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基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

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徐晓庆, 苏命, 朱宜平, 崔长征, MUHAMMAD Suruzzaman, 徐亚楠, 于建伟, 杨敏. 基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用[J]. 环境工程学报, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
引用本文: 徐晓庆, 苏命, 朱宜平, 崔长征, MUHAMMAD Suruzzaman, 徐亚楠, 于建伟, 杨敏. 基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用[J]. 环境工程学报, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
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XU Xiaoqing, SU Ming, ZHU Yiping, CUI Changzheng, MUHAMMAD Suruzzaman undefined, XU Yanan, YU Jianwei, YANG Min. Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
Citation: XU Xiaoqing, SU Ming, ZHU Yiping, CUI Changzheng, MUHAMMAD Suruzzaman undefined, XU Yanan, YU Jianwei, YANG Min. Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
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基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

  • 1.

    华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237

  • 2.

    中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085

  • 3.

    上海城投原水有限公司，上海 200125

    • 作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com
    通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn; 
  • 基金项目:
    国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07108-002-02)；国家自然科学基金资助项目(51878649)

  • 中图分类号: X832

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

  • 1.

    State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process, School of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

  • 2.

    State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

  • 3.

    Shanghai Chengtou Raw Water Co. Ltd., Shanghai 200125, China

    • Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ; 

摘要

  • 摘要: 我国地表水源中由丝状蓝藻代谢产生2-甲基异莰醇(2-MIB)导致的嗅味问题十分普遍。由于传统显微镜检测方法无法鉴别产嗅藻种，不能满足水源水质管理要求，故有必要构建能特异性表征水体产嗅潜力的检测方法。由于丝状藻代谢产生2-MIB主要受其合成功能基因调控，设计了2-MIB功能基因引物，经引物特异性检验及PCR条件优化后，构建了基于2-MIB功能基因的定量PCR方法，并采用实际环境样品进行测试与验证。结果表明：引物特异性良好，定量PCR方法能有效检测2-MIB功能基因，并绘制了标准曲线，得出检测限为8.44×102 copies·L−1；实际样品测试结果显示其2-MIB功能基因浓度在2.09×107~1.94×1010 copies·L−1范围内，与基于仪器分析方法测定的2-MIB浓度符合线性关系(R2=0.63，P<0.01)，表明定量方法可行。该方法具有灵敏性高、特异性好的特点，能特异性检测产嗅基因，可应用于水源地中产嗅潜力评估与预警。
    Abstract: Two-methylisoborneol (2-MIB) is a typical secondary metabolite released from cyanobacteria which causes off-flavor odor problem in surface water across China. Microscopy is the traditional method to identify such cyanobacteria. However, merely it is troublesome to distinguish between 2-MIB producers and non-producers by morphological structure and cannot meet the requirement of the source water quality management. It is necessary to build the test method which can specifically characterize the odor-producing capacity of waterbody. Due to the functional gene regulation for 2-MIB yield from cyanobacteria, the primers of 2-MIB function gene were designed and its specificity test was performed, then the PCR conditions were optimized. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) can be an alternative method to evaluate 2-MIB syntheses which is controlled by 2-MIB functional gene. Here, 2-MIB identification primers (MIBF/MIBR) have been designed and tested with field samples. A good standard curve was established, R2=0.999 5, P<0.01, and the detection limit was 8.44×102 copies·L−1. The concentrations of 2-MIB gene of field samples were between 2.09×107 copies·L−1 to 1.94×1010 copies·L−1, which were significantly conformity with 2-MIB concentrations measured by GC-MS (R2=0.63, P<0.01). The high sensitivity and specificity of this qPCR-based method suggests that it can effectively evaluate the risk of 2-MIB occurrence and able to monitor source water quality management.

  • 随着时代不断发展，城市内涝频繁发生，排水管网淤堵问题备受人们关注。排水管道沉积物是污水中的可沉降颗粒物，在排水管网运行过程中，这些颗粒物在适当条件下发生沉降并逐渐积累，形成底层沉淀物沉积在排水管道中[1]。沉积堵塞排水管网的物质主要包括有机物、无机物以及固体垃圾[2]。管网沉积物中所含的有机质一般是复杂的高分子物质，如脂类、糖类、蛋白质、动植物腐殖质以及微生物等[3]。也有研究将管网沉积物分为3类：底层粗颗粒沉积物、有机层和生物膜[4]。其中，生物膜通常形成于水面附近的管壁，或受扰动作用较小的沉积物表面上，由覆盖在有机质上的微生物构成[5]。胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)作为微生物的重要组成部分，其主要成分为多糖、蛋白质、核酸、脂肪、胞外 DNA 等[6]，具有粘性和吸附性，对排水管道的淤积及冲刷具有重要影响。传统的管网机械清淤方法均存在人工消耗量大，施工过程中影响道路交通等问题。因此，探究生物或化学方法来减缓管网中沉积物的沉积速率，降低管网清淤与维护频率是解决排水管网淤堵问题新的研究方向。

    相关研究表明，利用纤维素酶或蛋白酶可破坏污泥EPS，促使污泥颗粒变得细小分散，污泥颗粒比表面积增大，酶与细胞接触面积增加，并且EPS 的分解还降低了其对污泥细胞的保护作用，进而提高了酶对污泥的水解效率[7]。YANG等[8]研究发现经酶解后，污泥细胞破解，胞内物质流出，大大提高了污泥后续厌氧消化的效率并缩短了污泥消化时间。此外，LU等[9]报道了酸性处理过程中污泥内部酶(蛋白酶和α-葡萄糖苷酶)的释放也可以增强厌氧发酵污泥的破解。

    同时，在污泥处理方面，表面活性剂也有其不可或缺的作用。表面活性剂的增溶作用和分散作用[10]使胞外聚合物脱离污泥溶于液相[11]；而表面活性剂结构中自带的疏水烷基可与细胞壁相互作用，导致细胞溶解，破坏细胞结构和EPS[12]。王怡等[13]研究表明，添加SDS(十二烷基硫酸钠)可以促进剩余污泥水解，EPS中溶解性蛋白质和多聚糖含量大幅增加，污泥的粒径变小、比阻变大。WANG等[14]研究发现阴离子表面活性剂SDS可以增加体系中的负电荷，EPS与SDS之间的静电排斥和疏水相互作用使污泥中的EPS大量释放。LUO等[15]研究了SDS与酶制剂联合作用对剩余污泥水解酸化的影响，结果表明，组合体系比单一SDS和单一酶体系更能有效促进污泥水解，SDS和复配酶体系优于SDS和单一酶体系的水解性能。由于表面活性剂联合生物酶技术不仅反应条件温和，对管道无腐蚀和破坏性，并且两者联合对管网中有机沉积物具有较好的水解作用，有利于降低沉积物间的黏性，促进有机质从固相向液相转移，强化其冲刷性能，从而为解决排水管网淤堵问题提供新的解决方法，但目前尚未有关于该方面的报道。

    基于对排水管网中沉积物的性质分析，根据课题组前期研究结果，本研究在确定复配酶(α-淀粉酶∶中性蛋白酶=2∶3)投加量的质量百分比为8%的条件下，探究不同SDS投加量、反应温度、初始pH(7.28±0.3)和反应时间对SDS+复配酶体系对沉积物水解效果的影响，根据反应前后沉积物EPS、三维荧光、粒径和SEM(scanning electron microscope)表征结果对其水解沉积物的机理进行了深入分析；采用高通量测序技术对经复配酶(α-淀粉酶∶中性蛋白酶=2∶3)、SDS+复配酶(α-淀粉酶∶中性蛋白酶=2∶3)水解后的排水管网沉积物中微生物群落结构与功能菌群的影响进行了分析，探讨了不同方法对微生物群落结构的影响。

    1.   材料与方法

    1.1   污泥样品

    实验所用管网沉积物取自天津市某排水管道检查井，取回的污泥样品封装于样品袋中，存放在４ ℃冰箱内里冷藏待用。该沉积物样品的相关特性指标为：有机质含量为 (56.39±0.81)%，pH=7.28±0.3；沉积物上清液中SCOD(soluble chemical oxygen demand)值为 (206.9±16.9) mg·L−1、氨氮为 (85.03±2.53) mg·L−1、多糖为 (18.14±2.16) mg·L−1、蛋白质为 (0.08±0.01) mg·mL−1。

    1.2   实验试剂和仪器

    所用试剂主要包括中性蛋白酶、α-淀粉酶、SDS、氯化钠、COD专用耗材、氢氧化钠、苯酚、氯化氢、无水乙醇、纳氏试剂等。其中，实验所用酶制剂基本性质及来源见表1，其他化学试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

    表 1  生物酶基本性质
    Table 1.  Basic properties of biological enzymes
    生物酶种类 酶活性/(U·g−1) 适宜温度/ ℃ 适宜pH 来源
    中性蛋白酶 2×105 50~55 6.0~7.0 合肥博美生物科技有限公司
    α-淀粉酶 4 000 60~70 6.0~7.0 上海源叶生物科技有限公司
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    实验主要仪器包括 YH-3BS远红外线恒温干燥箱(天津中环)；SX-GO7103马弗炉(天津中环)；MY3 000-6B混凝实验搅拌仪器(武汉梅宇仪器)；721型可见分光光度计(上海佑科)；VELOCITY 18R台式多功能离心机(Dynamica公司)；FY-1C-N真空泵(浙江飞越)；G9 800A三维荧光激发-发射光谱仪(美国安捷伦)；PHS-3E型pH计(雷磁)；HH-4电热恒温水浴锅(绍兴苏珀)。

    1.3   实验方案

    取100 mL排水管网沉积物置于250 mL烧杯内，通过0.1 mol·L−1的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至 5~10；将烧杯放入水浴锅预热，使沉积物到目标温度(4~65 ℃)后；加入8%(质量百分比，酶质量与沉积物干质量比)污泥的复配酶(α-淀粉酶:中性蛋白酶=2:3)，并加入0、1%、2%、5%、8%和10%(质量百分比)的SDS；在200 r·min−1下搅拌，连续反应 0~6 h。反应结束后，取部分污泥进行有机质含量的检测，将剩余部分污泥置于离心管中，在4 000 r·min−1下离心15 min，离心后取上清液经0.45 μm滤膜过滤；检测滤液中SCOD、氨氮、多糖，每个实验重复3次，取平均值分析４个因素对SDS促进复配酶水解排水管网沉积物的影响，确定其最佳反应条件，并分析最佳反应条件下的上清液EPS、三维荧光光谱、沉积物表面结构形态和粒径的变化。

    1.4   测定方法

    氨氮采用纳氏分光光度法进行测定；溶解性化学需氧量(SCOD)采用快速消解分光光度法测定；多糖采用苯酚-硫酸法测定；蛋白质含量选用改良Lowry法测定；沉积物中有机质含量测定采用《中华人民共和国城镇建设行业标准》(CJ/T96-1999)中有机质灼烧法。EPS采用热提取法，EPS中各类物质变化采用三维荧光扫描光谱仪(安捷伦1260)检测；沉积物表面形态采用扫描电子显微镜 (7610F，日本电子株式会社) 分析。采用16s rRNA高通量测序方法表征微生物群落结构变化。

    2.   结果与讨论

    2.1   SDS投加量对沉积物水解效果的影响

    实验在原泥pH(7.28±0.3)，8%(质量百分比)复配酶(α-淀粉酶：中性蛋白酶=2:3)、25 ℃反应2 h的条件下，SDS投加量对排水管网沉积物水解效果的影响结果见图1。由图1(a)可以看出，当SDS投加量在0%~5%时，SCOD与多糖浓度随SDS投加量增多而增长，在SDS投加量为5%时，SCOD和多糖达到峰值，分别由初始的5 686.9 mg·L−1和1 913.75 mg·L−1升至8 192.9 mg·L−1和3 561.29 mg·L−1；当投加量继续增加到10%，SCOD与多糖含量反而下降，在10%时，SCOD和多糖分别下降到7 545.9 mg·L−1和2 484.92 mg·L−1。由图1(b)可以观察到，氨氮与SCOD、多糖变化趋势相同，在SDS投加量为5%时，由原始的87.32 mg·L−1达到峰值的153.37 mg·L−1。有机质含量的变化与氨氮、SCOD、多糖变化趋势相反，在SDS投加量为5%时，有机质含量最低，为55.59%；当SDS投加量继续增大，有机质减量效果稍有提高，但与SDS投加量为5%时相差无几。有研究[16]表明，SDS作为酶调节分子，在较低剂量下可增强酶活性，在较高剂量下反而会抑制酶活性。这是由于SDS为阴离子表面活性剂，可以与带负电的沉积物发生静电排斥[14]，在SDS含量为0%~5%，随投加量增加，沉积物更加分散，更利于复配酶与沉积物中有机质的接触，从而促进水解作用的发生；但当SDS投加过量时，SDS的烷基可与细胞壁结合，导致细胞破裂，从而部分影响微生物的活性，进而影响污泥水解效果[17]。因此，过低或过高的SDS均不利于生物酶对沉积物的水解。

    图 1  SDS投加量对沉积物水解效果的影响
    Figure 1.  Effect of SDS dosing on the hydrolysis effect of sediment
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    2.2   反应时间对沉积物水解效果的影响

    投加8%复配酶与5%SDS后，沉积物水解效果随反应时间的变化情况如图2所示。由图2可以看出，SCOD、多糖和氨氮随反应时间呈现先升高后下降的趋势。在反应2 h时，SCOD、多糖和氨氮含量分别由初始的211.3、18.38和87.32 mg·L−1升至9 726.5、3 868.84和185.12 mg·L−1。SDS的投加破坏了沉积物中微生物分泌出的EPS内部的非共价键，从而破坏沉积物结构，导致内部物质向外释放，促进了酶与沉积物之间的接触反应，从而使得SCOD、多糖和氨氮含量升高。随着反应时间继续延长，上清液中的SCOD、多糖与氨氮均开始了不同程度的下降，在6 h时，SCOD、多糖与氨氮质量浓度分别为3 581.5、3 056.05、156.09 mg·L−1。这可能是因为复配酶与SDS的协同作用随时间延长，沉积物的水解效果减弱，同时管网微生物对溶出物质进一步分解和利用[18]，SCOD、多糖、氨氮的生成速率小于消耗速率，使得上清液中各物质浓度降低。有机质含量随反应时间呈现出一直下降的趋势，这说明水解反应在0~6 h内一直在进行，且在4 h后有机质分解速率变慢。综上所述，选择SDS协同复配酶水解排水管网沉积物的最佳反应时间为2 h。

    图 2  反应时间对SDS+复配酶水解沉积物效果的影响
    Figure 2.  Effect of reaction time on the hydrolysis effect of sediment by SDS+compound enzyme
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    2.3   温度对沉积物水解效果的影响

    实验在原泥pH(7.28±0.3)，反应2 h，5%SDS与8%复配酶协同作用下，考察了温度对沉积物水解效果的影响，结果如图3所示。从图3可以看出，在4~65 ℃内，SCOD和氨氮随温度的升高而升高，多糖先升高后趋于平缓，有机质含量随温度的升高逐渐下降，随后变得平缓。当温度由4 ℃升至65 ℃时，SCOD由5 341.0 mg·L−1逐步升至8 983.0 mg·L−1；多糖由1 100.96 mg·L−1升至3 649.16 mg·L−1；氨氮由96.44 mg·L−1升至176.84 mg·L−1。有机质含量在4~35 ℃内下降较快，由开始的56.58%下降到54.69%，降低了1.89%；在35 ℃后随温度的升高，有机质含量保持在54.65%左右。这可能是由于温度升高，中性蛋白酶和α-淀粉酶的活性基团逐渐被激活，酶制剂活性增强，并且在SDS的增溶作用下，酶制剂和沉积物的接触更加充分，水解效果更好。在上述SDS与复配酶的协同作用下，液相中的蛋白质被分解为多肽以及小分子氨基酸，碳水化合物被水解成多糖与单糖[19]，水解效果增强，溶解性有机物浓度提高。

    图 3  温度对SDS+复配酶水解沉积物效果的影响
    Figure 3.  Effect of temperature on the hydrolysis effect of sediment by SDS and compound enzyme
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    根据实验结果，在反应温度高于15 ℃时，SDS协同复配酶的水解效果较好，而市政污水管网常年在8~35 ℃，因此，综合考虑项目经济性和实用性，在实际应用过程中，生物酶水解排水管网沉积物可选择管网温度在15 ℃以上时进行。

    2.4   pH对沉积物水解效果的影响

    本实验考察了5%SDS与8%复配酶在25 ℃，反应2 h条件下，不同pH对沉积物水解效果的影响结果见图4。由图4(a)可以看出，SCOD与多糖在pH=5~6保持一个平稳的数值，当pH升高为8时，二者均有不同程度的提高，SCOD与多糖分别由pH=6的4 830.4 mg·L−1 和2 369.82 mg·L−1提高到pH=8的5 895.4 mg·L−1和2 660.64mg·L−1；当pH进一步升高为8~10时，SCOD与多糖含量几乎不变。由图4(b)可以看出，氨氮含量随pH增加而下降，氨氮由pH=5的152.87 mg·L−1降到pH=10的82.83 mg·L−1。这是由于碱性条件下氨氮容易从液相转移到气相中，从而使得氨氮含量出现大幅度下降[20]。在pH=5~9，有机质含量随着pH的增加逐渐下降，从57.08%下降到55.09%，当pH增加到10时，有机质含量出现回升。结合图4(a)，在pH=10时SCOD、多糖含量变化不大，说明pH继续增大不能继续提升沉积物水解效果。在pH=7~9内，SDS+复配酶对排水管网沉积物的水解效果较好，而实际管网中沉积物pH大概在7~8，因此，在实际应用过程中不需要进行pH调节。

    图 4  pH对SDS+复配酶对沉积物水解效果的影响
    Figure 4.  Effect of pH on the hydrolysis effect of sediment by SDS+compound enzyme
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    2.5   SDS协同复配酶对沉积物EPS的影响

    沉积物中存在微生物，微生物日常生长代谢会产生有粘性的EPS等物质，增加了沉积物的抗冲刷能力；同时，EPS还能吸附污水中的有机颗粒，增加排水管网沉积物厚度和管网淤堵的风险。复配酶可水解沉积物中蛋白类与糖类物质，SDS的两亲性可以改变界面处的能量关系，增加EPS的溶解[21]。研究了复配酶协同SDS水解管网沉积物对EPS及其蛋白质与多糖浓度变化的影响，结果见图5。从图5(a)可以看出，在复配酶投加量为8%，水解2 h条件下，沉积物上清液中TB-EPS(tightly bound EPS)、LB-EPS(loosely bound EPS)与S-EPS(soluble-EPS)的多糖与蛋白含量均随着SDS投加量的增加呈现先升高后下降的趋势，各层EPS总含量变化趋势为S-EPS>LB-EPS>TB-EPS，其中TB-EPS向S-EPS转移。有研究表明，表面活性剂的两亲性使得SDS有一定的的分散作用，可以通过其疏水性与细胞膜蛋白相互作用，这可能导致沉积物的侵蚀[22]；当SDS与复配酶协同水解沉积物时，可以大大削弱LB-EPS与TB-EPS的结合[23]，使得沉积物发生更严重的裂解和内部生物聚合物的释放，使不溶性的EPS剥离从而进入沉积物上清液中，同时内层TB-EPS向外部转移，TB-EPS含量下降，LB-EPS与S-EPS增多，EPS中可溶性蛋白质与多糖含量增加。

    图 5  复配酶与SDS协同作用对沉积物EPS的影响
    Figure 5.  Effect of synergistic interaction of SDS+compound enzyme on sediment EPS
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    图5(b)为不同SDS投加量下EPS总量的变化情况。可以看出，随投加量增多，EPS含量先升高后基本不变。由于SDS具有增溶作用，大量大分子物质脱离沉积物固体溶解于液相[24]，从而释放出更多的蛋白质、多糖等物质到EPS中，使其含量增多。但由于表面活性剂在较低剂量(0~5%)下增强酶活性，在较高剂量(5%~10%)下抑制酶活性[16]，因此在SDS投加量高于5%后，随着SDS投加量进一步增加，复配酶失活，水解效果降低。

    2.6   三维荧光光谱分析溶解性有机物的变化

    中性蛋白酶与α-淀粉酶能够破解复杂的高分子物质，例如蛋白质、碳水化合物等，将一部分难降解物质水解，并释放之液相。而SDS具有增溶的特性，能够加快非液相物质溶解到水中的速度，同时也会释放被沉积物捕获的酶制剂，暴露出更多的底物[25]，从而促进沉积物中有机质的水解，增加进入液相中溶解性有机物的含量。而三维荧光光谱可以分析污泥中溶解性有机物的种类及分布，不同区域和不同荧光强度代表不同物质及相应的浓度。

    由图6可以明显看出，经SDS+复配酶组处理后的沉积物上清液EPS中，I~III区域荧光强度较复配酶组大幅度下降。表明在投加SDS后，酪氨酸、色氨酸与富里酸类物质含量减小甚至消失。左锦静[26]研究表明，SDS与蛋白质之间可以通过疏水作用自发结合，SDS作为淬灭剂对蛋白质进行淬灭，使得三维荧光光谱中蛋白质类物质几近消失；IV区域内的荧光强度和范围略有缩减，这可能是因为SDS具有抑菌性，随着反应时间的延长，导致沉积物中部分微生物死亡，可溶性微生物代谢产物含量降低；V区域所代表的腐殖酸类为五类可溶性有机物中的主要物质，与经复配酶处理后的沉积物上清液的三维荧光光谱图进行对比可以看出，SDS+复配酶的投加使得沉积物上清液中腐殖酸含量急剧增加，且又出现了一种新的腐殖酸物质(Ex/Em为390~440 nm/440~500 nm)，这2种腐殖酸浓度由内向外逐渐递增。一方面，SDS的两亲性使得复配酶更容易接触沉积物内部，释放出更多的物质，如腐殖酸；另一方面，微生物对腐殖酸利用率较低，容易在EPS中沉积，沉积物释放出的可溶性微生物副产物等物质更容易被微生物利用或被上清液中溶解的复配酶水解成小分子物质，导致腐殖酸含量高，溶性微生物副产物含量低。有研究[27]表明，腐殖酸浓度可以反映EPS溶解的程度，这也说明沉积物中腐殖酸类物质占比较高，腐殖酸浓度越大，溶解性EPS越多，沉积物水解减量效果越好。

    图 6  复配酶与SDS+复配酶处理后沉积物EPS荧光光谱变化
    Figure 6.  Changes in EPS fluorescence spectra of sediment after treatment by compound enzyme and SDS+compound enzyme
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    2.7   SEM表征

    SEM可较直观的反映出沉积物水解前后表面微观结构的变化，经SDS+复配酶、复配酶水解后的沉积物表面结构变化如图7所示。沉积物在被SDS+复配酶、复配酶水解后均出现密集多孔的表面形态，说明SDS+复配酶与复配酶对沉积物均有明显的破坏效果。经SDS+复配酶处理后，沉积物表面层状更多，说明SDS的增溶作用会打破沉积物紧密连接的结构，使得复配酶能够与更深层的沉积物的接触反应，进而促进水解反应的发生。同时疏松多孔的表面形态使得沉积物更容易被水力冲刷，有利于达到延缓管网淤堵和沉积物减量化的目的。

    图 7  复配酶处理后及SDS+复配酶作用后沉积物表面微观结构
    Figure 7.  Surface microstructure of sediment treated by compound enzyme and SDS+compound enzyme
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    2.8   SDS+复配酶对粒径变化的影响

    在复配酶投加量为8%的条件下，SDS投加量对沉积物粒径的影响结果见图8。可以看出，粒径>300 μm沉积物的质量占比由单独投加复配酶的48.25%下降到5% SDS投加量下的36.94%，随后SDS增加，此粒径沉积物的占比又增加；粒径在150~300 μm内的沉积物质量占比由独投加复配酶的21.05%升高到8%SDS的24.20%左右，随后其质量占比随SDS投加量增加而减小；粒径在75~150 μm内沉积物的质量分数由16.75%升至2%SDS下的23.5%，随后SDS投量增加，质量占比保持在22.0%左右；粒径<75 μm的沉积物质量分数占比由单独投加复配酶的13.95%升高到5%SDS的17.14%，随后SDS投量增加，其质量占比下降。

    图 8  不同投加量SDS处理后沉积物粒径变化情况
    Figure 8.  Variation of particle size after SDS treatment with different dosage
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    以上结果表明，在SDS+复配酶协同水解沉积物的过程中，随着SDS投加量的增加，在粒径>300 μm时，沉积物质量占比均有明显下降；小粒径占比增多。SDS的投加量在0%~5%内，投加量的增多会促进大颗粒物质向小颗粒转化。但当SDS投加量大于5%时，SDS对复配酶的水解起抑制作用，大颗粒向小颗粒转化效果变差。

    2.9   SDS协同复配酶水解排水管网沉积物微生物分析

    1)排水管网沉积物Alpha多样性。利用16S rRNA基因测序技术对原沉积物和分别经复配酶、SDS+复配酶处理沉积物的菌群结构进行Alpha多样性指数分析，结果见表2。OTUs大小可反应样品中物种多样性[28]。由表2可知，原泥OTUs数量最多，投加复配酶后，OTUs数量显著降低，而采用SDS+复配酶处理后，OTUs又有大幅度回升。表明单独采用复配酶可降低管网菌种数量，但采用SDS与复配酶联用可减少对管网中微生物多样性的影响。Shannon和Simpson指数也表明，经过复配酶处理后的样品中，这2个指数均出现明显下降，而经SDS+复配酶处理后的样品Shannon和Simpson指数与原泥相比相差不大，说明微生物多样性和均匀性没有出现很大改变。本次实验中4组样品的覆盖率均大于0.98，表明本次微生物测序的有效性和可靠性。

    表 2  微生物alpha多样性指数分析
    Table 2.  Microbial alpha diversity index analysis
    样本 OTUs Chao1 Shannon Simpson 覆盖率
    原泥 1 471 2 090 6.52 0.95 0.98
    复配酶 (中性蛋白酶:α-淀粉酶=2:3) 791 1 086 4.84 0.88 0.99
    SDS+复配酶 (中性蛋白酶:α-淀粉酶=2:3) 1 294 1 934 6.22 0.95 0.98
     | Show Table
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    2)基于OTU的微生物群落Venn图分析。各组样品间的OTU彼此关联，根据3组沉积物样品测定的OTU数据，绘制了3组样品OTUs的Venn图，以反映不同处理条件下沉积物样品的物种多样性差异[29]。由图9可以看出，原泥组(A)、复配酶组(B)和SDS+复配酶组(C)样品的OTU数目分别为2 098、1 273和2 001，相较于原泥，各组OUT数均有不同程度的降低，表明在投加酶制剂后，物质多样性出现了不同程度的下降[30]，其中复配酶下降最明显，而SDS+复配酶与原泥相差较小，这也与表2的结果一致。Venn图的重叠部分代表了不同样品的共有OTU，可知 3 组样品的共有OTU数为783，占总OTU数(2 647)的29.58%，说明酶制剂的投加会对排水管网沉积物中的微生物丰富度和多样性造成一定的影响[31]。

    图 9  不同处理条件下基于OTU的微生物群落Venn图
    Figure 9.  Venn diagram of OTU-based microbial communities under different treatment conditions
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    3)微生物属水平群落结构及功能菌群分析。观察了属水平上微生物群落结构演替(图10)，沉积物经复配酶、SDS+复配酶处理后，Sulfurovum (反硝化硫菌)的相对丰度均有不同程度的增加，分别从原沉积物的5.02%增加为34.53%和14.85%，其中复配酶组增幅最大。这可能由于投加酶制剂后，沉积物中大分子物质溶出，氨氮升高，可能硝态氮也有所升高，有利于Sulfurovum的繁殖。Caldisericum(嗜热、硫代硫酸盐还原细菌)与Methanosaeta(甲烷丝菌属)在投加复配酶、SDS+复配酶后，相对丰度均出现下降的现象。Methanosaeta(甲烷丝菌属)在原沉积物、复配酶和SDS+复配酶中所占比例分别为8.09%、1.34%和5.33%。Methanosaeta属于产甲烷菌(MA)的一种，其新陈代谢会产生CH4和CO2，此菌种所占比例减少，一定程度上也会降低排水管道中CH4产量。Caldisericum的变化趋势与Methanosaeta相同，复配酶组、SDS+复配酶组相对丰度均小于原沉积物，表明经SDS+复配酶处理后会减少管网中H2S的产量，这有利于管网的后续维护。Uncultured表示未能在人工条件下获得纯培养的微生物。

    图 10  各组沉积物属水平相对丰度
    Figure 10.  Relative abundance at genus levels for each treated sediment group
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    3.   结论

    1)采用SDS+复配酶可有效水解排水管网沉积物，在原泥pH(7.28±0.3)、25 ℃下反应2 h，沉积物上清液中SCOD、多糖和氨氮分别由初始的5 686.9、1 913.75和87.32 mg·L−1升至8 192.9、3 561.29和153.37 mg·L−1，有机质含量由56.32%降到55.59%，促进了有机质从固相向液相的转移。

    2) SEM、EPS、粒径以及三维荧光光谱表征分析结果表明，SDS+复配酶处理管网沉积物后其内部紧实结构被破坏、粒径尺寸变小；在SDS投加量为0~5%内，随着投加量的增多，各层EPS总含量变化趋势为S-EPS>LB-EPS>TB-EPS，其中TB-EPS向S-EPS转移；与单独复配酶水解沉积物效果相比，SDS+复配酶水解沉积物过程中腐殖酸类物质由内向外转移，且荧光强度增强，溶解性EPS增多。这有利于破坏沉积物紧密连接的结构形态，降低沉积物黏性，增加被冲刷性能，延缓排水管网淤堵。

    3) SDS+复配酶在一定程度上改变了沉积物中的功能菌群，使得沉积物中Sulfurovum相对丰度增加，而Caldisericum与Methanosaeta相对丰度下降，这对减少管网中CH4、H2S等的产生具有积极作用。SDS+复配酶对微生物的影响会降低管网内部的生化反应，有利于管网的后续维护。

  • 图 1  定量PCR引物(MIBF/MIBR)凝胶电泳验证结果

    Figure 1.  Test result of qPCR primer MIBF/MIBR

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    图 2  MIBF/MIBR质粒定量PCR标准曲线

    Figure 2.  Standard curve of plasmid based on primer MIBF/MIBR

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    图 3  基于定量PCR方法的实际样品2-MIB功能基因丰度测试结果

    Figure 3.  Quantitative PCR-based detection result of 2-MIB functional genes in real environment samples

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    图 4  基于 GC-MS分析法测定2-MIB物质浓度与qPCR方法测定2-MIB功能基因相关性检验

    Figure 4.  Correlation test of 2-MIB substance concentration based on GC-MS analysis and 2-MIB functional gene determination by qPCR method

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    表 1  2-MIB功能基因引物

    Table 1.  Primers of 2-MIB function gene

    序号名称引物序列(5′~3′)FACHB-1375FACHB-1277阴性对照PCR产物长度/bp来源
    1MIB3313FCTCTACTGCCCCATTACCGAGCGA++−913[19]
    MIB4226RGCCATTCAAACCCGCCGCCCATCCA
    2MIB3324FCATTACCGAGCGATTCAACGAGC++−726[19]
    MIB4050RCCGCAATCTGTAGCACCATGTTGA
    3MIBS-RTFCGCTCGCTTGTGAGTGAGATAG−−−未检测[19]
    MIBS-RTRGGCAGTAGAGTGGTGAGGCAGTT
    4MIBFGACCCAKMTCGGCTGYTGAT++−389本研究
    MIBRTAGAAGCTGTCGTGCTGKCG
    　　注：“+”表示PCR结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳检测结果有条带；“−”表示PCR结果为阴性，琼脂糖凝胶电泳检测结果无条带。
    序号名称引物序列(5′~3′)FACHB-1375FACHB-1277阴性对照PCR产物长度/bp来源
    1MIB3313FCTCTACTGCCCCATTACCGAGCGA++−913[19]
    MIB4226RGCCATTCAAACCCGCCGCCCATCCA
    2MIB3324FCATTACCGAGCGATTCAACGAGC++−726[19]
    MIB4050RCCGCAATCTGTAGCACCATGTTGA
    3MIBS-RTFCGCTCGCTTGTGAGTGAGATAG−−−未检测[19]
    MIBS-RTRGGCAGTAGAGTGGTGAGGCAGTT
    4MIBFGACCCAKMTCGGCTGYTGAT++−389本研究
    MIBRTAGAAGCTGTCGTGCTGKCG
    　　注：“+”表示PCR结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳检测结果有条带；“−”表示PCR结果为阴性，琼脂糖凝胶电泳检测结果无条带。
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    表 2  MIBF/MIBR NCBI比对结果

    Table 2.  NCBI blast result of MIBF/MIBR

    序号NCBI登记号基因名藻种拉丁名藻种中文名MIBF/%MIBR/%
    1HQ830028.12-methylisoborneol (2-MIB) synthesis complete sequencePseudanabaena sp.伪鱼腥藻属100100
    2HQ630883.1MIB synthase genePseudanabaena limnetica湖泊伪鱼腥藻100100
    3AB826230.1pgmtc gene for monoterpene cyclasePseudanabaena galeata 洋伪鱼腥藻100100
    4HQ630887.1MIB synthase genePseudanabaena sp.伪鱼腥藻属100100
    5LC486303.1micMicrocoleus pseudautumnalis微鞘藻属100100
    6HQ630885.1MIB synthase geneOscillatoria limosa泥生颤藻100100
    7HQ830029.12-methylisoborneol (2-MIB) synthesis associated operonPlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    8KP013063.1A2 MIB cyclase geneLeptolyngbya sp.瘦鞘丝藻属100100
    9LC157987.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    10LC157990.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    11LC157992.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻100100
    12LC157991.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    13LC157989.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    14LC157988.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻100100
    15LC157986.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻100100
    16KJ658377.12-methylisoborneol synthase geneOscillatoria sp.颤藻属100100
    17KJ658378.12-methylisoborneol synthase genePlanktothrix sp.浮丝藻属100100
    18MN167115.1MIB synthase genePseudanabaena galeata洋伪鱼腥藻100100
    19MK759878.12-methylisoborneol (mib) gene, partial cdsOscillatoria prolifera颤藻00
    20KM013398.1A2 MIB cyclase (mic) gene, partial cdsLeptolyngbya sp.瘦鞘丝藻属00
    21KM013397.1MIB cyclase (mic) gene, partial cdsPlanktothricoides sp. 浮丝藻属00
    22KM013396.1MIB cyclase (mic) gene, partial cdsPlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻00
    23MK124613.1MIB synthase gene, partial cdsPseudanabaena sp.伪鱼腥藻属00
    序号NCBI登记号基因名藻种拉丁名藻种中文名MIBF/%MIBR/%
    1HQ830028.12-methylisoborneol (2-MIB) synthesis complete sequencePseudanabaena sp.伪鱼腥藻属100100
    2HQ630883.1MIB synthase genePseudanabaena limnetica湖泊伪鱼腥藻100100
    3AB826230.1pgmtc gene for monoterpene cyclasePseudanabaena galeata 洋伪鱼腥藻100100
    4HQ630887.1MIB synthase genePseudanabaena sp.伪鱼腥藻属100100
    5LC486303.1micMicrocoleus pseudautumnalis微鞘藻属100100
    6HQ630885.1MIB synthase geneOscillatoria limosa泥生颤藻100100
    7HQ830029.12-methylisoborneol (2-MIB) synthesis associated operonPlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    8KP013063.1A2 MIB cyclase geneLeptolyngbya sp.瘦鞘丝藻属100100
    9LC157987.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    10LC157990.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    11LC157992.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻100100
    12LC157991.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    13LC157989.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii 拉氏拟浮丝藻100100
    14LC157988.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻100100
    15LC157986.1MIB synthasePlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻100100
    16KJ658377.12-methylisoborneol synthase geneOscillatoria sp.颤藻属100100
    17KJ658378.12-methylisoborneol synthase genePlanktothrix sp.浮丝藻属100100
    18MN167115.1MIB synthase genePseudanabaena galeata洋伪鱼腥藻100100
    19MK759878.12-methylisoborneol (mib) gene, partial cdsOscillatoria prolifera颤藻00
    20KM013398.1A2 MIB cyclase (mic) gene, partial cdsLeptolyngbya sp.瘦鞘丝藻属00
    21KM013397.1MIB cyclase (mic) gene, partial cdsPlanktothricoides sp. 浮丝藻属00
    22KM013396.1MIB cyclase (mic) gene, partial cdsPlanktothricoides raciborskii拉氏拟浮丝藻00
    23MK124613.1MIB synthase gene, partial cdsPseudanabaena sp.伪鱼腥藻属00
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-31
  • 录用日期:  2019-05-08
  • 刊出日期:  2020-11-10
徐晓庆, 苏命, 朱宜平, 崔长征, MUHAMMAD Suruzzaman, 徐亚楠, 于建伟, 杨敏. 基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用[J]. 环境工程学报, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
引用本文: 徐晓庆, 苏命, 朱宜平, 崔长征, MUHAMMAD Suruzzaman, 徐亚楠, 于建伟, 杨敏. 基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用[J]. 环境工程学报, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
shu
XU Xiaoqing, SU Ming, ZHU Yiping, CUI Changzheng, MUHAMMAD Suruzzaman undefined, XU Yanan, YU Jianwei, YANG Min. Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
Citation: XU Xiaoqing, SU Ming, ZHU Yiping, CUI Changzheng, MUHAMMAD Suruzzaman undefined, XU Yanan, YU Jianwei, YANG Min. Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(11): 3208-3215. doi: 10.12030/j.cjee.201912184
shu

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

    通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn; 
    作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com
  • 1. 华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237
  • 2. 中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
  • 3. 上海城投原水有限公司，上海 200125
  • 收稿日期:  2019-12-31
  • 录用日期:  2019-05-08
  • 网络出版日期:  2020-11-11
基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07108-002-02)；国家自然科学基金资助项目(51878649)

摘要: 我国地表水源中由丝状蓝藻代谢产生2-甲基异莰醇(2-MIB)导致的嗅味问题十分普遍。由于传统显微镜检测方法无法鉴别产嗅藻种，不能满足水源水质管理要求，故有必要构建能特异性表征水体产嗅潜力的检测方法。由于丝状藻代谢产生2-MIB主要受其合成功能基因调控，设计了2-MIB功能基因引物，经引物特异性检验及PCR条件优化后，构建了基于2-MIB功能基因的定量PCR方法，并采用实际环境样品进行测试与验证。结果表明：引物特异性良好，定量PCR方法能有效检测2-MIB功能基因，并绘制了标准曲线，得出检测限为8.44×102 copies·L−1；实际样品测试结果显示其2-MIB功能基因浓度在2.09×107~1.94×1010 copies·L−1范围内，与基于仪器分析方法测定的2-MIB浓度符合线性关系(R2=0.63，P<0.01)，表明定量方法可行。该方法具有灵敏性高、特异性好的特点，能特异性检测产嗅基因，可应用于水源地中产嗅潜力评估与预警。

English Abstract

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  • 湖库是我国许多城市的重要饮用水水源地[1]。然而，我国35个城市水源水库中有80%的水体存在饮用水嗅味问题[2]，其中由致嗅化合物2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol，2-MIB)导致的水体土霉味问题居多[3-7]。由于该物质嗅阈值极低[5](4~16 ng·L−1)，且很难通过常规水处理工艺去除[8]，饮用水中残留的痕量2-MIB物质容易引发消费者对水质的担忧，威胁城市供水安全[4]。水源地嗅味问题已经成为我国供水行业中重点关注的问题之一[9]。

    2-MIB主要由丝状蓝藻生长代谢产生，这类蓝藻包括颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮颤藻属(Planktothrix)以及伪鱼腥藻属(Pseudanabaena)等[9]。丝状蓝藻导致的2-MIB嗅味问题可最早追溯到1983年，由于水源水库底泥附着生长的颤藻引发美国加利福尼亚州3个供水系统出现嗅味问题[10]；1991年，MARTIN等[11]在密西西比某池塘中采集到一株产2-MIB的颤藻；1998年，日本学者SUGIURA等[12]在Kasumigaura湖中分离出4株丝状产嗅蓝藻，包括2株席藻、1株颤藻和1株鞘丝藻，发现这些藻种生物量与水体土霉味之间存在正相关关系。

    近10年来，我国关于水源地嗅味问题的报道越来越多。北京密云水库每年9—10月局部区域出现浮颤藻生长导致水体嗅味问题[7]；上海市新建水源地青草沙水库由于丝状蓝藻爆发导致季节性嗅味问题[13]；天津于桥水库、苏州东太湖湖滨水库、上海金泽水库及银川某化工园区水源水库等均存在由于不同种属的丝状产嗅蓝藻生长或爆发导致的嗅味问题[14]。

    大部分水源地中2-MIB由丝状蓝藻产生，由于丝状蓝藻种类较多、形态相近，不同藻种具有不同的产2-MIB特征，甚至同一藻种在不同外部环境条件下也存在产嗅差异。传统方法主要依托显微镜镜检通过藻细胞形态进行藻种计数。然而，从细胞形态上无法区分产嗅丝状藻种与非产嗅丝状藻种，因此，无法特异性检测水体中的产嗅藻；此外显微镜镜检前处理耗时长，检测效率低，准确度与精确度较低[7]。致嗅物质2-MIB可基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法[15]分析，但因仪器昂贵、操作要求高、运行维护成本高，大部分水源管理机构不具备该条件，且该方法只能测定水样中已产生的2-MIB物质浓度，无法提前预警，也不能鉴别产生来源。因此，有必要构建一种能特异性检测水体2-MIB产生潜力的方法。

    由于丝状藻代谢产生2-MIB受相关功能基因控制，可通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)方法构建特异性检测2-MIB合成功能基因的方法。关于2-MIB的合成途径最初在放线菌中被发现[16]，主要由SCO7701基因与SCO7700基因调控；随后，GIGLIO等[17]发现蓝藻中2-MIB的生物合成机制为GPP的甲基化和甲基GPP的环化反应，分别由GPPMT基因和2-MIBS基因调控。根据序列相似性分析，蓝藻和放线菌的2-MIB相关基因具有相对较高的相似度和同源性[18]。

    本研究通过设计针对蓝藻中2-MIB功能基因的特异性引物，构建实时定量PCR方法，并采用实际水体检验方法的可行性，实现水源中丝状蓝藻的致嗅功能基因定量检测，进而评估水体产嗅潜力与产嗅风险，为水源嗅味问题的监测与预警提供实时、快速、科学的方法。

1.   材料与方法

    1.1.   实验材料

  • 所用藻种均为产2-MIB蓝藻，分别为FACHB-1277(Pseudanabaena sp., 伪鱼腥藻)、FACHB-1375(Planktothrix sp., 浮颤藻)，购自中国科学院淡水藻种库。藻类培养使用BG11培养基，扩大培养后用于DNA提取及致嗅物质检测等目的。

    • 1.2.   培养藻种及环境样品DNA提取方法

  • 取500 mL藻培养液将藻细胞过滤富集至1.2 μm滤膜(RTTP04700，1.2 µm 聚碳酸酯膜，IsoporeTM, 美国)上；随后将滤膜剪切破碎后使用FastDNA ®SPIN Kit for Soil 试剂盒(6560-200，MPBio，美国)提取样品DNA。

    • 1.3.   引物设计与特异性验证

  • 采用已有研究[19]中的2-MIB引物(MIB3313F/MIB4226R和MIB3324F/MIB4050R)可以有效扩增FACHB-1277与FACHB-1375样品中2-MIB功能基因，验证了实验藻种含MIB功能基因。但由于两对引物所扩增得到的2-MIB基因片段较长，分别为913 bp与726 bp，不能用于定量PCR扩增。进一步检验了已有研究中报道的定量PCR引物MIBS-RTF/ MIBS-RTR[19]，发现不能扩增本研究中实验藻种的2-MIB功能基因。因此，本研究基于NCBI已公开的2-MIB功能基因数据库，设计2-MIB功能基因的特异性引物(表1)，基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将所设计的引物与NCBI中已有2-MIB基因数据库比对验证引物可行性与特异性；并采用普通PCR法测试相关引物，使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳方法检验了引物的特异性。

    • 1.4.   普通PCR与qPCR扩增条件

  • 普通PCR反应体系为：2×PCR Taq MasterMix with dye (RR005A，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.9 μL。普通PCR扩增程序为：高保真酶活化阶段95 ℃，持续5 min；高温变性阶段95 ℃，持续30 s；低温退火阶段64 ℃，持续 45 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；高温变性、低温退火、延伸阶段共45个循环。

    qPCR反应体系为：TB GreenTM Premix Ex TaqTM (RR820，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物MIBF/MIBR各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。qPCR扩增程序为：高温变性95 ℃，持续10 s；低温退火64 ℃，持续20 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；反应共40个循环；另外，溶解曲线设置条件为由65 ℃升温至97 ℃，速率为2.2 ℃·s−1。

    • 1.5.   标准曲线的建立

  • 基于引物MIBF与MIBR扩增FACHB-1277 DNA模板，经测序后根据序列信息合成2-MIB功能基因质粒，浓度为359 ng·μL−1(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。根据式(1)计算质粒拷贝数。

    式中：N为基因拷贝数浓度，copies·μL−1；NA为阿伏伽德罗常数；c为核酸质量浓度，ng·μL−1；L为碱基长度，bp；MW为单位碱基平均摩尔质量。

    由式(1)计算得到质粒拷贝数为8.44×1011copies·μL−1。按10倍进行梯度稀释，得到7个浓度水平，以此为DNA模板，按照1.4节提及的优化体系与运行参数进行qPCR扩增。同一浓度梯度质粒DNA为模板的反应孔作3组平行实验，将得到的Cq值与2-MIB基因量的对数构建线性模型，绘制标准曲线。

    • 1.6.   实际样品测试

  • 配制了9个不同浓度产嗅藻的培养样品，包括FACHB-1277伪鱼腥藻-1 (S01)、FACHB-1277伪鱼腥藻-2 (S02)、FACHB-1277伪鱼腥藻-3 (S03)、FACHB-1375浮颤藻-1 (S04)、FACHB-1375浮颤藻-2 (S05)、FACHB-1375浮颤藻-3 (S06)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 01 (S10)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 02 (S11)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 03 (S12)。采集了12个南水北调工程的环境样品，包括S07~S09、S13~S21。对这21组样品分别进行了定量PCR方法检测与气相色谱-质谱联用的2-MIB物质浓度分析[15, 20-22]，每个样品重复分析3次。

2.   结果与讨论

    2.1.   引物设计与特异性验证结果分析

  • 实验测试了已有研究[19]的2-MIB基因相关引物，发现MIB3313F/MIB4226R、MIB3324F/MIB4050R两对引物能有效扩增模拟培养藻种FACHB-1277与FACHB-1375。然而，目标基因片段过长，因此，无法用于定量PCR扩增。已有研究[19]的引物不能有效扩增本实验的藻种，这与2-MIB功能基因序列具有一定的可变性有关。因此，采用MIB3313F/MIB4226R引物扩增了FACHB-1277 DNA，并通过测序获得2-MIB功能基因序列，序列NCBI登记号为MN869917。基于该序列信息设计了MIBF/MIBR引物(见表1)。经测试发现，这对引物能有效扩增2-MIB功能基因，PCR产物长度为389 bp，可用于qPCR方法。MIBF/MIBR NCBI比对结果见表2。

    为验证MIBF/MIBR引物的可行性，比对了引物序列与NCBI基因数据库中所有蓝藻中MIB合成功能基因结果，发现这对引物能匹配18条MIB功能基因序列(截至目前发表了23条)。由结果分析可知：不能匹配的基因序列(19~23)是由于这些序列仅为部分MIB基因序列，未包含MIBF/MIBR引物段序列；而这对引物仅能匹配NCBI中已发表的MIB功能基因。进一步采用实际藻种进行普通PCR扩增实验，产物条带介于250 bp至500 bp之间，验证了MIBF/MIBR引物的可行性，结果如图1所示。

    • 2.2.   定量PCR标准曲线的构建

  • 将1.5节合成的2-MIB功能基因质粒(拷贝数8.44×1011copies·μL−1)作为标准品进行定量PCR测试，基于结果构建循环次数Cq值与2-MIB基因拷贝数的对数构建线性模型，绘制标准曲线如图2所示。标准曲线公式见式(2)。

    式中：Cq为循环次数；Cg为2-MIB基因丰度，copies·L−1。图2表明两者符合线性关系(R2=0.999 5，P<0.01)，检测限为8.44×102 copies·L−1，说明该方法能满足2-MIB功能基因检测要求。

    • 2.3.   实际样品2-MIB基因丰度测试结果

  • 图3为12个环境水体及9个不同浓度产嗅藻的培养样品的测试结果。由图3可知，该方法能够检测出环境水体及培养样品中的2-MIB功能基因，得到的环境样品浓度为2.09×107 ~1.94×1010 copies·L−1。其中，实验室培养的FACHB-1375 Planktothrix sp.浮颤藻样品2-MIB功能基因丰度最高，实际环境样品中2-MIB功能基因丰度水平相近，最低为于桥水库样品，相应基因丰度为2.09×107 copies·L−1。此外，各水样3组重复样品检测结果十分接近，表明该方法的重现性较好。

    • 2.4.   2-MIB监测方法的对比与验证

  • 为验证方法的可靠性，用GC-MS方法检测了上述21个样品中2-MIB浓度[7]。对比分析2种方法的结果发现其符合线性关系(R2=0.63，P<0.01)，表明定量PCR方法可以表征水体中2-MIB浓度(见图4)。式(3)为2-MIB浓度与功能基因之间的定量关系模型，可用于利用定量PCR结果评估水体中2-MIB浓度水平。

    式中：Cg为2-MIB基因丰度，copies·L−1；c为2-MIB浓度，ng·L−1。

    • 2.5.   2-MIB的定量PCR监测方法的应用前景

  • 水源地中藻类生长产生的嗅味问题已成为供水行业最为关注的问题。在我国，由于丝状蓝藻生长代谢2-MIB导致的水体土霉味问题尤为普遍，确认2-MIB的产生来源能提升水源地嗅味管理及防控水平。实时荧光定量PCR(qPCR)对基因定量的检测方法已广泛应用于检测蓝藻或有毒蓝藻总量中。该方法具有快速高效、灵敏度高、检出限低、特异性好和高重复性高等优点。目前，已有少量基于qPCR方法的检测水体中产土臭素(geosmin)微生物生物总量的方法[23]，但是用于含2-MIB功能基因微生物生物总量的检测应用还较少。

    本研究中构建的定量PCR方法，能直接定量检测水体中的2-MIB功能基因，避免了传统方法基于形态学无法区分产嗅藻与非产嗅藻的缺陷。相比于采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的仪器分析方法，定量PCR方法能同时检测多达96个样品，具有通量高、速度快等特点。此外，该方法检测限低，能最低检测到8.44×102 copies·L−1个2-MIB功能基因拷贝数。该结果与基于定量PCR方法检测水体中土臭素功能基因的结果一致[7]。

    然而，由于该方法存在一些缺陷，限制了其推广应用。大部分分子生物学方法是以目标生物DNA为主要研究对象，而蓝藻具有细胞壁，DNA的提取难度与误差增加。SU等[7]发现DNA提取是影响检测样品中土嗅素功能基因准确度的最主要步骤，与本研究的结论类似。DNA提取过程的不确定显著降低了结果的准确性。此外，由于产2-MIB的蓝藻并未完全界定，不同产2-MIB藻种的基因序列不完全相同，加上当前有关2-MIB的功能基因研究很少，NCBI中的MIB基因序列仍在不断完善中。因此，本研究中所设计的引物可能无法扩增之后新发现的产嗅藻2-MIB功能基因，正如以往引物不能有效扩增本研究涉及的产嗅藻种一样。随着DNA提取方法的不断改进，以及2-MIB功能基因库序列信息的完善，基于定量PCR的水源2-MIB风险评估方法具有广泛的应用前景。

    基于此，本课题组还将此方法应用于上海市、厦门市的水源水库中，旨在考察该方法是否能快速、有效地核算出水体的产嗅潜力，达到水体嗅味问题预警的要求，为水源地的水质管理提供十分重要的工具与技术支持。

3.   结论

  • 1)建立了检测水体中2-MIB功能基因的定量PCR方法，该方法能克服传统方法无法区分产嗅藻与非产嗅藻的缺点，且满足检测要求(R2=0.999 5，P<0.01)。

    2)通过采集我国不同地区的实际水源样品，对比验证了定量PCR方法与仪器分析方法结果的一致性(R2=0.63，P<0.01)，说明本研究提出基于定量PCR评估水体嗅味风险的方法具有可行性。

    3)基于qPCR的产嗅基因丰度检测代替了繁琐、重现性低的显微镜看藻、数藻过程。快速、准确有效地检测水体中致嗅功能基因的丰度，能起到预警作用，为水源地的水质管理提供十分重要的工具与技术支持。

参考文献 (23)

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