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抗凝血灭鼠剂被广泛用于控制共生啮齿动物[1]，其中杀鼠醚因其持久性、生物累积性和毒性，近年来引起了国际上多个组织的关注[2-3]. 暴露在水生环境中、饮用被污染的水或食用含有杀鼠醚残留的食物会对人体健康乃至整个生态系统产生不利影响. 目前，杀鼠醚的检测方法主要包括高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、薄层色谱法[5]、高效液相色谱-质谱法[6]和电喷雾电离串联质谱法[7]. 然而，这些方法都有一定的局限性，对样品纯度有严格的要求，需要繁琐的前处理步骤，对操作人员的技能要求较高[8]. 同时由于仪器体积较大，不适用于现场分析[9]. 因此，迫切需要建立一种杀鼠醚的现场快速检测方法.
表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）可以提供简单、快速和无损的检测，该技术具有高灵敏度和独特的光谱指纹，并且不受水分子的干扰，可以很好地适用于复杂的样品检测分析[10]. 目前，SERS技术已被应用于土壤[1]、水果和蔬菜[11]样品中的常规农药检测，但仍缺乏快速检测抗凝血杀鼠剂的相关报道.
本文建立了一种简单快速的SERS方法，以纳米金作为活性基底，结合便携式拉曼光谱仪，实现了环境水中杀鼠醚的快速现场检测（图1）. 与传统方法相比，该方法灵敏度高，检出限低，回收率良好，仅需3 min即可完成整个检测过程，有望成为现场应急分析的有效手段.
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材料 氯金酸（99.99%）购自中国上海阿拉丁化工有限公司；柠檬酸三钠（99.99%）购自国药化学试剂（上海）有限公司；杀鼠醚（99.4%）购自Dr. Ehrenstorfer（中国北京）；聚沉剂硫酸镁（99.7%）、氯化钙（99.7%）、氯化钾（99.8%）、氯化钠（99.7%）、硝酸铝（99.7%）、硝酸镁（99.7%）购自国药化学试剂有限公司；乙酸乙酯（99.9%）、二氯甲烷（99.5%）、乙腈（99.9%）、正己烷（99.5%）、环己烷（99.5%）购自天津科美尔化学试剂有限公司，三氯乙烷（95%）购自上海振兴第二化工厂；实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水（~18.2 MΩ cm）. 环境水样采自济南市黑虎泉.
仪器 便携式拉曼光谱仪（QE Pro，海洋光学，美国）；岛津2600紫外-可见光（UV-Vis）光谱仪（岛津株式会社，京都，日本）；透射电子显微镜（TEM; JEM-CXII, JEOL Ltd.，东京，日本）.
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纳米金的制备 根据先前的研究，用柠檬酸三钠化学还原氯金酸制备纳米金[12]. 将1 mL 1%的氯金酸加入到99 mL去离子水中，以600 r·min−1的转度搅拌，并加热至沸腾. 随后，加入1 mL 1%的柠檬酸钠溶液. 混合溶液在剧烈搅拌下继续煮沸35 min，使其发生反应，溶液很快变成黑色，然后逐渐合成为砖红色的纳米金胶体溶液.
杀鼠醚溶液的制备 将固体杀鼠醚溶解在乙醇中，配制2 mg·mL−1的杀鼠醚标准储备液. 然后用水稀释储备液配制成标准系列溶液，浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 μg·mL−1. 杀鼠醚的环境水样采用标准添加法制备，浓度为0.025—5 μg·mL−1.
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为了优化SERS信号，本研究并比较了6种盐（氯化钾、氯化钠、硝酸镁、硫酸镁、氯化钙和硝酸铝）对Au NPs的聚集效应. 首先，50 μL杀鼠醚水溶液（1 μg·mL−1）与940 μL Au NPs混合;然后加入10 μL的盐溶液，充分混合5 s，诱导聚沉. 使用配有785 nm波长激光器的便携式拉曼光谱仪采集信号，激光功率设置为500 mW，积分时间为20 s. 选择可以诱导最佳聚集效果的盐作为后续实验的聚沉盐. 通过比较不同浓度盐溶液（0.1、0.25、0.5、1、2 mol·L−1）对信号增强效果的影响，确定最佳聚沉条件. 随后采集连续60 min的SERS信号，选取信号强度稳定的时间点作为聚沉时间.
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透射电子显微镜结果显示，纳米金的粒径为45—60 nm（图2a）.
紫外-可见光谱显示纳米金溶液的吸收峰位于522 nm（图2b）. 将1 μg·mL−1杀鼠醚加入50 μL溶液中，未见明显变化. 相比之下，加入10 μL 0.5 mol·L−1硝酸镁溶液会导致吸收峰显著下降，溶液颜色从砖红色变为紫灰色（图2c插图），表明纳米颗粒发生了团聚[13]. 紫外可见光谱对应的拉曼和SERS信号见图2c和图2d.
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采用便携式拉曼光谱仪采集杀鼠醚固体的拉曼光谱和1 μg·mL−1杀鼠醚溶液的SERS光谱. 杀鼠醚由香豆素与四水萘连接形成（图3结构式）. 香豆素具有活性的羟基官能团，可以通过化学反应生成各种结构的衍生物. 且在杀鼠醚结构中存在着孤对电子，既能与金属离子配位，又能参与氢键的形成. 因此，环境变化也会引起杀鼠醚结构的轻微变化，图3显示了杀鼠醚固体及其溶液间的位移（图3）. 在杀鼠醚溶液中，固体样品在670 cm−1和1007 cm−1处的两个不同的SERS光谱带分别移动到665 cm−1和995 cm−1. 其他几处特征峰也发生了变化，表明杀鼠醚在溶液中的构型发生了改变. 但几个特征峰的出现仍然表明杀鼠醚的存在. 665 cm−1处的特征峰归属于芳香环中的C—C—C[14]，而995 cm−1处的特征峰由C—H振动引起[15]，557 cm−1的SERS谱带主要与苯环呼吸模式有关[16]，885 cm−1的SERS谱带归因于CH2模式[17]，1289 cm−1处主要是由于C—H弯曲模式[16]. 在本研究中，选取SERS信号强度最佳、峰型独立且清晰的995 cm−1处的SERS信号作为定量信号.
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盐离子的加入导致纳米金聚沉，并在相邻纳米颗粒之间形成热点. 基底的性能往往会受到聚沉程度和聚沉时间的影响[18-19]. 为此，本研究对聚沉盐类型、聚沉盐浓度以及聚沉时间等实验参数进行了优化，以提高检测的灵敏性.
聚沉盐种类的影响 比较了6种浓度相同（0.5 mol·L−1）的聚沉盐对1 μg·mL−1杀鼠醚的SERS强度影响（995 cm−1）. 结果表明，硝酸镁对信号的增强作用最为显著，其增强作用顺序为硝酸镁>硫酸镁>硝酸铝>氯化钙>氯化钠>氯化钾（图4）. 先前的研究表明，二价和三价阳离子比一价阳离子能更有效地诱导纳米颗粒的聚沉[20]. 纳米金胶体溶液由于其表面电荷相同且相互排斥而保持稳定. 这种胶体粒子只能在吸附离子和组成吸附层的一些异性离子中带电并稳定. 当向胶体中加入盐时，阳离子或阴离子的浓度增加，导致最初分布在扩散层的异性离子被挤压到吸附层[21]. 这导致扩散层变薄，最终降低了zeta电位的稳定性[22]. 随后，粒子之间的斥力减弱从而引起团聚[23]. 当胶体粒子聚集成更大的粒子时，热点产生，导致表面增强共振，进一步增强拉曼信号[24-25]. 通过上述结果，本研究选择硝酸镁作为聚沉剂用于后续的实验.
聚沉盐浓度的影响 图5a—5d为不同浓度硝酸镁诱导纳米金聚沉后的TEM图像. 加入聚沉盐后，纳米颗粒间隙变小并融合、团聚. 且随加入聚沉剂浓度的增加，纳米颗粒团聚现象越明显. 如图所示，低浓度的硝酸镁导致纳米金聚集不足，而较高浓度的硝酸镁则会导致过度聚沉[26]，这两者都会使得信号增强效果不佳.
本研究比较了5个浓度（0.1、0.25、0.5、1、2 mol·L−1）的硝酸镁对纳米金胶体溶液聚沉的程度，以及对995 cm−1处的特征峰信号强度信号增强的影响. 图5e显示了不同浓度的硝酸镁诱导纳米金聚沉后的紫外-可见光谱变化. 图5f显示，0.5 mol·L−1的硝酸镁可以诱导产生最强的SERS信号. 因此，本研究采用0.5 mol·L−1硝酸镁溶液作为聚沉剂.
图6a记录了使用0.5 mol·L−1硝酸镁诱导聚沉后连续30 min的紫外-可见光谱变化图，从图中可以看出吸光度强度随时间变化不大，说明加入0.5 mol·L−1硝酸镁聚沉后，溶液体系较为稳定.
聚沉时间对SERS信号的影响 本研究记录了加入聚沉剂后的SERS信号时间变化趋势（60 min）. 结果显示，SERS信号在1 min内即可达到最大值，随后缓慢下降，在第3—30 min保持相对稳定. 因此，以3 min为最佳聚沉时间（图6b）. 根据之前的一项研究[27]，在上述优化的条件下，平均增强因子计算为1.29×105. 具体计算公式如下：
AEF = （ISERS/CSERS）/（IRS/CRS）
其中，IRS代表的是非SERS条件下浓度为CRS的待测物溶液的拉曼强度，ISERS代表的是SERS基底上相同待测物的拉曼强度，浓度CSERS可能不同.
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在纳米金中加入不同浓度梯度的杀鼠醚溶液，使用便携式拉曼光谱仪进行SERS检测. 图7a显示，杀鼠醚最显著的SERS峰位于995 cm−1处，该特征峰的强度随着浓度的增加显著增加. 图7b显示了995 cm−1处拉曼光谱强度与对数浓度的定量校准曲线. 在0.025—5 μg·mL−1范围内，杀鼠醚溶液浓度与SERS信号值呈明显的线性关系（R2 = 0.990），可以满足定量检测要求.
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为了验证所提出的SERS方法的可行性和实用性，在加标的真实环境水中进行了杀鼠醚检测. 使用便携式拉曼光谱仪可以直接采集杀鼠醚的信号，无需样品预处理，3 min内即可完成定性和定量检测. 995 cm−1处的SERS信号强度随着杀鼠醚浓度的增加而增加，与标准水溶液中的趋势相似（图7c），并且两者之间线性关系良好（图7d）.
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获得重复稳定的SERS信号是评估基底性能的关键参数. 本研究选择浓度为0.05 μg·mL−1和1 μg·mL−1的杀鼠醚溶液，采用同批次的SERS基底，在不同时间内进行了21次平行实验. 由图8a和图8b可知，1 μg·mL−1和0.05 μg·mL−1对应的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）分别为6.81%和9.00%. 这些结果表明，该基底可以提供高重复性的结果. 此外，为了确定所制备基底在实际加标水中的重现性，比较了8个不同批次和同一批次使用该基底的检测效果，发现RSD均在10%以内（图8c—8d），良好的重复性和重现性有助于保证该SERS方法的稳定性.
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用建立的SERS方法对环境水中杀鼠醚的加标回收率及检出限进行了测定. 制备已知浓度的加标杀鼠醚溶液，以模拟受污染水中杀鼠醚的含量. 测得水中平均回收率为90.2%—98.2%，相对标准偏差为2.69%—6.40% （n=8）（表1）. 按照常规计算方法[28]，计算出本方法在真实水样中的检出限为1.53 ng·mL−1. 结果表明，该方法可作为环境水中杀鼠醚现场检测的一种有效手段.
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环境水中可能存在其他种类的混合农药残留，因此通过对几种潜在共存的农药（大隆、鼠得克、敌草快和福美双）进行SERS检测（图9），评估了在本方法对杀鼠醚的选择性. 结果显示，几类农药的SERS谱带各不相同，展示了拉曼技术获取化合物指纹谱的优点，信号来源如表2所示[29-30]. 同时，由于其他物质在995 cm−1处均未出现明显的SERS信号，因此不会对杀鼠醚的定量检测造成影响. 由于杀鼠醚所产生的SERS峰强度最高，说明本研究制备的纳米金基底对杀鼠醚具有良好的信号增强效果.
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本文建立了一种快速的定性和定量检测环境水中杀鼠醚的SERS方法. 通过对实验条件进行优化，该技术测得环境水中的检出限为1.53 ng·mL−1，加标回收率为90.2%—98.2%，相对标椎偏差在2.69%—6.40%之间. 本方法简单、快速，仅需3 min即可完成检测，仪器可便携，不受场地限制. 此高灵敏度、高特异性的检测方法可以为杀鼠醚环境水污染事故的现场应急分析提供一种便捷的检测手段.
基于表面增强拉曼光谱技术的环境水样中杀鼠醚的现场快速检测方法
Rapid on-site detection of coumatetralyl in environmental water based on surface-enhanced Raman spectroscopy
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摘要: 杀鼠醚在水环境中的蓄积可对生态系统造成破坏，并对人体健康产生不利影响. 本文利用表面增强拉曼光谱（SERS）技术，构建环境水中杀鼠醚的简单、快速定性及定量检测分析方法. 采用化学合成法制备了粒径为45—60 nm的纳米金作为SERS活性基底，以便携式拉曼光谱仪作为检测平台，实现了3 min内完成环境水中杀鼠醚的检测. 通过对实验条件进行优化，该方法的检出限低至1.53 ng·mL−1，加标回收率为90.2%—98.2%. 在浓度为0.025—5 μg·mL−1范围内，杀鼠醚浓度与SERS信号强度间呈现出良好的线性关系，R2 = 0.990. 与传统方法相比，该方法操作简单、快速、成本低廉，为水中杀鼠醚的现场检测分析提供了可靠的新选择.Abstract: The accumulation of coumatetralyl (CMTT) in the aquatic environment has caused damage to the ecosystem and adversely affected human health. In this paper, a simple and rapid qualitative and quantitative analysis of CMTT in environmental water was carried out using surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). Gold nanoparticles with a particle size of 45—60 nm were prepared by chemical synthesis method and used as SERS substrate. Combined with a portable Raman spectrometer, the whole detection process could be completed within 3 minutes. By optimizing the experimental conditions, the detection limit of this method was 1.53 ng·mL−1, and the recovery was 90.2%—98.2%. In the range of 0.025—5 μg·mL−1, the response between the concentration of CMTT and SERS signal intensity showed a clear linear dependence, R2 = 0.990. Compared with the traditional method, this method was simple, rapid and low-cost, providing a reliable application scenario for detecting and analyzing CMTT in water.
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抗凝血灭鼠剂被广泛用于控制共生啮齿动物[1]，其中杀鼠醚因其持久性、生物累积性和毒性，近年来引起了国际上多个组织的关注[2-3]. 暴露在水生环境中、饮用被污染的水或食用含有杀鼠醚残留的食物会对人体健康乃至整个生态系统产生不利影响. 目前，杀鼠醚的检测方法主要包括高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、薄层色谱法[5]、高效液相色谱-质谱法[6]和电喷雾电离串联质谱法[7]. 然而，这些方法都有一定的局限性，对样品纯度有严格的要求，需要繁琐的前处理步骤，对操作人员的技能要求较高[8]. 同时由于仪器体积较大，不适用于现场分析[9]. 因此，迫切需要建立一种杀鼠醚的现场快速检测方法.
表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）可以提供简单、快速和无损的检测，该技术具有高灵敏度和独特的光谱指纹，并且不受水分子的干扰，可以很好地适用于复杂的样品检测分析[10]. 目前，SERS技术已被应用于土壤[1]、水果和蔬菜[11]样品中的常规农药检测，但仍缺乏快速检测抗凝血杀鼠剂的相关报道.
本文建立了一种简单快速的SERS方法，以纳米金作为活性基底，结合便携式拉曼光谱仪，实现了环境水中杀鼠醚的快速现场检测（图1）. 与传统方法相比，该方法灵敏度高，检出限低，回收率良好，仅需3 min即可完成整个检测过程，有望成为现场应急分析的有效手段.
图 1 环境水中杀鼠醚的SERS检测示意图Figure 1. Schematic illustration for the SERS detection of coumatetralyl （CMTT） in environmental water1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 材料和仪器
材料 氯金酸（99.99%）购自中国上海阿拉丁化工有限公司；柠檬酸三钠（99.99%）购自国药化学试剂（上海）有限公司；杀鼠醚（99.4%）购自Dr. Ehrenstorfer（中国北京）；聚沉剂硫酸镁（99.7%）、氯化钙（99.7%）、氯化钾（99.8%）、氯化钠（99.7%）、硝酸铝（99.7%）、硝酸镁（99.7%）购自国药化学试剂有限公司；乙酸乙酯（99.9%）、二氯甲烷（99.5%）、乙腈（99.9%）、正己烷（99.5%）、环己烷（99.5%）购自天津科美尔化学试剂有限公司，三氯乙烷（95%）购自上海振兴第二化工厂；实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水（~18.2 MΩ cm）. 环境水样采自济南市黑虎泉.
仪器 便携式拉曼光谱仪（QE Pro，海洋光学，美国）；岛津2600紫外-可见光（UV-Vis）光谱仪（岛津株式会社，京都，日本）；透射电子显微镜（TEM; JEM-CXII, JEOL Ltd.，东京，日本）.
1.2 实验方法
纳米金的制备 根据先前的研究，用柠檬酸三钠化学还原氯金酸制备纳米金[12]. 将1 mL 1%的氯金酸加入到99 mL去离子水中，以600 r·min−1的转度搅拌，并加热至沸腾. 随后，加入1 mL 1%的柠檬酸钠溶液. 混合溶液在剧烈搅拌下继续煮沸35 min，使其发生反应，溶液很快变成黑色，然后逐渐合成为砖红色的纳米金胶体溶液.
杀鼠醚溶液的制备 将固体杀鼠醚溶解在乙醇中，配制2 mg·mL−1的杀鼠醚标准储备液. 然后用水稀释储备液配制成标准系列溶液，浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 μg·mL−1. 杀鼠醚的环境水样采用标准添加法制备，浓度为0.025—5 μg·mL−1.
1.3 实验条件的优化
为了优化SERS信号，本研究并比较了6种盐（氯化钾、氯化钠、硝酸镁、硫酸镁、氯化钙和硝酸铝）对Au NPs的聚集效应. 首先，50 μL杀鼠醚水溶液（1 μg·mL−1）与940 μL Au NPs混合;然后加入10 μL的盐溶液，充分混合5 s，诱导聚沉. 使用配有785 nm波长激光器的便携式拉曼光谱仪采集信号，激光功率设置为500 mW，积分时间为20 s. 选择可以诱导最佳聚集效果的盐作为后续实验的聚沉盐. 通过比较不同浓度盐溶液（0.1、0.25、0.5、1、2 mol·L−1）对信号增强效果的影响，确定最佳聚沉条件. 随后采集连续60 min的SERS信号，选取信号强度稳定的时间点作为聚沉时间.
2. 结果和讨论（Results and discussion）
2.1 纳米金的表征
透射电子显微镜结果显示，纳米金的粒径为45—60 nm（图2a）.
图 2 （a）本研究制备的纳米金透射电镜图；（b）纳米金、1 μg·mL−1杀鼠醚混合纳米金的紫外-可见光谱；（c）将1 μg·mL−1杀鼠醚与纳米金混合液加入硝酸镁聚沉后的紫外-可见光谱（插图显示纳米金胶体聚沉前后的颜色变化）;（d） （b）和（c）对应溶液的SERS强度Figure 2. （a） TEM image of Gold nanoparticles （Au NPs） prepared in this study; （b） UV-Vis spectra of colloidal Au NPs, Au NPs mixed with 1 μg·mL−1 CMTT; （c） UV-Vis spectra of aggregated Au NPs after adding 10 μL of 0.5 mol·L−1 Mg(NO3)2 （The inset shows the color change of Au NPs before and after aggregation）; （d） SERS intensity of the solutions corresponding to （b） and （c）紫外-可见光谱显示纳米金溶液的吸收峰位于522 nm（图2b）. 将1 μg·mL−1杀鼠醚加入50 μL溶液中，未见明显变化. 相比之下，加入10 μL 0.5 mol·L−1硝酸镁溶液会导致吸收峰显著下降，溶液颜色从砖红色变为紫灰色（图2c插图），表明纳米颗粒发生了团聚[13]. 紫外可见光谱对应的拉曼和SERS信号见图2c和图2d.
2.2 杀鼠醚的拉曼表征
采用便携式拉曼光谱仪采集杀鼠醚固体的拉曼光谱和1 μg·mL−1杀鼠醚溶液的SERS光谱. 杀鼠醚由香豆素与四水萘连接形成（图3结构式）. 香豆素具有活性的羟基官能团，可以通过化学反应生成各种结构的衍生物. 且在杀鼠醚结构中存在着孤对电子，既能与金属离子配位，又能参与氢键的形成. 因此，环境变化也会引起杀鼠醚结构的轻微变化，图3显示了杀鼠醚固体及其溶液间的位移（图3）. 在杀鼠醚溶液中，固体样品在670 cm−1和1007 cm−1处的两个不同的SERS光谱带分别移动到665 cm−1和995 cm−1. 其他几处特征峰也发生了变化，表明杀鼠醚在溶液中的构型发生了改变. 但几个特征峰的出现仍然表明杀鼠醚的存在. 665 cm−1处的特征峰归属于芳香环中的C—C—C[14]，而995 cm−1处的特征峰由C—H振动引起[15]，557 cm−1的SERS谱带主要与苯环呼吸模式有关[16]，885 cm−1的SERS谱带归因于CH2模式[17]，1289 cm−1处主要是由于C—H弯曲模式[16]. 在本研究中，选取SERS信号强度最佳、峰型独立且清晰的995 cm−1处的SERS信号作为定量信号.
图 3 杀鼠醚的化学结构，固体杀鼠醚的拉曼光谱和杀鼠醚溶液（1 μg·mL−1）的SERS光谱Figure 3. Chemical structure of CMTT, typical Raman spectrum of solid CMTT and SERS spectrum of CMTT solution （1 μg·mL−1）2.3 聚沉条件
盐离子的加入导致纳米金聚沉，并在相邻纳米颗粒之间形成热点. 基底的性能往往会受到聚沉程度和聚沉时间的影响[18-19]. 为此，本研究对聚沉盐类型、聚沉盐浓度以及聚沉时间等实验参数进行了优化，以提高检测的灵敏性.
聚沉盐种类的影响 比较了6种浓度相同（0.5 mol·L−1）的聚沉盐对1 μg·mL−1杀鼠醚的SERS强度影响（995 cm−1）. 结果表明，硝酸镁对信号的增强作用最为显著，其增强作用顺序为硝酸镁>硫酸镁>硝酸铝>氯化钙>氯化钠>氯化钾（图4）. 先前的研究表明，二价和三价阳离子比一价阳离子能更有效地诱导纳米颗粒的聚沉[20]. 纳米金胶体溶液由于其表面电荷相同且相互排斥而保持稳定. 这种胶体粒子只能在吸附离子和组成吸附层的一些异性离子中带电并稳定. 当向胶体中加入盐时，阳离子或阴离子的浓度增加，导致最初分布在扩散层的异性离子被挤压到吸附层[21]. 这导致扩散层变薄，最终降低了zeta电位的稳定性[22]. 随后，粒子之间的斥力减弱从而引起团聚[23]. 当胶体粒子聚集成更大的粒子时，热点产生，导致表面增强共振，进一步增强拉曼信号[24-25]. 通过上述结果，本研究选择硝酸镁作为聚沉剂用于后续的实验.
图 4 不同聚沉盐对995 cm−1处SERS信号强度的影响Figure 4. Effects of different aggregating salts on SERS signal intensity at 995 cm−1聚沉盐浓度的影响 图5a—5d为不同浓度硝酸镁诱导纳米金聚沉后的TEM图像. 加入聚沉盐后，纳米颗粒间隙变小并融合、团聚. 且随加入聚沉剂浓度的增加，纳米颗粒团聚现象越明显. 如图所示，低浓度的硝酸镁导致纳米金聚集不足，而较高浓度的硝酸镁则会导致过度聚沉[26]，这两者都会使得信号增强效果不佳.
图 5 加入0.1 mol·L−1（a）、0.25 mol·L−1（b）、0.5 mol·L−1（c）、1 mol·L−1（d）硝酸镁聚沉后纳米金的TEM图像；（e） 加入不同浓度硝酸镁聚沉纳米金的紫外-可见光谱；（f）不同浓度的硝酸镁对995 cm−1处的SERS强度影响Figure 5. TEM image of Au NPs after adding 0.1 mol·L−1 （a）, 0.25 mol·L−1 （b）, 0.5 mol·L−1 （c） and 1 mol·L−1 （d） Mg（NO3）2; （e） UV-Vis spectra of Au NPs with different concentrations of Mg（NO3）2; （f） SERS intensity at 995 cm−1 induced by different concentrations of Mg（NO3）2本研究比较了5个浓度（0.1、0.25、0.5、1、2 mol·L−1）的硝酸镁对纳米金胶体溶液聚沉的程度，以及对995 cm−1处的特征峰信号强度信号增强的影响. 图5e显示了不同浓度的硝酸镁诱导纳米金聚沉后的紫外-可见光谱变化. 图5f显示，0.5 mol·L−1的硝酸镁可以诱导产生最强的SERS信号. 因此，本研究采用0.5 mol·L−1硝酸镁溶液作为聚沉剂.
图6a记录了使用0.5 mol·L−1硝酸镁诱导聚沉后连续30 min的紫外-可见光谱变化图，从图中可以看出吸光度强度随时间变化不大，说明加入0.5 mol·L−1硝酸镁聚沉后，溶液体系较为稳定.
图 6 （a） 加入0.5 mol L−1硝酸镁聚沉纳米金后30 min的紫外-可见光谱变化；（b）杀鼠醚水溶液60 min的SERS光谱变化Figure 6. （a） UV-Vis spectra of Au NPs added with 0.5 mol L−1 Mg（NO3）2 for 30 min; （b） A 60-min evolution ofS SERS spectra of aqueous CMTT聚沉时间对SERS信号的影响 本研究记录了加入聚沉剂后的SERS信号时间变化趋势（60 min）. 结果显示，SERS信号在1 min内即可达到最大值，随后缓慢下降，在第3—30 min保持相对稳定. 因此，以3 min为最佳聚沉时间（图6b）. 根据之前的一项研究[27]，在上述优化的条件下，平均增强因子计算为1.29×105. 具体计算公式如下：
AEF = （ISERS/CSERS）/（IRS/CRS）
其中，IRS代表的是非SERS条件下浓度为CRS的待测物溶液的拉曼强度，ISERS代表的是SERS基底上相同待测物的拉曼强度，浓度CSERS可能不同.
2.4 杀鼠醚溶液的测定
在纳米金中加入不同浓度梯度的杀鼠醚溶液，使用便携式拉曼光谱仪进行SERS检测. 图7a显示，杀鼠醚最显著的SERS峰位于995 cm−1处，该特征峰的强度随着浓度的增加显著增加. 图7b显示了995 cm−1处拉曼光谱强度与对数浓度的定量校准曲线. 在0.025—5 μg·mL−1范围内，杀鼠醚溶液浓度与SERS信号值呈明显的线性关系（R2 = 0.990），可以满足定量检测要求.
图 7 （a）不同浓度杀鼠醚溶液的SERS检测；（b）杀鼠醚SERS峰强度随浓度变化的曲线；（c）水样中不同浓度杀鼠醚的SERS检测；（d）水样中杀鼠醚SERS峰强度随浓度变化的曲线Figure 7. （a） SERS detection of CMTT aqueous solution with different concentrations; Calibration curve for different CMTT; （c） SERS detection of CMTT with different concentrations in water samples; Calibration curve for different CMTT in water samples2.5 环境水样的测定
为了验证所提出的SERS方法的可行性和实用性，在加标的真实环境水中进行了杀鼠醚检测. 使用便携式拉曼光谱仪可以直接采集杀鼠醚的信号，无需样品预处理，3 min内即可完成定性和定量检测. 995 cm−1处的SERS信号强度随着杀鼠醚浓度的增加而增加，与标准水溶液中的趋势相似（图7c），并且两者之间线性关系良好（图7d）.
2.6 基底的重现性与重复性
获得重复稳定的SERS信号是评估基底性能的关键参数. 本研究选择浓度为0.05 μg·mL−1和1 μg·mL−1的杀鼠醚溶液，采用同批次的SERS基底，在不同时间内进行了21次平行实验. 由图8a和图8b可知，1 μg·mL−1和0.05 μg·mL−1对应的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）分别为6.81%和9.00%. 这些结果表明，该基底可以提供高重复性的结果. 此外，为了确定所制备基底在实际加标水中的重现性，比较了8个不同批次和同一批次使用该基底的检测效果，发现RSD均在10%以内（图8c—8d），良好的重复性和重现性有助于保证该SERS方法的稳定性.
图 8 使用同批次纳米金在21 d内测定（a）1 μg·mL−1和（b）0.05 μg·mL−1杀鼠醚在995 cm−1处的SERS强度；（c）8个不同批次纳米金检测加标水样中0.25 μg·mL−1杀鼠醚在995 cm−1处的SERS强度；（d）同批次纳米金检测加标水样中0.25 μg·mL−1杀鼠醚在995 cm−1处的SERS强度Figure 8. SERS intensity at 995 cm−1 of （a） 1 and （b） 0.05 μg·mL−1 CMTT acquired over 21 d using the same batch of Au NPs; （c） SERS intensity at 995 cm−1 of 0.25 μg·mL−1 CMTT in spiked water using eight batches of Au NPs; （d） SERS intensity at 995 cm−1 of 0.25 μg·mL−1 CMTT in spiked water generated by the same batch of Au NPs2.7 加标回收率和检出限
用建立的SERS方法对环境水中杀鼠醚的加标回收率及检出限进行了测定. 制备已知浓度的加标杀鼠醚溶液，以模拟受污染水中杀鼠醚的含量. 测得水中平均回收率为90.2%—98.2%，相对标准偏差为2.69%—6.40% （n=8）（表1）. 按照常规计算方法[28]，计算出本方法在真实水样中的检出限为1.53 ng·mL−1. 结果表明，该方法可作为环境水中杀鼠醚现场检测的一种有效手段.
表 1 环境水中不同浓度杀鼠醚的平均回收率Table 1. Average recoveries of different CMTT concentrations in spiked environmental water加标量/（μg·mL−1）Added 回收量±标准差/（μg·mL−1）Found ± SD 回收率/%Recovery 相对标准偏差/%RSD 0.50 0.48 ± 0.12 96.4 6.40 1.00 0.90 ± 0.12 90.2 2.86 2.50 2.46 ± 0.36 98.2 2.69 | Show Table
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2.8 方法的选择性
环境水中可能存在其他种类的混合农药残留，因此通过对几种潜在共存的农药（大隆、鼠得克、敌草快和福美双）进行SERS检测（图9），评估了在本方法对杀鼠醚的选择性. 结果显示，几类农药的SERS谱带各不相同，展示了拉曼技术获取化合物指纹谱的优点，信号来源如表2所示[29-30]. 同时，由于其他物质在995 cm−1处均未出现明显的SERS信号，因此不会对杀鼠醚的定量检测造成影响. 由于杀鼠醚所产生的SERS峰强度最高，说明本研究制备的纳米金基底对杀鼠醚具有良好的信号增强效果.
表 2 各农药对应SERS谱带的分配Table 2. The Assignation of SERS spectral bands corresponding to each pesticide表面增强拉曼光谱位移/cm−1SERS shift 归属结构Assignation 563 C—C—C弯曲振动 939 C—O/C—H弯曲振动 1028 C—O弯曲振动/C—C拉伸振动 1044 C—O弯曲振动/C—C拉伸振动 1145 H—C—H弯曲振动/CH2扭转 1193 C—H平面弯曲 1323 H—C—H/CH3/CH2/CH弯曲振动 1379 H—C—H/CH2扭转 | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusion）
本文建立了一种快速的定性和定量检测环境水中杀鼠醚的SERS方法. 通过对实验条件进行优化，该技术测得环境水中的检出限为1.53 ng·mL−1，加标回收率为90.2%—98.2%，相对标椎偏差在2.69%—6.40%之间. 本方法简单、快速，仅需3 min即可完成检测，仪器可便携，不受场地限制. 此高灵敏度、高特异性的检测方法可以为杀鼠醚环境水污染事故的现场应急分析提供一种便捷的检测手段.
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图 1 环境水中杀鼠醚的SERS检测示意图
Figure 1. Schematic illustration for the SERS detection of coumatetralyl （CMTT） in environmental water
图 2 （a）本研究制备的纳米金透射电镜图；（b）纳米金、1 μg·mL−1杀鼠醚混合纳米金的紫外-可见光谱；（c）将1 μg·mL−1杀鼠醚与纳米金混合液加入硝酸镁聚沉后的紫外-可见光谱（插图显示纳米金胶体聚沉前后的颜色变化）;（d） （b）和（c）对应溶液的SERS强度
Figure 2. （a） TEM image of Gold nanoparticles （Au NPs） prepared in this study; （b） UV-Vis spectra of colloidal Au NPs, Au NPs mixed with 1 μg·mL−1 CMTT; （c） UV-Vis spectra of aggregated Au NPs after adding 10 μL of 0.5 mol·L−1 Mg(NO3)2 （The inset shows the color change of Au NPs before and after aggregation）; （d） SERS intensity of the solutions corresponding to （b） and （c）
图 3 杀鼠醚的化学结构，固体杀鼠醚的拉曼光谱和杀鼠醚溶液（1 μg·mL−1）的SERS光谱
Figure 3. Chemical structure of CMTT, typical Raman spectrum of solid CMTT and SERS spectrum of CMTT solution （1 μg·mL−1）
图 4 不同聚沉盐对995 cm−1处SERS信号强度的影响
Figure 4. Effects of different aggregating salts on SERS signal intensity at 995 cm−1
图 5 加入0.1 mol·L−1（a）、0.25 mol·L−1（b）、0.5 mol·L−1（c）、1 mol·L−1（d）硝酸镁聚沉后纳米金的TEM图像；（e） 加入不同浓度硝酸镁聚沉纳米金的紫外-可见光谱；（f）不同浓度的硝酸镁对995 cm−1处的SERS强度影响
Figure 5. TEM image of Au NPs after adding 0.1 mol·L−1 （a）, 0.25 mol·L−1 （b）, 0.5 mol·L−1 （c） and 1 mol·L−1 （d） Mg（NO3）2; （e） UV-Vis spectra of Au NPs with different concentrations of Mg（NO3）2; （f） SERS intensity at 995 cm−1 induced by different concentrations of Mg（NO3）2
图 6 （a） 加入0.5 mol L−1硝酸镁聚沉纳米金后30 min的紫外-可见光谱变化；（b）杀鼠醚水溶液60 min的SERS光谱变化
Figure 6. （a） UV-Vis spectra of Au NPs added with 0.5 mol L−1 Mg（NO3）2 for 30 min; （b） A 60-min evolution ofS SERS spectra of aqueous CMTT
图 7 （a）不同浓度杀鼠醚溶液的SERS检测；（b）杀鼠醚SERS峰强度随浓度变化的曲线；（c）水样中不同浓度杀鼠醚的SERS检测；（d）水样中杀鼠醚SERS峰强度随浓度变化的曲线
Figure 7. （a） SERS detection of CMTT aqueous solution with different concentrations; Calibration curve for different CMTT; （c） SERS detection of CMTT with different concentrations in water samples; Calibration curve for different CMTT in water samples
图 8 使用同批次纳米金在21 d内测定（a）1 μg·mL−1和（b）0.05 μg·mL−1杀鼠醚在995 cm−1处的SERS强度；（c）8个不同批次纳米金检测加标水样中0.25 μg·mL−1杀鼠醚在995 cm−1处的SERS强度；（d）同批次纳米金检测加标水样中0.25 μg·mL−1杀鼠醚在995 cm−1处的SERS强度
Figure 8. SERS intensity at 995 cm−1 of （a） 1 and （b） 0.05 μg·mL−1 CMTT acquired over 21 d using the same batch of Au NPs; （c） SERS intensity at 995 cm−1 of 0.25 μg·mL−1 CMTT in spiked water using eight batches of Au NPs; （d） SERS intensity at 995 cm−1 of 0.25 μg·mL−1 CMTT in spiked water generated by the same batch of Au NPs
表 1 环境水中不同浓度杀鼠醚的平均回收率
Table 1. Average recoveries of different CMTT concentrations in spiked environmental water
加标量/（μg·mL−1）Added 回收量±标准差/（μg·mL−1）Found ± SD 回收率/%Recovery 相对标准偏差/%RSD 0.50 0.48 ± 0.12 96.4 6.40 1.00 0.90 ± 0.12 90.2 2.86 2.50 2.46 ± 0.36 98.2 2.69
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表 2 各农药对应SERS谱带的分配
Table 2. The Assignation of SERS spectral bands corresponding to each pesticide
表面增强拉曼光谱位移/cm−1SERS shift 归属结构Assignation 563 C—C—C弯曲振动 939 C—O/C—H弯曲振动 1028 C—O弯曲振动/C—C拉伸振动 1044 C—O弯曲振动/C—C拉伸振动 1145 H—C—H弯曲振动/CH2扭转 1193 C—H平面弯曲 1323 H—C—H/CH3/CH2/CH弯曲振动 1379 H—C—H/CH2扭转
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