SRB菌种由课题组前期驯化所得。培养基的组成为 0.06 g·L⁻¹ CaCl₂·6H₂O、1.0 g·L⁻¹ NH₄Cl、0.5 g·L⁻¹ K₂HPO₄、0.738 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.8 g·L⁻¹ Na₂SO₄、1 g·L⁻¹ FeSO₄·7H₂O、6 mL·L⁻¹ 乳酸钠(COD为2 000 mg·L⁻¹)。SRB反应器运行控制参数为温度(25±2) ℃、pH 6.7~7.0。酸性矿山废水的水质参数为pH 3.01、21 mg·L⁻¹ Cu²⁺、199 mg·L⁻¹ Fe²⁺、30 mg·L⁻¹ Zn²⁺、28.5 mg·L⁻¹ Mn²⁺、1 098 mg·L⁻¹ ${\rm{SO}}_4^{2 - }$。

实验装置如图1所示。主要由SRB反应器(总体积4 L，其底部设有曝气装置)、硫化沉淀反应器(总体积3 L)、气泵、中和沉淀池组成；反应装置制备材料均为有机玻璃；反应器中AMD的进水量为3 L·d⁻¹，中和排水量为3 L·d⁻¹；在反应器运行过程中，采用气泵将循环N₂(气体流量为0.005 L·min⁻¹)引入SRB反应器，SRB代谢过程中产生的H₂S被吹脱至硫化沉淀反应器；将中和沉淀池的上清液与培养基混合作为物料引入SRB反应器。传统反应器为有机玻璃SRB反应器(总体积4 L)，将AMD(进水量为3 L·d⁻¹)和培养基混合，直接引入该SRB反应器，反应过程中不进行吹脱，反应后排水量为3 L·d⁻¹。

气提内循环反应器(SRB反应器)、传统反应器中菌液接种量均为20%。每隔2 h，对气提内循环反应器(SRB反应器)、传统反应器内涉硫组分(${\rm{SO}}_4^{2 - }$、${\rm{SO}}_3^{2 - }$、H₂S、S²⁻)进行检测；每隔3 h，对气提内循环反应器(SRB反应器)、传统反应器内pH和ORP进行测定。在10、20、30、40、50、60 min和24 h时，在气提内循环反应器(硫化沉淀反应器)、传统反应器中取样，测定废水中金属离子的浓度。

使用pH计(上海雷磁，PHS-3C)测定pH；采用自动电位滴定仪(上海雷磁，ZD-2)测定ORP；使用硫离子浓度计(上海般特，Bante931-S)测定S²⁻；采用吹脱-金属离子吸收法和火焰原子吸收光谱仪(普析通用，TAS-990)测定H₂S；选用 16S rDNA技术进行微生物群落结构分析；采用火焰原子吸收光谱仪(普析通用，TAS-990)测定重金属离子。

${\rm{SO}}_3^{2 - }$、${{\rm{S}}_2}{\rm{O}}_3^{2 - }$、${\rm{SO}}_4^{2 - }$的样品预处理在4 000 r·min⁻¹离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤后，使用离子色谱分析仪(北京东西分析，IC-2800)并搭配色谱柱(美国Dionex，IonPac^TMAS23 4×250 mm)进行测定，淋洗液配比为4.5 mmol·L⁻¹ Na₂CO₃和0.8 mmol·L⁻¹ NaHCO₃，抑制电流为30 mA，淋洗液泵流速为1.0 mL·min⁻¹。

从气提内循环反应器(SRB反应器)、传统反应器中取3组平行菌液，离心收集菌体，采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng·μL⁻¹。以稀释后的基因组DNA为模板，引物对应区域：16S V4区引物(515F和806R)鉴定细菌多样性，使用带Barcode的特异引物、New England Biolabs公司的Phusion®带有GC缓冲液的高保真PCR预混液、高效高保真酶进行PCR。

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后，使用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳，纯化PCR产物，剪切回收目标条带。使用Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒回收产物。

使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。

气提内循环反应器可有效解除代谢产物H₂S对SRB的毒性抑制，并提高${\rm{SO}}_4^{2 - }$的去除率。气提内循环反应器与传统反应器的涉硫组分比率变化如图2所示。由图2可知，气提内循环反应器中${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率为91.24%；传统反应器因不能及时排出H₂S(S²⁻)，其${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率仅为36.5%。在气提内循环反应器中，${\rm{SO}}_4^{2 - }$主要转化为${\rm{SO}}_3^{2 - }$和H₂S(图2(a))，随着H₂S的产率增加，${\rm{SO}}_3^{2 - }$逐渐降低，${\rm{SO}}_3^{2 - }$作为${\rm{SO}}_4^{2 - }$和H₂S的中间产物，成为代谢转化的限速因素。H₂S作为${\rm{SO}}_4^{2 - }$还原的最终产物，其浓度较高时会对SRB产生毒性抑制。FIRMINO等^[17]、ZHAO等^[18]发现H₂S会导致反应器中微生物活性和硫酸盐降解率的下降。BIJMANS等^[14]对生物反应器内硫化物进行了去除，发现微生物代谢活性可由13 mmol·(L·d)⁻¹上升至51 mmol·(L·d)⁻¹。气提内循环反应器的${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率较传统反应器高，其原因是气提内循环反应器及时去除反应产物H₂S，从而促进反应的进行，且解除S²⁻累积富集对SRB的毒性抑制。

气提内循环反应器可避免AMD与SRB的直接接触所造成的毒性抑制与冲击，可实现较高的产碱效率。气提内循环反应器的产碱量变化情况如图3所示。由图3可知，气提内循环反应器的产碱量是传统反应器的3倍。在SRB代谢乳酸盐过程中会产生${\rm{HCO}}_3^ -$，使得反应器内碱度逐渐增加^[19]，其反应机理^[20]如式(1)和式(2)所示。

系统中存在的Fe²⁺能促进各种酶的合成，缩短反应迟滞，促进SRB还原反应的进行^[21-23]，导致pH上升。随着反应的进行，${\rm{SO}}_4^{2 - }$逐渐转化为H₂S，气提内循环反应器将H₂S去除，不仅能使水体中OH⁻增加，还能避免S²⁻积累对SRB的毒性抑制。

根据Barcode处理数据得到有效数据，再利用Uparse软件对所有样品的有效数据进行聚类，筛选出OTUs(operational taxonomic units，默认以97%的一致性序列聚类)，并利用SSUrRNA数据库对OTUs进行物种注释分析，获得目、科、属群落组成(图4)。由图4可知，气提内循环反应器中脱硫弧菌(Desulfovibrio)在目、科、属水平上的相对丰度均为73%，传统反应器中脱硫弧菌的相对丰度仅为48%，对比2个反应器中菌属丰度，传统反应器中丛毛单胞菌(Comamonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)的相对丰度较气提内循环反应器明显增多。在适宜的环境条件下，SRB生长速度最快，能竞争到更多的营养物，使其在体系中的相对丰度较其他微生物高；当环境因素(pH、毒性物质的产生及含量等)改变时，SRB会对环境条件做出快速反应(调节体内代谢过程或改变细胞结构等)，其内在生长速率也会发生变化^[24]。传统反应器中pH(3.01)较低、代谢S²⁻积累和重金属离子的毒性抑制，均会导致SRB的竞争能力变弱、数量减少，而气提内循环反应器可解除酸、重金属及代谢S²⁻对SRB活性的多重抑制，充分发挥系统内优势菌属脱硫弧菌的还原能力。

气提内循环反应器对AMD中重金属离子的去除效果较传统反应器好。气提内循环反应器和传统反应器对金属离子的去除效果如图5(a)和图5(b)所示。气提内循环反应器内Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺的去除率分别为100%、86.67%、93.34%、90.14%，Cu²⁺和Zn²⁺的出水浓度分别为0 mg·L⁻¹和2 mg·L⁻¹(表1)，可达到《污水综合排放标准》二级标准；而在传统反应器内，Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺的去除率分别仅为96.6%、16.5%、21.4%、26.3%。反应器中Cu²⁺较其他金属离子容易去除的原因是，CuS的K_sp相较于ZnS、MnS、FeS等金属硫化物低，其溶度积常数顺序为MnS>FeS>ZnS>CuS^[25-26]；气提内循环反应器的金属去除率较传统反应器高，在气体内循环反应器中各金属的去除率为Cu²⁺>Zn²⁺>Fe²⁺>Mn²⁺，但在传统反应器中Fe²⁺的去除率较Zn²⁺高，产生该结果的原因是传统反应器内SRB酶的合成需要消耗大量的Fe^2+[21]。

传统SRB反应器采用生化出水直接与重金属混合沉淀，但生化出水中除S²⁻外，还含有大量无效组分(如硫代硫酸根以及溶解性微生物产物、胞外多聚物等^[1])，导致沉淀物中除金属硫化物外还含有其他复合物。气提内循环反应器运用目标代谢产物H₂S与重金属沉淀，反应结束后，对该反应器中的沉淀物进行了XRF分析。结果表明，沉淀物中含有3.9% Cu、4.27% Zn、5.28% Mn、35.78% Fe、48.89% S，这说明目标代谢产物H₂S与重金属产生的金属硫化物不含其他复合组分，且该金属硫化物的纯度可达98.12%。

1) H₂S作为${\rm{SO}}_4^{2 - }$还原的最终产物，会对SRB产生毒性抑制；气提内循环反应器可有效解除H₂S对SRB的毒性抑制，${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率由36.5%(传统反应器)提升至91.24%。

2)气提内循环反应器可避免AMD与SRB直接接触所造成的毒性抑制和冲击，实现较高的产碱效率，产碱效率是传统反应器的3倍。

3)体系中环境条件会影响脱硫弧菌属与丛毛单胞菌、柠檬酸杆菌属、假单胞菌之间的竞争；气提内循环反应器解除了多重抑制对脱硫弧菌属的活性影响，其相对丰度由传统反应器的48%提升至73%。

4)气提内循环反应器对AMD中重金属离子去除效果优于传统反应器。气提内循环反应器中Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺的去除率为86.67%、93.07%、90.14%，其金属硫化物的纯度可达98.12%，出水Cu²⁺和Zn²⁺浓度分别为0和2 mg·L⁻¹，可达到《污水综合排放标准》二级标准。