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20世纪50年代美国食品与药物管理局首次批准抗生素用作饲料添加剂，世界各国相继将抗生素应用于畜牧生产，提高了畜牧业的经济效益. 但是，抗生素在养殖业和畜牧业中的广泛使用对环境和人体健康造成了很大危害[1]. 抗生素会加剧细菌的变异，使细菌产生耐药性，甚至可能产生超级细菌[2]. 抗生素还可能使人体发生“二重感染”，对人体的多个器官均有损害，导致过敏反应和药物性耳聋发生[3].
有研究显示，奶牛在饲养过程中用到的抗生素类药物，主要用于预防乳头发炎和细菌感染，并防止奶制品的细菌污染[4]. 奶牛体内无法被吸收的抗生素会有部分随着乳汁排出体外，并制成液态奶和奶粉等乳制品[5]. 这些奶粉中的抗生素可能会对于易感人群产生一定的危害. 其中婴幼儿因为对奶粉的需求量大、自身免疫力较弱、身体器官尚未发育成熟等原因，可能受到的影响较大. 因此，对于婴幼儿奶粉中抗生素残留的检测值得特别关注.
目前关于液态奶中抗生素残留的研究较多[6-8]. Zhang等[9]检测了中国市场上的巴氏奶和高温灭菌奶中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物的含量，Wang等[10]检测了牛奶中20种大环内酯、磺胺类和喹诺酮类抗生素残留量，均表明牛奶中含有一定的抗生素残留（μg·L−1）. 另一方面，由于奶粉中抗生素残留低，并且含有大量蛋白质和脂肪，基体复杂，可能会干扰抗生素的检测[11]，因此关于奶粉尤其是婴幼儿奶粉中的污染特征的研究较少. 张律[12]采用高效液相色谱-串联质谱法进行环丙沙星、氧氟沙星等11种喹诺酮类抗生素的检测，结果在深圳市110份奶粉样品中均未检出. Tian等[13]采用超高效液相色谱-串联质谱法应用于50个市售牛奶和奶粉样品中抗生素的检测，并在部分品牌样品中检出头孢噻呋和环丙沙星残留（μg·kg−1）. 陆峥[14]和周显凤等[15]分别采用纸片扩散法对分离自婴幼儿配方奶粉的阪崎肠杆菌进行药敏实验，结果显示该细菌对头孢噻吩100％耐药，对环丙沙星等抗生素高度敏感[14-15]，表明婴幼儿配方奶粉中存在抗生素污染. 因此，对常见市售奶粉中抗生素的含量进行检测，并根据检测结果主要对婴幼儿的暴露情况进行研究，这对于保障婴幼儿的健康具有很强的现实意义.
本研究建立了同时检测22种喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素的分析方法，并用该方法对市面上常见的婴幼儿奶粉进行检测，根据其检测结果分析婴幼儿奶粉中抗生素的污染水平和分布规律. 通过计算抗生素对婴幼儿的暴露水平，评估奶粉中抗生素的含量对婴幼儿的生长发育的风险.
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大环内酯类（macrolides，MCs）：红霉素（ERY，99.1%）、罗红霉素（ROX，90%）、交沙霉素（JOS，98%）、泰乐菌素（TYL，82.4%）、螺旋霉素（SPI，88.9%）（美国Sigma-Aldrich公司）.
磺胺类（sulfonamides，SAs）：磺胺噻唑（ST，98%）、磺胺吡啶（SPD，98%）、磺胺甲基异恶唑（SMX，98%）（日本东京化成工业株式会社）；磺胺二甲基嘧啶（SMX，99%）（美国Acros Organics公司）；磺胺嘧啶（SD，99.7%）、磺胺甲基嘧啶（SMR，99.9%）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM，99.4%）、磺胺二甲基异恶唑（SIA，99.0%）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM，98%）（美国Sigma-Aldrich公司）.
喹诺酮类（quinolones，QNs）：诺氟沙星（NOR，99.9%）、恩诺沙星（ENR，99.9%）、环丙沙星（CIP，99.9%）、氧氟沙星（OFL，99.9%）、沙拉沙星（SAR，95.0%）、氟罗沙星（FLE，99.5%）、洛美沙星（LOM，98%）、双氟沙星（DIF，98.0%）（美国Sigma-Aldrich公司）.
替代物标准品：磺胺甲基异恶唑-d4（SMX-d4，99.0%）、磺胺二甲基嘧啶-d4（SMX-d4，99.0%），红霉素-13C, d3（ERY-13C, d3，98.0 %）和螺旋霉素I-d3（SPI I-d3，98.0 %）（购于加拿大Toronto Research Chemicals公司）；氧氟沙星-d3（OFL-d3，99.5 %）、诺氟沙星-d5（NOR-d5，99%）、沙拉沙星-d8（SAR-d8，99.5 %）（美国Sigma-Aldrich公司）；
色谱纯甲醇和乙腈（美国Fisher公司），氨水（50%，V/V）和甲酸铵（99%，美国Alfa Aesar公司），甲酸（98%，美国Fluka公司），乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）.
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质谱：API3200三重四极杆串联质谱检测系统（美国AB公司），配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.4.1工作软件.
色谱：UltiMate3000液相色谱仪（美国Dionex公司）； XTerra MS C18型色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美国Waters公司）.
其他：AutoTrace 280全自动固相萃取仪（美国Dionex公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；Oasis HLB（6 mL，200 mg）（美国Waters公司）；3-15高速离心机（北京松源华兴科技发展有限公司）.
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采集23个常见品牌的市售婴幼儿奶粉共41份样品（表1）. 样品采集后在4 ℃ 冰箱中冷藏，为了防止其中抗生素的分解造成的损失，在1周内进行处理分析.
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优化后抗生素前处理方法如下：称取1.0 g奶粉样品于聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL甲醇/乙腈（V/V=8:2）的萃取液，以及20 ng替代物内标（NOR-d5、OFL-d3、SAR-d8、SMX-d4、SMX-d4、ERY-13C, d3 和SPI I-d3）和1.0 g氯化钠，涡旋振荡2 min，于摇床中振荡12 h（转速:350 r·min−1、温度:35 ℃）. 之后在5000 r·min−1的条件下离心10 min，取上清液，用5 mL甲醇-乙腈（V/V=8:2）混合溶液清洗，合并上清液. 重复上述步骤2次.
在35 ℃的条件下氮吹至溶液体积约5 mL，加入3 mL正己烷，涡旋振荡1 min，5000 r·min−1的条件下离心10 min，取上清液继续氮吹至2—3 mL. 转移溶液至100 mL PET小瓶中并加入超纯水稀释溶液至100 mL，使用自动固相萃取技术进行富集净化（5 mL甲醇、5 mL超纯水活化，6 mL氨水-甲醇（V/V=5:95）溶液洗脱）. 洗脱液在35 ℃的条件下再次进行氮吹，至小于0.5 mL，定容至1 mL. 转移到1 mL离心管中，冷冻12 h，之后在漩涡振荡后以14500 r·min−1离心5 min，取上层清液经过0.22 μm尼龙滤膜转移到棕色色谱瓶中以备仪器分析.
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采用电喷雾离子源（ESI），分析物在正离子扫描下以多反应监测（MRM）模式，分别进行母离子Q1和子离子Q3扫描，选择丰度最强的2个子离子与分子离子组成离子对作为目标物的监测离子. 信号最强的离子对可以为定量提供高灵敏度，另一个离子对则可提供辅助定性信息. 之后优化质谱参数和色谱条件，使仪器信号稳定且灵敏度最高. 优化的质谱分析条件：气帘气压力0.14 MPa，碰撞气压力0.02 MPa，电喷雾电压5000 V，雾化气温度600 ℃，雾化气：0.38 MPa，加热气及辅助雾化气: 0.45 MPa. 优化的色谱条件：流动相A：0.3%甲酸水溶液（含0.1%（体积分数）甲酸铵，pH=2.9），流动相B：甲醇-乙腈（V/V=1:1）；流速：0.2 mL·min−1；进样量：15 μL；梯度洗脱条件：0—2 min，10%B；2—12 min，10%—70% B；12—16 min，70%—100% B，保持3 min；19—19.1 min，100%—10% B；19.1—33 min，10% B.
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在选定的最佳质谱和色谱条件下，进样15 μL，对一系列浓度的混合标准样品（20 ng NOR-d5、OFL-d3、SAR-d8、SMX-d4、SMZ-d4、 ERY-13C, d3和SPI I-d3内标）进行分析，以各分析物和内标离子对的峰面积之比进行定量. 每批样品都要做一个程序空白样品，以保证检测结果的可靠性. 实验中设置方法空白、空白加标、基质加标对数据进行质量控制. 22种抗生素的加标回收率为72.8%—123%，相对标准偏差（RSD）为1.6%—11.2%. 结果表明，22种化合物均在较宽的范围内具有良好的线性，方法检出限（LODs）为0.01—0.10 μg·kg−1 （见表2）.
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根据婴幼儿奶粉建议用量计算婴幼儿每天奶粉的实际摄入量，再根据奶粉中抗生素的检测结果，换算出婴幼儿经口对奶粉中抗生素的日平均暴露剂量（Average daily dose, ADD），公式（EPA，2011）[16]如下:
其中，ADD：抗生素的日平均暴露量，μg （kg d）−1; C：奶粉中抗生素的浓度，μg·kg−1；IR：饮食摄入量，kg d−1；EF：暴露频率，d a−1；ED：暴露持续时间，a；BW：体重，kg；AT：平均暴露时间，d.
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本研究中∑QNs、∑SAs和∑MCs分别代表9种喹诺酮、8种磺胺和5种大环内酯抗生素的浓度之和. 所有数据均使用IBM PASW Statistics 20软件进行分析. 如奶粉样品中抗生素浓度低于分析方法检出限，则该检测数据赋予0值参加平均值统计计算. Kolmogorov–Smirnov检验用来验证数据是否呈正态分布，Kruskal–Wallis非参数检验用来比较抗生素的浓度差异. 一般认为当P< 0.05时该检验具有显著性差异.
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婴幼儿配方奶粉中抗生素浓度见表3. 样品共检出19种抗生素，包括8种喹诺酮（NOR、CIP、DIF、ENR、FLE、OFL、LOM和SAR），6种磺胺（SMX、SPD、SMZ、SDZ、SIA和SDM）和3大环内酯（TYL、ROX和ERY）. 其他1种磺胺（SPD）和2种大环内酯（SPI和JOS）在所有样品中浓度均低于检测限，可能是这3种抗生素主要应用于人体感染性疾病的治疗，在动物的生长过程中很少使用[1].
三类抗生素中，喹诺酮类抗生素浓度最高，平均浓度可达2.92 μg·kg−1（0.49—20.1 μg·kg−1），比磺胺（平均浓度0.39 μg·kg−1，0.03—2.93 μg·kg−1）和大环内酯类（平均浓度0.16 μg·kg−1，＜LOD—1.14 μg·kg−1）抗生素浓度高1个数量级. 这是因为奶牛在生长过程中喹诺酮类抗生素的使用量远大于磺胺和大环内酯的使用量（见表4），并且喹诺酮类抗生素具有更高的稳定性和生物富集能力[17-19]. 在所有抗生素中，CIP、NOR和ENR的检出率较高（90.2%—100%），浓度分别为0.87、0.68、0.48 μg·kg−1，而其他抗生素检出率（<60%）和浓度均较低（<0.2 μg·kg−1）. 有研究报道[1]，CIP、NOR和ENR均可作为兽用抗生素使用，并在养殖业中大量使用（表4），因此可在奶粉样品中较多检出.
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不同阶段婴幼儿配方奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的浓度如图1（a）所示. 单因素方差（见表5）结果表明，这三类抗生素浓度在不同阶段的奶粉中无显著差异（P>0.05）. 2段奶粉中抗生素残留水平的总体平均值为4.48 μg·kg−1（浓度范围1.18—17.4 μg·kg−1），略高于1段（平均3.77 μg·kg−1，0.89—23.1 μg·kg−1）和3段（平均2.36 μg·kg−1，0.71—6.98 μg·kg−1）奶粉中抗生素的残留水平.
国内外不同奶源奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的污染水平如图1（b）所示. 通过对比发现，国内奶源的奶粉的污染水平（平均值3.88 μg·kg−1，1.36—23.1 μg·kg−1）略高于进口奶源（平均值2.41 μg·kg−1，0.71—9.15 μg·kg−1），但并没有显著性差异（P>0.05）. 需要指出的是，个别国产奶源的奶粉中抗生素含量较高，可达23.1 μg·kg−1，需要值得关注.
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目前，国内还尚未出台关于奶粉中抗生素残留限量的相关规定，因此本研究参考农业部于2019年修订发布了最新的《动物源性食品中兽药最高残留限量》（GB 31650-2019）中的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）和日允许摄入量（acceptable daily intake, ADI）对婴幼儿的暴露风险进行研究[20-22]. 通过比较发现，抗生素在婴幼儿奶粉中的检出浓度均较低，41个婴幼儿奶粉中抗生素的含量比国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量低1—3个数量级，符合食品安全（见表6）.
进一步根据奶粉中抗生素的检测结果换算婴幼儿经口对奶粉中抗生素的日平均暴露剂量. 婴幼儿暴露水平计算公式中婴幼儿体重参照《中国7岁以下儿童生长发育参照标准》[23]. 其中0—2周男孩体重为3.6 kg、女孩为2.7 kg，2—4周男孩体重为5.0 kg、女孩为3.6 kg，2个月男孩体重为5.2 kg、女孩为4.0 kg，3—4月男孩体重为6.3 kg、女孩为5.1 kg，5—6月男孩体重为7.6 kg、女孩为6.7 kg，7—12月男孩体重为10.6 kg、女孩为9.9 kg，13—24月男孩体重为12.7 kg、女孩为12.0 kg，25—36月男孩体重为15.3 kg、女孩为14.7 kg. 婴幼儿对奶粉的吸收率约为94%[24]. 0—6个月，7—12个月以及13—36个月月龄段婴幼儿配方奶粉消费量，按照样品标签上的推荐量求平均值计算，分别为102、109和 91 g d−1 [25].
婴幼儿对抗生素的日暴露水平如表7所示，结果表明婴幼儿对于喹诺酮类抗生素的暴露水平相对最高，其最大暴露浓度达到了430 ng·kg−1·d−1·bw，均值在3.40—13.2 ng·kg−1·d−1·bw. 对于大环内酯类抗生素的暴露水平较低，其最高暴露浓度为31.2 ng·kg−1·d−1·bw，均值在1.07—4.14 ng·kg−1·d−1·bw. 对于磺胺类抗生素的暴露水平最低，最高值也仅为是57.3 ng·kg−1·d−1·bw，均值在1.04—4.05 ng·kg−1·d−1·bw.
对于这41个婴幼儿配方奶粉来说，婴幼儿对喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素的的暴露水平比《动物性食品中兽药最高残留限量》中ADI值低2—3个数量级（见表6）. 因此，婴幼儿奶粉中抗生素残留对儿童的暴露水平均处在较低的水平，不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害. 需要注意的是，本研究参考的《动物源性食品中兽药最高残留限量》（GB 31650-2019）仅对部分抗生素的最高残留限量和日允许摄入量做了限定，因此也仅对部分抗生素进行了风险评估，其评估结果可能会低于实际风险值. 考虑到不同抗生素之间的毒性协同作用，奶粉中低水平抗生素长期暴露对人体健康造成潜在的危害不能忽视.
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本文研究了婴幼儿配方奶粉样品中抗生素的污染特征和暴露水平. 研究表明奶粉中存在抗生素残留，其中主要组分是喹诺酮，其次是磺胺和大环内酯. 研究表明不同阶段和不同奶源婴幼儿配方奶粉中抗生素残留水平无显著性差异. 三类抗生素的日暴露水平均低于《动物性食品中兽药最高残留限量》中ADI值. 总体来看，婴幼儿的暴露水平均处在较低的水平. 因此，婴幼儿配方奶粉中所残留的抗生素尚不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害.
婴幼儿配方奶粉中22种抗生素污染特征及暴露风险
Study on pollution characteristics and human exposure of 22 antibiotic in infant milk powder
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摘要: 作为一类新污染物，抗生素的环境污染及其潜在的健康风险受到国内外的广泛关注. 作为主要的抗菌药物和生长促进剂，抗生素在养殖业和畜牧业中的广泛使用可能会使其在奶粉等农副产品中有一定水平的残留，对人体尤其婴幼儿等易感人群造成潜在的危害. 本研究以婴幼儿奶粉为研究对象，采集41个国内外常见市售婴幼儿品牌奶粉，利用液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）测定奶粉中22种抗生素的含量，并评价婴幼儿奶粉中抗生素对婴幼儿等易感人群的健康风险. 研究表明，抗生素在婴幼儿配方奶粉普遍存在，但残留水平较低（μg·kg−1）. 其中喹诺酮类抗生素含量略高（∑QNs平均值2.92 μg·kg−1，浓度范围0.49—20.1 μg·kg−1），而磺胺（∑SAs平均浓度0.39 μg·kg−1，0.03—2.93 μg·kg−1）和大环内酯类（∑MCs平均浓度0.16 μg·kg−1，低于检出限（LOD）—1.14 μg·kg−1）抗生素浓度普遍较低. 统计分析表明不同阶段和不同奶源婴幼儿配方奶粉中抗生素残留水平无显著性差异（P＞0.05）. 总体来看，婴幼儿的暴露水平均处在较低的水平. 其中喹诺酮类抗生素的日暴露水平较高（均值范围3.40—13.2 ng·kg−1·d−1·bw），最高可达430 ng·kg−1·d−1·bw，而磺胺（1.04—4.05 ng·kg−1·d−1·bw）和大环内酯类（1.07—4.14 ng·kg−1·d−1·bw）抗生素的日暴露水平最低，均低于《动物性食品中兽药最高残留限量》中日允许摄入量（ADI）. 因此，婴幼儿配方奶粉中所残留有抗生素，但尚不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害.Abstract: Antibiotics, an emerging group of environmental contaminant, have attracted wide attention due to their potential risks on human health and ecosystems. As a class of antibacterial drugs and growth promoters, antibiotics are widely used in livestock farming, which may cause a certain level of antibiotic residues in infant milk powder and pose a potential threat to infants and young children. In the present study, 41 common brands of infant milk powder were collected from domestic and foreign markets, and the levels of 22 antibiotics in the milk powder were determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), and the health risks of antibiotics in infant milk powder to susceptible people such as infants and young children were evaluated. The results revealed that antibiotics were widely distributed in the infant milk powder. Quinolones were the predominant compounds with mean concentrations of 2.92 μg·kg−1 (0.49—20.1 μg·kg−1), which were one order of magnitude higher than those of sulfonamides (mean: 0.39 μg·kg−1, 0.03—2.93 μg·kg−1) and macrolides (mean: 0.16 μg·kg−1,＜limits of detection (LODs)—1.14 μg·kg−1). Statistical analysis showed that there was no significant difference in antibiotic residues in infant milk powder at different stages and from different milk sources（P＞0.05）.The results showed that the average daily dose (ADD) of quinolone in infant milk powder was high (max: 430 ng·kg−1·d−1·bw; mean 3.40—13.2 ng·kg−1·d−1·bw), while the ADD of sulfonamide (1.04—4.05 ng·kg−1·d−1·bw) and macrolides (1.07—4.14 ng·kg−1·d−1·bw) were relatively low. Overall, the exposure of antibiotics in the milk powder to infants was at a low level, which were lower than acceptable daily intake (ADI) values. Therefore, the antibiotic residues in infant milk powder will not cause significant harm to the growth and development of infants.
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Key words:
- antibiotics /
- infant milk powder /
- pollution characteristics /
- risk assessment
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砷（As）是一种广泛分布在自然环境中的有毒类金属元素，被列为I类致癌物[1]。自然水体中砷的浓度较低（1—5 μg·L−1），主要以无机砷砷酸盐（AsⅤ）和亚砷酸盐（AsⅢ）的形态存在[2-3]。砷的毒性不仅由总量决定，更取决于其形态[2]；相对于无机砷，有机砷如一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、三甲基砷酸（TMA）、砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）、砷糖（arsenosugar）和砷脂（arsenolipid）等[4-6]的毒性要小得多。目前砷糖（arsenosugar）和砷脂（arsenolipid）的毒性尚未充分阐明，但已有报道，部分砷脂对人体细胞具有一定毒性[7]。微藻是一类广泛分布在陆地和海洋中的自养生物，种类和数量繁多，在地球生态系统中具有重要地位。砷对微藻有较强的毒性作用，但微藻在与砷长期共存的过程中，进化出了多种砷解毒机制，主要有细胞表面的吸附，细胞吸收后对砷形态的转化，包括AsⅢ的氧化、AsⅤ的还原、AsⅢ的甲基化或甲基化后挥发、胞内巯基物质对砷的络合、合成砷糖和砷脂等[3, 8]。不同条件下微藻对砷的解毒机制明显不同，然而造成这些差异的原因尚不清楚。
砷被微藻吸收后，可通过多种解毒途径进行形态转化并与不同细胞组分结合，根据其溶解性大体可分为水溶态、脂溶态和残渣态等3种组分[9]。水溶态砷指胞内亲水性砷化物，一般以无机砷为主，也存在少量MMA、DMA、AsB、AsC、砷糖等[10]；脂溶态砷指胞内含砷脂质，包括含砷脂肪酸、含砷烃、含砷长链醇、砷糖磷脂等[11]；经过水和有机类试剂连续萃取后剩余的部分是残渣态砷，这类砷与细胞中不溶性物质相结合，主要以未知结构的阳离子形式存在[12]。
以往的研究多用单一提取法[13-14]提取砷形态（提取剂为水或稀硝酸等），这种方法操作简单，然而对于一些结构复杂的砷化物，若只用一种提取剂，无法将其完全分离，提取率较低。例如，Miyashita等[15]研究表明，刚毛藻Cladophora glomerata和莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii具有较多的脂溶态砷化物，仅用水提取这些藻类的效率很低（C. glomerata为16%，C. reinhardtii为32%）。连续分级提取法[10, 16]即根据砷与细胞不同组分的结合特性，选择水和有机溶剂等多种提取剂，将样品中不同砷化物依序分离出来，其提取效率更高，且利于鉴定更多种类的砷形态。
C. reinhardtii是一种广泛存在于水体环境中的模式藻类，具有很强的砷富集、吸收能力[17-18]，然而不同砷浓度处理下莱茵衣藻的代谢规律与胞内各组分砷的分配尚不清楚。因此，本文采用不同AsⅤ浓度处理莱茵衣藻，测定其砷富集、吸收和培养基中含量；采用连续分级提取法，分离定量胞内水溶、脂溶和残渣态砷，并运用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）分析培养基中砷的形态，探究莱茵衣藻对砷酸盐的富集、分配和形态转化，进一步揭示微藻砷解毒机制。
1. 材料与方法 (Materials and methods)
1.1 试验材料与培养条件
C. reinhardtii购于美国明尼苏达大学衣藻资源中心。采用TAP（tris-acetate-phosphate）培养基（pH 7.0），121 ℃灭菌30 min；培养温度为（25±2 ）℃；光照强度为2000 lux，并维持光暗比（12 h∶12 h）；且在藻种传代扩增及培养过程中均保证无菌操作。
1.2 试验方法
1.2.1 不同AsⅤ浓度处理莱茵衣藻
AsⅤ处理浓度：5、10、20、50、100 μg·L−1，并设置空白对照两组（有藻无砷和有砷无藻）。每个处理设置3个平行。将生长至对数期的莱茵衣藻接入新鲜的TAP培养基，藻细胞初始OD680=0.10，整个接种转移过程均在无菌超净工作台中进行，每天使用SpectraMax i3X多功能酶标仪（Molescular Devices）对其OD680进行测定。
1.2.2 藻样砷总量的测定
培养7 d后离心收集上清液和藻样（7291 r·min−1，2 min），并将藻样分为两部分，一部分用0.1 mol·L−1磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.0）和去离子水清洗3遍洗去藻细胞表面吸附的砷，用于测定莱茵衣藻对砷的吸收量；另一部分藻样用于测定莱茵衣藻对砷的富集量。将藻样冷冻干燥后称取0.05 g至消煮管内，加入2 mL硝酸（UP级），浸没过夜。使用石墨消解仪（海能SH230）在(120±2)℃下电热消解至溶液澄清透明，开盖赶酸至管内剩下0.5 mL的液体，静置冷却后将消煮液转移至10 mL容量瓶，用去离子水定容。同时以不加藻样的相同体系作为试剂空白。最后使用0.45 μm的水系滤器过滤，待测。采用ICP-MS（NexION2000）测定藻样和培养基中砷含量。本文使用动态反应池(DRC)技术，通过让砷离子与氧反应形成在m/z为91时可测量的75As16O+离子的方式减少氯离子的干扰，使结果更加准确。
1.2.3 藻样不同组分砷的提取测定
莱茵衣藻胞内的砷分为水溶态、脂溶态和残渣态，采用连续分级提取，方法如下。
水溶态砷[19]：准确称取加砷处理的经冷冻干燥后的藻样0.10 g，加入2 mL水为萃取剂，用超声波清洗仪超声10 min（100 W，40 Hz），7291 r·min−1离心2 min。重复3次。将离心后的上清液合并，使用0.45 μm的水系滤器过滤。过滤后样品（水溶态）放置−60 ℃低温冰箱保存，待测。
脂溶态砷[16]：向提取过水溶态的藻样干燥后加入萃取剂二氯甲烷/甲醇（2:1，V/V）混合溶液6 mL，充分震荡并超声10 min。随后7291 r·min−1离心2 min收集上清液，过滤后样品（脂溶态）经旋转蒸发后浓缩至微量并放置−60 ℃低温冰箱保存，待测。
残渣态砷[6]：在经过水溶态和脂溶态连续提取后，剩下的即为残渣态。将藻样放入通风橱待有机试剂挥发完全后再放置−60 ℃低温冰箱保存，待测。
不同组分砷含量的测定方法同1.2.2节。将收集的上清液经0.22 μm的水系滤器过滤后采用HPLC-ICP-MS测定培养基中砷形态，同时配置不同浓度的混合砷标准溶液（AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ）作标准曲线。具体仪器条件见表1。
表 1 砷形态分析的HPLC-ICP-MS仪器条件Table 1. Experimental conditions for As speciation by HPLC-ICP-MS高效液相色谱HPLC PerkinElmer 电感耦合等离子体质谱ICP-MS NexION 2000 色谱柱Chromatographic column Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱分析柱Anion exchange chromatography column（250 mm×4.1 mm, 10 μm） 等度分离流动相Equally separated mobile phase 17.5 mmol·L−1 (NH4)2HPO4, pH 5.8 进样体积Injection volume 50 μL 流速Flow velocity 1.5 mL·min−1 运行时间Run time 8 min | Show Table
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1.3 质量控制
砷含量的测定以115In为内标，以砷的标准曲线进行定量；采用消解标准物质羊栖菜（NMIJ CRM 7405-a）和鱼肝（DOLT-5）对本试验测定结果的可靠性进行评估，标准物质的消解与样品同时进行，并设置3个平行。测定的两标准物质的总砷回收率为91.3%—95.7%，数据精密度较好，说明分析方法不存在明显的系统误差。此外，仪器的检测限可达0.02 μg·L−1，内标回收率99.24%—111.66%，相对标准偏差(RSD)<5%。此外，本文采用连续分级提取法对羊栖菜和鱼肝的胞内砷形态进行提取并测定，以各组分砷含量相加之和占总砷含量的百分比作为提取率，两种标准物质的提取率为92.84%—93.72%，说明此方法可靠。
以不加莱茵衣藻、加入5—100 μg·L−1 AsⅤ处理的TAP培养基为空白对照，放置于同等试验条件下7 d后，用HPLC-ICP-MS检测培养基中的砷形态，结果发现AsⅢ含量均低于检出限，说明整个培养期内AsⅤ形态稳定。
1.4 数据分析
试验数据采用Origin 96进行处理、作图，并采用SPSS 20.0进行差异显著性分析（P<0.05）。试验数据为平均值±标准偏差（n=3）。
2. 结果与讨论 (Results and discussion)
2.1 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻的生长
对照组（不加AsⅤ）莱茵衣藻在第4 天进入生长稳定期，而加砷处理的莱茵衣藻随着时间的增加缓慢生长，在第7 天趋于平稳（图1）。相对于对照组，AsⅤ的加入对莱茵衣藻的生长有显著抑制，但最终的生长OD680值维持在1.19—1.29，各处理组之间无显著差异。说明本研究采用的莱茵衣藻对AsⅤ比较敏感.
图 1 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻的生长（OD680）Figure 1. Growth (OD680) of C. reinhardtii after exposure to different concentrations of AsⅤ2.2 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻对砷的富集和吸收
随着AsⅤ处理浓度的增加，C. reinhardtii对砷的富集和吸收量显著增加（表2），这与Yin等[17]的结果一致。而莱茵衣藻对砷的吸附量较少（0.92—1.83 μg·g−1），且处理间无明显差异。由此可知，不同AsⅤ浓度处理下C. reinhardtii均以对砷的吸收为主，其吸收量占富集量的比例为81.92%—96.79%。李崇华等[20]用20 μg·L−1的AsⅤ处理莱茵衣藻6 h，发现其对砷的富集、吸收和吸附量随着AsⅤ暴露时间的增加呈现先增加后减少的趋势，在4 h时对砷的富集量达到最大值（（90.83±0.49 ）μg·g−1），高于本文相同浓度处理7 d后的砷富集量13.77 μg·g−1（表2），说明莱茵衣藻短期内可富集吸收大量的砷，但最终将大部分砷外排来减小砷的毒性。
表 2 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻富集、吸收的砷含量 (μg·g−1 DW)Table 2. Arsenic accumulation and absorption by C. reindardtii exposed to different AsⅤ concentrations (μg·g−1 DW)AsⅤ处理/（μg·L−1）AsⅤ treatment 富集Accumulation 吸收Absorption 5 6.25±0.53e 5.12±0.12e 10 10.93±0.48d 9.83±0.24d 20 13.77±0.62c 12.65±0.21c 50 16.43±0.58b 15.38±0.18b 100 28.62±0.38a 27.70±0.25a 注：不同小写字母表示不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻的砷富集和吸收含量的显著性差异（P<0.05）. Note: Different letters are significant difference at P<0.05 among As accumulation and absorption by C. reindardtii exposed to AsⅤ under different concentrations. | Show TableDownLoad:
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2.3 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻胞内不同组分砷含量
由图2可知，莱茵衣藻胞内主要以脂溶态砷为主，残渣态和水溶态含量较少。这与Miyashita等[15]的结果保持一致。研究表明，除了莱茵衣藻，还有许多藻类及鱼类也存在脂溶态砷[21-24]。有研究表示，砷脂可能在生物细胞膜化学中起作用，细胞膜中脂质动态排列的微小变化可能影响细胞信号传导等膜功能[25]，对人体健康有潜在的风险[11]。
图 2 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻不同组分的砷含量Figure 2. Arsenic contents of different components in C. reinhardtii exposed to different AsⅤ concentrations注：不同小写字母表示不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻各组分砷含量的显著性差异（P<0.05）Note: Different letters are significant difference at P<0.05 among As contents of different components by C. reinhardtii exposed to AsⅤ under different concentrations随着AsⅤ浓度的增加，莱茵衣藻脂溶态砷含量呈增加的趋势，由3.61 μg·g−1增加至22.19 μg·g−1，然而脂溶态砷占总砷的比例先减少后增加（最高可达72.2%）（图3）；水溶态砷的含量随着AsⅤ浓度的增加而显著增加，由0.41 μg·g−1增加至4.31 μg·g−1，而水溶态砷占总砷的比例虽先增加后减少，但整体成上升的趋势（图3）。Glabonjat等[16]研究表示随着AsⅤ浓度的增加，盐藻Dunaliella tertiolecta产生的水溶态砷的含量及所占比例显著增加，与本文的结果一致；而盐藻砷脂的含量虽显著增加，但占总砷的比例维持不变。Xue等[10]对施加AsⅤ处理的念珠藻Nostoc sp. PCC 7120进行连续分级提取砷形态，发现念珠藻产生了AsⅤ、DMA、甘油砷糖和磷酸砷糖，还生成了两种砷脂，且随着AsⅢ浓度的增加，DMA及两种砷糖的含量逐渐减少；说明随着砷浓度的增加，莱茵衣藻的解毒途径可能发生了改变，将毒性较强的水溶态无机砷转化为毒性较弱的脂溶态砷。
图 3 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻培养基中各形态砷所占比例Figure 3. Proportions of As species in the medium of C. reinhardtii exposed to different AsⅤ concentrations2.4 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻培养基中的砷含量及形态
随着AsⅤ浓度的逐渐增加，在培养7 d后，培养基中的砷含量为（1.62±0.11）、（4.02±0.37）、（12.50±0.26）、（42.01±0.95）、（73.70±6.22） μg·L−1，分别占施加总砷含量的23.65%、37.37%、52.74%、77.94%、77.54%，说明随着砷浓度的增加，莱茵衣藻对砷的富集逐渐减少。培养基中砷形态的含量及占比如表3、图3、4所示。在5—20 μg·L−1 AsⅤ处理下，培养基中的砷主要以AsⅢ为主（60.89%—78.66%）且其含量随砷浓度的增加而增加，含有少量的DMA和AsⅤ，未检测到MMA，但检测到两种未知物质，这与Miyashita等[26]的研究一致；由此可知莱茵衣藻能介导砷形态的转化，将AsⅤ还原为AsⅢ随后进行甲基化，生成了未知砷化物并外排至培养基。根据已有研究[27-28]，未知形态1、2可能分别是磷酸砷糖和磺酸砷糖。Murray等[29]发现将C. vulgaris暴露于AsⅤ 7 d后不仅生成了AsⅢ、DMA，还产生了磷酸砷糖、磺酸砷糖和甘油砷糖。50—100 μg·L−1 AsⅤ处理下，培养基中AsⅤ的含量及所占比例增加（49.50%—52.63%），说明随着砷浓度的增加，莱茵衣藻抑制了AsⅤ的吸收来减轻毒性；此外，培养基中AsⅢ含量其次（43.57%—46.60%），也含有较少的DMA，相较于低浓度砷处理，磷酸砷糖含量虽有显著增加，但所占比例明显减少且未检测到磺酸砷糖。Miyashita等[26]发现具有代表性的脂溶态砷化物--磷脂酰砷糖的基本结构中包含甘油砷糖和磷酸砷糖，因此认为这些含氧砷糖可能是砷脂合成的前体。Xue等[30-31]发现Synechocystis sp. PCC 6803在亚砷酸盐的胁迫下生成了DMA、磷酸砷糖、磺酸砷糖和两种砷糖磷脂，并阐明了砷糖生物合成途径的前两个步骤。藻细胞内砷组分分配的变化说明，随着砷胁迫的增加，除AsⅤ还原外排外，莱茵衣藻的解毒机制由以AsⅢ甲基化生成DMA和砷糖等过程为主，转变为以减少吸收并生成更多的脂溶态砷等途径为主，藻细胞减少对AsⅤ的吸收，DMA、磷酸砷糖和磺酸砷糖等含有甲基砷的化合物可能作为前体，进一步合成脂溶态砷化物。
表 3 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻培养基中各砷形态的浓度Table 3. Concentrations of As species in the medium of C. reinhardtii exposed to different AsⅤ concentrations各砷形态的浓度 / (μg·L−1)As species concentrations AsⅤ处理 / (μg·L−1)AsⅤ treatment AsⅢ DMA Unknown 1 AsⅤ Unknown 2 5 0.72±0.08d 0.03±0.00b 0.13±0.02d 0.15±0.03c 0.16±0.00a 10 2.37±0.33d 0.09±0.01b 0.29±0.03cd 0.13±0.05c 0.14±0.02b 20 6.22±0.29c 0.37±0.09b 0.56±0.08c 1.91±0.10c 0.12±0.00b 50 15.79±0.05b 1.21±0.12a 1.12±0.01b 16.77±0.88b — 100 34.92±1.80a 1.45±0.25a 1.60±0.10a 42.18±1.93a — 注：不同小写字母表示不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻培养基中各砷形态的浓度的显著性差异（P<0.05）. Note: Different letters are significant difference at P<0.05 among the concentrations of As species in medium by C. reinhardtii exposed to AsⅤ under different concentrations. | Show TableDownLoad:
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图 4 不同AsⅤ浓度处理下莱茵衣藻培养基中砷形态HPLC-ICP-MS谱图Figure 4. HPLC-ICP-MS spectra of As species in the medium of C. reinhardtii exposed to different As(Ⅴ) concentrations (5, 100 μg·L−1)a: 5 μg·L−1 AsⅤ, b: 100 μg·L-1 AsⅤ（稀释10倍）注：各砷形态分别用不同数字表示：（1）AsⅢ；（2）DMA；（3）未知形态1；（4）AsⅤ；（5）未知形态2a: 5 μg·L−1AsⅤ, b: 100 μg·L−1 AsⅤ (diluted 10 times) Note: As species are indicated by numbers: (1) AsⅢ; (2) DMA; (3) Unknown 1; (4) AsⅤ; (5) Unknown 23. 结论 (Conclusion)
在不同浓度AsⅤ处理下，莱茵衣藻生长受到一定抑制，对砷的富集以吸收为主；胞内脂溶态砷占主要部分，水溶态和残渣态砷的含量较少，且随着砷浓度的增加，脂溶态砷占总砷的比例先减少后增加，而水溶态砷所占比例先增加后减少，说明砷的解毒途径存在差异。结合培养基中砷形态变化可推断，在砷酸盐胁迫下，莱茵衣藻主要将AsⅤ还原为AsⅢ，并大量外排；同时，AsⅢ甲基化为DMA，可能合成砷糖并外排。随着AsⅤ浓度的增加，藻细胞减少对AsⅤ的吸收，甲基化程度加大，合成更多的脂溶态砷。因此，深入解析脂溶态砷的生物合成过程、研究微藻对砷的分配和形态转化，有助于揭示微藻对砷的解毒机制，进一步明确微藻在砷生物地球化学循环中的作用。
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图 1 婴幼儿配方奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的浓度
Figure 1. Concentrations of ∑QNs、∑SAs and ∑MCs in milk power
表 1 奶粉样品相关信息
Table 1. Information about infant milk powder samples
序号No. 奶粉品牌Brand 是否进口Import/Local 阶段Stage 序号No. 奶粉品牌Brand 是否进口Import/Local 阶段Stage 1 A1 是 1段 22 J1 否 2段 2 A2 是 2段 23 K 否 1段 3 B1 否 1段 24 L 是 3段 4 C1 是 1段 25 M1 是 2段 5 C2 否 3段 26 M2 是 2段 6 C3 是 3段 27 M3 是 2段 7 C4 是 3段 28 M4 是 1段 8 C5 是 3段 29 N1 是 1段 9 C6 是 2段 30 O1 是 2段 10 D1 是 2段 31 O3 是 3段 11 E1 否 1段 32 P1 否 2段 12 E2 否 3段 33 Q1 否 2段 13 E3 否 1段 34 Q2 否 3段 14 E4 否 3段 35 R1 是 1段 15 F1 是 1段 36 S1 是 1段 16 F2 是 3段 37 T1 是 3段 17 F3 是 1段 38 T2 是 3段 18 G1 是 2段 39 X1 否 2段 19 H1 是 3段 40 X1 否 1段 20 I1 否 1段 41 Y1 是 3段 21 A1 是 2段
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表 2 22种抗生素的回收率、线性范围和检出限（S/N=3）
Table 2. Recoveries （%）,linear range, and limits of detection （LODs，S/N=3） of 22 antibiotics
抗生素Antibiotics 替代物Surrogate 相关系数r Correlation 线性范围/（μg·kg−1）Linear range 回收率/%（加标10 μg·kg−1）Recovery LODs/ （μg·kg−1） NOR NOR-d5 0.9974 0.1—500 87.5±7.4 0.09 CIP NOR-d5 0.9987 0.05—500 82.7±11.4 0.08 DIF OFL-d3 0.9985 0.05—500 74.3±10.3 0.08 ENR OFL-d3 0.9990 0.05—500 97.4±8..9 0.08 FLE OFL-d3 0.9984 0.1—500 97.6±6.8 0.04 OFL OFL-d3 0.9988 0.1—500 104.0±8.5 0.06 LOM OFL-d3 0.9967 0.05—500 72.4±3.3 0.05 SAR SAR-d8 0.9992 0.05—200 95.9±4.6 0.09 STZ SMX-d4 0.9974 0.01—500 84.2±5.9 0.04 SMX SMX-d4 0.9991 0.1—500 101.0±4.3 0.06 SIA SMX-d4 0.9987 0.02—500 88.3±2.7 0.06 SPD SMZ-d4 0.9985 0.02—500 98.0±5.3 0.04 SDM SMZ-d4 0.9996 0.01—500 121.0±5.6 0.04 SMZ SMZ-d4 0.9993 0.01—500 102.0±3.7 0.04 SDZ SMZ-d4 0.9986 0.05—500 101.0±3.5 0.04 SMR SMZ-d4 0.9977 0.02—500 107.0±7.1 0.04 SMM SMZ-d4 0.9985 0.02—500 112.0±7.3 0.01 SPI SPI I-d3 0.9980 0.1—500 104.0±5.2 0.08 JOS SPI I-d3 0.9934 0.05—200 84.4±5.6 0.04 TYL SPI I-d3 0.9934 0.05—200 90.0±7.1 0.10 ROX SPI I-d3 0.9905 0.05—500 101.0±6.1 0.04 ERY ERY-13C,d3 0.9992 0.1—500 109.0±5.3 0.04
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表 3 婴幼儿配方奶粉中抗生素的浓度（n=41, μg·kg−1）
Table 3. Concentrations of antibiotics in infant milk power
抗生素Antibiotics 最小值Minimum 中位数Median 最大值Maximum 平均值Mean 检出率/%Detection rate NOR <LOD 0.44 5.78 0.68 90.2 CIP 0.15 0.47 9.95 0.87 100 DIF <LOD <LOD 0.54 0.04 12.2 ENR <LOD 0.16 3.76 0.48 90.2 FLE <LOD <LOD 0.68 0.06 26.8 OFL <LOD 0.08 1.55 0.16 58.5 LOM <LOD <LOD 0.84 0.07 39.0 SAR <LOD <LOD 0.92 0.08 36.6 STZ <LOD <LOD 0.30 0.02 17.1 SMX <LOD <LOD 0.50 0.05 39.0 SIA <LOD 0.06 0.77 0.07 51.2 SPD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD SDM <LOD <LOD 0.54 0.03 7.32 SMZ <LOD 0.04 0.43 0.07 58.5 SDZ <LOD <LOD 0.24 0.01 7.32 SMR <LOD 0.04 0.30 0.05 58.5 SMM <LOD <LOD 0.53 0.05 41.5 SPI <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD JOS <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD TYL <LOD <LOD 0.24 0.01 7.32 ROX <LOD <LOD 1.08 0.06 17.1 ERY <LOD 0.04 0.51 0.08 53.7 ∑QNs 0.49 1.96 20.1 2.92 100 ∑SAs 0.03 0.27 2.93 0.39 100 ∑MCs <LOD 0.05 1.14 0.16 83.0 Total 0.71 2.39 23.1 3.46 100
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大类Group 抗生素Antibiotics 简写Abbreviation 主要用途Application 使用量/tUsage amount 人Human 猪Pig 鸡Chicken 其他Other 汇总Summary QNs 诺氟沙星 NOR 医用,兽用 1013 2820 961 644 5440 环丙沙星 CIP 医用,兽用 455 3110 1060 712 5340 双氟沙星 DIF 兽用 0 378 172 117 667 恩诺沙星 ENR 兽用 0 3090 1150 940 5180 氟罗沙星 FLE 医用,兽用 119 60.6 21.6 15.1 216 氧氟沙星 OFL 医用,兽用 1286 2440 832 557 5110 洛美沙星 LOM 医用,兽用 228 650 222 149 1250 沙拉沙星 SAR n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Total 3101 12549 4419 3134 23203 SAs 磺胺噻唑 STZ 兽用 0.66 40.2 13.7 9.18 63.7 磺胺甲基异恶唑 SMX 医用,兽用 2.0 198 67.6 45.3 313 磺胺二甲基异恶唑 SIA 医用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺吡啶 SPD n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺间二甲氧嘧啶 SDM 兽用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺二甲基嘧啶 SMZ 医用,兽用 68.4 388 132 88.7 677 磺胺嘧啶 SDZ 医用,兽用 238 648 221 148 1260 磺胺甲基嘧啶 SMR 医用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺间甲氧嘧啶 SMM 兽用 9.93 1400 477 320 2210 Total 319 2674 911 611 4524 MCs 螺旋霉素 SPI 医用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 交沙霉素 JOS n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 泰乐菌素 TYL 兽用 0 3090 1050 706 4850 红霉素 ERY 医用,兽用 1244 1580 565 377 3770 罗红霉素 ROX 医用,兽用 184 112 67.3 22.5 386 Total 1428 4782 1682 1106 9006 n.a.: 没有数据来源；其他：包括除猪和鸡之外的牛、羊等其他家畜.
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表 5 不同阶段奶粉∑QNs、∑SAS和∑MCs浓度的单因素方差分析
Table 5. One-way ANOVA of ∑QNs, ∑SAS and ∑MCs of milk powder at different stages
P 1段 vs 2段 1段 vs 3段 2段 vs 3段 ∑QNs 0.648 0.380 0.195 ∑SAs 0.611 0.309 0.642 ∑MCs 0.263 0.483 0.638 Total 0.678 0.381 0.210
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表 6 动物性食品中部分兽药最大残留限量（μg·kg−1） [22]
Table 6. Maximum residue limits of some veterinary drugs in animal foods （μg·kg−1） [22]
抗生素 Antibiotics 标志残留物 Marker residue 动物种类 Animal species 靶组织 Target tissue MRL ADI DIF DIF 所有食品动物 肌肉脂肪 300100 0—10 ENR ENR与CIP总量 所有食品动物 肌肉脂肪 100100 0—2 SAR SAR 鸡 肌肉脂肪 1020 0—0.3 ERY ERY A 所有食品动物 奶 40 0—5 TYL TYL A 牛 奶 50 0—6 SPI SPI总量 牛 奶 100 0—6 SAs SAs总量 牛/羊 奶 100 0—50 MRL：最高残留限量，μg·kg−1；ADI: 日允许摄入量，ng·kg−1·d−1·bw.
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表 7 奶粉中抗生素对婴幼儿的日暴露水平（ng·kg−1·d−1·bw）
Table 7. Daily exposure to antibiotics in powdered milk for infants（ng·kg−1·d−1·bw ）
抗生素Antibiotics 年龄Age 男Male 女Female 最小值Minimum 最大值Maximum 均值Mean 最小值Minimum 最大值Maximum 均值Mean 喹诺酮类 0—2周 0.00 143 8.22 0.00 190 10.9 2—4周 0.00 137 7.88 0.00 182 10.4 2月 0.00 331 10.2 0.00 430 13.2 3—4月 0.00 139 7.98 0.00 139 7.98 5—6月 0.00 112 7.24 0.00 127 8.21 7—12月 0.00 165 5.96 0.00 177 6.38 13—24月 0.00 47.9 3.94 0.00 50.8 4.17 25—36月 0.00 39.8 3.27 0.00 41.4 3.40 磺胺类 0—2周 0.00 19.0 2.52 0.00 25.3 3.36 2—4周 0.00 18.2 2.42 0.00 24.2 3.21 2月 0.00 44.1 3.12 0.00 57.3 4.05 3—4月 0.00 18.6 2.45 0.00 18.6 2.45 5—6月 0.00 15.0 2.22 0.00 17.0 2.52 7—12月 0.00 8.34 1.83 0.00 8.93 1.96 13—24月 0.00 5.73 1.21 0.00 6.06 1.28 25—36月 0.00 4.76 1.00 0.00 4.95 1.04 大环内酯类 0—2周 0.00 10.4 2.58 0.00 13.8 3.44 2—4周 0.00 9.95 2.47 0.00 13.2 2.39 2月 0.00 24.1 3.19 0.00 31.2 4.14 3—4月 0.00 10.2 2.50 0.00 10.1 2.50 5—6月 0.00 8.18 2.27 0.00 9.28 2.57 7—12月 0.00 18.0 1.87 0.00 19.3 2.00 13—24月 0.00 6.79 1.23 0.00 7.19 1.31 25—36月 0.00 5.64 1.02 0.00 5.87 1.07
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