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自从抗生素被发现、生产和使用以来，全世界每年至少生产1×105—2×105 t抗生素[1]，因其对病原微生物具有良好的抑制作用[2]，抗生素被大量应用在医疗等许多方面[3]. 目前，抗生素种类和数量剧增，仅中国一年抗生素的用量就有1.62×105 t，产出达到2.48×105 t，进入环境的抗生素质量甚至超过了5 t[4]，造成环境中抗生素被大量检出，如盐酸四环素在黄浦江的上游支流中被检测出，浓度达34.25—211.82 ng·L−1[5]，在苏州市某一湖泊中也检测出，浓度达3.27—547 ng·L−1[6]；在香港的维多利亚湾β-内酰胺类抗生素最高被检测出493 ng·L−1[7]. 进入环境中的抗生素不仅会对环境中微生物造成危害，也会影响植物根系的伸长，阻碍种子的发芽生长[8]，甚至还会通过食物链等途径进入动物甚至人体，对动物及人类肠道菌群产生影响，更为严重还会导致人体产生抗药性和体重变化等其它危害[9].
环境中残留的抗生素不是以单个形式存在，常以混合物的形式存在，不同抗生素之间在环境中很可能会出现协同或拮抗作用[10]，给生态环境及人体健康带来更大潜在的风险[11]，如王桂祥等[12]发现，环境浓度下的恩诺沙星和磺胺甲恶唑的协同作用会使普通小球藻产生更强的氧化损伤. 因此，研究抗生素及其混合污染物的毒性作用具有重要的环境意义.
中药因对细菌和病毒等微生物产生良好的抑菌效果，而被大量使用[13]，同时，也产生了大量药渣，其中含有黄酮、生物碱、多酚、萜类等成分[14]也随之进入环境中，抑制微生物的生长. 刘海席[15]研究发现，中药提取物盐酸小檗碱在1.47—23.44 mg·L−1浓度范围，对桃褐腐菌（Monilinnia fructioncola）的抑菌作用随浓度的升高而增强. 无论是进入环境还是在人体中的中药都很有可能会对环境中残留的或者通过食物链等途径进入生物体甚至人体的抗生素的抑菌作用产生影响，如氢青蒿素和氟康唑联合使用恢复了氟康唑对耐药性白色念珠菌的抑菌作用，并与氟康唑产生了较强的协同作用[16]. 因此，考察抗生素与中药联合抑菌作用具有重要的实际意义.
大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）常存在于人和动物肠道中，伴随粪便排出，在自然环境中广泛传播[17]，和人体是互利共生的关系，多数不会给身体带来危害，反而可以抑制肠道致病菌和其他病原体的繁殖[18]. 因其具有生长速度快、培养方法简单等优点，也常被作为一种模式生物. 尹孝仁等[19]发现诺氟沙星和多粘菌素E对E. coli出现协同作用. 曾范利等[20]发现鱼腥草、黄芩和五倍子联用时，对E. coli抑菌效果为协同或加和作用. 这都说明E. coli作为指示生物来反映抗生素和中药抑菌效果的可行性. 抗生素与中药的联合抑菌效果虽已有前人进行研究[21]，而定量评估其潜在的风险是关键，而目前大多数研究都缺乏对联合抑菌作用强度的定量表征.
此外，盐酸四环素作为世界上使用非常广泛的广谱抗生素，也是污水中检出最为频繁的抗生素之一[22]；氨卡西林钠是作为β-内酰胺类的广谱抗生素，具有抗菌谱广、药效高和价格便宜等特点[23]，在临床医疗上被广泛的使用. 虽然这两种抗生素降解速率都很快，但是由于使用量大、频率高，仍可能在环境中造成假持久性污染[24]，对生态及人体造成威胁. 因此，本文选择β-内酰胺类抗生素（氨苄西林钠（ampicillin sodium，AMP））、四环素类抗生素（盐酸四环素（tetracycline hydrochloride，TET））和中药提取成分（盐酸小檗碱（berberine chloride hydrate，BCH））作为目标污染物，应用直接均分射线法（direct equipartition ray，EquRay）和均匀设计射线法（uniform design ray，UD-Ray）[25]，分别设计了3种药物的3个二元（AMP-BCH、AMP-TET、TET-BCH）及1个三元混合物体系（AMP-BCH-TET）；利用时间微板毒性分析法（time-dependent microplate toxicity analysis method，t-MTA）[26]测定并分析3种药物及其混合物体系对E. coli的时间、浓度和组分比依赖抑菌毒性；应用拟合归零法进一步对混合物组分间的相互作用类型及强度进行分析，并测定药物作用前后E. coli细胞的核酸溶出量和电镜扫描的细胞形态，以探讨可能的作用机理. 研究结果可为评价抗生素和中药的混合物毒性及环境生态风险等研究提供参考.
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实验用药物均购于国药集团化学试剂有限公司，其理化性质见表1，储备液均采用mili-Q水配制，置于棕色瓶储备，放4 ℃冰箱保存. 实验所用主要仪器见参考文献[27].
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实验菌种为菌株号ATCC8739大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli），购自上海鲁微科技有限公司，E. coli的活化过程，培养基成分和制备见参考文献[28]. 将营养肉汤培养基（nutrient broth，NB）培养至对数生长期的E. coli菌液接入2倍MHB培养基（mueller-hinton broth，MHB），使其OD600值在0.08—0.1，备用.
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在微板孔上设计防边缘效应组（200 μL mili-Q水）、空白对照组（100 μL mili-Q水＋ 100 μL备用菌）和实验组（100 μL药＋100 μL备用菌）. 样品微板由实验组、防边缘效应组和空白对照组组成，实验组设计12个浓度梯度，每种药或混合物射线设计3块样品微板，同步设计一块由空白对照组和防边缘效应组组成的阴性对照板. 将所有微板置于（37±1）℃生化恒温培养箱中培养，分别在暴露时间0.25、2、4、8、12 h取出，用酶标仪测定微板各孔中菌的OD600值. 经实验同步测定，在12 h，空白对照组的菌都处于对数生长期，生长状态良好. 具体操作过程见文献[29]. 药物及其混合物体系对E. coli的抑菌性计算公式如下：
式中， I0 为空白对照的 OD600 平均值，I为各浓度梯度的 OD600 平均值；x为为抗生素对E. coli 的生长抑制率.
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为有效地研究混合物组分对E. coli毒性相互作用，分别采用直接均分和均匀设计射线法设计3种药物的二元（AMP-TET、AMP-BCH、TET-BCH）及三元 （AMP-BCH-TET） 混合物体系，每种混合物体系共有5条射线（R1、R2、R3、R4、R5），每条射线有12个浓度梯度. 二元及三元混合物的各组分浓度比 （pi） 如表2所示.
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Weibull函数能较好拟合不同暴露时间点的“S”型浓度-效应关系[30]，函数表达式如（2）所示. 同步用APTox软件处理数据[31]，并绘制时间-浓度-效应曲线（time-concentration-effect curve，t-CRC）.
式中，E为效应（ 0 ≤ E ≤1） ；C为单个药物或者混合物浓度；α 和 β为模型参数.
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拟合归零法是以实验数据拟合CRC数据归零为基础，将实验效应、置信区间以及用浓度加和模型（concentration addition，CA） [32]预测的CRC数据投影到实验效应的拟合曲线上. 本文将拟合归零法加入时间变量，以实测数据的拟合曲线与CA预测曲线间的偏差视作混合物的浓度加和偏离指数（deviation from CA model，dCA），绘制拟合归零法的三维曲面形式. 根据95%置信区间（observed confident interval，OCI）绘制dOCI曲面，即为置信曲面. 用dCA曲面与置信曲面相对位置来判别混合物的相互作用类型，当dCA曲面在dOCI曲面上方为协同作用，下方为拮抗作用，中间为加和作用. 再用dCA值的大小表示相互作用的强度大小，当dCA>0时，dCA越大则协同强度越强；当dCA<0时，dCA的绝对值越大则拮抗强度越强. 以dOCI对实验所得数据结果是否在上下95%置信区间内进行界定，加强了评判效应强度的准确性[32]. dCA和dOCI的表达式见（3）和（4）.
式中，EOBS为实际拟合效应；EPRE,CA为CA预测效应；EPRE,OCI为上下95%置信区间的拟合效应.
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为反映药物及其混合物的对E.coli作用前后细胞遗传物质的受损程度，测定在12 h-EC50条件下3种药物及其混合物的代表射线（AMP、BCH、TET、AMP-BCH-R5、AMP-TET-R5、TET-BCH-R5和AMP-BCH-TET-R5）作用E. coli前后随时间变化的核酸溶出量.
取1.2节40 mL备用菌液至离心管中，离心（15 min，8000 r·min−1）后，舍弃上清液取菌体，用PBS缓冲液（0.1 mol·L−1，pH=7.4）冲洗3次，之后将菌体转移到100 mL锥形瓶中，备用. 随后进行实验组及空白组设置：将等体积等浓度（12 h-EC50）的3种药物及其代表体系加入锥形瓶为实验组，同时设与之等体积mili-Q水为空白对照组，两组都加入等量的备用菌体，实验组和空白对照组均设置3组平行，在生化恒温培养箱（37 ℃、170 r·min−1）中培养；最后进行核酸溶出量测定：在暴露时间为0.25、2、4、8、12 h时，用移液枪吸取锥形瓶中的溶液，离心（15 min，8000 r·min−1）后，收集上清液，采用紫外分光光度计测定吸光度（OD260），以OD260值表示胞外核酸含量[33].
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为进一步分析AMP、TET、BCH及其混合物体系作用E.coli的抑制机理及迫害效果，应用电镜扫描技术，分析在12 h-EC50条件下3种药物及其混合物体系的代表射线（AMP、BCH、TET、AMP-BCH-R5、AMP-TET-R5、TET-BCH-R5和AMP-BCH-TET-R5） 作用E.coli前后细胞形态结构变化.
实验组及空白组设置：取1.2节20 mL备用菌液和20 mL不同梯度药物加入锥形瓶中为实验组，再将同体积备用菌液和mili-Q水加入另一锥形瓶中为空白对照组，实验组和空白对照组均设计3组平行. 将实验组和对照组都放入生化培养箱（37 ℃、170 r·min−1、12 h）中培养，取培养后的混合液离心（15 min，8000 r·min−1），收集菌体，之后用PBS缓冲液（0.1 mol·L−1，pH=7.4）冲洗3次，再用戊二醛溶液（20 mL，2.5%）浸没，过夜固定. 接着再用PBS缓冲液冲洗菌体3次后，用乙醇溶液（30%、50%、80%、90%和100%）脱水，经冷冻干燥和喷金处理后，最用扫描电镜观察细胞形态[34].
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采用时间微板毒性分析法（time-dependent microplate toxicity analysis method，t-MTA）对单个药物不同暴露时间的E. coli抑菌性进行测定，并用Weibull函数拟合浓度-效应数据，结果见表3. 除0.25 h外，其余暴露时间的浓度-效应数据拟合效果良好（RMSE<0.10，r>0.90）. 为全面得出3种药物对E. coli的在不同暴露时间抑菌毒性强弱关系，以半数效应浓度（EC50）的负对数（pEC50）作为抑菌毒性作用的指标，在0.25—2 h，3种药物对E. coli的抑菌毒性均较低，在4—12 h，各药物在不同暴露时间的抑菌毒性各不相同，毒性强弱也随时间变化而变化，在12 h时，抑菌毒性的强弱顺序为：TET>BCH>AMP.
3种药物的t-CRC如图1所示. 由图1可知，3种药物对E. coli的t-CRC均为“S”型，具有明显的时间依赖抑菌性，但各药物的抑菌性变化规律迥异. 在0.25 h时，除AMP表现出急性抑菌性外，BCH和TET均无明显的急性抑菌性；在2 h时，AMP和TET的t-CRC明显弯曲，表明这两种药物的抑菌性随浓度升高逐渐增大，但BCH的t-CRC弯曲不明显，仅仅表现出轻微抑菌作用；在4—12 h时，3种药物的t-CRC表现为更明显的弯曲状态，说明抑菌作用明显. 在0—12 h，3种药物的t-CRC随浓度的升高在不同程度上逐渐攀升，说明这3种药物对E. coli的抑菌作用具有浓度依赖性， AMP、BCH和TET对E. coli的最大抑菌率分别为0.9296、0.9298和0.9103.
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同样用Weibull函数对实验结果数据进行拟合，得各混合物射线在各暴露时间的pEC50值，绘制其随时间及组分变化的热图，如图2所示. 从时间来看，3种药物的二元混合物体系均具有时间依赖抑菌性. 4—12 h，3组二元混合物的抑菌毒性随暴露时间的增加都在不断增强，增幅明显，在同一二元混合物射线中，各暴露点抑菌毒性顺序为：12 h-pEC50>8 h-pEC50>4 h-pEC50. 在最终暴露时间点（12 h），AMP-BCH、AMP-TET和TET-BCH各射线的抑菌毒性达到最大，最大值分别为5.16、6.25和6.15，均远高于3种药物单独抑菌毒性.
从组分比来看，3种药物的二元混合物体系均具有组分比依赖抑菌性. 对于AMP-BCH体系，AMP组分的减少及BCH组分的增加都会使同一时间节点（4、8、12 h）的抑菌毒性逐渐减弱（R1>R2>R3>R4>R5）；对于AMP-TET体系，TET组分的增加，AMP组分的减少反而会使同一时间节点的抑菌毒性逐渐增强（R1<R2<R3<R4<R5）；对于TET-BCH体系，抑菌毒性随时间变化规律与AMP-BCH相似，TET组分的减少和BCH组分的增加使同一时间的抑菌毒性逐渐减弱（ R1>R2>R3>R4>R5）. 综上，说明在4、8、12 h， 3种药物的各二元体系的抑菌毒性与TET组分正相关，与BCH组分负相关，而AMP组分在AMP-TET中呈负相关，在AMP-BCH中则呈正相关.
为了直观说明各二元混合物的时间依赖抑菌性和浓度依赖抑菌性，对3种药物的所有二元混合体系共15条射线的实验数据进行t-CRC拟合，拟合结果如图3所示. 首先由图3可知，t-CRC最终呈“S”型，各二元混合物对E. coli的抑菌性随时间的增加而逐渐增大，呈现明显的时间依赖性，验证了图2的结论. 其次，在短暴露时间段 （0.25—2 h），抑菌性均较低，无急性抑菌性，说明BCH和TET组分的单独加入，减弱、消除或掩盖了AMP的急性抑菌性；在长暴露时间段 （4—12 h），抑菌性均随混合物浓度的升高而变大，说明二元混合物都具有浓度依赖抑菌性，最高抑菌率达0.9999，抑菌效果明显.
综上， AMP、BCH、TET的二元混合物体系对E. coli均有较好的抑菌毒性作用，并明显强于单个药物；二元混合物的抑菌毒性和暴露时间、浓度及组分比密切相关，且均具有时间、浓度和组分比依赖抑菌性.
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采用Weibull函数拟合AMP-BCH-TET三元混合物浓度-效应数据，除0.25 h外，均可良好拟合（RMSE<0.10，r>0.90），根据拟合结果得三元混合物的在各暴露时间的pEC50值，其随时间及组分变化的热图，如图2所示. 从图2来看，AMP-BCH-TET对E. coli的抑菌性具有明显的时间依赖性，且抑菌作用大于单个药物. 三元混合物对E. coli的抑菌性与暴露时间正相关（4 h-pEC50<8 h-pEC50<2 h-pEC50）. 随着目标药物与E. coli接触时间延长，5条射线对E. coli的pEC50值不断增大，其12 h-pEC50值（5.54—5.96）明显大于单个药物.
从组分比来看，三元混合物的组分比依赖性无法从图2中清晰看出，因此为进一步探究三元混合物在不同暴露时间点的抑菌毒性与组分比的相关性，用Pearson相关系数检验变量间相关性的强弱，结果如图4所示. 在AMP-BCH-TET混合物体系中，虽然4 h-pEC50、8 h-pEC50、12 h-pEC50值与TET正相关，与AMP和BCH负相关，但Pearson相关系数r<0.9，显著系数P>0.05 ，AMP与TET相关系数极小，这说明二者间无显著相关性；三元混合物的4 h-pEC50、8 h-pEC50、12 h-pEC50相互显著正相关，其中4 h-pEC50与12 h-pEC50极显著正相关（r=0.994，P≤0.001），4 h-pEC50与8 h-pEC50非常显著正相关（r = 0.960，0.001<P≤0.01），8 h-pEC50与12 h-pEC50显著正相关（r=0.934，0.01<P≤0.05），这也说明三元混合物的抑菌毒性有显著的时间依赖性.
为进一步直观说明三元混合物的时间及浓度依赖抑菌性，将AMP-BCH-TET对E. coli的t-CRC进行绘制，结果如图5所示. 首先，三元混合物的t-CRC最终呈“S”型，抑菌性随时间的增加逐渐增大，说明具有时间依赖性，这与图2的结论一致. 其次，在0.25 h，t-CRC无明显起伏，说明无急性抑菌性，这也说明对于AMP，其他两种组分的单独或混合加入都会使其急性抑菌性减弱、消失或被掩盖；在2—12 h，t-CRC在低浓度区域增加趋势微弱，而在中、高浓度区域出现了大幅度的攀升，与抑菌毒性变化基本相同，并且随着浓度的增加，抑菌性明显增强，具有明显的浓度依赖抑菌性，最大抑菌率为0.9999，抑菌效果明显.
综上所述，AMP-BCH-TET的抑菌毒性远大于单个药物，且均具有显著的时间依赖抑菌性和浓度依赖抑菌性，但无组分比依赖抑菌性，三元混合物的 4 h-pEC50、8 h-pEC50、12 h-pEC50之间呈正相关.
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为了分析3种药物的二元混合物的联合作用类型以及联合作用强度与时间和浓度之间的关系，采用dCA曲面与dOCI曲面的上下关系来描述三元混合物的联合作用类型，用dCA值定量表征混合物之间的联合作用强度，3种药物的二元混合物的dCA值随时间和浓度变化情况如图6所示，其绿色颜色越深表示组分间相互作用强度越强.
由图6知，AMP-BCH、AMP-TET和TET-BCH的所有射线对E. coli的联合作用均为协同作用，其强度均随时间和浓度的变化而变化. 在短暴露时间（0.25—2 h）的低浓度时，所有混合射线的dCA曲面均位于dOCI上下曲面之内，且dCA曲面由淡紫色逐渐转变为绿色，组分间的协同作用趋势明显增强；在较长的暴露时间内（4—12 h），dCA曲面已逐渐与dOCI上曲面产生了相交，并大幅度地高出dOCI的上曲面，绿色颜色加深，组分间的协同强度不断增强. 在所有二元体系中，在12 h且浓度分别为1.904×10−5、6.64×10−6、1.46×10−5 mol·L−1时，最大协同强度分别为0.9739、0.9849和0.9841.
此外，TET-BCH体系的协同曲面更大且无紫色区域，说明 TET-BCH的协同作用强度增加范围较为明显，这可能是由于BCH为脂多糖拮抗剂，可以从源头阻断脂多糖/TLR4信号通路，且TET会深度抑制菌体内部核糖体的工作性能，进而使转运RNA对肽链间的衔接程序紊乱，从而减少了肽链间的结合位点，进一步延缓了蛋白质的“建设”进度. 2种药物的双重抑菌机制，使其协同强度更为明显. 混合物体系的强协同作用可为解决耐药菌的问题提供解决思路和有效方法.
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AMP-BCH-TET的dCA结果变化情况如图7所示. 由图7可知，dCA曲面图整体均为绿色， dCA曲面大多在置信曲面的上方，随时间和浓度的增加，绿色逐渐加深，即该三元混合物的5条射线组分间相互作用大多为协同作用，且协同作用强度整体呈增大趋势. 在同一暴露时间，dCA随混合物浓度的增加而增加；在同一药物浓度下，dCA随着时间的延长而增大. 当混合物浓度较低且暴露时间为0.25 h时，dCA曲面在dOCI面内向上攀升，绿色曲面大范围地扩增，无紫色曲面出现，即协同趋势逐渐显现；当混合物浓度较高且暴露时间为4—12 h时，dCA曲面与dOCI上曲面产生相交线，且dCA曲面大面积超越dOCI上曲面，绿色区域的颜色不断加深，dCA大小随混合物浓度和暴露时间的增大而不断增大，协同强度逐步增强. 三元混合物的5条射线，都为协同作用，其联合抑菌毒性强于单个药物，其中，AMP-BCH-TET-R3在暴露时间12 h且混合物浓度2.24×10−5mol·L−1时，达到最大协同作用强度（0.9746）.
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核酸作为生命体的重要遗传物质，承担着储存信息、合成蛋白质和转运氨基酸等重要功能，若核酸大量泄露，则生命体的正常活动必将受损[35]. 故通过核酸溶出量的变化，能够反映出细胞遗传物质的受损程度. 选取3种药物及每个混合物体系中抑菌效果较好且混合物相互作用较为明显的代表射线作用于E. coli，相对于空白对照组的核酸溶出量影响结果如图8所示，实验数据以平均值±标准差表示，以单因素方差分析法比较不同组之间的差异，并用最小显著差法多重比较判断分析实验组和空白组之间差异显著性. 当P<0.05时，认为具有统计学意义.
从图8可知，E. coli细胞在BCH、TET、AMP-BCH、AMP-TET和TET-BCH作用下，核酸溶出量随暴露时间的延长均呈现上升趋势，且所有实验组的核酸溶出量较空白对照组均存在极显著性差（P<0.01）. 在AMP作用下，E. coli核酸溶出量随暴露时间的延长，变化规律不明显. 由图1可知AMP具有急性抑菌性，但在0.25 h也存在核酸溶出量大于AMP的无急性抑菌性的实验组，所以0.25 h 的E. coli的核酸溶出量与不是药物急性抑菌性的必要条件. 由AMP与TET、BCH的二元及三元混合物体系对应的t-CRC可知，它们对E. coli都无急性抑菌性，说明TET和BCH的单独或混合添加，掩盖、减少或湮灭了AMP的急性抑菌性. BCH和TET对E. coli的核酸溶出量随时间的延长在逐步增加. 在AMP-TET作用下，12 h核酸溶出量大于两个单个药物，两个单个药物的联用相较单个药物提高了12 h核酸溶出量，而随时间延长而增加，核酸溶出量增加的趋势相比两个单个药物都有了明显的攀升，说明该混合物体系也提高了核酸溶出量的溶出速率. 而在AMP-BCH和TET-BCH作用下，12 h核酸溶出量大于单个药物，但核酸溶出量的溶出速率却没有明显提升. 在AMP-BCH-TET的作用下，随时间延长E. coli细胞的核酸溶出量却逐渐减少，但核酸溶出量依旧大于单个药物，说明3个药物的联用增加了核酸溶出量的溶出. 这可能是由于三种药物的主要作用位点各不相同，它们分别对细胞壁、蛋白质和菌丝的形成进行抑制[36-37]，而这最终的结果都会导致细胞膜破裂或通透性改变，从而加剧了细胞内核酸的溶出.
综上所述，AMP、TET、BCH组成的混合物体系的核酸溶出量整体大于单个药物，组分间的强协同作用强度和抑菌毒性整体也高于单个药物，这说明混合物对E. coli的高抑菌毒性和组分间的强协同作用强度都与核酸溶出量有关.
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通过电镜扫描能够直观地反映细胞形态的变化，且正常细胞结构是生命体活动的必要条件，当细胞结构受损时，其生存也将受到威胁，故通过观察细胞形态的变化能够反映出目标药物对受试生物的迫害. Lee等[38]通过对比李斯特菌（Listeria monocytogenes）在马尾藻（Myagropsis myagroides）提取物作用前后的变化，发现药物不仅影响了菌体的完整形态，而且会导致穿孔破裂，最终殒命. 3种药物及其混合物代表射线对细胞形态的影响结果如图9所示.
由图9可知，E. coli细胞在milli-Q水（阳性对照组）和MHB（阴性对照组）作用后，两者形态相似且菌体完整，形态规则，表面平滑，而在3种药物及其混合物代表射线作用后，形态变化显著，细胞结构形态出现了不同形式的改变. 在AMP作用后，细胞难以维持基本形态，内溶物大量溢出，其作用机制是抑制E. coli细胞壁的合成，使细胞壁缺失而使细胞膨胀、破裂和溶解[39]；在BCH作用后，细胞膜发育不全且表面极为粗糙并皱缩，细胞间的粘稠性变高，景春娥等[40]等研究表明，BCH可抑制体外阪崎克罗诺杆菌（Microbial Pathogenesis ）生物膜生成，从而抑制细菌生长；在TET作用后，细胞出现了断裂和大面积的凹陷，根据汤淼等[41]研究表明. TET可进入细胞内部影响蛋白质的合成，进而可能影响了细胞形态. 对于二元混合物，在AMP-BCH作用后，有凹陷和粘连物，且大小不一，部分延续了BCH的作用特点；在AMP-TET作用后，有凹陷和孔洞出现，且有少部分细胞变长，说明AMP-TET比单个药物加剧了对细胞膜的破坏，致使细胞质大量泄露，这也解释了2.6节AMP-TET组核酸溶出量最高的现象；在TET-BCH作用后，大部分细胞变为短杆状，部分呈现球状，表现与单个药物不同的作用特征. 在AMP-BCH-TET作用后，E. coli细胞显著变长，少部分在菌体中部出现断裂，形态明显改变. 整体来说，二元及三元混合物对E. coli细胞形态的变化比单个药物更大，这从细胞形态上解释了混合物体系的高抑菌毒性、强协同作用强度和高核酸溶出量产生的原因.
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（1） AMP、BCH和TET对E. coli均产生了明显的时间和浓度依赖抑菌性，12 h，3种药物抑菌性大小关系为：TET>BCH>AMP，仅AMP具有急性抑菌性. 这表明暴露时间和浓度是影响3种药物抑菌毒性作用的重要因素.
（2） 3种药物的混合物体系对E. coli均具有明显的时间和浓度依赖抑菌性. 二元混合物体系具有组分比依赖抑菌性，而三元体系无明显的依赖性. 所有混合物体系均无急性抑菌作用，说明BCH和TET组分的单独或混合加入，减少、掩盖或削弱了AMP的急性抑菌性. 二元和三元混合物抑菌毒性作用明显强于单个药物的，最高抑菌率可达0.9999.
（3） 3种药物的二元和三元混合物体系对E. coli的联合抑菌作用类型整体均为协同，强度随时间和浓度的增大而增大，最大协同作用强度分别为0.9849和0.9746.
（4） 在AMP、BCH、TET及其混合物体系作用下，E. coli的核酸含量均高于空白对照组，且有极显著性差异，二元及三元混合物作用后的核酸溶出量整体高于单个药物的，说明混合物会导致胞内DNA等大分子物质产生更严重的泄漏和细胞损伤；药物作用后E. coli细胞严重受损，出现了破裂、皱缩、黏连、凹陷、变长、孔洞、内溶物外泄和大小不一等现象，且部分混合物对细胞形态的作用相比单个药物有不同表现形式，对细胞形态的破坏更为严重. 这都说明3种药物的混合物导致的高核酸溶出量和更严重的细胞损伤是产生强协同作用强度和高抑菌毒性的原因之一.
抗生素与中药对大肠杆菌的联合抑菌作用及机理
Combined antibacterial action and mechanism of antibiotics and traditional Chinese medicine on Escherichia coli
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摘要: 为研究抗生素和中药对环境及生物体中菌群的联合毒性作用，以2种常用抗生素氨苄西林钠(ampicillin sodium，AMP) 、盐酸四环素(tetracycline hydrochloride，TET)和1种中药提取物盐酸小檗碱 (berberine chloride hydrate，BCH)为目标污染物，以大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)为指示生物，分别应用直接均分射线法和均匀设计射线法设计3个二元(AMP-BCH、AMP-TET、BCH-TET)及1个三元混合物体系(AMP-TET-BCH)，共20条射线，采用以96孔微板为实验载体的时间微板毒性分析法(time-dependent microplate toxicity analysis method，t-MTA)对3种药物及其混合物体系的毒性进行系统测定. 运用拟合归零法分析混合物毒性相互作用类型及强度，选取抑菌作用明显的代表性混合物射线进行暴露前后E. coli核酸溶出量以及电镜扫描分析. 结果表明，AMP、TET、BCH及其混合物体系对E. coli的浓度效应曲线为“S”型且时间和浓度依赖抑菌性明显，仅AMP具有明显的急性抑菌性二元混合物体系具有明显的组分比依赖性，而三元混合物体系无明显的组分比依赖性；暴露时间不同，3种药物及其混合物体系的抑菌毒性(半数效应浓度的负对数值(pEC50))也不同，整体上随暴露时间的增加而增加，在同一暴露时间二元和三元混合物体系的抑菌毒性大于单个药物，其中毒性最强为AMP-TET-R5(pEC50=6.25)；混合物体系联合抑菌作用均为协同作用，其中协同作用强度最强也为AMP-TET-R5 (dCA=0.9849)，且受时间、浓度和组分比影响；混合物体系可以通过破坏细胞形态和结构来抑制E. coli的生长，其中混合物体系的核酸溶出量整体高于单个药物的，且E. coli被作用后的细胞形态和结构的变化比单个药物作用后破坏的更为严重.Abstract: To investigate the combined toxic effects of antibiotics and Chinese herbal medicines on the microbial flora in the environment and organisms, two commonly used antibiotics, ampicillin sodium (AMP) and tetracycline hydrochloride (TET), and one Chinese herbal medicine extract, berberine chloride hydrate (BCH), were selected as target contaminants, and their three binary (AMP-BCH, AMP-TET, BCH-TET) and one ternary mixture (AMP-TET-BCH) systems were designed by using the direct equipartition ray and uniform design ray methods, respectively. The time-dependent microplate toxicity analysis method (t-MTA) with 96-well microplates was used to systematically determine the toxicity of the three drugs and the mixture system to Escherichia coli (E. coli). The return-to-zero fitting method was used to analyze the types and strengths of toxic interactions in the mixtures, and representative rays with significant toxicity interactions were chosen for the analysis of the nucleic acid content of E. coli before and after exposed to drugs, as well as scanning electron microscopy mechanistic experiments. The results showed that the concentration-effect curves of AMP, TET, BCH and their mixture systems on E.coli were "S" shaped with significant time- and concentration- dependent inhibition. Only AMP had a significant acute inhibition. The binary mixture system had a significant component-ratio dependence, while the ternary mixture system did not have. The inhibition toxicity (negative logarithm of the half-effect concentration (pEC50)) of the three drugs and their mixture systems differed and increased with increasing of exposure time. At the same exposure time, the inhibition toxicity of the binary and ternary mixture systems was stronger than that of the individual drugs, AMP-TET-R5 with pEC50 = 6.25 was the strongest toxicity. The inhibition of the mixture systems was all synergistic with the highest synergistic intensity in AMP-TET-R5 (dCA=0.9849), which was influenced by time, concentration and fraction. The mixture system could inhibit the growth of E. coli by disrupting cell morphology and structure. The nucleic acid dissolution of E. coli after exposed to the mixture systems was overall higher, and the changes in cell morphology and structure were more severely disrupted than those exposed to the individual drugs.
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电化学厌氧消化（electrochemical anaerobic digestion，EAD）是一种利用微生物电解池（microbial electrolysis cell，MEC）的耦合厌氧消化（anaerobic digestion，AD）的新技术，其原理是利用MEC的制氢功能，对系统内的二氧化碳（CO2）进行固定和转化，生成更多的CH4，从而减少CO2的排放[1]，并极大地提高了CH4的转化率和沼气的品质[2]，所以，EAD作为一种新型的沼气制备技术，因其具有甲烷转化率高、能量回收率高、能耗低、适用于多种有机废弃物和废水的降解等优势而受到了广泛的关注，是目前AD领域的最新发现[3-5].
但不管是AD，还是EAD，绝大多数相关研究仍然停留在提高消化能力或者副产物的产率等方面[6-8]，很少涉及代谢过程的研究. 代谢通量分析（metabolic flux analysis，MFA）是一项研究胞内代谢状态和分析系统代谢能力的强有力技术，通过MFA：（1）可以确定细胞或者系统内存在的不同代谢途径，明确物质的流向和流量[8]；（2）可以计算胞内的中间产物的通量，对未知途径加以辨别[9]；（3）可以识别代谢节点的刚柔性[10]，和对环境扰动的影响做出评价，从而对代谢途径中具有特殊地位的途径实施有效调控[11]（如优化目标产物代谢途径、计算最大理论转化率等[12]）. 因此，本文将利用MFA中的通过通量平衡分析（flux balance analysis，FBA）的方法，构建EAD代谢网络，研究EAD代谢网络中的相关代谢途径的通量分布信息.
在代谢通量分析中，通量是反映各代谢产物在整个代谢网络中参与程度的重要参数[7]，可以依据通量的大小评价各代谢途径在整个代谢网络中所发挥的作用[13]. 然而由于EAD代谢网络中的相关代谢途径，往往是在相应的酶催化下进行的，在EAD代谢途径中，乙酸的形成和转化是EAD产甲烷过程中最为关键的节点. 乙酸的形成主要的途径是乙酰辅酶A通过磷酸转乙酰酶（PTA）转化为乙酰基-P，然后再通过乙酸激酶（AK）从乙酰基-P转化为乙酰基-P，AK催化反应产生ATP[14]. 厌氧消化EMP途径所产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳，然后乙醛通过ADH还原成乙醇[15]. 丁酸的产生则与磷酸转丁酰酶（PTB）与丁酸激酶相关. 此外，ADP/ATP转运酶也发挥着重要的作用. ADP/ATP转运酶又被称为腺嘌呤核苷酸易位子或ADP/ATP载体蛋白，ADP/ATP转运酶通过ADP 与ATP相互转化产生能量从而为细胞提供能量[16]. 而在乙酸转化中，CoF420参与产甲烷菌中的氧化还原反应，充当电子载体. CoF430是甲基辅酶M还原酶的辅助因子，在甲烷生成的最后一步释放甲烷. 而辅酶M是古菌产甲烷菌代谢中甲基转移反应所需的辅酶.
综上所述，利用FBA不仅可以对EAD系统的代谢过程进行表征，还能对代谢通量进行分析和直观地了解代谢网络中不同代谢途径的产物生成情况以及代谢关键节点处的酶活性变化水平.
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 实验装置
EAD实验装置由 电解电流及电压记录单元、 EAD反应单元和排水集气单元组成，EAD反应单元主要包含400 mL的发酵罐，其中电极距离为3.0 cm，一端的电极片完全地浸于发酵液中，另一端通过导线与宽屏无纸记录仪（SIN-R7000A，中国）相连；在EAD系统中，阳极为石墨电极，阴极为铂电极，参比电极为饱和的Ag/AgCl电极. EAD实验装置如图1所示.
图 1 EAD实验装置Figure 1. EAD experimental setupa. 电解电流及电压记录单元，b. EAD反应单元，c. 排水集气单元a. electrolysis current and voltage recording unit, b. EAD reaction unit, c. drainage gas gathering unit.1.2 接种物、缓冲营养液和微量元素液
厌氧活性污泥来自云南师范大学昆明实验室通过猪粪厌氧发酵. 经检测，pH值为8.07，TS为17.11%，VS为10.08%.
缓冲营养液配比：NaH2PO4∙2H2O（5.54 g·L−1）、Na2HPO4∙12H2O（23.09 g·L−1）、KCl（0.26 g·L−1）和NH4Cl（0.62 g·L−1）.
微量元素液配比：Na2WO4∙2H2O（0.03 g·L−1）、NaCl（1 g·L−1）、FeCl2∙7H2O（0.07 g·L−1）、CuSO4∙5H2O（0.01 g·L−1）、NiCl2∙6H2O（0.02 g·L−1）、C6H9NO6（1.50 g·L−1）、MgSO4（3.00 g·L−1）、AlK（SO4）2∙12H2O（0.01 g·L−1）、ZnCl2（0.13 g·L−1）、CaCl2∙2H2O（0.10 g·L−1）、H3BO3（0.01 g·L−1）、MnCl2∙4H2O（0.60 g·L−1）、CoCl2∙6H2O（0.10 g·L−1）、Na2MoO4（0.03 g·L−1）和复合维生素（1 粒·L−1）.
1.3 实验方法
EAD实验设置3个实验组，每组3个平行. 首先在每个实验组的发酵罐中添加：葡萄糖1.0 g，接种物120.0 g，缓冲营养液100.0 mL，微量元素液10.0 mL，再补加蒸馏水使物料的总质量为360.0 g；其次将密封好的发酵罐连接气体收集装置，再利用高纯氮排出体系内的溶解氧和空气（通气时间为3 min），使EAD体系处于厌氧状态；最后施加恒定电压1.0 V，进行培养.
培养阶段：将发酵罐置于恒温磁力搅拌器中，设置温度为30.0 ℃；每天监测pH值变化，待其恢复到7.0左右，立即添加等量的葡萄糖将体系培养至稳定.
扰动阶段：培养阶段结束后，测定发酵液中底物和代谢产物的浓度，同时记下该时间点为扰动的初始点，随后添加1.0 g的葡萄糖，施加扰动后，通过监测体系中底物的消耗量和代谢产物的生成量，然后进行代谢通量分析.
1.4 常规检测分析
日产气量：采用排水法法，每天定时记录产气量. TS和VS：在（105±5）℃下干燥并在（550±10）℃下马弗炉燃烧1 h后，测量污泥的. pH值：采用pH计（HAOSHI H-1008A，中国）.
VFAs：样品经离心分离，取上清液，采用气相色谱仪（FULI, GC9790II，中国），以FID为检测器进行测量[17]. 色谱柱为KB- FFAP（30 m×0. 32 mm×0. 25 μm）毛细管柱.
气体含量：采用气相色谱仪（FULI, GC9790II，中国），以TCD 检测器对H2、CH4和CO2含量进行测量. 色谱柱为TDX-01填充柱. 葡萄糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[18].
1.5 酶活测量与分析
酶活测量采用改良的双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）方法[19-21]在测量过程中，以ADP/ATP转运酶、磷酸转乙酰酶（PTA）、乙酸激酶（AK）、磷酸转丁酰酶（PTB）、丁酸激酶（BK）、辅酶M（CoM）、甲基丙二酰CoA变位酶（MCM）、辅酶F420（F420）、辅酶F430（F430）为标准酶. 检测时在酶标包被板上设定空白孔、标准孔、待测样品孔. 空白孔不加样品及标准酶，作为对照，标准孔加标准酶，待测样品孔中先加酶试剂盒中的样品稀释液，然后再加待测样品. 按照酶试剂盒说明书进行操作，最后采用Epoch酶标仪在450 nm波长下进行测定，以空白孔调零依序测量各孔的吸光度（OD值），并通过标准曲线计算样品中酶的活性.
1.6 通量分析
通量分析采用通量平衡分析（FBA）的方法，采用代谢通量分析软件Cell Net Analyzer进行代谢网络的构建及分析. FBA是MFA中基于质量守恒的代谢过程研究常用的一种数学建模分析法[22]，在拟稳态条件下，模型中代谢产物处于平衡状态，此时，可将代谢物的通量描述为一个线性方程，只需对底物和相关产物的浓度变化进行测量，再采用线性规划或者计量矩阵分析方法则可确定每种产物的代谢通量[23].
2. 结果与讨论 （Results and discussion）
2.1 EAD培养阶段的产气及含量分析
EAD反应过程中产气特性的变化是表征反应器效能的重要因素. 图2为培养过程中的产气变化情况，从图2可以发现，在反应器启动阶段，气体中以CO2为主，随着反应器的运行，产甲烷菌逐渐生长富集. 在稳定阶段，其甲烷含量最高可以达到55%左右，葡萄糖厌氧消化中理论产甲烷含量在50%左右，也就是说，MEC的引入明显提升了葡萄糖的理论产甲烷率，而且此时CO2的含量降低到11%左右，明显的降低了CO2的排放. 在反应器稳定后，日产气量也得到了明显的提升，从最初的50 mL·d−1左右增加到了200 mL·d−1左右. 对于氢气含量，除启动阶段有氢气产生外，反应中后期基本没有氢气产生，这可能是由于前期pH较低，适于产氢菌的生长，中后期pH值恢复较快，可以迅速恢复至已6.5以上，不利于产氢菌的生长，导致氢气含量极低. 此外，也可能是由于电化学辅助促进了H2还原CO2途径产甲烷，使得反应器中的H2迅速被噬氢产甲烷菌消耗，从而提高了CH4的含量，降低了H2的含量.
图 2 EAD培养阶段中产气体积及气体组分含量Figure 2. Gas production volume and gas component content in EAD operation stage2.2 EAD培养阶段的VFAs的分析
VFAs是厌氧消化中重要的中间产物，其产生和分解过程受多种因素影响，同时也关系到EAD产甲烷过程的稳定性. EAD体系中 VFAs的浓度一旦超过 200 mmol·L−1 就有可能发生酸抑制问题[24]，并对产甲烷过程产生严重的影响，然而本次实验研究并未出现VFAs累积的现象. 图3显示了EAD培养过程中各短链有机酸的变化情况. 从图3可以看出，各短链有机酸的变化与底物补充时间相关，培养前期VFAs波动较大且浓度较高，但15 d后，因阳极上形成了电活性微生物膜，致使VFAs能够在阳极表面降解，尽管进料时间间隔缩短为3 d，也没有产生VFAs累积，表明EAD具有较强的抗酸化的能力.
图 3 EAD运行阶段中VFAs的含量变化Figure 3. Changes in the content of VFAs during the EAD operation stage在厌氧消化中丁酸累积是抑制厌氧消化的重要因素之一，由于丁酸的产氢产乙酸过程必须依赖氢还原CO2产甲烷过程，否则本身不能自发进行，一旦产氢产乙酸和产甲烷过程失衡，将会产生严重的丁酸抑制作用。然而在EAD中丁酸的降解除了依赖氢还原CO2产甲烷过程外，还可以在电活性微生物的作用下，在电极表面降解. 在这条途径中，丁酸分解为CO2、H+和电子， H+向阴极迁移在阴极上获得电子而形成H2，这部分H2同样被氢营养型产甲烷菌利用还原CO2，加强H2还原CO2产甲烷途径.
2.3 代谢网络构建
对于纯培养体系而言，由于体系内菌种单一，代谢产物和途径比较明确，构建与之相对应的代谢网络相对比较容易. 但对于复杂的混合培养而言，特别是像EAD这种由多种微生物构成的体系，变量较多，对于代谢网络的构建及分析难度较大[25]，为了使代谢通量分析能适用于混合体系，提出了“统一微生物”这一个概念[26]，同时国内外一些学者已经在部分混合体系中作了应用上的尝试，并且成功地建立了发酵制氢体系的代谢网络[27]，还有在新型多级厌氧甲烷反应器中也进行了FBA的研究[28]，但还需进一步地完善，才能使其适用于EAD的混合培养体系中. EAD是在AD中引入MEC，由于MEC的引入，使H+向阴极迁移，在阴极上生成H2，这在AD基础上增加了一条重要的产氢途径. 根据相关研究表明[9, 12]，在严格的厌氧条件下，丙酮酸几乎不会流向三羧酸循环，甲酸也不是所有严格厌氧菌都能产生. 结合相关研究[29-33]，构建了如图4所示的EAD代谢网络该网络包含了37个主要的代谢反应式，每一步的代谢的具体生化反应过程如表1所示.
表 1 EAD体系葡萄糖代谢过程包含的主要生化反应Table 1. The main biochemical reactions included in the glucose metabolism process of the EAD systemNO. 反应式 Equation NO. 反应式 Equation R1 GLC+PEP ∀ G6P + Pyr R20 HPr + 2 H2O ∀ HAc + CO2 +3 H2 R2 NADH + Pyr ∀ HLa + NAD R21 HBu + 2 H2O ∀ 2 HAc + 2 H2 R3 Pyr + NADH ∀ NAD + HFo +AcCoA R22 HPr = HPr （ext） R4 2 Fd + Pyr + CoA ∀ CO2 + AcCoA + 2 FdH R23 EtOH+ HPr ∀ Hva （ext） + H2O R5 2 Fd + NADH = 2 FdH + NAD R24 HFo = HFo （ext） R6 NADPH + NAD ⇌ NADH + NADP R25 CO2 = CO2 （ext） R7 2 NADH = H2 + 2 NAD R26 CO2 + 4 H2 = CH4 + 2 H2O R8 2 FdH = H2 + 2 Fd R27 H2 = H2 （ext） R9 HLa = HLa （ext） R28 2 AcCoA + H2 ∀ PrOH（ext） +2 CoA + CO2 R10 HLa + NADH ∀ HPr + NAD R29 HAc ∀ CO2 + CH4 R11 HFo ∀ CO2 + H2 R30 HAc = HAc （ext） R12 AcCoA + ADP + iP ∀ATP + HAc + CoA R31 EtOH = EtOH （ext） R13 AcCoA + 2 NADH ∀ EtOH + CoA + 2 NAD R32 HBu + EtOH ∀ HCa （ext） + H2O R14 2 AcCoA + NADH ⇌ CoA + H2O + CroCoA + NAD R33 HBu = HBu （ext） R15 CroCoA + 2 Fd + NADH ∀ ButCoA + 2 FdH + NAD R34 HBu + 2 NADH ∀ BuOH（ext） + CoA + 2 NAD R16 CroCoA + NADH ∀ ButCoA + NAD R35 Pyr ⇌ Pyr （ext） R17 ButCoA + ADP + iP ∀ HBu + ATP + CoA R36 CH4 = CH4 （ext） R18 2 CO2 + 4 H2 ∀ HAc +2 H2O R37 2 H+ + 2 e- = H2 R19 EtOH + 2H2O ∀ 4 H+ + HAc 注：iP为磷酸根离子，CoA为辅酶A，H+为氢离子，e-为转移电子或者电解协助装置提供的电子. Note: iP is the phosphate ion, CoA is the coenzyme A, H+ is the hydrogen ion, and e- is the electron provided by the transfer electron or electrolysis assistance device. | Show Table
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2.4 电压扰动对EAD产甲烷代谢通量的影响
在培养阶段中，当EAD运行稳定后，从取样口取样，检测残余葡萄糖和相关代谢物的含量，然后添加1 g的葡萄糖，以此时的状态为FBA的初始状态，实施电压扰动. 在对照组电压为1.0 V的基础上，扰动组1电压降低至0.6 V，而扰动组2增加至1.4 V. 14 h后，再次检测残余葡萄糖和相关代谢物，产气量和气体含量. 经过计算得到EAD扰动前后的发酵液中代谢产物的净生成速率，如表2所示.
表 2 EAD体系中关键代谢物的净生成速率①（mmol·L−1·h−1）Table 2. Net formation rate of key metabolites in EAD system①（mmol·L−1·h−1）代谢物Metabolites 对照组1.0 VControl group 1.0 V 扰动组0.6 VDisturbance group 0.6 V 扰动组1.4 VDisturbance group 1.4 V 葡萄糖② 1.1274 ± 0.0154 1.0958 ± 0.0055 1.1195 ± 0.0175 甲 酸 0.0032± 0.0000 0.0086 ± 0.0021 0.0093± 0.0026 乙 酸 0.7511 ± 0.1440 0.5229 ± 0.0770 0.7064 ± 0.1202 丙 酸 0.1061 ± 0.0096 0.0860 ± 0.0049 0.0902 ± 0.0023 丁 酸③ 0.4180± 0.0335 0.4218± 0.0391 0.4026 ± 0.0201 乳 酸 0.0107 ± 0.0046 0.0081 ± 0.0035 0.0128 ± 0.0056 丙酮酸 0.0156 ± 0.0037 0.0335± 0.0074 0.0261 ± 0.0171 戊 酸④ 0.0230 ± 0.0107 0.0107 ± 0.0046 0.0277 ± 0.0093 己 酸 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 乙 醇 0.0173 ± 0.0014 0.0092 ± 0.0019 0.0160 ± 0.0067 丙 醇 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 丁 醇 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 CO2 0.2258 ± 0.0229 0.2255 ± 0.0376 0.2716 ± 0.0071 CH4 0.2947 ± 0.0127 0.4909 ± 0.0515 0.3924 ± 0.0293 H2 0.0281 ± 0.0231 0.0228 ± 0.0137 0.0039 ± 0.0024 注：表2中的实验数据①为电压扰动实验组的主要代谢物的净生成速率；葡萄糖②的测量值代表底物的净摄取速率；丁酸③为正丁酸和异丁酸的总和，戊酸④为正戊酸和异戊酸的总和. Note: The experimental data① in Table 2 are the net production rates of major metabolites in the voltage disturbance group; The measured value of glucose② represents the net uptake rate of substrate; Butyrate③ is the sum of n-butyrate and isobutyrate, valerate④ is the sum of n-valerate and isovalerate. | Show TableDownLoad:
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根据表2中的净生成速率，采用运行Cell Net Analyzer软件，获得EAD代谢通量分布信息，如图4所示，并以H2、CO2、HAc和CH4代谢物进行评价.
在0.6 V扰动下，NADH通量明显优于1.4 V电压扰动，且此条件下最终产物甲烷通量达到43.52，明显高于1.0 V和1.4 V下的26.14和34.81. 由图4可知，H2的代谢途径主要形成途径为：R7、R20、R21和R37. 由通量值可知，EAD中H2主要来源于电极反应R37，和丁酸降解为乙酸的途径R21，其次是NADH平衡调节产氢R7. CH4为最终的目标代谢物，主要由H2还原CO2途径R26和乙酸转化途径R29两条途径形成. EAD体系中CH4的合成途径是以乙酸转化途径占主导地位，其次为H2还原CO2途径，1.0 V下EAD体系的这两条途径的占CH4产生总量的64.95%和35.05%. 0.6 V和1.4 V扰动下，通过H2还原CO2产生的产甲烷（R26）分别占13.44%和12.76%，相比对照组5.97%均有所提高，表明电压扰动使得EAD产甲烷代谢途径偏向了氢营养型产甲烷. 值得注意的EAD产甲烷系统明显产生了甲酸，但根据代谢通量，CH4和H2并无一来源于甲酸，说明EAD反应体系中可能没有噬甲酸型产甲烷菌存在. 最终产物H2大多由EAD中的阴极产生，但在最终产物中，氢气通量明显下降，说明H2还原为CH4（R26）的途径较为活跃. 本次从发酵液代谢物中未检测到己酸、丙醇和己酸盐. 乙酸的来源有R12、R18、R19、R20和R21途径. 通量值表明乙酰辅酶A转化是乙酸最主要的来源，其次是丁酸转化、H2还原CO2、乙醇转化和丙酸转化. 其通量大小受多个中间产物的影响，但在电压扰动（0.6 V和1.4 V）下，其通量明显增大，其中以0.6 V扰动增幅最大，说明反应器中的产酸微生物在此时相对较活跃. 乳酸和乙醇的产生不利于H2的生产，图中0.6 V扰动下的乳酸通量较高，这也可能是导致了H2较低的原因之一.
2.5 酶活水平变化
表3为葡萄糖代谢过程中关键酶活性的变化. 其中ADP/ATP转运酶的活性，0.6 V和1.4 V扰动时的酶活性均高于对照组1.0 V 的239.28 IU·L−1. ADP/ATP是能量代谢的载体，为微生物生长和繁殖提供能量基础. 当电压扰动时，需要大量能量来使微生物群落发生转变，因此ADP/ATP转运酶酶活性增加. 在乙酸代谢途径中首要的是乙酸的活化，它需要由乙酸激酶AK和磷酸转乙酰酶PTA的先后催化来进行. 在ATP参与下由乙酸激酶AK催化，乙酸被磷酸化为乙酰磷酸，然后乙酰磷酸再在磷酸转乙酰酶PTA催化下生成乙酰辅酶A，进行乙酸代谢[34-35]. 但从图5中可以看出，所产生的乙酸大部分都R12途径逆反应生成乙酰辅酶A，其中当进行0.6 V扰动时，R12逆反应通量最大，这与在0.6 V时PTA活性达到115.69 U·L−1检测结果相吻合. 当进行电压扰动时，EAD体系内在乙酸代谢中PTA和AK的酶活调节现象相似，有研究表明[36]当谷氨酸棒杆菌生长在以乙酸（取代葡萄糖）为碳源的培养基上时，PTA和AK酶活性明显提高，该现象是微生物碳代谢中葡萄糖效应的具体体现，表明酶在基因表达环节上可能存在葡萄糖基质上的负调控效应或乙酸基质上的正调控效应. 降低电压，PTA与AK酶活性增加. PTB和BK酶与丁酸产生有关，由图5代谢通量可知，丁酸的产生是从乙酰基通过PTB与BK的共同催化所形成. 在丁酸代谢中，PTB催化反应产生大量的丁酰辅酶A，但产生的丁酸大部分却通过R21转化为乙酸. 在0.6 V扰动下，PTB的酶活性352.19 U·L−1，明显高于对照组310.19 U·L−1和1.4 V的338.04 U·L−1，但BK酶活性，对照组1.0 V的酶活性52.59 U·L−1，要略高于0.6 V的50.92 U·L−1. PTB酶活性高于BK，这是由于PTB需要先将丁酰辅酶A转化为在丁酰磷酸，最终再由BK催生与ADP反应形成丁酸和ATP. 而BK在1.0 V与0.6 V酶活性差异不大，这是可能是由于电压BK影响不大. 辅酶M在甲烷形成的最终反应步骤中充当甲基的载体. CoM的化学结构虽然很简单，但在甲基还原酶的反应体系中却有高度的专一性，因此在进行电压扰动时，辅酶M的酶活性变化差异不大. 值得一提是，MCM酶活性变化与CoM酶活性变化相似. 在丙酮酸转化为丙酸代谢过程中，关键酶为MCM，在电压扰动下，酶活性变化差异较小. 结合图6中的产丙酸代谢通量图可以看出，丙酸通量变化也差异较小，说明酶活性与所构建的代谢通量有较好的相关性. CoF420在产甲烷途径中电子载体，而CoF430产甲烷古菌形成甲烷最后步骤作为甲基载体的四吡咯化合物，因此产甲烷的总通量应当取决于CoF420与CoF430共同酶活性，在0.6 V电压扰动下，总酶活性为63.01 IU·L−1，对照组为56.94 IU·L−1，1.4 V扰动为59.57 IU·L−1，这与图5中产甲烷代谢通量中，0.6 V时产甲烷最多，1.4 V次之，对照组最少结果相吻合.
表 3 代谢途径中关键酶活性水平的变化Table 3. Changes in activity levels of key enzymes in metabolic pathways酶名称Enzyme 对照组1.0 VControl group 1.0 V 扰动组0.6 VDisturbance group 0.6 V 扰动组1.4 VDisturbance group 1.4 V 单位Unit ADP/ATP转运酶 239.28±23.54 337.04±7.88 344.23±7.54 IU·L−1 磷酸转乙酰酶（PTA） 99.78±6.39 115.69±11.32 97.69±7.50 U·L−1 乙酸激酶（AK） 106.26±24.23 151.38±28.81 120.25±28.93 U·L−1 磷酸转丁酰酶（PTB） 310.19±1.29 352.19±12.66 338.04±22.08 U·L−1 丁酸激酶（BK） 52.59±6.63 50.92±0.90 36.08±4.89 U·L−1 辅酶M（CoM） 173.84±17.97 191.01±23.53 176.85±12.82 U·L−1 甲基丙二酰CoA变位酶（MCM） 58.17±4.06 51.71±2.71 54.20±3.09 U·L−1 辅酶F420（CoF420） 40.38±2.22 43.72±4.37 36.86±6.48 IU·L−1 辅酶F430（CoF430） 16.56±2.05 19.29±1.55 22.71±2.14 IU·L−1 | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusion）
本研究通过外加电压对EAD体系扰动过程中代谢通量的影响，对EAD代谢网络通量上的变化结合关键酶活性的变化，进一步分析电压扰动对EAD系统代谢产物生成上的提高或者降低提供理论依据，由通量分析结果可知，EAD体系中并没有很高的H2生成，相反，EAD体系中产甲烷能力得到提高. 原因可能是由于电解协助装置的引入，极大地促进H2的产生，随后，所产生的H2被用来还原CO2产乙酸和产甲烷的代谢过程，进而提升了EAD系统的产甲烷能力. 结合关键节点处酶活性变化，酶活性与代谢通量有着较好的相关性. 在进行电压扰动时，ADP/ATP转运酶、PTA与AK、PTB与BK，这些酶活性均随电压变化而产生较大的差异. 而CoM与MCM酶活性，具有高度专一性的酶，随电压扰动变化不大. 在0.6 V电压扰动下，CoF420与CoF430酶活性与产甲烷代谢通量变化相吻合.
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图 2 3种药物混合物各射线pEC50随时间变化的热图
Figure 2. Heat map of pEC50 for each ray of the 3 binary mixtures of the 3 drugs with time
图 3 3种药物二元混合物的时间-浓度-效应曲线图
Figure 3. Time-concentration-effect curves for binary mixtures of the 3 drugs
图 4 AMP-BCH-TET三元混合物在不同暴露时间的抑菌毒性与组分比的相关性图
Figure 4. Correlation between the inhibition toxicity of AMP-BCH-TET ternary mixtures at different exposure time and component ratios
图 5 AMP-BCH-TET三元混合物的时间-浓度-效应曲线图
Figure 5. Time-concentration-effect curve of AMP-BCH-TET ternary mixture
图 6 3种药品二元混合物的dCA随时间变化曲面图
Figure 6. Surface plot of dCA with time for binary mixtures of the 3 drugs
图 7 AMP-BCH-TET三元混合物的dCA随时间变化曲面图
Figure 7. Surface plot of dCA with time for AMP-BCH-TET ternary mixture
图 8 3种药物及其混合物体系代表射线作用E. coli前后相对空白组的核酸溶出量随时间的变化
Figure 8. Changes in nucleic acid lysis over time before and after the action of representative rays of three drugs and their mixture systems on E. coli relative to a blank control group
图 9 3种药物及其混合物代表射线作用E. coli前后细胞形态的变化
Figure 9. Changes in cell morphology before and after the action of representative rays of three drugs and their mixtures on E. coli
表 1 3种药物的理化性质及其储备液浓度
Table 1. Physicochemical properties of the three drugs and their stock solution concentrations
名称Name 简称Abbreviation 分子式Molecular formula 分子量Molecular weight CAS-RN 纯度Purity 储备液/（mol·L−1）Stock solution 氨苄西林钠Ampicillin sodium AMP C16H18N3NaO4S 371.380 69-52-3 ≥98% 3.45×10−3 盐酸四环素Tetracycline hydrochloride TET C22H25ClN2O8 480.900 64-75-5 ≥98% 1.04×10−3 盐酸小檗碱Berberine chloride hydrate BCH C20H18ClNO4 371.814 141433-60-5 ≥97% 2.15×10−3
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表 2 混合物体系各物质组分浓度比（pi）
Table 2. Concentration ratio of each substance component of the mixture system （pi）
AMP-BCH AMP-TET 射线Ray pAMP pBCH 射线Ray pAMP pTET R1 8.959×10−1 1.041×10−1 R1 9.187×10−1 8.127×10−2 R2 7.750×10−1 2.250×10−1 R2 8.189×10−1 1.811×10−1 R3 6.326×10−1 3.674×10−1 R3 6.933×10−1 3.067×10−1 R4 4.626×10−1 5.374×10−1 R4 5.306×10−1 4.694×10−1 R5 2.562×10−1 7.438×10−1 R5 3.114×10−1 6.886×10−1 TET-BCH AMP-BCH-TET 射线Ray pTET pBCH 射线Ray pAMP pBCH pTET R1 7.920×10−1 2.080×10−1 R1 2.546×10−1 2.831×10−1 4.623×10−1 R2 6.037×10−1 3.963×10−1 R2 3.724×10−1 4.709×10−1 1.567×10−1 R3 4.323×10−1 5.677×10−1 R3 5.388×10−1 8.558×10−2 3.757×10−1 R4 2.758×10−1 7.242×10−1 R4 5.909×10−1 2.326×10−1 4.314×10−1 R5 1.322×10−1 8.678×10−1 R5 4.943×10−1 2.871×10−1 2.186×10−1
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表 3 3种药物的Weibull函数拟合结果及其统计量
Table 3. Fitting results of Weibull function for 3 drugs and their statistics
药物 Drug 时间/h Time α β RMSE r EC50/（mol·L−1） pEC50 AMP 0.25 3.41 1.63 0.023 0.9683 ∞ 0.00 2 4.17 1.45 0.037 0.9831 7.44×10−4 3.13 4 5.26 1.68 0.060 0.9728 4.48×10−4 3.35 8 6.89 2.14 0.075 0.9696 4.07×10−4 3.39 12 7.42 2.39 0.124 0.9417 5.52×10−4 3.26 BCH 0.25 0.13 12 0.057 -0.8805 ∞ 0.00 2 0.14 0.92 0.036 0.5397 ∞ 0.00 4 8.04 2.87 0.074 0.8824 1.18×10−3 2.93 8 7.33 2.14 0.075 0.9697 2.53×10−4 3.60 12 7.46 2.24 0.108 0.9496 3.21×10−4 3.49 TET 0.25 0.01 0.73 0.017 0.5919 ∞ 0.00 2 2.95 0.95 0.067 0.9067 3.23×10−4 3.49 4 5.3 1.5 0.074 0.9519 1.67×10−4 3.78 8 8.74 2.46 0.109 0.9229 1.99×10−4 3.70 12 13.36 3.8 0.142 0.8863 2.44×10−4 3.61
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