB)的代谢活性，从而消耗反应器中剩余的亚硝酸盐，降低了TN的浓度[26]。然而，在投加ZnO NPs 24 d后，与空白对照组相比，CW-15、CW-50和CW-90对TN的去除率分别下降了10.95%、10.00%和3.78%。

    如图2(d)所示，在投加ZnO NPs 18 d后，CW-15、CW-50和CW-90对TP的去除率有不同程度的增加，分别为42.49%、52.34%和56.38%。可以推测，随着堵塞的发生，基质中积累的EPS作为堵塞物的关键成分，引入了大量的磷吸附位点。此外，ZnO NPs释放的Zn2+与磷酸盐反应生成磷酸锌等络合物，也会抑制磷酸盐的释放[12]，从而提高了CWs的除磷性能。

    2.2   ZnO NPs粒径对CWs堵塞的影响

    1) CWs渗透系数的变化。进水中连续投加不同粒径的ZnO NPs，稳定运行83 d后，4个CWs发生了不同程度的堵塞。如表2所示，CW-对照组的渗透系数维持在1.20×10−3 cm·s−1，而CW-15、CW-50和CW-90基质层的渗透系数明显变小，分别比CW-对照降低了71.17%、67.83%和37.50%。随着ZnO NPs在CWs中的累积，导致系统水流阻力增大，出现短流、返混等现象，从而缩短HRT。同时，CWs处理性能的下降导致营养物质不断积累，再加上ZnO NPs刺激微生物产生的EPS不断增多，加剧了堵塞的程度。

    表 2  不同粒径的ZnO NPs短期暴露对CWs渗透系数的影响
    Table 2.  Effect of short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes on permeability coefficient of CWs
    ZnO NPs 粒径/nm堵塞实验后渗透系数K/(cm·s−1)
    运行83 d运行86 d运行89 d
    空白1.20×10−31.20×10−31.20×10−3
    153.50×10−43.44×10−43.43×10−4
    503.88×10−43.85×10−43.85×10−4
    907.52×10−47.50×10−47.48×10−4
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    2) EPS和PN和PS产量的变化。有研究[27]表明，当微生物暴露于ZnO NPs等有毒物质下会产生应激反应并促进EPS的分泌。污泥絮体表面的EPS可以吸附ZnO NPs颗粒从而阻止其扩散到微生物中[28]。如图3(a)所示，与对照组(97.18 mg·g−1)相比，CW-15、CW-50和CW-90中的EPS分别增加到212.97、156.30和128.53 mg·g−1。15 nm的ZnO NPs可刺激微生物分泌EPS的量最多，这主要是因为小粒径的ZnO NPs比表面积大，更易于与微生物接触。有研究[29]表明，8 nm的ZnO NPs对金黄色葡萄球菌生长的抑制性强于50~70 nm ZnO NPs。此外，溶出的Zn2+会损伤细胞膜和DNA结构，可进一步诱导微生物持续分泌EPS[30]。

    图 3  不同粒径的ZnO NPs短期暴露下EPS、PN和PS的含量变化
    Figure 3.  Changes in EPS, PN, and PS content of ZnO NPs with different particle sizes after short-term exposure
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    EPS主要由PN、PS以及少量核酸和脂质组成[12]。短期暴露于不同粒径的ZnO NPs后，LB-EPS(图3(b))和TB-EPS(图3(c))中PN和PS含量显著升高，尤以CW-15最为显著。这主要是因为小粒径的ZnO NPs毒性更强，易刺激微生物分泌更多的EPS。此外，ZnO NPs的短期暴露可能导致了大量生物量衰减和大量细胞破裂[31]，从而使PN和PS含量大幅增加。

    3) LB-EPS和TB-EPS主要组分分析。由图4可以看出，投加ZnO NPs前后LB-EPS和TB-EPS中识别出4个特征峰(峰A~D)，其中峰A(200 nm/290~300 nm)为芳香族类蛋白物质，峰B(220~230 nm/300~330 nm)为类色氨酸物质，峰C(270~280 nm/300~330 nm)为类可溶性微生物副产物，而峰D(270 nm/420 nm)为类胡敏酸物质[32]。CW-对照和CW-15的LB-EPS主要为芳香族类蛋白和类胡敏酸物质，CW-50和CW-90的LB-EPS中峰D被峰C取代，这说明由于微生物的作用，可溶性微生物代谢副产物峰明显增强。同时，CW-50的峰C出现红移，表明某些官能团(如羰基、羟基、氨基和羧基)的含量增多。TB-EPS主要为芳香族类蛋白、类色氨酸物质和类可溶性微生物副产物，并未发现类胡敏酸物质。TB-EPS的组成成分未发生显著变化，可能是因为其位于内层，在LB-EPS的保护下未受到大的影响。这进一步说明，EPS的主要组分受到了ZnO NPs尺寸效应的影响。

    图 4  不同粒径的ZnO NPs短期暴露LB-EPS和TB-EPS三维荧光光谱
    Figure 4.  3D-EEM of LB-EPS and TB-EPS after short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes
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    2.3   ZnO NPs粒径对微生物群落丰度和多样性的影响

    1)微生物群落丰度和多样性差异分析。通过Illumina MiSeq平台测序，进一步考察了不同粒径的ZnO NPs对微生物群落结构和多样性影响。如表3所示，4组样本在最低测序深度序列量为95%的条件下，测序深度指数稳定在0.995~0.998，说明测序已检测绝大多数物种。通过Chao1和物种指数评价微生物群落丰富度，其大小顺序为CW-15>CW-50>CW-对照>CW-90。Simpson和Shannon指数常用于评估微生物多样性[33]。投加ZnO NPs后可刺激微生物产生应激反应，从而促进微生物多样性地增加[34]。在4个反应器中，CW-15中Simpson和Shannon指数均最低。这说明小粒径的ZnO NPs会对微生物产生更强的毒性，降低微生物群落结构多样性[35]，从而影响系统的稳定性。

    表 3  不同粒径的ZnO NPs短期暴露下微生物群落的丰富度和多样指数
    Table 3.  Richness and diversity index of the microbial community after short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes
    粒径/nmChao1指数物种指数Simpson指数Shannon指数测序深度指数
    对照4 359.014 280.90.9929.3260.996
    154 740.834 707.90.9809.1830.998
    504 488.434 357.20.9959.4340.995
    904 302.154 253.50.9969.7500.997
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    如图5(a)所示，4组样品的总OTUs为12 085个，其中共有787个，占总OTUs的6.51%。如图5(b)所示，4组样品共有的OTUs中微生物中最优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)相对丰度占微生物总量的51.50%，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯杆菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)和放线菌门(Acidobacteria)，占微生物总量的比例依次为15.15%、11.46%、4.66%和4.19%。CW-对照、CW-15、CW-50、CW-90中独有的OTUs分别为2 006、2 063、2 973和1 997个，说明不同粒径的ZnO NPs对微生物群落产生了差异性的影响。有研究[36]表明，Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria为CWs底泥中的优势菌种。Proteobacteria中大多为革兰氏阴性菌，为兼性或专性厌氧菌，参与厌氧消化反应和氮的循环[37-38]。Bacteroidetes专性厌氧，可以降解纤维素、淀粉、蛋白质和脂类等大分子有机物，并参与自养反硝化[39]。此外，Proteobacteria和Bacteroidetes能够分泌脂多糖，有助于微生物粘附到生物载体表面[40]。因此，短期暴露于不同粒径的ZnO NPs会影响Proteobacteria、Bacteroidetes的丰度，这也是导致CWs中COD、NH+4-N和TN的去除率降低和EPS含量增加的主要影响因素之一。

    图 5  不同粒径的ZnO NPs短期暴露下微生物群落的ASV/OTU的韦恩图
    Figure 5.  Veen of ASV/OTU of the microbial community after short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes
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    PCoA是基于Unweighted UniFrac距离指标来考察物种间进化距离和多样性相异系数，其值越小进化距离和差异性越小。如图6(a)所示，主成分1和主成分2分别占微生物群落结构变异的42.10%和30.10%。CW-50和CW-90之间的多样性差异性最小，二者分别与CW-15和CW-对照相比，多样性存在明显差异，说明不同粒径的ZnO NPs导致微生物群落多样性之间存在一定差异性。

    图 6  不同粒径的ZnO NPs短期暴露下对CWs内微生物群落的影响
    Figure 6.  Effect of short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes on microbial community in CWs
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    为了更好地了解不同粒径的ZnO NPs对CWs系统内微生物群落结构的影响，对4个样本进行了属水平的分析(图6(b))。属水平微生物相对丰度中Thauera、Burkholderiaceae、Acinetobacter和Nitrosomonas为优势菌属。CWs系统脱氮主要通过硝化作用、反硝化作用和氨化作用等协同实现[41]。硝化菌属主要为Acinetobacter、Nitrosomonas和Candidatus，在4个系统(CW-对照、CW-15、CW-50和CW-90)中所占比例分别为14.18%、10.05%和6.44%，反硝化菌属主要包括Thauera、Burkholderiaceae和Caldilineaceae，在4个系统中所占比例分别为21.34%、16.47%和9.37%。其中Thauera是广泛存在的自养和异养反硝化的功能菌[42-43]，尽管在高C/N的进水条件下异养反硝化菌占绝对优势，但ZnO NPs对Thauera有明显抑制作用，因而进一步抑制了CWs的反硝化效果。Acinetobacter具有脱氮除磷功能[44-45]，能在异养硝化去除NH4+-N的同时实现磷的去除[46-47]。CW-15中Acinetobacter的相对丰度较对照组增加了13.12%，显示出良好的除磷能力。4个系统内反硝化菌属的相对丰度显著高于硝化菌属，故可推测，硝化过程可能为CWs脱氮的主要限制性因素[48]。在进水C/N较高的条件下，微生物分泌大量的EPS导致基质层渗透系数降低，在系统中产生缺氧或厌氧环境，从而有利于异养反硝化菌的生长，硝化菌属活性则受到抑制。此外，ZnO NPs及其释放的Zn2+会引起微生物体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加，引起细胞膜的损伤[49-50]，从而降低CWs系统的脱氮性能。

    由属水平热图聚类结果可知，样本中含有的菌群丰度差异性(图6(c))。CW-对照与CW-50的物种组成相似性较高，而与CW-15的差异性最大。不同粒径的ZnO NPs均降低了Thauera、Desulfobacter和Thermomonas的相对丰度，使其变成非优势菌。同时，CW-15中优势微生物群落组成相比于其他组差异性较大，其中Acinetobacter、C39和Desulfobulbus等10种优势菌属具有较高的相对丰度，这些优势菌对15 nm的ZnO NPs表现出极大的耐受性，但在50 nm和90 nm ZnO NPs存在的条件下受到不同程度的抑制。投加不同粒径的ZnO NPs后，CWs中微生物群落的变化导致其性能也有所不同。

    2)微生物与环境因子的关系。如图7所示，RDA反映了属水平微生物与环境因子各组分之间的关系。根据蒙特卡洛置换检验，结果具有统计学意义(P<0.05)[51]，且第1与第2坐标轴的方差解释率占总方差的97.31%。由图7可以看出，ZnO NPs的粒径与Caldilineaceae、Spirochaetaceae、Saprospiraceae、Candidatus、Nitrosomonas、Burkholderiaceae和Hyphomicrobium均呈正相关，与Caldilineaceae的相关性最大。COD、NH+4-N、TN和TP与上述关系相反。因此，ZnO NPs的粒径效应对属水平微生物的相对丰度有着不同程度的影响。

    图 7  不同粒径的ZnO NPs短期暴露下环境因子与属水平微生物的冗余分析(RDA)(P<0.05)
    Figure 7.  RDA of environmental factors and genus level microorganisms under the short-term exposure of ZnO NPs with different particle sizes (P<0.05)
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    3.   结论

    1) ZnO NPs(10.00 mg·L−1)对COD、NH+4-N和TN的去除具有明显的粒径效应，其粒径越小，对去除效果的抑制作用越明显；而ZnO NPs(10.00 mg·L−1)对TP的去除有促进作用，粒径越大，其促进效果越明显。

    2) ZnO NPs粒径越小，刺激微生物分泌EPS的量越多，CWs的渗透系数下降越明显；同时，ZnO NPs对LB-EPS和TB-EPS的含量和组成成分产生了不同程度的影响，15 nm的ZnO NPs对类蛋白质物质有明显抑制作用。

    3)短期暴露于不同粒径的ZnO NPs后，CWs中微生物群落结构和多样性可产生显著的差异性；前10种属水平的优势菌属中，与粒径呈正相关的菌属占比为70%。

  • 图 1  SBR实验装置

    Figure 1.  Equipment of SBR

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    图 2  乙酸钠为碳源条件下反应器内各指标的变化

    Figure 2.  Variations of indices in reactor with sodium acetate as carbon source

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    图 3  乙醇为碳源条件下反应器内各指标的变化

    Figure 3.  Variations of indices in reactor with ethanol as the carbon source

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    图 4  葡萄糖为碳源条件下反应器内各指标的变化

    Figure 4.  Variations of indices in reactor with glucose as carbon source

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    图 5  蔗糖为碳源条件下反应器内各指标的变化

    Figure 5.  Variations of indices in reactor with sucrose as the carbon source

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    图 6  NO−2-N最大积累时刻点的参数动力学分析

    Figure 6.  Analysis of kinetic parameters at maximum accumulation of NO−2-N

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    表 1  不同水质条件下的COD与NO−3-N浓度

    Table 1.  COD and NO−3-N concentration under different water quality

    碳源类型COD/(mg·L−1)NO−3-N /(mg·L−1)COD∶N
    乙酸钠4501004.5
    乙醇5001005
    葡萄糖6501006.5
    蔗糖6501006.5
    碳源类型COD/(mg·L−1)NO−3-N /(mg·L−1)COD∶N
    乙酸钠4501004.5
    乙醇5001005
    葡萄糖6501006.5
    蔗糖6501006.5
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    表 2  反硝化细菌的驯化时间

    Table 2.  Period for domestication of denitrifying bacteria

    碳源类型驯化时间/dMLSS/(g·L−1)MLVSS/(g·L−1)MLVSS∶MLSS
    乙酸钠172.651.980.746
    乙醇243.282.560.78
    葡萄糖262.752.230.812
    蔗糖304.43.50.795
    碳源类型驯化时间/dMLSS/(g·L−1)MLVSS/(g·L−1)MLVSS∶MLSS
    乙酸钠172.651.980.746
    乙醇243.282.560.78
    葡萄糖262.752.230.812
    蔗糖304.43.50.795
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-15
  • 录用日期:  2020-06-04
  • 刊出日期:  2020-09-10
付昆明, 杨宗玥, 刘凡奇, 仇付国, 曹秀芹. 碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
引用本文: 付昆明, 杨宗玥, 刘凡奇, 仇付国, 曹秀芹. 碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响[J]. 环境工程学报, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
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FU Kunming, YANG Zongyue, LIU Fanqi, QIU Fuguo, CAO Xiuqin. Effect of carbon sources on nitrogen removal in denitrification process of rural wastewater[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
Citation: FU Kunming, YANG Zongyue, LIU Fanqi, QIU Fuguo, CAO Xiuqin. Effect of carbon sources on nitrogen removal in denitrification process of rural wastewater[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(9): 2331-2338. doi: 10.12030/j.cjee.202001103
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碳源种类对农村污水反硝化过程脱氮效果的影响

    通讯作者: 付昆明, E-mail: fukunming@163.com ; 
    作者简介: 付昆明(1981—)，男，博士，副教授。研究方向：污水自养脱氮技术等。E-mail：fukunming@163.com
  • 北京建筑大学，城市雨水系统与水环境教育部重点实验室，中-荷污水处理技术研发中心，北京 100044
  • 收稿日期:  2020-01-15
  • 录用日期:  2020-06-04
  • 网络出版日期:  2020-09-05
基金项目:
北京建筑大学市属高校基本科研业务费专项(X18214)

摘要: 针对农村污水普遍存在碳源不足的问题，研究了不同碳源种类对反硝化脱氮过程的影响。选用SBR，以乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖为碳源，分别控制COD∶N值为4.5、5、6.5、6.5，对反应器脱氮速率以及氮素指标变化规律进行了研究。结果表明：投加乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖时，其平均反硝化速率分别为0.050、0.031、0.034、0.026 g·(g·h)−1；有机物结构越复杂，意味着代谢过程越复杂，反硝化所需时间亦相对延长；投加乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖时，当硝酸盐基本被完全消耗时，分别于第50、70、70、70 min时反应器中亚硝酸盐积累量达到了最大值；以葡萄糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率为42.5%；而以乙酸钠和乙醇为碳源时，最大亚硝酸盐积累率次之，分别为23.2%和19.5%；以蔗糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率最小，仅为7.0%。以上研究结果可为低浓度农村污水处理过程中针对外加碳源种类的选择提供参考。

English Abstract

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  • 随着我国城镇化进程和新农村建设的不断推进，村镇生活污水排放量也在逐渐增长。考虑到农村地区对优美生态环境的客观需要，有针对性地对农村污水进行治理是社会发展的必然趋势。目前，我国农村污水处理方式主要包括两类：一是靠近城镇排水管道的，纳入排水管道处理，通过管网将农户污水收集并统一处理；二是采用小型污水处理设备，以及自然生态处理等形式将单户或几户的污水就近处理利用[1]。相对于城镇污水而言，农村污水具有以下特点：污水来源复杂，不同地区的排放强度及规律各有差异；农村污水水量波动较为明显；村镇规模相对较小，且分布极为分散，不利于将污水集中处理；污水排放量不稳定，夜间排放量可以忽略[2]。这些不利因素对农村污水的高效治理构成了巨大挑战。

    2018年9月29日，住建部和生态环境部联合发布了《关于加快制定地方农村生活污水处理排放标准的通知》[3]。通知提到，农村生活污水500 m3·d−1以上规模(含500 m·d−1)的农村生活污水处理设施可参照执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)[4]执行；而处理规模在500 m3·d−1以下的农村生活污水处理设施，由各地可根据实际情况进一步确定具体处理规模标准。在此政策基础上，各省市纷纷制定了各自地方的排放标准。有些地方标准相对宽松，但有些却比较严格，对氮磷要求很高，例如北京市、天津市等。

    根据《室外排水设计规范》[5]，为了达到良好的脱氮效果，要求进水的BOD5/TKN宜大于4，而农村污水常常不满足这一要求。农村污水浓度往往较低，低浓度生活污水对生物脱氮影响的后果往往是出水总氮(TN)不达标[6]。其原因主要包括：雨污水合流的稀释作用、地下水渗入稀释作用、化粪池的不合理设置等[7-8]。为了满足日益严格的TN出水标准，尽管外加碳源一定程度上加重了污水厂的经济负担。但是，在缺氧区投加碳源是一条最为稳妥的方法，也是目前不同运营单位最常采用的一种方法。不同污水厂(站)在外加碳源时，采用的外加碳源不尽相同。选择合适的碳源，确定适合的碳源投加量是保证村镇低浓度污水处理达标排放的一条重要途径。

    对于农村污水而言，虽然处理工艺具有一定的差异，但主要脱氮原理基本上仍为传统的硝化-反硝化过程。其中，COD与磷酸盐浓度可分别通过曝气以及投加沉淀剂的方式达到排放标准，而脱氮过程则难以通过投加药剂这种立竿见影的形式迅速达标。因此，在农村污水处理的过程中，面临的主要困境往往是出水TN无法达标，为此需要进行深入研究，探究适宜的碳源类型。反硝化菌对不同类型有机物的代谢方式具有差异，其代谢速率各不相同；且不同反硝化菌属最适利用的碳源种类同样具有差异，投加不同种类的碳源可富集不同的反硝化菌属。为摸清不同碳源作为补充碳源对反硝化过程脱氮效果的影响，本研究采用乙酸钠、乙醇、葡萄糖和蔗糖作为碳源，对不同的反硝化过程的脱氮效果进行了探究。本研究可为农村污水处理过程中选用外加碳源的种类提供参考依据。

1.   材料与方法

    1.1.   实验装置

  • 实验装置采用4组SBR，用以驯化和培养反硝化污泥。其有效容积均为4.8 L，装置结构如图1所示。 SBR通过自控装置每天运行6个周期，每个周期包括：进水(10 min)→缺氧反应(160 min)→曝气(10 min)→沉淀(30 min)→排水/闲置(15 min)→搅拌(15 min)。缺氧段采用电动搅拌器搅拌，转速为96 r·min−1。曝气段采用曝气头曝气，控制DO在1.5~2 mg·L−1。设置曝气段的目的为，反硝化细菌体内某些酶只有在有氧条件下才能合成[9]；同时，曝气可以吹脱缺氧阶段产生的氮气，提高反硝化污泥的沉降性能。在下一个周期之前15 min开始搅拌以恢复反硝化细菌活性，使反硝化细菌保持最佳状态。每个周期排出1.6 L处理过的废水，并用蠕动泵泵入1.6 L人工配水，水力停留时间(HRT)=12 h。每天定时在搅拌结束后曝气开始前排一次泥，保证SRT为10 d左右。反应装置由定时装置控制周期循环运行。

    • 1.2.   接种污泥

  • 以乙酸钠、乙醇和葡萄糖为碳源的反硝化污泥接种北京某污水厂二沉池回流污泥；以蔗糖为碳源的反硝化污泥接种于已经驯化成功的以乙酸钠为碳源的反硝化污泥。将种泥按比例稀释，使得MLSS为1500 mg·L−1左右。

    • 1.3.   实验水质

  • SBR采用人工配水，分别以乙酸钠、乙醇、蔗糖和葡萄糖作为碳源，分别维持乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖4种碳源的碳氮比为4.5、5、6.5、6.5，以获得活性污泥的最佳驯化效果。硝酸钠为氮源。磷酸二氢钠为磷源。由于自来水里含有微生物生长所需的微量元素，故不再另外投加。进水水质主要指标如表1所示。

    • 1.4.   批次实验

  • 批次实验的反硝化污泥混合液分别取于稳定运行的SBR曝气之后，取出的污泥经沉淀、离心去除上清液，加入清水后再次进行沉淀、离心、去除上清液，重复上述步骤至少3次，以确保污泥中不再残留化学物质。将去除上清液后的污泥置于500 mL广口瓶中，加入不含NO−3-N和COD的配水液，摇晃均匀以配成悬浮液。

    用HCl或NaOH稀溶液调节pH为6.5，并向瓶中持续通入5 min氮气以去除混合液中氧气，之后将插有两根橡胶管的瓶塞将瓶口密封。2根橡胶管只有在取气样、水样时打开，其他时候均用夹子夹住。将NO−3-N和COD按SBR配水浓度分别配成50 mL浓缩液，在反应开始时，立即注射入广口瓶中，并将广口瓶置于磁力搅拌器上进行搅拌，转速为150 r·min−1。按原SBR的典型周期进行批次实验，温度为22 ℃，反硝化污泥在缺氧条件下运行，时间为160 min。 其中，反硝化速率按照式(1)计算。

    式中：V为反硝化速率，g·(g·h)−1；C0为起始NO−3-N或NO−2-N浓度，g·L−1；C1为终点NO−3-N或NO−2-N浓度，g·L−1；CMLVSS为混合液体挥发性悬浮固体浓度，g·L−1；t为反应时间，h。

    • 1.5.   分析方法

  • 活性污泥驯化阶段，每天定时在曝气前取1次水样，检测其NO−3-N、COD、pH；并在曝气前和曝气中分别检测DO，以确保反硝化系统正常运行。

    MLSS，MLVSS采用重量法；NH+4-N采用纳氏试剂分光光度法；NO−3-N采用紫外分光光度法；NO−2-N采用N-(1萘基)-乙二胺光度法；COD采用重铬酸钾法[10]。温度采用水银温度计测定；pH采用pHTestr 30型pH计测定；溶解氧采用Multi 3620 WTW型溶解氧仪测定。

2.   结果与讨论

    2.1.   驯化时间

  • 以乙酸钠、乙醇、葡萄糖和蔗糖为有机碳源时，认定单周期过程结束后，若反应器出水中不包含NO−3-N以及NO−2-N时，则反硝化菌驯化完全。反应器的反硝化脱氮效果达到稳定的时间如表2所示。由表2可知，乙酸钠的驯化时间最短，蔗糖的驯化时间最长，驯化时间大约为乙酸钠的2倍。有研究[11]表明，相对于乙醇、葡萄糖和蔗糖而言，反硝化细菌对乙酸的降解要更为容易，故反硝化细菌对于乙酸钠的适应性更强，所需的驯化时间则相对较短。

    • 2.2.   不同碳源的反硝化过程

  • 以乙酸钠为碳源时， NH+4-N、NO−3-N、NO−2-N和N2O的变化情况如图2所示。以乙酸钠为碳源时，NO−3-N迅速得到降解，在60 min内全部被反硝化完毕。这说明，硝酸盐的还原呈现零级反应[12]。平均比反硝化速率为0.050 g·(g·h)−1。

    NO−2-N浓度先增加后减少。在反应开始50 min内，NO−2-N浓度逐渐增加；待反应器内NO−3-N几乎被耗尽后，积累值达到最大23.2 mg·L−1；此后，NO−2-N浓度逐渐下降为0。这表明，在反硝化时，硝酸盐还原速率大于亚硝酸盐的还原速率，导致亚硝酸盐的积累，最高亚硝酸盐积累率23.2%，因为碳源充足，反应器出水中NO−2-N累积将会消失。

    反应周期内，气态的N2O总量为0.002 8 mg·L−1，溶解态N2O积累量出现2个峰值，分别出现在10 min和50 min，其值为1.23 mg·L−1和1.60 mg·L−1，N2O的产生源于亚硝酸盐的还原。后期N2O没有继续升高，亚硝酸盐还原速率与N2O还原速率基本稳定，而少量的N2O是因为溶液中没有溢出所致。

    反应中，NH+4-N浓度几乎保持稳定，说明NH+4-N浓度变化可以忽略。

    以乙醇为碳源时，各个指标的变化情况如图3所示。以乙醇为碳源时，与乙酸钠为碳源时相似，NO−3-N在70 min内迅速被反硝化完毕，平均比反硝化速率为0.031 g·(g·h)−1。NO−2-N浓度在70 min内达到最大值19.5 mg·L−1，即最高亚硝酸盐积累率19.5%；此后，NO−2-N浓度逐渐下降为0。

    NH+4-N浓度几乎保持稳定。气态的N2O总量为0.001 mg·L−1。溶解态N2O积累量在20 min内迅速升高到0.63 mg·L−1；之后缓慢升高到极大值1.25 mg·L−1；此后开始缓慢下降，至反应结束，浓度为0.67 mg·L−1。

    以葡萄糖为碳源时，各个指标的变化情况如图4所示。以葡萄糖为碳源时，NO−3-N迅速得到降解，在80 min内全部被反硝化完毕，平均比反硝化速率为0.034 g·(g·h)−1。在0~140 min内，NO−2-N浓度先增加后减少。在70 min内，NO−2-N积累值达到42.5 mg·L−1，最高亚硝酸盐积累率42.5%；此后，NO−2-N浓度逐渐下降为0。NH+4-N浓度在反应期间维持稳定。反应周期内气态N2O总量为0.023 mg·L−1。溶解态N2O首先缓慢增加后开始下降。0~110 min内，N2O浓度逐渐积累至5.43 mg·L−1，之后开始下降。

    以蔗糖为碳源时，各个指标变化情况如图5所示。以蔗糖为碳源时，NO−3-N在70 min内全部被反硝化完毕，平均比反硝化速率为0.026 g·(g·h)−1。NO−2-N的最大积累值为7 mg·L−1，最高亚硝酸盐积累率7.0%，最终NO−2-N也逐渐变为0。

    NH+4-N浓度在反应期间浓度保持稳定。气态N2O总量为0.002 5 μg·L−1。与乙醇为碳源时相似，溶解态N2O积累量在10 min内迅速升高到0.44 mg·L−1，之后缓慢升高到极大值0.66 mg·L−1，此后保持稳定。

    • 2.3.   不同碳源的反硝化效果分析

  • 在传统的城市污水处理过程中，往往采用硝化-反硝化工艺，其中氮磷的有效去除依赖于进水有机物的充分供给。农村污水的进水有机物浓度普遍较低，在处理低浓度污水的农村污水处理设施当中，进水COD浓度往往低于250 mg·L−1，BOD5则通常低于100 mg·L−1；此时，污水厂的同步脱氮除磷效果会由于反硝化菌与聚磷菌对于有机物的竞争过程而恶化，尤其不利于出水TN去除，甚至NH+4-N也无法满足排放标准[6]。因此，农村污水的脱氮过程更依赖于外加碳源的投加，选择合适的外加碳源有利于反硝化过程顺利进行，保证农村污水处理设施出水氮素的达标排放。

    硝酸盐还原包括同化反硝化和异化反硝化两大类。其中，同化反硝化最终形成有机氮化合物；异化反硝化中，包括常规反硝化和异化反硝化为氨两种路径(dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA)[13]。常规反硝化过程中，硝酸盐按照式(1)的路径[14-15]还原为氮气，依次由硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、氧化亚氮还原酶完成。

    本实验中，在不同碳源条件下，NH+4-N浓度变化情况基本相似，即反应期间保持稳定。有研究[16]表明，在反硝化过程中，NH+4-N和NO−2-N浓度都会发生显著变化。这是因为，在某些特定环境(氧化还原电位小于-200 mV、低DO、氮源受限而碳源丰富等)下，反硝化过程除了由NO−3-N向氮气转化的异化性硝酸盐还原路径之外，还会发生由DNRA作用[14]，同时某些特定反硝化菌群只具备DNRA能力[17]。YANG等[18]从反硝化污泥中分离出Pseudomonas stutzeri D6菌株，通过控制C/N比、DO、碳源种类(乙酸、葡萄糖、柠檬酸钠)等条件探究了其DNRA作用。而在本实验中，NH+4-N浓度并未发生明显变化。由此可知，本实验中反硝化过程只涉及常规反硝化过程(式(1))。

    以乙酸钠、乙醇、葡萄糖和蔗糖为碳源的各典型周期运行过程中，NO−3-N的比降解速率分别为0.05、0.03、0.03和0.02 g·(g·h)−1。其中，乙酸钠为碳源时，反硝化速率最快，乙醇和葡萄糖次之，蔗糖最慢。这是因为，乙酸能够与辅酶A结合形成乙酰辅酶A，直接进入三羧酸循环被微生物降解，而乙醇在为微生物利用的过程中需要先转化为乙酸才能进而被降解。葡萄糖作为较复杂的有机物，同样需要经过两个氧化过程才能得以降解：第1步，反硝化细菌将其氧化得到丙酮酸和ATP；第2步，丙酮酸进入三羧酸循环时被丙酮酸脱氢酶复合物转化为乙酰辅酶A[19]。因此，有机物结构越复杂，意味着代谢过程越复杂，反硝化速率也就越慢。由此可知，由1个葡萄糖分子和1个果糖分子组成的蔗糖，有机物结构最复杂，导致其反硝化速率最慢。

    由图2~图5可以看出，各碳源的典型周期内，反应器中均出现NO−2-N积累。以NO−3-N为氮源的反硝化过程中，NO−2-N来源于常规反硝化。在反应周期内，NO−2-N均出现短暂积累情况，浓度均先升高后降低，并逐渐趋于0。葡萄糖为碳源时，最大NO−2-N积累率最大，为42.5%，乙酸钠和乙醇次之，分别为23.2%和19.5%，蔗糖最小，仅为7.0%。

    值得注意的是，从图2~图5中还可以发现，在4种碳源条件下，对应的NO−2-N浓度均是在NO−3-N即将耗尽时达到最大值的。计算各最大积累值时刻点对应的NO−3-N浓度之前和之后的实测降解速率，分别以NO−3-N左和NO−3-N右表示，然后用NO−3-N左减去NO−2-N实测积累速率，即得到NO−2-N的真实降解速率(即Nir酶的降解速率)，如图6所示。在SBR乙酸钠中，当NO−2-N最大积累时，NO−3-N的降解速率由0.041 g·(g·h)−1骤降为0.016 g·(g·h)−1，由NO−3-N降解速率减去NO−2-N积累速率得到的NO−2-N降解速率为0.036 g·(g·h)−1；若要使得NO−2-N继进行积累，NO−3-N的降解速率至少应为0.036 g·(g·h)−1，而此时NO−3-N的降解速率显然并不能满足，故而NO−2-N浓度开始下降。这表明，NO−2-N的降解是滞后于NO−3-N的。

    从电子传递角度而言，NO−2-N作为电子受体所需的电子需要从细胞质膜的周质获得，这使得其获得电子滞后于NO−3-N [20]。此外，如果细胞内氧化代谢产生的还原黄素达到饱和，NO−3-N和NO−2-N在底物电子的获取上将形成竞争，而Nar酶对电子的亲和力强于Nir酶[15]。同时，有些反硝化细菌种群细胞内只含有Nar酶，而没有Nir酶，也就是其不具备将NO−3-N向NO−2-N转化的能力，如Comamonadaceae属[20]。这些都将使得NO−2-N的降解落后于NO−3-N，从而导致以NO−3-N为氮源的反硝化脱氮过程中出现NO−2-N短暂积累的现象。GE等[19]在研究以乙酸、甲醇、葡萄糖等为碳源的反硝化过程中也发现了相同的现象。

    由碳源种类导致的NO−2-N最大积累值存在差异的情况同样也出现在很多研究[19, 21]中，乙酸、丙酸、乙醇等为碳源时出现较多NO−2-N积累；但丁酸、戊酸、己酸等却仅出现少量甚至并未出现积累。在本实验中，葡萄糖为碳源时，反硝化过程中NO−2-N的最大积累值是4种碳源之首，乙醇和乙酸钠次之，蔗糖最少。有研究[22]指出，有机物本身作为电子供体，对Nar酶和Nir酶的亲和力不同使得NO−3-N和NO−2-N降解速率的差值不同，将导致NO−2-N积累值不同。而碳源种类作为营养物质，若长期对反硝化细菌进行培养，将改变菌群结构，使得微生物群落中所含的Nar酶和Nir酶的数量发生改变，从而导致NO−2-N积累值发生显著变化。LU等[23]发现，在以乙酸和乙醇为碳源的反硝化细菌中，Thauera属占主导，而Thauera中Nar酶的数量要比Nir酶多；而GLASS等[24]发现，以葡萄糖为碳源的反硝化细菌中Comamonadaceae属则占主导，而Comamonadaceae属中的一些菌株，如Acidovorax facilis株，并不具备Nir酶系统，这将导致以葡萄糖为碳源时，NO−2-N积累现象更显著。但是，在阎宁等[25]的实验中，葡萄糖为碳源时并未出现或只出现少量NO−2-N积累的现象。这表示，NO−2-N积累除了与微生物结构和碳源种类有关，还与其他环境控制条件有关，如温度、pH、碳源适应时间等。

3.   结论

  • 1)针对农村污水处理过程中普遍存在碳源不足的问题，可通过投加外加碳源以保障污水处理过程中具有稳定的TN去除率。

    2)采用乙酸钠，乙醇，葡萄糖，蔗糖时作为外加碳源时，反硝化脱氮实现稳定的时间分别为17、24、26、30 d，其平均反硝化速率分别为0.050、0.031、0.034和0.026 g·(g·h)−1，即硝酸盐还原速率依次降低。

    3)在反硝化过程中，外加碳源均出现了显著的亚硝酸盐积累，在硝酸盐耗尽时，出现亚硝酸盐的最大值。

    4)以葡萄糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率为42.5%；而以乙酸钠和乙醇为碳源时，最大亚硝酸盐积累率次之，分别为23.2%和19.5%；以蔗糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率最小，仅为7.0%。

参考文献 (25)

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