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对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制

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杨传玺, 王小宁, 朱青, 薛岩, 刘琳, 刘永林, 谢康, 陈栋, 孙好芬, 王炜亮. 对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制[J]. 环境化学, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
引用本文: 杨传玺, 王小宁, 朱青, 薛岩, 刘琳, 刘永林, 谢康, 陈栋, 孙好芬, 王炜亮. 对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制[J]. 环境化学, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
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YANG Chuanxi, WANG Xiaoning, ZHU Qing, XUE Yan, LIU Lin, LIU Yonglin, XIE Kang, CHEN Dong, SUN Haofen, WANG Weiliang. Molecular mechanism on interaction between p-nitrophenol degradation products and FK506 binding protein[J]. Environmental Chemistry, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
Citation: YANG Chuanxi, WANG Xiaoning, ZHU Qing, XUE Yan, LIU Lin, LIU Yonglin, XIE Kang, CHEN Dong, SUN Haofen, WANG Weiliang. Molecular mechanism on interaction between p-nitrophenol degradation products and FK506 binding protein[J]. Environmental Chemistry, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
shu

对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制

  • 1.

    青岛理工大学环境与市政工程学院，青岛，266520

  • 2.

    山东省创新发展研究院，济南，250101

  • 3.

    青岛理工大学管理工程学院，青岛，266520

  • 4.

    济南大学土木建筑学院，济南，250022

    • 通讯作者: E-mail：sdqcsdnu@163.com
  • 基金项目:
    国家自然科学基金(42207019，41672340)资助.

  • 中图分类号: X-1; O6

Molecular mechanism on interaction between p-nitrophenol degradation products and FK506 binding protein

  • 1.

    School of Environmental and Municipal Engineering, Qingdao University of Technology, Qingdao, 266520, China

  • 2.

    Shandong Institute of Innovation and Development, Jinan, 250101, China

  • 3.

    School of Management Engineering, Qingdao University of Technology, Qingdao, 266520, China

  • 4.

    School of Civil Engineering and Architecture, University of Jinan, Jinan, 250022, China

    • Corresponding author: WANG Weiliang, sdqcsdnu@163.com
  • Fund Project: the National Natural Science Foundation of China（42207019，41672340）.

摘要

  • 摘要: 对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）作为典型内分泌干扰物，其环境污染与人体健康问题一直是环境领域的研究热点. 环境中对硝基苯酚降解产物（p-NP degradation products，p-NP-DPs）与FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP5）结合形成p-NP-DPs-FKBP5加合物是p-NP-DPs产生雌激素和抗雄激素活性的主要机制. 然而，p-NP-DPs与FKBP5相互作用的分子水平机制尚未引起足够的重视. 本文采用分子对接技术模拟计算p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能和结合面积. 结果表明，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）>200 Å2（p-NP）>184 Å2（邻苯二酚）>175 Å2（对苯二酚）>173 Å2（苯酚）>171 Å2（对苯醌），结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）>−3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚），高频氨基酸残基为Pro221、Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Lys283、Tyr284、Met285和Gln286，p-NP-DPs药效团主要包括氢键供体（—OH）、氢键受体（—NO2和C=O）、芳香中心（苯环）和疏水中心（C原子）. p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）、氢键受体数量（75%）、密度（50%）和闪点（25%）. 本研究对认识水环境中p-NP-DPs分子水平健康效应和环境风险具有重要科学意义.
    Abstract: P-nitrophenol (p-NP), as typical endocrine disruption chemicals (EDCs), their environmental pollution and human health issues have always been hotspots in the environmental field. The p-NP-DPs-FKBP5 adducts, formed by p-NP degradation products (p-NP-DPs) and FK506 binding protein (FKBP5), is the main estrogenic and anti-androgenic mechanism. However, this molecular-level mechanism between p-NP-DPs and FKBP5 has not attracted enough attention. In this study, the molecular docking technology was used to simulate the binding energy and binging area between p-NP-DPs and FKBP5 interaction. The results indicated that the order of binging area between p-NP-DPs and FKBP5 interaction was 213 Å2 (4-nitrocatechol) > 200 Å2 (p-NP) > 184 Å2 (o-dihydroxybenzene) > 175 Å2 (p-dihydroxybenzene) > 173 Å2 (phenol) > 171 Å2 (p-benzoquinone), but the order of binding energy between p-NP-DPs and FKBP5 interaction was −3.69 kcal·mol−1 (4-nitrocatechol) > −3.76 kcal·mol−1 (p-NP) > −3.81 kcal·mol−1 (p-/o-dihydroxybenzene) > −3.83 kcal·mol−1 (p-benzoquinone) > −3.91 kcal·mol−1 (phenol). The high frequency amino acid residues were included Pro221, Gly224, Glu227, Ala228, Gly282, Lys283, Tyr284, Met285 and Gln286. The pharmacophores of p-NP-DPs were included hydrogen-bond donor (—OH), hydrogen-bond acceptor (—NO2 and C=O), aromatic center (benzene ring) and hydrophobic center (C atom). The physicochemical properties of p-NP-DPs were dependent on molecular weight and topological polar surface area (100%), hydrogen bond donor count (75%), density (50%) and flash point (25%). The research results probably enhance people’s knowledge and understanding of molecular-level health effects and environmental risks of p-NP-DPs in the water environmental system in the future.

  • 湿地享有“地球之肾”的美名，被人类视为地球上最重要的自然生存环境之一[1]. 由于地势低洼，湿地易在水动力作用下持续汇集人类活动产生的重金属，而成为重金属的重要汇源地之一[2-4]. 因此，湿地土壤重金属已成为众多学者关注的对象之一. 本世纪以来，广大学者在重金属富集[5]、空间分布[6]、赋存形态[7]、生态风险评价[8]等方面对湿地表层土壤开展一系列的研究，结果表明当前世界各地湿地土壤均存在不同程度的重金属累积，并呈现稳步增长的态势. 对湿地表层土壤中重金属的研究不足以解释自然和人为双重作用下的重金属分布特征，更难以阐明重金属在剖面土壤中的垂向迁移特征及其对生态环境的潜在污染风险等问题.

    重金属在进入土壤后受耕种、淋滤和翻耕等因素综合影响会向土壤的不同方向发生迁移转化，从而导致不同土层受到污染[9]，这不仅阻碍农作物健康生长，而且会对地下水的安全构成严重威胁. 同时，重金属在不同深度土壤中的垂向迁移特征是展现重金属迁移能力和土壤污染状况最直观的指标之一[10-11]. 据研究报道，国内外对剖面土壤重金属研究多集中在工矿业场地[12]、城市土壤[13]、农田土壤[14]以及喀斯特地区[15]. 但是，目前对于湿地土壤剖面重金属分布特征及其迁移规律的研究报道较少. 此外，湿地周边不同类型土壤所处环境不同，其性质差异较大，以本研究的草滩和泥滩为例，二者在植被类型、土壤质地及水位变化条件等方面都存在较大差异，其重金属含量特征及迁移规律也必然有所不同. 因此，开展湿地土壤重金属的垂向分布特征及其影响因素研究，对揭示重金属在湿地土壤中的分布特征及迁移规律是十分必要的.

    菜子湖作为长江中下游典型的沿江湿地，其生态环境质量对长江生态环境保护至关重要. 菜子湖湿地是国家工程“引江济淮”线路中重要节点之一，该工程完工后主要用以保障城乡供水和农业灌溉用水、促进航运发展、改善水生态环境，对沿途地区社会经济的发展至关重要[16-17]. 前人研究表明，菜子湖湿地周边土壤已累积了部分重金属，并存在不同程度的生态风险[2,18]. 基于此，本研究以菜子湖湿地为案例地，以湿地周边不同类型垂直剖面土壤为研究对象，阐明湿地土壤重金属在垂直方向上的分布特征及其迁移规律，以期为沿江湿地生态环境保护提供基础数据和科学依据.

    1.   材料与方法（Materials and methods）

    1.1   研究区概况

    菜子湖，隶属于长江中下游支流水体（116°07′—117°44′ E，29°50—30°58′ N）（图1），为典型的北亚热带湿润季风气候，湖面由3个主要湖泊（白兔湖、嬉子湖、菜子湖）共同组成. 菜子湖流域境内自然物种丰富，据不完全统计，湿地范围内仅维管植物就多达一百多种，不同类型植物群落（芦苇、水浊等）广泛分布，更有大量湖泊的优势种随处可见（菹草、黑藻、苦草、菰等）. 同时，湿地周边土壤受不同水位变化条件的影响，草滩和泥滩分布广泛，两种类型土壤在理化性质和植被类型等方面存在差异.

    图 1  研究区采样示意图
    Figure 1.  Sampling diagram of the study area
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    1.2   样品采集与处理

    于2022年1月初，选择湿地暴露明显的6个典型样地（祠堂、大坟墓、许咀、王家大圩、河脚庄、湿地公园），每个样地分别采集草滩与泥滩两种类型湿地土壤，每种类型土壤均挖取3个剖面，剖面采集深度均为100 cm，并按照（0—10 cm、 10—20 cm、20—40 cm、 40—60 cm、 60—80 cm、80—100 cm）分层取样，然后将采集的剖面土壤样品装入封口袋后带回实验室，在室温条件下自然风干，再去除细小石块、植物残根等多余杂质. 将自然风干的土壤按实验要求分别研磨过10目、60目和100目筛，过10目和60目的样品用于测定土壤理化性质，过100目的样品用于测定土壤重金属元素.

    本研究中土壤有机质采用高温外热重铬酸钾氧化-容量法测定；全磷采用酸溶-钼锑抗比色法测定；pH采用电位法（水土比2.5∶1），pH计测定[19]. 粒度和全氮数据分别采用贝克曼COULTER LS230型激光粒度分析仪与德国Elementar公司生产的Vario MACRO CHNS元素分析仪测定，并根据美国农业部（USAD）制定的标准，将土壤粒级一共分为6个等级：粗砂粒（500—1000 μm）、中砂粒（250—500 μm）、细砂粒（100—250 μm）、极细砂粒（50—100 μm）、粉粒（2—50 μm）和黏粒（<2 μm）[20]. 土壤重金属元素As、Co、Cr、Cu、Ni、Pb、V、Zn采用HF-HClO4-HNO3三酸消解，电感耦合等离子体发射光谱仪（Perkin Elmer ICP-OES Optima 7000）测定[21]. 实验过程进行严格质量控制，平行样测定的相对标准偏差（RSD）总体控制在5%以下，标准物质（GSS-1）的整体回收率范围在84%—121%.

    1.3   迁移系数

    为计算菜子湖湿地剖面土壤重金属的迁移系数，因Al元素在土壤自然成土过程中比较稳定，不易受外源输入影响而发生变化，且本研究区内土壤中Al元素含量未超过安庆市土壤背景值，变异程度也较低，说明Al元素在土壤中稳定性高且受人为影响较小，故选择Al作为参比元素[22]. 迁移系数计算公式如下：

    Tj=(Cj,s/Cj,b)(CAl,s/CAl,b)−1 (1)

    式中，Tj表示湿地土壤剖面中j元素的迁移系数，Cj,s表示土壤样品中j元素的含量，Cj,b表示土壤中j元素的背景值，CAl,s表示土壤样品中Al的含量，CAl,b表示研究区土壤中Al的背景值. 当Tj=0时，说明j元素相对于Al元素来说不存在富集或者部分流失，Tj=−1时，说明j元素在湿地土壤剖面中完全流失，Tj>0时，说明j元素出现明显富集，Tj<0 时，说明j元素流失.

    2.   结果与讨论（Results and discussion）

    2.1   湿地土壤剖面理化性质及重金属总量特征

    研究区所采集的剖面土壤pH值变化范围为4.45—7.96，均值为5.83（表1），整体呈弱酸性，且土壤pH值随着土层深度的增加表现出明显的上升趋势. 土壤SOM、TN和TP含量范围分别为1.16—61.94、0.39—5.37、0.02—0.32 g·kg−1，平均值分别为16.41、1.51、0.11 g·kg−1. 此外，研究区土壤组成总体以粉粒为主（77.87%），黏粒次之（20.55%），砂粒占比最小（1.58%），平均粒径为6.77 μm. 通过对比发现，各级土壤粒度的变化特征不尽相同，其中砂粒和粉粒均表现为底层大于表层的垂向分布特征，而黏粒则呈现出相反的变化趋势. 总体来看，平均粒径呈现出随土壤深度增加而波动增大的变化趋势，这主要是受当地植被类型及覆盖程度、成土母质及人为扰动等众多因素的综合影响.

    表 1  湿地土壤剖面理化性质总体特征 （n=170）
    Table 1.  Overall characteristics of physical and chemical properties of soil in wetland profile （n=170）
    项目ItempHSOM/（g·kg−1）TN/（g·kg−1）TP/（g·kg−1）砂粒/%Sand粉粒/%Silt黏粒/%Clay平均粒径/μmAverage grain diameter
    最大值7.9661.945.370.329.7586.1830.7210.40
    最小值4.451.160.390.020.0459.1112.004.07
    平均值5.8316.411.510.111.5877.8720.556.77
    标准差0.7014.771.050.051.493.543.291.33
    变异系数0.120.900.700.450.940.050.160.20
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    除Cr、Cu和Pb外，其余元素均超过安庆市土壤背景值（表2）. As、Co、Ni、V和Zn的含量分别是当地土壤背景值的3.06、1.35、1.52、1.19、1.04倍，说明As、Co、Ni、V和Zn等元素在菜子湖湿地土壤中已经出现累积现象，尤以As和Ni较严重. As富集主要受菜子湖周边农业活动的影响，农田中的化肥农药会通过地表径流进入湖边草滩及泥滩土壤中；Ni富集是因为菜子湖流域内分布着铁矿、铜铁矿以及铁锰矿等金属矿产资源，且安庆市作为重要的化工基地，其石油化工企业较多，人为开采矿产资源以及石油化工企业排放的“三废”等都会向周边土壤缓慢释放重金属[23]，从而促使湿地土壤中Ni的累积. 各重金属元素变异系数均在0.1—1之间，属于中等变异，这说明人类活动已对该地土壤中重金属含量造成了显著影响.

    表 2  湿地土壤剖面重金属总量特征（mg·kg−1，n=170）
    Table 2.  Characteristics of Total heavy metals in soil of wetland profile
    项目ItemAsCoCrCuNiPbVZn
    最小值2.740.6217.442.444.650.0838.1819.14
    最大值70.3348.09125.36101.2981.3661.73216.32301.28
    平均值28.8116.6559.4224.2136.1919.35111.5977.22
    标准差11.558.3022.2711.6414.9610.6330.9141.58
    变异系数0.400.500.370.480.410.550.280.54
    土壤背景值9.4112.3563.3830.3023.7526.9293.7974.41
    　　注：土壤背景值参考依据来源于安徽省环境监测中心-1992.　　Note: The reference basis of soil background value is from Anhui Environmental Monitoring Center-1992.
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    2.2   湿地不同类型土壤重金属垂向分布特征及影响因素分析

    整体上，菜子湖湿地土壤剖面中各重金属含量随土层深度变化虽有波动，但主体趋势表现为随土层深度的增加而逐渐减少（图2），主要是由于湿地土壤表层汇聚着大量有机质，而有机质主要以腐殖质为主，其中胡敏酸（HA）与富里酸（FA）带有大量的负电荷以及各种官能团，对重金属产生强烈的吸附能力，致使湿地土壤表层相比底层更易聚集重金属[24]；并且也有学者指出，土壤环境中大多数重金属元素受母质影响较大，迁移能力较差，故主要在土壤0—20 cm表层积累[25].

    图 2  湿地不同土层深度重金属含量特征
    Figure 2.  Characteristics of heavy metal contents in different soil layers of wetland
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    As、Co、Cr、Pb、V等元素含量在土壤表层均呈现出草滩>泥滩的规律（图3），这主要由3个原因造成，一是跟泥滩相比，菜子湖湿地草滩距离当地居民的农耕区更近，容易受到农民耕作及放牧等活动的外源影响，大量农药、化肥不合理施用以及禽畜排便等都会导致土壤中重金属的逐渐累积；二是因为草滩能够为候鸟提供更优的生存环境，菜子湖湿地作为东亚-澳大利西亚候鸟迁徙途中的必经之地，大量候鸟迁徙至此并在草滩进行觅食、栖息等活动，而鸟类会通过一系列自身行为来释放所富集的重金属[26]，加之生物体可以对重金属产生富集与放大作用，都会进一步促使土壤中重金属的富集；三是因为草滩土壤表层植被类型丰富，土壤内部植物根系发达，易于吸附土壤中的重金属，从而成为重金属在土壤表层的主要富集载体[27]. 而在底层土壤，除Co和V之外，其它重金属元素含量又表现为泥滩>草滩的规律，一是因为泥滩靠近湖边浅水区，土壤含水率较大（泥滩55.92%>草滩33.85%，P<0.05），水的向下淋溶作用会导致部分移动性较强的重金属元素向深层土壤转移[24,28]；二是因为泥滩底层土壤有机质含量高于草滩（6.10 g·kg−1>4.90 g·kg−1，P<0.05），有机质带有大量负电荷以及各种官能团能够对重金属产生强烈的吸附能力，进而导致泥滩底层土壤相比于草滩底层更容易积累重金属.

    图 3  湿地不同类型土壤重金属垂向变化特征
    Figure 3.  Vertical variation characteristics of heavy metals in different types of soil in wetland
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    不同类型土壤剖面的物质来源及其理化性质都不相同，因而重金属元素的垂直分布特征既有相似或共同之处，又存在差异. 与泥滩相比，草滩不同土层深度的重金属含量垂向变化规律更为明显（图3），主要表现为随土层深度增加而线性降低的变化趋势，表明重金属元素在草滩土壤的垂直剖面演化过程中未受明显人为扰动；此外，本研究发现，草滩土壤表层黏粒含量大于底层（21.84%>19.89%，P<0.05），草滩土壤重金属变化趋势与土壤的黏粒和淤泥含量随土层深度增加而下降有关，有研究报道，重金属在不同土层深度富集与土壤颗粒大小存在显著相关[29]. 泥滩土壤中As、Co和Zn含量的变化特征基本一致，整体表现为随土层深度增加而波动下降的趋势. Cr、Cu、Ni和Pb含量分别在60—80 cm深度土壤中出现一个峰值，一方面与不同时期Cr、Cu、Ni和Pb的输入、不同地理位置湿地沉积速度及湿地水文条件变化有关；另一方面，根据采样观察发现，中层土壤结构较为疏松且拥有良好的通透性，而深层土壤的紧实度和保水性能较好，在降水作用下重金属会由中层向深层富集[30]，本研究中泥滩的深层土壤黏粒含量要略高于中层，这也一定程度上解释了部分重金属元素含量在底层土壤中出现峰值的原因.

    2.3   重金属相关性分析

    通常情况下，在相同或相似的地质条件下，化学性质相似的元素会呈现相互聚集共生的现象[31]. 菜子湖湿地土壤剖面各理化性质与重金属含量的相关系数如图4所示. 除As外，土壤黏粒、SOM与各重金属均呈显著正相关，平均粒径与各重金属呈显著负相关，这是因为细小颗粒土壤具有较大的比表面积和较高的表面活性，更利于重金属的吸附[32-33]；而SOM具有较高的阳离子交换量, 并具有大量不同的官能团，它们可以通过表面沉淀、络合和离子交换吸附金属元素. 除V外，土壤pH与各重金属元素呈显著负相关，这是因为土壤pH越低，H+越多，重金属被解吸的越多，其活动性就越强[34]，故重金属不易富集. TP与各重金属无显著相关性，可知TP对湿地土壤重金属含量富集影响十分微弱，而TN与各重金属呈显著正相关，土壤中的TN主要以有机氮为主，本研究中TN与SOM呈极显著正相关，这也进一步验证了前文的解释.

    图 4  不同理化性质与各重金属元素相关系数 （n=170）
    Figure 4.  Correlation coefficients between different physicochemical properties and heavy metal elements （n=170）
    注：***、**、*表示相关性（P<0.001）、相关性（P＜0.01） 、相关性（P＜0.05）； Dav表示平均粒径.
    Note: ***, ** and * indicate correlation （P<0.001）, correlation （P<0.01） and correlation （P<0.05）；Dav stands for average grain diameter.
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    人类活动和土壤母质都会对土壤中重金属的来源和含量累积产生重要影响，一般来说，相似的外源输入会使不同的重金属元素呈现出相近的特点，因此，不同重金属元素间的同源性判断可采用相关性分析，进而为重金属来源解析提供合理参考[35]. 由图4可知，研究区8种重金属之间基本都具有显著正相关性，这说明菜子湖湿地土壤重金属可能具有相同的来源[36].

    2.4   湿地土壤重金属垂向迁移特征及影响因素分析

    从垂直剖面迁移系数（图5）来看，菜子湖湿地两种类型土壤中As、Co、Ni和V这4种元素的迁移系数在整个剖面中均大于0，且As的迁移系数远高于其它元素，而Cu也仅是在80—100 cm的草滩中为负，其余深度均为正，说明这些元素已在菜子湖湿地土壤中出现富集，并且已经开始向深层土壤缓慢迁移，尤以As最为严重. 重金属迁移与土壤pH值有关，pH值会对土壤中重金属的溶解度产生显著影响，从而对其形态和迁移能力产生决定性作用[37]. 研究区土壤整体呈弱酸性（pH=5.83），在酸性条件下土壤重金属易向下迁移[38]，这是上述几种重金属由表层土壤向深层迁移的原因之一.

    图 5  湿地不同类型土壤剖面重金属迁移系数
    Figure 5.  Soil heavy metal transport coefficient of different types of profiles in wetland
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    Cr在草滩40—100 cm的迁移系数为负，其余土层深度均为正，主要原因为：一方面，草滩土壤周边存在小范围的农业活动以及渔业养殖，农耕机器的运作以及渔船燃料的消耗，都会导致Cr的外源输入[39]；另一方面，安庆市区拥有大量的石油化工企业以及金属冶炼厂，而菜子湖正处于安庆市区夏季风的下风向，工业活动排放的大量废气会随盛行风向外扩散，进一步加剧Cr在菜子湖周边表层土壤中的累积[40]，且Cr相比其它重金属元素的水溶性较高，在土壤剖面中可随降水一直向下渗漏迁移[30]，故Cr容易在含水率较高的泥滩中底层土壤中富集. Pb和Zn在湿地剖面土壤中的迁移特征较为相似，其迁移系数均是在草滩0—20 cm土壤中为正，草滩20—100 cm为负，在泥滩0—40 cm土壤中为正，泥滩40—100 cm为负，这是因为土壤中Pb主要以Pb（OH）2、PbCO3和PbSO4等固体形式存在，土壤溶液中可溶性Pb含量很低，Pb2+也可以置换黏土矿物上吸附的Ca2+，因此Pb在土壤中基本很少移动[41]；土壤胶体表面的Zn以配位吸附形态为主，pH越接近中性，有机胶体对Zn的配位吸附固定能力越强，故移动性就越弱[42]，而菜子湖湿地整体剖面土壤接近中性，且pH值随土层深度增加而上升，因此中底层土壤中的Zn不易出现富集；同时Zn含量实测值与背景值相差不大，推测也一定程度受母质影响.

    3.   结论（Conclusion）

    （1） 研究区As、Co、Ni、V和Zn的含量分别是当地土壤背景值的3.06、1.35、1.52、1.19、1.04倍，说明存在不同程度的重金属累积现象；各重金属元素变异系数均在0.1—1之间，属于中等变异.

    （2） 湿地不同类型土壤重金属含量整体呈现出随土壤深度的增加而逐渐减少的趋势，但存在一定波动. 草滩土壤重金属垂直分布规律较为明显，表现为随土壤深度增加而线性降低的趋势，而泥滩变化特征则稍显复杂.

    （3） 除As外，SOM、土壤黏粒与各重金属均呈显著正相关，而平均粒径与各重金属呈显著负相关；除V外，土壤pH值与各重金属元素呈显著负相关，TP与各重金属元素无显著相关性，而TN与各重金属元素均呈显著正相关；同时，研究区各重金属元素之间基本都呈显著正相关性，推测菜子湖湿地周边土壤重金属可能具有相同来源.

    （4） As、Co、Ni和V在草滩和泥滩整个剖面土壤中的迁移系数均大于0，表明这几种元素均存在明显富集现象，尤以As较为严重；Cu和Cr在两种类型土壤剖面中以富集为主，仅在草滩中底层土壤中出现流失；Pb和Zn均是在草滩0—20 cm和泥滩0—40 cm土壤中出现不同程度富集，在草滩20—100 cm和泥滩40—100 cm土壤中集体流失.

  • 图 1  p-NP-DPs结构式：p-NP（a）、苯酚（b）、对苯二酚（c）、对苯醌（d）、4-硝基邻苯二酚（e）和邻苯二酚（f）

    Figure 1.  Structure of p-NP-DPs: p-NP （a）, phenol （b）, p-dihydroxybenzene （c）, p-benzoquinone （d）, 4-nitrocatechol （e） and o-dihydroxybenzene （f）

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    图 2  p-NP-DPs与FKBP5相互作用的分子对接结果

    Figure 2.  Interaction results between p-NP-DPs and FKBP5 using molecular docking technology

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    图 3  小分子种类/分子量对结合能和结合面积的影响

    Figure 3.  Effect on binding energy and binding area with types/molecular weight of small moleculars

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    图 4  p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合区域：p-NP（a）、苯酚（b）、对苯二酚（c）、对苯醌（d）、4-硝基邻苯二酚（e）和邻苯二酚（f）

    Figure 4.  Binding domain between p-NP-DPs and FKBP5: p-NP （a）, phenol （b）, p-dihydroxybenzene （c）, p-benzoquinone （d）, 4-nitrocatechol （e） and o-dihydroxybenzene （f）

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    图 5  p-NP-DPs与FKBP5相互作用药效团：p-NP（a）、苯酚（b）、对苯二酚（c）、对苯醌（d）、4-硝基邻苯二酚（e）和邻苯二酚（f）氢键受体： hydrogen-bond acceptor（HA）；氢键供体： hydrogen-bond donor（HD）；芳香-疏水中心： aromatic-hydrophobic center（AHC）；疏水中心： hydrophobic center（HC）

    Figure 5.  Pharmacophores between p-NP-DPs and FKBP5: p-NP （a）, phenol （b）, p-dihydroxybenzene （c）, p-benzoquinone （d）, 4-nitrocatechol （e） and o-dihydroxybenzene （f）

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    图 6  高频氨基酸分布

    Figure 6.  Distribution of high frequency amino acid residues

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    表 1  p-NP-DPs的理化性质

    Table 1.  Physicochemical property of p-NP-DPs

    名称Sample CAS 熔点/°C Melting point 沸点/°C Boiling poin 闪点/°C Flash point 密度/（g·cm−3） Density lgSw
    p-NP 100—02—7 113—114 279 169 1.480—1.50 -0.74
    苯酚Phenol 108—95—2 40.9 181.8 79 1.04—1.07 0
    对苯二酚p-dihydroxybenzene 123—31—9 170—173 285—287 165 1.330—1.332 N/A
    对苯醌p-benzoquinone 106—51—4 114—116 180 93 1.318—1.320 N/A
    4-硝基邻苯二酚4-nitrocatechol 3316—09—4 174—176 N/A N/A N/A N/A
    邻苯二酚o-dihydroxybenzene 120—80—9 105 245 127 1.344 0.62
    名称Sample 相对分子质量Molecular weight lgP 拓扑极表面积/Å2Topological polar surface area 氢键供体数量Hydrogen bond donor count 氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count
    p-NP 139.1100 1.91 66 1 3
    苯酚Phenol 94.1130 1.46 20.2 1 1
    对苯二酚p-dihydroxybenzene 110.1120 0.59 40.5 2 2
    对苯醌p-benzoquinone 108.0960 0.2 34.1 0 2
    4-硝基邻苯二酚4-nitrocatechol 155.1090 1.66 86.3 2 4
    邻苯二酚o-dihydroxybenzene 110.1120 0.88 40.5 2 2
    　　说明：N/A为数据未查到
    名称Sample CAS 熔点/°C Melting point 沸点/°C Boiling poin 闪点/°C Flash point 密度/（g·cm−3） Density lgSw
    p-NP 100—02—7 113—114 279 169 1.480—1.50 -0.74
    苯酚Phenol 108—95—2 40.9 181.8 79 1.04—1.07 0
    对苯二酚p-dihydroxybenzene 123—31—9 170—173 285—287 165 1.330—1.332 N/A
    对苯醌p-benzoquinone 106—51—4 114—116 180 93 1.318—1.320 N/A
    4-硝基邻苯二酚4-nitrocatechol 3316—09—4 174—176 N/A N/A N/A N/A
    邻苯二酚o-dihydroxybenzene 120—80—9 105 245 127 1.344 0.62
    名称Sample 相对分子质量Molecular weight lgP 拓扑极表面积/Å2Topological polar surface area 氢键供体数量Hydrogen bond donor count 氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count
    p-NP 139.1100 1.91 66 1 3
    苯酚Phenol 94.1130 1.46 20.2 1 1
    对苯二酚p-dihydroxybenzene 110.1120 0.59 40.5 2 2
    对苯醌p-benzoquinone 108.0960 0.2 34.1 0 2
    4-硝基邻苯二酚4-nitrocatechol 155.1090 1.66 86.3 2 4
    邻苯二酚o-dihydroxybenzene 110.1120 0.88 40.5 2 2
    　　说明：N/A为数据未查到
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    表 2  p-NP-DPs与FKBP5相互作用和理化性质Spearman相关性分析

    Table 2.  Spearman correlation between physicochemical property and interaction of p-NP-DPs and FKBP5

    理化性质Physicochemical property 结合能Absolute value of binding energy 结合面积Binding area
    相关性系数Correlation coefficient P 相关性系数Correlation coefficient P
    分子量Molecular weight −1** 0.0056 0.9276* 0.0167
    熔点Melting point −0.6377 0.2000 0.3714 0.4972
    沸点Boiling point −0.7182 0.1667 0.7000 0.2333
    闪点Flash point −0.9747* 0.0333 0.8000 0.1333
    密度Density −0.9747* 0.0333 0.9000 0.0833
    lgSw 0.5000 1.0000 −0.5000 1.0000
    lgP −0.5798 0.2389 0.7714 0.1028
    拓扑极表面积Topological polar surface area −1** 0.0056 0.9276* 0.0167
    氢键供体数量Hydrogen bond donor count −0.5323 0.3000 0.6172 0.2333
    氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count −0.9549* 0.0167 0.8197 0.0667
    　　* P < 0.1，** P < 0.05.
    理化性质Physicochemical property 结合能Absolute value of binding energy 结合面积Binding area
    相关性系数Correlation coefficient P 相关性系数Correlation coefficient P
    分子量Molecular weight −1** 0.0056 0.9276* 0.0167
    熔点Melting point −0.6377 0.2000 0.3714 0.4972
    沸点Boiling point −0.7182 0.1667 0.7000 0.2333
    闪点Flash point −0.9747* 0.0333 0.8000 0.1333
    密度Density −0.9747* 0.0333 0.9000 0.0833
    lgSw 0.5000 1.0000 −0.5000 1.0000
    lgP −0.5798 0.2389 0.7714 0.1028
    拓扑极表面积Topological polar surface area −1** 0.0056 0.9276* 0.0167
    氢键供体数量Hydrogen bond donor count −0.5323 0.3000 0.6172 0.2333
    氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count −0.9549* 0.0167 0.8197 0.0667
    　　* P < 0.1，** P < 0.05.
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    表 3  p-NP-DPs与FKBP5相互作用和理化性质Pearson相关性分析

    Table 3.  Pearson correlation between physicochemical property and interaction of p-NP-DPs and FKBP5

    理化性质Physicochemical property 结合能Absolute value of binding energy 结合面积Binding area
    相关性系数Correlation coefficient P 相关性系数Correlation coefficient P
    分子量Molecular weight −0.9591** 0.0025 0.9589** 0.0025
    熔点Melting point −0.7880 0.0626 0.4672 0.3502
    沸点Boiling point −0.7669 0.1303 0.6279 0.2567
    闪点Flash point −0.8471 0.0701 0.6638 0.2218
    密度Density −0.9928*** 0.0000 0.6887 0.1985
    lgSw 0.3750 0.7553 −0.6296 0.5665
    lgP −0.3641 0.4780 0.7306 0.0991
    拓扑极表面积Topological polar surface area −0.9743*** 0.0000 0.9597** 0.0024
    氢键供体数量Hydrogen bond donor count −0.4120 0.4170 0.4180 0.4095
    氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count −0.9860*** 0.0000 0.9230** 0.0087
    　　** P < 0.05，*** P < 0.01.
    理化性质Physicochemical property 结合能Absolute value of binding energy 结合面积Binding area
    相关性系数Correlation coefficient P 相关性系数Correlation coefficient P
    分子量Molecular weight −0.9591** 0.0025 0.9589** 0.0025
    熔点Melting point −0.7880 0.0626 0.4672 0.3502
    沸点Boiling point −0.7669 0.1303 0.6279 0.2567
    闪点Flash point −0.8471 0.0701 0.6638 0.2218
    密度Density −0.9928*** 0.0000 0.6887 0.1985
    lgSw 0.3750 0.7553 −0.6296 0.5665
    lgP −0.3641 0.4780 0.7306 0.0991
    拓扑极表面积Topological polar surface area −0.9743*** 0.0000 0.9597** 0.0024
    氢键供体数量Hydrogen bond donor count −0.4120 0.4170 0.4180 0.4095
    氢键受体数量Hydrogen bond acceptor count −0.9860*** 0.0000 0.9230** 0.0087
    　　** P < 0.05，*** P < 0.01.
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-11-21
  • 录用日期:  2023-03-05
  • 刊出日期:  2024-05-27
杨传玺, 王小宁, 朱青, 薛岩, 刘琳, 刘永林, 谢康, 陈栋, 孙好芬, 王炜亮. 对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制[J]. 环境化学, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
引用本文: 杨传玺, 王小宁, 朱青, 薛岩, 刘琳, 刘永林, 谢康, 陈栋, 孙好芬, 王炜亮. 对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制[J]. 环境化学, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
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YANG Chuanxi, WANG Xiaoning, ZHU Qing, XUE Yan, LIU Lin, LIU Yonglin, XIE Kang, CHEN Dong, SUN Haofen, WANG Weiliang. Molecular mechanism on interaction between p-nitrophenol degradation products and FK506 binding protein[J]. Environmental Chemistry, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
Citation: YANG Chuanxi, WANG Xiaoning, ZHU Qing, XUE Yan, LIU Lin, LIU Yonglin, XIE Kang, CHEN Dong, SUN Haofen, WANG Weiliang. Molecular mechanism on interaction between p-nitrophenol degradation products and FK506 binding protein[J]. Environmental Chemistry, 2024, 43(5): 1659-1669. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022112101
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对硝基苯酚降解产物与FK506结合蛋白相互作用分子机制

    通讯作者: E-mail：sdqcsdnu@163.com
  • 1. 青岛理工大学环境与市政工程学院，青岛，266520
  • 2. 山东省创新发展研究院，济南，250101
  • 3. 青岛理工大学管理工程学院，青岛，266520
  • 4. 济南大学土木建筑学院，济南，250022
  • 收稿日期:  2022-11-21
  • 录用日期:  2023-03-05
  • 网络出版日期:  2024-05-23
基金项目:
国家自然科学基金(42207019，41672340)资助.

摘要: 对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）作为典型内分泌干扰物，其环境污染与人体健康问题一直是环境领域的研究热点. 环境中对硝基苯酚降解产物（p-NP degradation products，p-NP-DPs）与FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP5）结合形成p-NP-DPs-FKBP5加合物是p-NP-DPs产生雌激素和抗雄激素活性的主要机制. 然而，p-NP-DPs与FKBP5相互作用的分子水平机制尚未引起足够的重视. 本文采用分子对接技术模拟计算p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能和结合面积. 结果表明，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）>200 Å2（p-NP）>184 Å2（邻苯二酚）>175 Å2（对苯二酚）>173 Å2（苯酚）>171 Å2（对苯醌），结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）>−3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚），高频氨基酸残基为Pro221、Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Lys283、Tyr284、Met285和Gln286，p-NP-DPs药效团主要包括氢键供体（—OH）、氢键受体（—NO2和C=O）、芳香中心（苯环）和疏水中心（C原子）. p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）、氢键受体数量（75%）、密度（50%）和闪点（25%）. 本研究对认识水环境中p-NP-DPs分子水平健康效应和环境风险具有重要科学意义.

English Abstract

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  • 对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）是一种重要的有机合成材料，同时也是典型内分泌干扰物和难降解有机污染物，在自然环境中半衰期较长，对水生生物、水体环境和人体健康均有不利影响[1 − 3]. 美国环境保护署将p-NP列为水体中的优先控制污染物，同时p-NP也是我国饮用水水质标准中的污染物控制指标之一[4 − 6].

    p-NP具有雌激素活性和抗雄激素活性， 研究表明p-NP可能分别与雌激素受体和雄激素受体相互作用[7]. Li等[8]通过体内实验发现每天向未成熟雌性大鼠注射p-NP会导致子宫重量显著增加，而向未成熟雄性大鼠施用p-NP则会导致生长依赖雄激素的副性腺重量减少. 而Zhang等[9]研究发现，经p-NP治疗的未成熟雄性大鼠的血清雄激素浓度和雄激素受体表达水平均上调，这表明p-NP抗雄激素活性的分子机制是复杂的. 雄激素受体活性通过直接蛋白-蛋白相互作用调节，应激诱导的热激蛋白（heat shock protein 90，HSP）与伴侣蛋白FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP5）通过形成FKBP5-Hsp90超复合物来调节雄激素受体活性[10]. 尽管p-NP在体内具有抗雄激素作用，但p-NP抑制雄激素受体信号的分子机制仍不十分清楚. Wu等[11]来用微摩尔亲和力（micromolar affinity）表征了p-NP与FKBP51的结合，实验和分子动力学模拟结果发现p-NP稳定地结合在FK1区域，p-NP结合的热点残基主要是疏水性官能团，p-NP可能通过下调雄激素受体活性激活下游基因的表达水平抑制人类前列腺癌细胞的雄激素依赖性生长，研究结果可以为评估p-NP的潜在健康影响提供新的指导.

    近年来，分子对接技术作为计算生物学重要组成部分，在药物研发、生物修复以及计算毒理学等领域起到重要作用[12 − 13]. Ding等[14]利用分子对接技术研究了对羟基苯甲酸酯类物质侧链官能团对其抗雄激素活性的影响，结果表明侧链官能团的种类和长度对抗雄激素活性存在显著影响，同时对羟基苯甲酸酯类物质抗雄激素活性与结合能呈线性关系. Ng等[15]为了研究全氟化合物的生物累积性，利用分子对接技术预测其结合强度和生物半衰期，结果表明全氟辛烷磺酸能够成功对接到人血清白蛋白上且偏差小于2 Å，为新污染物的环境风险管控提供新的思路. 江文婷等[16]利用分子对接技术研究抗冻多肽与海鲈鱼肌球蛋白重链的作用位点及可能的作用机制，结果表明肽段GPR和GPAGGK能够通过碳氢键、氢键和范德华力等分子作用力对海鲈鱼肌球蛋白的结构及聚集行为产生影响，阻碍蛋白侧链聚集、结构改变和冰晶的位移等.

    有关研究已经对p-NP在环境中的降解路径和降解产物进行了研究，然而环境中p-NP降解产物（p-NP degradation products，p-NP-DPs）与FKBP5相互作用及其分子水平机制的研究尚未开展. 赵子晗[17]利用紫外全谱扫描和液质联用测定p-NP-DPs，主要有对苯二酚、邻苯二酚、4-硝基邻苯二酚、1,2,4-苯三酚、对苯醌、苯酚等6种物质. Yang等[18]发现环境中p-NP-DPs主要包括对苯二酚、邻苯二酚、4-硝基邻苯二酚、对苯醌、苯酚以及小分子有机酸. p-NP-DPs与和FKBP5相互作用机理尚不清晰，而p-NP-DPs与FKBP5相互作用性能和机理对于理解和防控环境中p-NP对人体的健康风险十分重要. 小分子污染物的降解产物由于具有污染物类似的结构而具有相似的环境效应，污染物与受体蛋白的相互作用受到官能团和分子量等理化性质的影响[19 − 22]. Anzelle等[23]通过研究亚甲基蓝结构类似物对单胺氧化酶抑制作用的影响，结果发现亚甲基蓝、Azure B和ethylthioninium chloride（ETC）对单胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）和单胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAOB）的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为0.07 μmol·L−1（亚甲基蓝-MAOA）、0.01 μmol·L−1（Azure B-MAOA）和0.51 μmol·L−1（ETC-MAOA），4.47 μmol·L−1（亚甲基蓝-MAOB）、0.97 μmol·L−1（Azure B-MAOB）和0.59 μmol·L−1（ETC-MAOB）. 袁霞等[24]通过HRMS Orbitrap和GC-MS鉴定出UV/氯高级氧化工艺降解卡马西平的10种降解产物，并利用发光细菌毒性实验和ECOSAR预测卡马西平降解产物的毒性，结果表明卡马西平在UV/氯高级氧化工艺中产生更高毒性的中间产物，对水质安全和污染物毒性管控造成潜在风险.

    环境中p-NP-DPs与FKBP5结合形成p-NP-DPs-FKBP5加合物是产生雌激素和抗雄激素活性的主要机制[8 − 10]，而p-NP-DPs与FKBP5结合的分子水平机制亟需阐述清楚. 基于此，本文采用通过分子对接技术模拟计算p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能和结合面积. 在此基础上，通过Spearman相关性和Pearson相关性分析探讨p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5结合的影响，剖析影响p-NP-DPs与FKBP5结合的关键因子，从分子水平阐述p-NP-DPs与FKBP5相互作用的本质. 研究结果有助于增进人们对水环境中p-NP-DPs新污染物分子水平健康效应和环境风险的认识和理解.

    • 1.   实验部分（Experimental setion）

      1.1.   分子对接

    • 选择用于分子对接研究的p-NP-DPs为p-NP、苯酚、对苯二酚、对苯醌、4-硝基邻苯二酚和邻苯二酚，化学结构式及其理化性质分别见图1和表1. 根据p-NP-DPs的CAS号，通过PubChem网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子三维结构，利用分子可视化软件分别对配体小分子进行电荷、质子化状态确认. 通过AutoDock 4.2软件Minimized模块对小分子进行能量最优化、加氢、加电荷及完善结构处理实现小分子的结构修饰，最后将p-NP-DPs的三维结构分别保存为pdb格式文件作为配体结构.

      FKBP5原始结构（PDB: 5OMP）从国际标准蛋白质数据库（http://www.rcsb.org/）下载[25]. 通过分子可视化软件对FKBP5进行去除水分子和不需要的杂原子等操作处理，然后通过AutoDock 4.2软件Minimized模块将目的蛋白结构进行能量最优化，同时进行加氢、加电荷及补充大分子的氨基酸残缺结构等完善蛋白结构，最后将FKBP5的晶体结构保存为pdb格式作为受体结构.

      打开AutoDock 4.2软件，导入受体结构，确定分子对接口袋区；导入配体结构，通过Dock模块进行分子对接. 通过给出配体与受体结合时氢键、疏水作用、结合面积、能量变化、药效团等参数，对p-NP-DPs与FKBP5相互作用及其分子机制进行解析.

      • 1.2.   统计分析

    • 采用SPSS 25.0软件（IBM, Armonk，NY，美国）对实验结果进行统计分析. 采用Pearson相关性和Spearman相关性对p-NP-DPs与FKBP5相互作用参数和p-NP-DPs理化性质之间的相关性进行分析，P<0.05被认为具有统计学意义. 根据公式（1）—（4）计算 Pearson 相关性：

      式中SX i 和SY j是样本Xi和样本Yj的标准差，Cov（Xi，Yj）是样本Xi和样本Yj的协方差，m表示样本中个体的序号，n表示样本的容量. 样本Xi代表p-NP-DPS的11种理化性质，当i=1, 2…11时分别对应分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、亨利常数、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量. 样本Yj代表p-NP-DPS与FKBP5相互作用强度，当j=1, 2时分别对应结合能绝对值和结合面积.

      根据公式（5）计算Spearman相关性：

      式中，dm是样本Xi和Yj中的第m个体的等级差，n表示样本的容量. 样本Xi代表p-NP和p-NP-DPS的11种理化性质，当i=1, 2…11时分别对应分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、亨利常数、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量. 样本Yj代表p-NP-DPS与FKBP5相互作用强度，当j=1, 2时分别对应结合能绝对值和结合面积.

    2.   结果与讨论（Results and discussion）

      2.1.   p-NP-DPs与FKBP5相互作用的性能和机理

    • 分子对接是目前计算化学中一种重要的研究方法，可用于p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合位点和相互作用的研究[26 − 27]. p-NP-DPs与FKBP5分子对接后的最优位置如图2所示. 由图2（a）可知，p-NP与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Glu227、Ala228、Lys254、Glu255、Gly282、Met285、Gln286和Trp297. p-NP与FKBP5的相互作用包括—OH→Gly282（氢键）、—OH→Glu227（氢键）、—NO2←Met285（氢键）、—OH→Gln286（氢键）、—OH→Lys254（氢键）、苯环-Trp297（π-π/范德华力相互作用）、苯环-Glu227（范德华力相互作用）、—OH→Glu255（氢键）和苯环-Ala228（范德华力相互作用）. 受体和供体相互作用的强度由结合能和结合面积决定，p-NP与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.76 kcal·mol−1和200 Å2.

      如图2（b）所示，苯酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Pro221、Glu227、Lys254、Glu255、Lys283、Met285、Gln286和Trp297. 苯酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gln286（氢键）、—OH→Pro221（氢键）、—OH→Lys254（氢键）、苯环-Trp297（π-π/范德华力相互作用）、—OH→Glu227（氢键）、苯环-Met285（范德华力相互作用）、苯环-Lys283（范德华力相互作用）、苯环-Glu227（范德华力相互作用）和—OH→Glu255（氢键）. 苯酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.91 kcal·mol−1和173 Å2.

      如图2（c）所示，对苯二酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Pro221、Glu227、Gly282、Gln286和Arg331. 对苯二酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gln286（氢键）、—OH→Pro221（氢键）、—OH→Glu227（氢键）、—OH→Gly282（氢键）和—OH←Arg331（氢键）. 对苯二酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为-3.81 kcal·mol−1和175 Å2.

      如图2（d）所示，对苯醌与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Lys204、Ala228、Met285、Arg331和Lys335. 对苯醌与FKBP5的相互作用包括C=O←Met285（氢键）、C=O←Arg331（氢键）、C=O←Ala228（氢键）、苯环-Ala228（范德华力相互作用）、C=O←Lys204（氢键）和C=O←Lys335（氢键）. 对苯醌与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.83 kcal·mol−1和171 Å2.

      如图2（e）所示，4-硝基邻苯二酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Gly224、Asn238、Gly282、Met285和Gln286. 4-硝基邻苯二酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gly282（氢键）、—NO2 ←Met285（氢键）、—NO2←Asn238（氢键）、—OH→Gln286（氢键）和—OH→Gly224（氢键）. 4-硝基邻苯二酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.69 kcal·mol−1和213 Å2.

      如图2（f）所示，邻苯二酚与FKBP5相互作用的关键氨基酸为Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Tyr284和Gln286. 邻苯二酚与FKBP5的相互作用包括—OH→Gln286（氢键）、—OH→Gly224（氢键）、—OH→Gly282（氢键）、苯环-Ala228（范德华力相互作用）、—OH→Glu227（氢键）和苯环-Tyr284（π-π/范德华力相互作用）. 邻苯二酚与FKBP5相互作用的结合能和结合面积分别为−3.81 kcal·mol−1和184 Å2.

      • 2.2.   p-NP-DPs与FKBP5相互作用构效关系

    • p-NP-DPs与FKBP5相互作用结果如图3（a）所示. p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）> 200 Å2（p-NP）> 184 Å2（邻苯二酚）> 175 Å2（对苯二酚）> 173 Å2（苯酚）> 171 Å2（对苯醌），而p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）> −3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚）.

      结合面积的数值越正意味着p-NP-DPs与FKBP5相互作用越强，而结合能的数值越负意味着p-NP-DPs与FKBP5相互作用越强，基于结合面积因素，p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度大小顺序为4-硝基邻苯二酚 > p-NP > 邻苯二酚 > 对苯二酚 > 苯酚 > 对苯醌；基于结合能因素，p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度大小顺序为苯酚 > 对苯醌 > 对苯二酚/邻苯二酚 > p-NP > 4-硝基邻苯二酚. 因此，结合能和结合面积对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响是复杂的，p-NP-DPs与FKBP5相互作用的强度取决于结合能和结合面积复合作用的结果[28].

      影响p-NP-DPs与FKBP5相互作用的关键因素可能是小分子的种类，而分子量是决定小分子性能和结构的关键因素，因此，研究p-NP-DPs分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响十分必要. p-NP-DPs分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积的影响如图3（b）所示，结果表明p-NP-DPs分子量越大，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积越大，二者呈正相关关系，线性相关系数R2=0.9194，表明污染物分子量越大，污染物与受体蛋白相互作用越强，污染物环境风险越大. 而p-NP-DPs分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合能的影响如图3（c）所示，p-NP-DPs分子量越大，p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合能越大，二者呈正相关关系，线性相关系数R2=0.9198，表明污染物分子量越小，污染物与受体蛋白相互作用越强，污染物环境风险越大. p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积和结合能的影响如图3（d）所示，结果表明结合面积和结合能呈正相关关系，线性相关系数R2=0.7906，因此分子量对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度影响随分子量增加呈“先升后降”趋势，过大的分子量导致污染物空间结构变大，受体蛋白空间位阻抑制p-NP-DPs与FKBP5相互结合，而过小的分子量则因为官能团和药效团减少抑制了p-NP-DPs与FKBP5相互结合[29 − 30].

      p-NP-DPs与FKBP5相互作用的结合区域如图4所示，p-NP-DPs药效团如图5所示. p-NP与FKBP5相互作用结合区域由Glu227、Ala228、Lys254、Glu255、Gly282、Met285、Gln286和Trp297组成，结合面积200 Å2（图4a），p-NP的药效团为氢键供体（—OH）、氢键受体（—NO2）和芳香中心-疏水中心（苯环及其C原子），如图5a所示. 苯酚与FKBP5相互作用结合区域由Pro221、Glu227、Lys254、Glu255、Lys283、Met285、Gln286和Trp297组成，结合面积173 Å2（图4b），苯酚的药效团为氢键供体（—OH）、芳香中心（苯环）和芳香中心-疏水中心（苯环上C原子），如图5b所示. 对苯二酚与FKBP5相互作用结合区域由Pro221、Glu227、Gly282、Gln286和Arg331组成，结合面积175 Å2（图4c），对苯二酚的药效团为氢键供体（—OH），如图5c所示. 对苯醌与FKBP5相互作用结合区域由Lys204、Ala228、Met285、Arg331和Lys335组成，结合面积171 Å2（图4d），对苯醌的药效团为氢键受体（C=O）和疏水中心（苯环），如图5d所示. 4-硝基邻苯二酚与FKBP5相互作用结合区域由Gly224、Asn238、Gly282、Met285和Gln286组成，结合面积213 Å2（图4e），4-硝基邻苯二酚的药效团为氢键供体（—OH）和氢键受体（—NO2），如图5e所示. 邻苯二酚与FKBP5相互作用结合区域由Gly224、Glu227、Ala228、Gly282、Tyr284和Gln286组成，结合面积184 Å2（图4f），邻苯二酚的药效团为氢键供体（—OH）和芳香中心-疏水中心（苯环），如图5f所示.

      p-NP-DPs与FKBP5相互作用的氨基酸残基分布如图6所示，结果表明氨基酸残基分布区间为Lys204（对苯醌和FKBP5）到Lys335（对苯醌和FKBP5），其中高频氨基酸残基主要由两个区域组成，包括氨基酸残基序号221—228（Pro221、Gly224、Glu227、Ala228）和氨基酸残基序号282—286（Gly282、Lys283、Tyr284、Met285、Gln286）.

      • 2.3.   p-NP-DPs与FKBP5相互作用关键因子

    • p-NP-DPs分子结构的不同导致其理化性质（分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量，表1）差异显著[31 − 32]. 为了明确p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度与p-NP-DPs物理化学性质之间的关系，分别采用SPSS软件中的Spearman相关性和Pearson相关性分析了分子量、熔点、沸点、闪点、密度、lgSw、lgP、拓扑极表面积、氢键供体数量和氢键受体数量分别与结合面积和结合能绝对值之间的相关性. 表2为利用Spearman相关性分析理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响，结果表明结合能绝对值与分子量和拓扑极表面积在0.01水平的相关系数均达到-1，与闪点、密度和氢键受体数量在0.05水平的相关系数达到-0.9747、-0.9747和-0.9549，表明结合能绝对值与分子量、拓扑极表面积、闪点、密度和氢键受体数量呈显著的负相关关系. 结合能绝对值与熔点、沸点、lgSw、lgP和氢键供体数量的相关系数分别为-0.6377、-0.7182、0.5000、-0.5798和-0.5323，且P>0.05，结合能绝对值与熔点、沸点、lgSw、lgP和氢键供体数量无相关性. 而结合面积仅与分子量和拓扑极表面积在0.05水平的相关系数均达到0.9276，表明结合面积仅与分子量和拓扑极表面积呈显著的正相关关系.

      表3为利用Pearson相关性分析理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用的影响，结果表明结合能绝对值与分子量在0.01水平的相关系数达到−0.9591，与密度、拓扑极表面积和氢键受体数量在0.001水平的相关系数分别达到−0.9928、−0.9743和−0.9860，表明结合能绝对值与分子量、密度、拓扑极表面积和氢键受体数量呈显著的负相关关系. 结合面积与分子量、拓扑极表面积和氢键受体数量在0.01水平的相关系数达到0.9589、0.9597和0.9230，表明结合面积与分子量、拓扑极表面积和氢键受体数量呈显著的正相关关系. 结果表明，p-NP-DPs分子结构及理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）> 氢键受体数量（75%）> 密度（50%）> 闪点（25%）.

    3.   结论（Conclusion）

    • （1）p-NP-DPs与FKBP5相互作用结合面积顺序为213 Å2（4-硝基邻苯二酚）> 200 Å2（p-NP）> 184 Å2（邻苯二酚）> 175 Å2（对苯二酚）> 173 Å2（苯酚）> 171 Å2（对苯醌），结合能顺序为−3.69 kcal·mol−1（4-硝基邻苯二酚）> −3.76 kcal·mol−1（p-NP）> −3.81 kcal·mol−1（对苯二酚/邻苯二酚）> −3.83 kcal·mol−1（对苯醌）> −3.91 kcal·mol−1（苯酚）.

      （2）p-NP-DPs与FKBP5相互作用高频氨基酸残基为Pro221、Gly224、Glu227、Ala228（221-228）和Gly282、Lys283、Tyr284、Met285、Gln286（282-286），p-NP-DPs的药效团主要包括氢键供体、氢键受体、芳香中心和疏水中心.

      （3）p-NP-DPs理化性质对p-NP-DPs与FKBP5相互作用强度的影响主要取决于分子量和拓扑极表面积（100%）> 氢键受体数量（75%）> 密度（50%）> 闪点（25%）.

    参考文献 (32)

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