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对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）是一种重要的有机合成材料，同时也是典型内分泌干扰物和难降解有机污染物，在自然环境中半衰期较长，对水生生物、水体环境和人体健康均有不利影响[1 − 3]. 美国环境保护署将p-NP列为水体中的优先控制污染物，同时p-NP也是我国饮用水水质标准中的污染物控制指标之一[4 − 6].
p-NP具有雌激素活性和抗雄激素活性， 研究表明p-NP可能分别与雌激素受体和雄激素受体相互作用[7]. Li等[8]通过体内实验发现每天向未成熟雌性大鼠注射p-NP会导致子宫重量显著增加，而向未成熟雄性大鼠施用p-NP则会导致生长依赖雄激素的副性腺重量减少. 而Zhang等[9]研究发现，经p-NP治疗的未成熟雄性大鼠的血清雄激素浓度和雄激素受体表达水平均上调，这表明p-NP抗雄激素活性的分子机制是复杂的. 雄激素受体活性通过直接蛋白-蛋白相互作用调节，应激诱导的热激蛋白（heat shock protein 90，HSP）与伴侣蛋白FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP5）通过形成FKBP5-Hsp90超复合物来调节雄激素受体活性[10]. 尽管p-NP在体内具有抗雄激素作用，但p-NP抑制雄激素受体信号的分子机制仍不十分清楚. Wu等[11]来用微摩尔亲和力（micromolar affinity）表征了p-NP与FKBP51的结合，实验和分子动力学模拟结果发现p-NP稳定地结合在FK1区域，p-NP结合的热点残基主要是疏水性官能团，p-NP可能通过下调雄激素受体活性激活下游基因的表达水平抑制人类前列腺癌细胞的雄激素依赖性生长，研究结果可以为评估p-NP的潜在健康影响提供新的指导.
近年来，分子对接技术作为计算生物学重要组成部分，在药物研发、生物修复以及计算毒理学等领域起到重要作用[12 − 13]. Ding等[14]利用分子对接技术研究了对羟基苯甲酸酯类物质侧链官能团对其抗雄激素活性的影响，结果表明侧链官能团的种类和长度对抗雄激素活性存在显著影响，同时对羟基苯甲酸酯类物质抗雄激素活性与结合能呈线性关系. Ng等[15]为了研究全氟化合物的生物累积性，利用分子对接技术预测其结合强度和生物半衰期，结果表明全氟辛烷磺酸能够成功对接到人血清白蛋白上且偏差小于2 Å，为新污染物的环境风险管控提供新的思路. 江文婷等[16]利用分子对接技术研究抗冻多肽与海鲈鱼肌球蛋白重链的作用位点及可能的作用机制，结果表明肽段GPR和GPAGGK能够通过碳氢键、氢键和范德华力等分子作用力对海鲈鱼肌球蛋白的结构及聚集行为产生影响，阻碍蛋白侧链聚集、结构改变和冰晶的位移等.
有关研究已经对p-NP在环境中的降解路径和降解产物进行了研究，然而环境中p-NP降解产物（p-NP degradation products，p-NP-DPs）与FKBP5相互作用及其分子水平机制的研究尚未开展. 赵子晗[17]利用紫外全谱扫描和液质联用测定p-NP-DPs，主要有对苯二酚、邻苯二酚、4-硝基邻苯二酚、1,2,4-苯三酚、对苯醌、苯酚等6种物质. Yang等[18]发现环境中p-NP-DPs主要包括对苯二酚、邻苯二酚、4-硝基邻苯二酚、对苯醌、苯酚以及小分子有机酸. p-NP-DPs与和FKBP5相互作用机理尚不清晰，而p-NP-DPs与FKBP5相互作用性能和机理对于理解和防控环境中p-NP对人体的健康风险十分重要. 小分子污染物的降解产物由于具有污染物类似的结构而具有相似的环境效应，污染物与受体蛋白的相互作用受到官能团和分子量等理化性质的影响[19 − 22]. Anzelle等[23]通过研究亚甲基蓝结构类似物对单胺氧化酶抑制作用的影响，结果发现亚甲基蓝、Azure B和ethylthioninium chloride（ETC）对单胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）和单胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAOB）的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为0.07 μmol·L−1（亚甲基蓝-MAOA）、0.01 μmol·L−1（Azure B-MAOA）和0.51 μmol·L−1（ETC-MAOA），4.47 μmol·L−1（亚甲基蓝-MAOB）、0.97 μmol·L−1（Azure B-MAOB）和0.59 μmol·L−1（ETC-MAOB）. 袁霞等[24]通过HRMS Orbitrap和GC-MS鉴定出UV/氯高级氧化工艺降解卡马西平的10种降解产物，并利用发光细菌毒性实验和ECOSAR预测卡马西平降解产物的毒性，结果表明卡马西平在UV/氯高级氧化工艺中产生更高毒性的中间产物，对水质安全和污染物毒性管控造成潜在风险.
环境中p-NP-DPs与FKBP5结合形成p-NP-DPs-FKBP5加合物是产生雌激素和抗雄激素活性的主要机制[8 − 10]，而p-NP-DPs与FKBP5结合的分子水平机制亟需阐述清楚. 基于此，本文采用通过分子对接技术模拟计算p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能和结合面积. 在此基础上，通过Spearman相关性和Pearson相关性分析探讨p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5结合的影响，剖析影响p-NP-DPs与FKBP5结合的关键因子，从分子水平阐述p-NP-DPs与FKBP5相互作用的本质. 研究结果有助于增进人们对水环境中p-NP-DPs新污染物分子水平健康效应和环境风险的认识和理解.
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选择用于分子对接研究的p-NP-DPs为p-NP、苯酚、对苯二酚、对苯醌、4-硝基邻苯二酚和邻苯二酚，化学结构式及其理化性质分别见图1和表1. 根据p-NP-DPs的CAS号，通过PubChem网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子三维结构，利用分子可视化软件分别对配体小分子进行电荷、质子化状态确认. 通过AutoDock 4.2软件Minimized模块对小分子进行能量最优化、加氢、加电荷及完善结构处理实现小分子的结构修饰，最后将p-NP-DPs的三维结构分别保存为pdb格式文件作为配体结构.
FKBP5原始结构（PDB: 5OMP）从国际标准蛋白质数据库（http://www.rcsb.org/）下载[25]. 通过分子可视化软件对FKBP5进行去除水分子和不需要的杂原子等操作处理，然后通过AutoDock 4.2软件Minimized模块将目的蛋白结构进行能量最优化，同时进行加氢、加电荷及补充大分子的氨基酸残缺结构等完善蛋白结构，最后将FKBP5的晶体结构保存为pdb格式作为受体结构.
打开AutoDock 4.2软件，导入受体结构，确定分子对接口袋区；导入配体结构，通过Dock模块进行分子对接. 通过给出配体与受体结合时氢键、疏水作用、结合面积、能量变化、药效团等参数，对p-NP-DPs与FKBP5相互作用及其分子机制进行解析.
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采用SPSS 25.0软件（IBM, Armonk，NY，美国）对实验结果进行统计分析. 采用Pearson相关性和Spearman相关性对p-NP-DPs与FKBP5相互作用参数和p-NP-DPs理化性质之间的相关性进行分析，P<0.05被认为具有统计学意义. 根据公式（1）—（4）计算 Pearson 相关性：
式中SX i 和SY j是样本Xi和样本Yj的标准差，Cov（Xi，Yj）是样本Xi和样本Yj的协方差，m表示样本中个体的序号，n表示样本的容量. 样本Xi代表p-NP-DPS的11种理化性质，当i=1, 2…11时分别对应分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、亨利常数、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量. 样本Yj代表p-NP-DPS与FKBP5相互作用强度，当j=1, 2时分别对应结合能绝对值和结合面积.
根据公式（5）计算Spearman相关性：
式中，dm是样本Xi和Yj中的第m个体的等级差，n表示样本的容量. 样本Xi代表p-NP和p-NP-DPS的11种理化性质，当i=1, 2…11时分别对应分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、亨利常数、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量. 样本Yj代表p-NP-DPS与FKBP5相互作用强度，当j=1, 2时分别对应结合能绝对值和结合面积.
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分子对接是目前计算化学中一种重要的研究方法，可用于p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合位点和相互作用的研究[26 − 27]. p-NP-DPs与FKBP5分子对接后的最优位置如图2所示. 由图2（a）可知，p-NP与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Glu227、Ala228、Lys254、Glu255、Gly282、Met285、Gln286和Trp297. p-NP与FKBP5的相互作用包括—OH→Gly282（氢键）、—OH→Glu227（氢键）、—NO2←Met285（氢键）、—OH→Gln286（氢键）、—OH→Lys254（氢键）、苯环-Trp297（π-π/范德华力相互作用）、苯环-Glu227（范德华力相互作用）、—OH→Glu255（氢键）和苯环-Ala228（范德华力相互作用）. 受体和供体相互作用的强度由结合能和结合面积决定，p-NP与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.76 kcal·mol−1和200 Å2.
如图2（b）所示，苯酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Pro221、Glu227、Lys254、Glu255、Lys283、Met285、Gln286和Trp297. 苯酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gln286（氢键）、—OH→Pro221（氢键）、—OH→Lys254（氢键）、苯环-Trp297（π-π/范德华力相互作用）、—OH→Glu227（氢键）、苯环-Met285（范德华力相互作用）、苯环-Lys283（范德华力相互作用）、苯环-Glu227（范德华力相互作用）和—OH→Glu255（氢键）. 苯酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.91 kcal·mol−1和173 Å2.
如图2（c）所示，对苯二酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Pro221、Glu227、Gly282、Gln286和Arg331. 对苯二酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gln286（氢键）、—OH→Pro221（氢键）、—OH→Glu227（氢键）、—OH→Gly282（氢键）和—OH←Arg331（氢键）. 对苯二酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为-3.81 kcal·mol−1和175 Å2.
如图2（d）所示，对苯醌与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Lys204、Ala228、Met285、Arg331和Lys335. 对苯醌与FKBP5的相互作用包括C=O←Met285（氢键）、C=O←Arg331（氢键）、C=O←Ala228（氢键）、苯环-Ala228（范德华力相互作用）、C=O←Lys204（氢键）和C=O←Lys335（氢键）. 对苯醌与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.83 kcal·mol−1和171 Å2.
如图2（e）所示，4-硝基邻苯二酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Gly224、Asn238、Gly282、Met285和Gln286. 4-硝基邻苯二酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gly282（氢键）、—NO2 ←Met285（氢键）、—NO2←Asn238（氢键）、—OH→Gln286（氢键）和—OH→Gly224（氢键）. 4-硝基邻苯二酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.69 kcal·mol−1和213 Å2.
如图2（f）所示，邻苯二酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Tyr284和Gln286. 邻苯二酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gln286（氢键）、—OH→Gly224（氢键）、—OH→Gly282（氢键）、苯环-Ala228（范德华力相互作用）、—OH→Glu227（氢键）和苯环-Tyr284（π-π/范德华力相互作用）. 邻苯二酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.81 kcal·mol−1和184 Å2.
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p-NP-DPs与FKBP5相互作用结果如图3（a）所示. p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）> 200 Å2（p-NP）> 184 Å2（邻苯二酚）> 175 Å2（对苯二酚）> 173 Å2（苯酚）> 171 Å2（对苯醌），而p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）> −3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚）.
结合面积的数值越正意味着p-NP-DPs与FKBP5相互作用越强，而结合能的数值越负意味着p-NP-DPs与FKBP5相互作用越强，基于结合面积因素，p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度大小顺序为4-硝基邻苯二酚 > p-NP > 邻苯二酚 > 对苯二酚 > 苯酚 > 对苯醌；基于结合能因素，p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度大小顺序为苯酚 > 对苯醌 > 对苯二酚/邻苯二酚 > p-NP > 4-硝基邻苯二酚. 因此，结合能和结合面积对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响是复杂的，p-NP-DPs与FKBP5相互作用的强度取决于结合能和结合面积复合作用的结果[28].
影响p-NP-DPs与FKBP5相互作用的关键因素可能是小分子的种类，而分子量是决定小分子性能和结构的关键因素，因此，研究p-NP-DPs分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响十分必要. p-NP-DPs分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积的影响如图3（b）所示，结果表明p-NP-DPs分子量越大，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积越大，二者呈正相关关系，线性相关系数R2=0.9194，表明污染物分子量越大，污染物与受体蛋白相互作用越强，污染物环境风险越大. 而p-NP-DPs分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合能的影响如图3（c）所示，p-NP-DPs分子量越大，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合能越大，二者呈正相关关系，线性相关系数R2=0.9198，表明污染物分子量越小，污染物与受体蛋白相互作用越强，污染物环境风险越大. p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积和结合能的影响如图3（d）所示，结果表明结合面积和结合能呈正相关关系，线性相关系数R2=0.7906，因此分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度影响随分子量增加呈“先升后降”趋势，过大的分子量导致污染物空间结构变大，受体蛋白空间位阻抑制p-NP-DPs与FKBP5相互结合，而过小的分子量则因为官能团和药效团减少抑制了p-NP-DPs与FKBP5相互结合[29 − 30].
p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合区域如图4所示，p-NP-DPs药效团如图5所示. p-NP与FKBP5相互作用结合区域由Glu227、Ala228、Lys254、Glu255、Gly282、Met285、Gln286和Trp297组成，结合面积200 Å2（图4a），p-NP的药效团为氢键供体（—OH）、氢键受体（—NO2）和芳香中心-疏水中心（苯环及其C原子），如图5a所示. 苯酚与FKBP5相互作用结合区域由Pro221、Glu227、Lys254、Glu255、Lys283、Met285、Gln286和Trp297组成，结合面积173 Å2（图4b），苯酚的药效团为氢键供体（—OH）、芳香中心（苯环）和芳香中心-疏水中心（苯环上C原子），如图5b所示. 对苯二酚与FKBP5相互作用结合区域由Pro221、Glu227、Gly282、Gln286和Arg331组成，结合面积175 Å2（图4c），对苯二酚的药效团为氢键供体（—OH），如图5c所示. 对苯醌与FKBP5相互作用结合区域由Lys204、Ala228、Met285、Arg331和Lys335组成，结合面积171 Å2（图4d），对苯醌的药效团为氢键受体（C=O）和疏水中心（苯环），如图5d所示. 4-硝基邻苯二酚与FKBP5相互作用结合区域由Gly224、Asn238、Gly282、Met285和Gln286组成，结合面积213 Å2（图4e），4-硝基邻苯二酚的药效团为氢键供体（—OH）和氢键受体（—NO2），如图5e所示. 邻苯二酚与FKBP5相互作用结合区域由Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Tyr284和Gln286组成，结合面积184 Å2（图4f），邻苯二酚的药效团为氢键供体（—OH）和芳香中心-疏水中心（苯环），如图5f所示.
p-NP-DPs与FKBP5相互作用的氨基酸残基分布如图6所示，结果表明氨基酸残基分布区间为Lys204（对苯醌和FKBP5）到Lys335（对苯醌和FKBP5），其中高频氨基酸残基主要由两个区域组成，包括氨基酸残基序号221—228（Pro221、Gly224、Glu227、Ala228）和氨基酸残基序号282—286（Gly282、Lys283、Tyr284、Met285、Gln286）.
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p-NP-DPs分子结构的不同导致其理化性质（分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量，表1）差异显著[31 − 32]. 为了明确p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度与p-NP-DPs物理化学性质之间的关系，分别采用SPSS软件中的Spearman相关性和Pearson相关性分析了分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量分别与结合面积和结合能绝对值之间的相关性. 表2为利用Spearman相关性分析理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响，结果表明结合能绝对值与分子量和拓扑极表面积在0.01水平的相关系数均达到-1，与闪点、密度和氢键受体数量在0.05水平的相关系数达到-0.9747、-0.9747和-0.9549，表明结合能绝对值与分子量、拓扑极表面积、闪点、密度和氢键受体数量呈显著的负相关关系. 结合能绝对值与熔点、沸点、lgSw、lgP和氢键供体数量的相关系数分别为-0.6377、-0.7182、0.5000、-0.5798和-0.5323，且P>0.05，结合能绝对值与熔点、沸点、lgSw、lgP和氢键供体数量无相关性. 而结合面积仅与分子量和拓扑极表面积在0.05水平的相关系数均达到0.9276，表明结合面积仅与分子量和拓扑极表面积呈显著的正相关关系.
表3为利用Pearson相关性分析理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响，结果表明结合能绝对值与分子量在0.01水平的相关系数达到−0.9591，与密度、拓扑极表面积和氢键受体数量在0.001水平的相关系数分别达到−0.9928、−0.9743和−0.9860，表明结合能绝对值与分子量、密度、拓扑极表面积和氢键受体数量呈显著的负相关关系. 结合面积与分子量、拓扑极表面积和氢键受体数量在0.01水平的相关系数达到0.9589、0.9597和0.9230，表明结合面积与分子量、拓扑极表面积和氢键受体数量呈显著的正相关关系. 结果表明，p-NP-DPs分子结构及理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）> 氢键受体数量（75%）> 密度（50%）> 闪点（25%）.
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（1）p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）> 200 Å2（p-NP）> 184 Å2（邻苯二酚）> 175 Å2（对苯二酚）> 173 Å2（苯酚）> 171 Å2（对苯醌），结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）> −3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚）.
（2）p-NP-DPs与FKBP5相互作用高频氨基酸残基为Pro221、Gly224、Glu227、Ala228（221-228）和Gly282、Lys283、Tyr284、Met285、Gln286（282-286），p-NP-DPs的药效团主要包括氢键供体、氢键受体、芳香中心和疏水中心.
（3）p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）> 氢键受体数量（75%）> 密度（50%）> 闪点（25%）.
对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制
Molecular mechanism on interaction between p-nitrophenol degradation products and FK506 binding protein
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摘要: 对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）作为典型内分泌干扰物，其环境污染与人体健康问题一直是环境领域的研究热点. 环境中对硝基苯酚降解产物（p-NP degradation products，p-NP-DPs）与FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP5）结合形成p-NP-DPs-FKBP5加合物是p-NP-DPs产生雌激素和抗雄激素活性的主要机制. 然而，p-NP-DPs与FKBP5相互作用的分子水平机制尚未引起足够的重视. 本文采用分子对接技术模拟计算p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能和结合面积. 结果表明，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）>200 Å2（p-NP）>184 Å2（邻苯二酚）>175 Å2（对苯二酚）>173 Å2（苯酚）>171 Å2（对苯醌），结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）>−3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚），高频氨基酸残基为Pro221、Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Lys283、Tyr284、Met285和Gln286，p-NP-DPs药效团主要包括氢键供体（—OH）、氢键受体（—NO2和C=O）、芳香中心（苯环）和疏水中心（C原子）. p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）、氢键受体数量（75%）、密度（50%）和闪点（25%）. 本研究对认识水环境中p-NP-DPs分子水平健康效应和环境风险具有重要科学意义.Abstract: P-nitrophenol (p-NP), as typical endocrine disruption chemicals (EDCs), their environmental pollution and human health issues have always been hotspots in the environmental field. The p-NP-DPs-FKBP5 adducts, formed by p-NP degradation products (p-NP-DPs) and FK506 binding protein (FKBP5), is the main estrogenic and anti-androgenic mechanism. However, this molecular-level mechanism between p-NP-DPs and FKBP5 has not attracted enough attention. In this study, the molecular docking technology was used to simulate the binding energy and binging area between p-NP-DPs and FKBP5 interaction. The results indicated that the order of binging area between p-NP-DPs and FKBP5 interaction was 213 Å2 (4-nitrocatechol) > 200 Å2 (p-NP) > 184 Å2 (o-dihydroxybenzene) > 175 Å2 (p-dihydroxybenzene) > 173 Å2 (phenol) > 171 Å2 (p-benzoquinone), but the order of binding energy between p-NP-DPs and FKBP5 interaction was −3.69 kcal·mol−1 (4-nitrocatechol) > −3.76 kcal·mol−1 (p-NP) > −3.81 kcal·mol−1 (p-/o-dihydroxybenzene) > −3.83 kcal·mol−1 (p-benzoquinone) > −3.91 kcal·mol−1 (phenol). The high frequency amino acid residues were included Pro221, Gly224, Glu227, Ala228, Gly282, Lys283, Tyr284, Met285 and Gln286. The pharmacophores of p-NP-DPs were included hydrogen-bond donor (—OH), hydrogen-bond acceptor (—NO2 and C=O), aromatic center (benzene ring) and hydrophobic center (C atom). The physicochemical properties of p-NP-DPs were dependent on molecular weight and topological polar surface area (100%), hydrogen bond donor count (75%), density (50%) and flash point (25%). The research results probably enhance people’s knowledge and understanding of molecular-level health effects and environmental risks of p-NP-DPs in the water environmental system in the future.
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Key words:
- p-NP /
- FKBP5 /
- molecular docking /
- pharmacophore /
- structure-activity relationship
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水体富营养化导致水体异味（off-flavor）是一个严重且普遍存在的环境问题. 异味将直接对饮用水和水产品的质量造成影响，并最终危害到饮用水和水产品的品质，造成消费者不安全感和渔业经济损失，因此水体中的异味物质研究受到越来越多的关注. 水体中最常见的两种异味物质是土臭素（geosmin）和 2-甲基异莰醇（2-methylisoborneol，2-MIB），这两种物质已经得到了较多的研究，在生活饮用水卫生标准[1]当中也规定了限量值. 但随着工业的发展和各种环境问题的爆发，仅仅关注这两种异味物质是不够的. 其他的水体异味，如土霉味、氯味、草木味、沼气味、芳香味、鱼腥味、药水味及化学品味等也需要引起我们的关注. 了解水体中异味物质的种类、分布和浓度水平是判断异味物质来源、采取针对性控制措施的基础，因此建立准确可靠并且可同时分析多种异味物质的方法十分必要.
由于异味物质的嗅觉阈值极低，例如，土臭素和2-甲基异莰醇的嗅觉阈值分别为5—10 ng·L−1和1—10 ng·L−1，因此需要高效的样品前处理和高灵敏度的检测方法. 样品富集方法目前用的比较多的有吹扫捕集法[2-3]、分散固相萃取法[4]、闭环捕集[5-6]、液液萃取[7-8]、固相萃取[9-10]、搅拌棒吸附萃取[11-12]等. 这些方法大多费时费力，需要用到有机溶剂，前处理设备如果管路多，容易存在样品残留，引起交叉污染的状况. 而20世纪80年代发展起来的固相微萃取技术由于其富集能力强，无需使用有机溶剂而深受广大科研工作者的青睐，越来越多的应用于水中异味物质的分析检测[13-17]. 2016 年，我国颁布了国家标准检测方法《GB/T 32470—2016 生活饮用水臭味物质 土臭素和 2-甲基异莰醇检验方法》[18]. 该方法采用固相微萃取技术吸附样品中的土臭素和2-甲基异莰醇，顶空富集后用气质联用仪进行分离、测定. 但是手动固相微萃取，耗时长，每天能够检测的样品数量非常少，特别不利于大批量样品的检测，并且萃取头寿命较短.
本研究中采用新的箭型固相微萃取（SPME Arrow）技术对水中的异味物质进行在线富集，涂层体积更大，加大了吸附容量，从而大大提高了富集倍数，进而提高了方法的灵敏度. 异味物质的检测技术方面，目前大多采用气相色谱-单四极杆质谱进行检测，检测的目标物种类比较少，不能满足当前水中异味物质多样化的检测需求，并且对复杂基质中的目标物检测存在基质干扰的情况. 本方法采用气相色谱-三重四极杆质谱对异味物质进行检测，提高了方法对复杂基质的抗干扰能力. 选取了57种常见的异味物质作为目标物，优化了萃取过程中对萃取效率有显著影响的关键参数，建立水体中多种异味物质的高效、稳定、全自动的SPME Arrow -气相色谱/三重四极杆质谱联用分析方法.
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 仪器
PAL3自动样品前处理平台，包含孵化炉、SPME Arrow 老化模块、加热磁力搅拌模块（瑞士CTC Analytics公司）；Agilent 7890B/7000D 三重四极杆气质联用系统，配备 EI 源（美国Agilent公司）.
1.2 标准品与试剂
异味物质标准品（固体标准品或溶液，上海安谱实验科技股份有限公司，标准品物质名称详见表1）；氯化钠，乙酸，碳酸钠，均为优级纯（国药集团）；甲醇，色谱纯（美国Merck公司）；所用实验用水为现制备的超纯水.
表 1 57种化合物保留时间、名称、CAS、定量离子对Table 1. Retention time, name, CAS, quantitative ion pair of 57 compounds序号No. 保留时间/minRT 英文名称Name 中文名称Name CAS 定量离子对Quantitative ion pair 1 2.94 1-Propanethiol 1-丙硫醇 107-03-9 76.0 -> 42.0 2 3.16 1-Bromopropane 1-溴丙烷 106-94-5 122.0 -> 43.0 3 4.87 n-Valeric aldehyde 正戊醛 110-62-3 44.0 -> 43.0 4 4.47 2,3-Butandione 2,3-丁二酮 431-03-8 86.0 -> 43.0 5 6.20 Dimethyl disulfide 二甲基二硫 624-92-0 94.0 -> 79.0 6 6.63 β-Pinene β-蒎烯 127-91-3 93.0 -> 93.0 7 6.79 Diethyl carbonate 碳酸二乙酯 105-58-8 91.0 -> 63.0 8 6.81 n-Amylformate 甲酸正戊酯 638-49-3 70.0 -> 42.0 9 7.20 Isoamyl methyl ketone 甲基异戊酮 110-12-3 43.0 -> 43.0 10 7.91 Cumene 异丙苯 98-82-8 105.0 -> 77.0 11 8.52 Cineole 桉叶素 470-82-6 139.0 -> 43.0 12 8.25 Pyridine 吡啶 110-86-1 79.0 -> 52.0 13 8.63 Pyrazine 吡嗪 290-37-9 80.0 -> 53.0 14 9.43 p-Cymene 对伞花烃 99-87-6 119.0 -> 119.0 15 9.62 Terpinolene 萜烯 586-62-9 136.0 -> 121.0 16 9.59 pyrimidine 嘧啶 289-95-2 80.0 -> 53.0 17 9.82 Cyclohexanone 环己酮 108-94-1 98.0 -> 55.0 18 9.90 1,3-Diethylbenzene 1,3-二乙苯 141-93-5 105.0 -> 77.0 19 10.29 2,5-Dimethylpyrazine 2,5-二甲基吡嗪 123-32-0 108.0 -> 108.0 20 10.37 4-tert-Butyltoluene 4-叔丁基甲苯 98-51-1 133.0 -> 105.0 21 10.42 1,2,3-Trimethyl benzene 1,2,3-三甲基苯 526-73-8 105.0 -> 105.0 22 10.42 tert-Amylbenzene 叔戊苯 2049-95-8 91.0 -> 91.0 23 10.51 Anisole 苯甲醚 100-66-3 108.0 -> 108.0 24 10.53 n-Butyl glycidyl ether 正丁基缩水甘油醚 2426-08-6 57.0 -> 57.0 25 11.48 Pentyl valerate 戊酸戊酯 2173-56-0 85.0 -> 57.0 26 12.61 Acetonylacetone 丙酮基丙酮 110-13-4 99.0 -> 99.0 27 13.02 2-Isobutyl-3-methoxypyrazine 2-异丁基-3-甲氧基吡嗪 24683-00-9 124.0 -> 94.0 28 13.04 N,N-Dimethylacrylamide N，N-二甲基丙烯酰胺 2680-03-7 98.0 -> 42.0 29 13.23 Linalool 芳樟醇 78-70-6 93.0 -> 93.0 30 13.83 Isoborneol acetate 乙酸异冰片 125-12-2 136.0 -> 121.0 31 13.93 2-Methylisoborneol 2-甲基异莰醇 2371-42-8 108.0 -> 93.0 32 14.44 L-Menthol L-薄荷醇 2216-51-5 81.0 -> 81.0 33 14.44 Dicyclohexylamine 二环己基胺 101-83-7 138.0 -> 55.0 34 14.45 trans-2-Decenal 反-2-癸烯醛 3913-81-3 55.0 -> 55.0 35 15.64 4-Ethylbenzaldehyde 4-乙基苯甲醛 4748-78-1 134.0 -> 105.0 36 15.67 Naphthalene 萘 91-20-3 128.0 -> 128.0 37 16.31 Perillaldehyde 紫苏醛 18031-40-8 122.0 -> 79.0 38 16.44 Ethyl salicylate 水杨酸乙酯 118-61-6 120.0 -> 92.0 39 16.65 Anethole 茴香脑 104-46-1 148.0 -> 105.0 40 16.69 Geosmin 土臭素 16423-19-1 112.0 -> 97.0 41 16.79 2-Chlorophenol 2-氯酚 95-57-8 128.0 -> 64.0 42 16.87 α-Ionone 2-紫罗兰酮 127-41-3 121.0 -> 77.0 43 16.91 2-Methylnaphthalene 2-甲基萘 91-57-6 142.0 -> 142.0 44 16.93 Guaiacol 愈创木酚 90-05-1 109.0 -> 81.0 45 17.42 2,6-Dimethylphenol 2,6-二甲基苯酚 576-26-1 107.0 -> 77.0 46 17.53 p-Ethylaniline 对乙基苯胺 589-16-2 106.0 -> 106.0 47 19.19 Methyl cinnamate 肉桂酸甲酯 103-26-4 131.0 -> 103.0 48 19.51 2,6-Dichlorophenol 2,6-二氯苯酚 87-65-0 164.0 -> 63.0 49 20.07 2,4-Dichlorophenol 2,4-二氯苯酚 120-83-2 162.0 -> 162.0 50 21.12 Dihydrojasmonic acid methyl ester 二氢茉莉酸甲酯 24851-98-7 153.0 -> 97.0 51 21.81 2,4,6-Trichlorophenol 2,4,6-三氯酚 88-06-2 196.0 -> 97.0 52 22.41 4-Chlorophenol 4-氯酚 106-48-9 128.0 -> 65.0 53 22.97 4-Chloro-m-cresol 4-氯-3-甲酚 59-50-7 142.0 -> 107.0 54 23.16 Ethyl vanillin 乙基香兰素 121-32-4 166.0 -> 137.0 55 23.53 Vanillin 香兰素 121-33-5 152.0 -> 151.0 56 23.83 p-Bromophenol 对溴苯酚 106-41-2 172.0 -> 65.0 57 24.09 Benzyl benzoate 苯甲酸苄酯 120-51-4 212.0 -> 105.0 | Show Table
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1.3 样品前处理参数
取 5.0 mL 水样，加入 1.0 g 氯化钠，置于 20 mL 螺口顶空瓶中. 旋紧瓶盖，置于顶空样品盘中，待测定.
萃取前，将样品置于40 ℃ 下孵化3.0 min，然后将样品转移到加热磁力搅拌模块中，将 SPME Arrow 伸入样品上方顶空气相中，在40 ℃ 下顶空萃取30.0 min，最后在进样口解吸5.0 min.
1.4 仪器检测参数
色谱柱：Agilent DB-WAX UI 气相色谱柱，30 m×0.25 mm×0.25 µm. 多模式（MMI）进样口：不分流进样，250 ℃. 载气类型及流速：He，恒流模式，流速1 mL·min−1. 炉温升温程序：在40 ℃ 下保持3.0 min，然后以10.0 ℃·min−1的速率升至250 ℃ 并保持10.0 min. 传输线温度280 ℃. 质谱离子源温度250 ℃. 检测模式：MRM模式，57种化合物保留时间及定量离子对详见表1.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 实验条件的优化
固相微萃取技术中吸附效率的影响因素主要包括萃取头涂层（固定相）、萃取时间、萃取温度、样品pH值和离子强度等. 本方案中着重考察了萃取时间、萃取温度、样品pH的影响. 另外在实验过程中发现了萃取头在进样口进入的深度对解析效率有显著影响，因此也对萃取头在进样口的深度进行了优化.
萃取涂层的选择上考虑到水中的异味物质既有极性化合物，也有弱极性和非极性化合物，分子量比较小，沸点较低，所以一般选用三相复合涂层DVB/CAR/PDMS来满足多种异味物质的萃取要求[16]. Arrow萃取头的长度为2 cm，直径为1.1 mm和1.5 mm两种型号，比表面积大，吸附速度快，涂层体积大，灵敏度高. 本实验中，选择了1.1 mm直径的DVB/CAR/PDMS作为萃取涂层，能够得到非常优异的结果.
2.1.1 萃取温度
萃取温度对固相微萃取有双重作用：温度升高，可以加快目标物的分子扩散速度，有利于尽快达到平衡，但是温度的升高，又使得涂层对待测物的吸附减弱，降低了灵敏度. 在本实验中，考察了萃取温度对57种分析物的影响，考察的温度范围从30 ℃到70 ℃. 结果表明，对于保留时间在21.0 min之前的化合物，萃取温度40 ℃能够达到最优的萃取效果. 当萃取温度高于40 ℃后，随着萃取温度的升高，这些化合物的响应值逐渐降低，这是由于温度的升高减弱了目标物在涂层上的吸附而导致的结果（图1）. 而对于保留时间在21.0 min之后的化合物，随着萃取温度的升高，萃取效率一直是升高的趋势. 对于这些化合物而言，温度增加，分子扩散速度的增加更为明显. 考虑到保留时间21.0 min之前的化合物占了大多数，并且温度过高，水汽的量会增加，对Arrow也会有不利的影响，因此选择40 ℃为本实验的萃取温度.
2.1.2 萃取时间
萃取时间即萃取达到平衡所需的时间，由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定. 本实验中，考察了萃取时间对萃取效率的影响，考察的时间范围从10 min到50 min. 结果表明，对于出峰时间较短的化合物，萃取时间10 min能够达到最优的萃取效果. 而对于出峰时间较长的化合物，随着萃取时间的加长，萃取效率一直是升高的趋势（图2）. 在实际的实验中，通常选择具有较大萃取量且萃取时间不太长作为实际的萃取时间，考虑到本实验中仪器的运行时间为34 min，因此最终选择30 min为本实验的萃取时间.
2.1.3 盐析效应和pH的影响
两者在实质上是一样的，都是影响了基质的离子强度，从而影响了待分析物在样品和顶空气相之间的分配系数. 盐析是向待测样品中加入氯化钠或其他盐，使得溶液中的离子强度增加，从而减少了待测物在基质中的溶解，提高了待测物在顶空气相中的含量，从而提高了萃取效率. 本实验中向待测溶液中加入20%的氯化钠，增强离子强度，从而提高萃取效率[16] .
pH的影响是通过调节酸碱度而影响了溶液中的离子强度从而改变了待测物在基质中的溶解性。在 本实验中，考察了样品的pH值对萃取效率的影响：向样品溶液中加入0.1 mL乙酸，使样品在酸性条 件下萃取，可以看到，对酚类等具有羟基的化合物的萃取有明显的促进作用，对酯类化合物的萃取也 有促进作用（图3）；而 向样品中添加0.1 g碳酸钠，使样品在碱性条件下萃取，对吡嗪类化合物和醚类化合物的萃取有明显的促进作用（图4）。 从图中可以观察到，酸性条件下萃取对吡嗪类化合物 的负面影响非常显著，而碱性条件下萃取对酚类化合物的负面影响非常显著。因此，最终的实验为了兼顾所有化合物的萃取，实现一次萃取进样完成所有化合物的分析，选择的是中性的萃取条件（样品只添加20%的氯化钠）。
图 3 酸性条件下萃取效率提高的代表性化合物Figure 3. Some compounds with high extraction efficiency under acidic conditions（从上至下依次为中性条件、酸性条件、碱性条件）（neutral conditions, acidic conditions and alkaline conditions from top to bottom）
图 4 碱性条件下萃取效率提高的代表性化合物Figure 4. Some compounds with high extraction efficiency under alkaline conditions（从上至下依次为中性条件、酸性条件、碱性条件）（neutral conditions, acidic conditions and alkaline conditions from top to bottom）2.1.4 进样深度的影响
萃取头在气相进样口插入的深度对解析的效率有比较大的影响. 本实验优化了进样口插入深度对解析的影响，考察的进样口深度范围从40 mm到65 mm. 结果如图5所示，对于多模式进样口而言，萃取头在进样口插入的位置越深，峰型越尖锐，说明位置越深，解析的速度越快，解析效率也越高. 分析原因，应该是由于进样口中衬管的中下部位置温度是比较高的区域，因此，Arrow在进样口中的插入深度越深，解析速度越快，解析效率也越高.
2.2 方法评价
2.2.1 线性范围
配制浓度梯度为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng·L−1的标准溶液，按照上述优化后的条件，分别进行萃取：加入氯化钠（20%，M/M）以增强离子强度，提高萃取效率；然后在40 ℃下萃取30.0 min，最后在进样口插入深度65 mm的条件下解吸5.0 min. 用外标法建立校准曲线. 所有57个目标物中其线性相关系数均大于0.99.
2.2.2 重复性
实际水样加标水平10 ng·L−1，化合物出峰状况良好，峰型尖锐，基本无干扰. 重复萃取测定10次，其中52种化合物RSD小于10%；两种酚类物质（2,6-二氯酚、2,4,6-三氯酚）和嘧啶的RSD值均大于10%，但小于20%（表2）.
表 2 57种化合物线性范围、相关系数、重复性、检出限Table 2. Linear range, correlation coefficient, repeatability, MDL of 57 compounds序号No. 保留时间/minRT 中文名称Name 线性范围/（ng·L−1） 线性相关系数R2 相对标准偏差RSD 方法检出限/（ng·L−1）MDL 1 2.94 1-丙硫醇 10—500 0.9936 7.21 1.20 2 3.16 1-溴丙烷 10—500 0.9956 7.26 1.24 3 4.87 正戊醛 10—500 0.9991 3.15 2.90 4 4.47 2,3-丁二酮 10—500 0.9973 8.72 2.96 5 6.20 二甲基二硫 1—500 0.9888 1.18 0.49 6 6.63 β-蒎烯 1—500 0.9993 2.72 0.35 7 6.79 碳酸二乙酯 10—500 0.9958 8.12 1.02 8 6.81 甲酸正戊酯 10—500 0.9973 6.99 1.43 9 7.20 甲基异戊酮 10—500 0.9975 5.56 0.81 10 7.91 异丙苯 10—500 0.9997 6.02 0.46 11 8.52 桉叶素 10—500 0.9999 7.00 1.47 12 8.25 吡啶 10—500 0.9933 7.25 5.75 13 8.63 吡嗪 10—500 0.9920 6.79 2.90 14 9.43 对伞花烃 10—500 0.9903 2.13 0.73 15 9.62 萜烯 10—500 0.9006 3.10 1.02 16 9.59 嘧啶 50—500 0.9986 17.35 18.03 17 9.82 环己酮 10—500 0.9902 9.50 3.34 18 9.90 1,3-二乙苯 10—500 0.9993 8.19 1.07 19 10.29 2,5-二甲基吡嗪 10—500 0.9993 7.15 1.10 20 10.37 4-叔丁基甲苯 10—500 0.9994 6.05 1.96 21 10.42 1,2,3-三甲基苯 10—500 0.9989 6.63 1.30 22 10.42 叔戊苯 10—500 0.9990 3.61 1.48 23 10.51 苯甲醚 10—500 0.9978 6.75 0.77 24 10.53 正丁基缩水甘油醚 10—500 0.9960 8.28 1.29 25 11.48 戊酸戊酯 10—500 0.9967 2.15 0.82 26 12.61 丙酮基丙酮 10—500 0.9930 1.21 1.69 27 13.02 2-异丁基-3-甲氧基吡嗪 10—500 0.9975 4.42 1.18 28 13.04 N,N-二甲基丙烯酰胺 200—1000 0.9998 — 204.80 29 13.23 芳樟醇 1—500 1.0000 4.78 0.92 30 13.83 乙酸异冰片 1—500 0.9983 7.65 0.65 31 13.93 2-甲基异莰醇 1—500 1.0000 2.92 0.89 32 14.44 L-薄荷醇 10—500 0.9980 8.71 3.22 33 14.44 二环己基胺 10—500 0.9986 9.37 3.26 34 14.45 反-2-癸烯醛 10—500 0.9989 8.66 1.57 35 15.64 4-乙基苯甲醛 10—500 0.9989 5.74 2.02 36 15.67 萘 10—500 0.9998 9.85 2.98 37 16.31 紫苏醛 1—500 0.9998 4.60 0.65 38 16.44 水杨酸乙酯 1—500 0.9955 1.45 0.93 39 16.65 茴香脑 1—500 0.9991 2.91 0.91 40 16.69 土臭素 1—500 1.0000 1.09 0.22 41 16.79 2-氯酚 1—500 0.9984 5.14 0.77 42 16.87 2-紫罗兰酮 1—500 0.9958 1.97 0.81 43 16.91 2-甲基萘 10—500 0.9990 9.18 2.46 44 16.93 愈创木酚 10—500 0.9996 5.99 1.41 45 17.42 2,6-二甲基苯酚 10—500 0.9998 7.38 1.88 46 17.53 对乙基苯胺 10—500 0.9951 3.13 9.54 47 19.19 肉桂酸甲酯 10—500 0.9971 3.16 1.41 48 19.51 2,6-二氯苯酚 10—500 0.9864 13.83 3.44 49 20.07 2,4-二氯苯酚 10—500 0.9991 4.24 1.43 50 21.12 二氢茉莉酸甲酯 10—500 0.9952 7.96 3.53 51 21.81 2,4,6-三氯酚 10—500 0.9864 12.40 2.87 52 22.41 4-氯酚 10—500 0.9990 6.77 2.40 53 22.97 4-氯-3-甲酚 10—500 0.9992 3.15 1.09 54 23.16 乙基香兰素 100—500 0.9983 — 76.41 55 23.53 香兰素 50—500 0.9972 7.67 15.70 56 23.83 对溴苯酚 10—500 0.9992 5.86 1.85 57 24.09 苯甲酸苄酯 1—500 0.9988 1.77 0.48 | Show TableDownLoad:
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2.2.3 检出限
方法最低检出限（MDL）是根据同一浓度的10次测定的精密度来确定的. 配置1 ng·L−1的加标样品，平行测定10次，以3倍的标准偏差为方法检出限. 计算结果显示，52个化合物检测限小于5 ng·L−1，仅有4个化合物的方法检测限大于10 ng·L−1（详见表2）. 在国家标准检测方法《GB/T 32470—2016 生活饮用水臭味物质 土臭素和2-甲基异莰醇检验方法》中采用传统的固相微萃取纤维的方式，土臭素和2-甲基异莰醇的检出限分别为3.8 ng·L−1和2.2 ng·L−1，而本方法中土臭素和2-甲基异莰醇的检出限分别达到0.22 ng·L−1和0.89 ng·L−1，相比传统的方法，灵敏度分别提高17倍和2.5倍. 因此，本研究建立的方法具有非常高的检测灵敏度.
3. 结论（Conclusion）
采用新型的箭型固相微萃取技术顶空富集水中的异味物质，然后转移至气相色谱进样口进行热解析，三重四极杆串联质谱进行异味物质的高通量筛查，方法优化过程中主要对萃取时间、萃取温度和样品pH值进行了优化，同时在优化过程中发现，对于多模式进样口来说，萃取头解析时进入进样口的深度对解析的速度和效率有显著的影响. 本方法采用了新型的箭型固相微萃取头萃取水中的异味物质，具有更高的灵敏度；整个方法前处理过程无需使用有机溶剂，减少环境污染，保护操作人员安全；萃取头小巧，方便携带，易于实现原位检测；萃取头采用金属材质，增强了机械性能，延长了使用寿命，箭型末端还能减小对隔垫的损伤. 2022年3月15日，国家卫生健康委员会发布《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2022），对饮用水中土臭素和2-甲基异莰醇的限量作出了明确的规定为10 ng·L−1，本方法完全能够满足该标准对饮用水和水源水的卫生检测要求.
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图 1 p-NP-DPs结构式：p-NP（a）、苯酚（b）、对苯二酚（c）、对苯醌（d）、4-硝基邻苯二酚（e）和邻苯二酚（f）
Figure 1. Structure of p-NP-DPs: p-NP （a）, phenol （b）, p-dihydroxybenzene （c）, p-benzoquinone （d）, 4-nitrocatechol （e） and o-dihydroxybenzene （f）
图 2 p-NP-DPs与FKBP5相互作用的分子对接结果
Figure 2. Interaction results between p-NP-DPs and FKBP5 using molecular docking technology
图 3 小分子种类/分子量对结合能和结合面积的影响
Figure 3. Effect on binding energy and binding area with types/molecular weight of small moleculars
图 4 p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合区域：p-NP（a）、苯酚（b）、对苯二酚（c）、对苯醌（d）、4-硝基邻苯二酚（e）和邻苯二酚（f）
Figure 4. Binding domain between p-NP-DPs and FKBP5: p-NP （a）, phenol （b）, p-dihydroxybenzene （c）, p-benzoquinone （d）, 4-nitrocatechol （e） and o-dihydroxybenzene （f）
图 5 p-NP-DPs与FKBP5相互作用药效团：p-NP（a）、苯酚（b）、对苯二酚（c）、对苯醌（d）、4-硝基邻苯二酚（e）和邻苯二酚（f）氢键受体： hydrogen-bond acceptor（HA）；氢键供体： hydrogen-bond donor（HD）；芳香-疏水中心： aromatic-hydrophobic center（AHC）；疏水中心： hydrophobic center（HC）
Figure 5. Pharmacophores between p-NP-DPs and FKBP5: p-NP （a）, phenol （b）, p-dihydroxybenzene （c）, p-benzoquinone （d）, 4-nitrocatechol （e） and o-dihydroxybenzene （f）
表 1 p-NP-DPs的理化性质
Table 1. Physicochemical property of p-NP-DPs
名称Sample CAS 熔点/°C Melting point 沸点/°C Boiling poin 闪点/°C Flash point 密度/（g·cm−3） Density lgSw p-NP 100—02—7 113—114 279 169 1.480—1.50 -0.74 苯酚Phenol 108—95—2 40.9 181.8 79 1.04—1.07 0 对苯二酚p-dihydroxybenzene 123—31—9 170—173 285—287 165 1.330—1.332 N/A 对苯醌p-benzoquinone 106—51—4 114—116 180 93 1.318—1.320 N/A 4-硝基邻苯二酚4-nitrocatechol 3316—09—4 174—176 N/A N/A N/A N/A 邻苯二酚o-dihydroxybenzene 120—80—9 105 245 127 1.344 0.62 名称Sample 相对分子质量Molecular weight lgP 拓扑极表面积/Å2Topological polar surface area 氢键供体数量Hydrogen bond donor count 氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count p-NP 139.1100 1.91 66 1 3 苯酚Phenol 94.1130 1.46 20.2 1 1 对苯二酚p-dihydroxybenzene 110.1120 0.59 40.5 2 2 对苯醌p-benzoquinone 108.0960 0.2 34.1 0 2 4-硝基邻苯二酚4-nitrocatechol 155.1090 1.66 86.3 2 4 邻苯二酚o-dihydroxybenzene 110.1120 0.88 40.5 2 2 说明：N/A为数据未查到
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表 2 p-NP-DPs与FKBP5相互作用和理化性质Spearman相关性分析
Table 2. Spearman correlation between physicochemical property and interaction of p-NP-DPs and FKBP5
理化性质Physicochemical property 结合能Absolute value of binding energy 结合面积Binding area 相关性系数Correlation coefficient P 相关性系数Correlation coefficient P 分子量Molecular weight −1** 0.0056 0.9276* 0.0167 熔点Melting point −0.6377 0.2000 0.3714 0.4972 沸点Boiling point −0.7182 0.1667 0.7000 0.2333 闪点Flash point −0.9747* 0.0333 0.8000 0.1333 密度Density −0.9747* 0.0333 0.9000 0.0833 lgSw 0.5000 1.0000 −0.5000 1.0000 lgP −0.5798 0.2389 0.7714 0.1028 拓扑极表面积Topological polar surface area −1** 0.0056 0.9276* 0.0167 氢键供体数量Hydrogen bond donor count −0.5323 0.3000 0.6172 0.2333 氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count −0.9549* 0.0167 0.8197 0.0667 * P < 0.1，** P < 0.05.
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表 3 p-NP-DPs与FKBP5相互作用和理化性质Pearson相关性分析
Table 3. Pearson correlation between physicochemical property and interaction of p-NP-DPs and FKBP5
理化性质Physicochemical property 结合能Absolute value of binding energy 结合面积Binding area 相关性系数Correlation coefficient P 相关性系数Correlation coefficient P 分子量Molecular weight −0.9591** 0.0025 0.9589** 0.0025 熔点Melting point −0.7880 0.0626 0.4672 0.3502 沸点Boiling point −0.7669 0.1303 0.6279 0.2567 闪点Flash point −0.8471 0.0701 0.6638 0.2218 密度Density −0.9928*** 0.0000 0.6887 0.1985 lgSw 0.3750 0.7553 −0.6296 0.5665 lgP −0.3641 0.4780 0.7306 0.0991 拓扑极表面积Topological polar surface area −0.9743*** 0.0000 0.9597** 0.0024 氢键供体数量Hydrogen bond donor count −0.4120 0.4170 0.4180 0.4095 氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count −0.9860*** 0.0000 0.9230** 0.0087 ** P < 0.05，*** P < 0.01.
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