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铬（chromium, Cr）是一种广泛存在于自然环境中的过渡金属元素，同时也是一种毒性较强的重金属污染物，可通过物质循环过程进入食物链后在人体内蓄积，从而导致人体机能出现功能性障碍和不可逆转性损伤，对人体健康构成潜在威胁[1-2]. 随着工业的快速发展，重金属Cr及其化合物作为重要的基础原料被广泛应用于电镀、印染、鞣革、化工等行业，但由于生产过程中大量含Cr废弃物的随意排放，造成土壤Cr污染问题日益严重[3]. 污染土壤中Cr元素进入人体的途径包括无意口部摄入、饮食摄入、呼吸和皮肤接触等，其中通过食物链传递作用形成的饮食摄入常被认为是土壤Cr进入人体的主要途径[4]. 作为人们日常饮食中重要的组成部分，蔬菜在为人体提供多种维生素和矿物质的同时，也成为土壤Cr元素迁移与生物富集过程中重要的载体. 长期摄入受重金属Cr污染的蔬菜会导致Cr元素积累在肺、肝、肾和分泌腺中，对人体肝、肾等器官和DNA造成损伤，甚至可能会产生致癌效应[5-6]. 因此，开展蔬菜中重金属Cr的人体健康风险的科学评估具有重要意义.
近年来，体外试验（食物基质中污染物溶解于胃肠消化液中且能被人体所吸收最大部分，即生物可给性）被国内外学者广泛应用于食物中重金属的人体健康风险研究中[7]. 因体外试验（in vitro）具有较强的可控性和重复性，且试验周期短和实际应用中不受限制等优点，在国际上已逐步形成了一套较为完善的人体健康风险评估体系[8]. 但目前大多数应用in vitro开展的健康风险评估主要基于胃和小肠阶段中重金属生物可给性，未考虑到结肠阶段. 通常认为，小肠作为人体的主要吸收器官，食物基质中重金属溶出后基本被小肠中的肠壁细胞吸收[9]；但食物基质中未溶出的重金属可随食糜进入人体的大肠，即人体结肠阶段. 人体结肠中存在大量的肠道微生物（至少约1000种不同类型的微生物，菌落总数达到1×1014），这些微生物具有较强的代谢能力，在人体消化过程中对于食物残渣中重金属元素的代谢具有影响[10]. 由此可见，未考虑结肠阶段食物中重金属生物可给性的人体健康风险评估方法是不够全面的. SHIME模型是一种体外条件下动态模拟人体胃肠环境及微生物生态系统[11]. 目前，国内外学者利用该体外模型报道了肠道微生物对土壤和稻米中Cr的代谢影响[12-13]，但有关利用SHIME模型研究肠道微生物对于矿区常见蔬菜中重金属Cr的生物可给性及人体健康风险的影响鲜有报道.
本文的主要研究内容为：（1）以铅锌矿区4种蔬菜为研究对象，分析蔬菜样品在生和煮熟两种不同条件下重金属Cr的含量；（2）采用体外方法（PBET[14]联合SHIME模型）测定蔬菜中Cr在胃、小肠和结肠阶段的生物可给性，并分析两名不同宿主肠道微生物对Cr的代谢影响；（3）运用人体健康风险评估模型评估当地居民膳食暴露风险，并对比基于Cr总量和生物可给性的人体健康风险. 研究结果将对更全面地进行膳食重金属暴露的健康风险评估起到推动作用，也对今后开展基于肠道微生物的人群健康效应研究提供参考.
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供试蔬菜样品于2020年9月采自贵州某铅锌矿区内周边居民蔬菜种植地（104º 13′—105º 1′E，26º 47′—27º 27′ N）. 在设置的采样区内采用五点取样法，通过连根拔起的采摘方式随机采集点位上的大小均匀的蔬菜植株（5—10 株）并避开遭受病虫害的样本，现场混合均匀后取1 kg作为该采样点的1个蔬菜样本并贴上标签，装入便携式冷藏箱中. 采集的样品包含辣椒（Capsicum annuum L.）（n=14）、芥菜（Brassica juncea（L.）Czern. et Coss）（n=10）、小白菜（Brassica chinensis L.）（n=7）和甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）（n=4）4种当地居民常见种植和经常食用的蔬菜,共计35个蔬菜样品.
当日运回的新鲜蔬菜样品在实验室用去离子水清洗掉表面土壤和浮尘后，分取可食用部分后再用去离子水清洗3次，室温沥干表面附着水份，然后称取蔬菜可食用部分于100 ℃纯水中煮沸5 min，作为熟蔬菜样品[15]；同时将生鲜蔬菜样品可食用部分置于100 ℃烘箱中杀青15 min，随后将生熟两种蔬菜样品分别置于70 ℃烘箱中低温烘干、切碎、研磨、过100目筛网后装入密封保存袋备用[16].
蔬菜样品的消解方法根据国家标准（GB 5009.123—2014），经HNO3-HClO4（9:1, V:V，优级纯）溶液消解，并采用电感耦合等离子体发射光谱（inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES）（ICAP 7400，Thermo Scientific公司，美国）测定样品中Cr含量. 为确保实验数据的准确可靠性，同一批次消解过程中加入国家标准物质（GBW10036，中国计量科学研究院，Cr：0.105 mg·kg−1）、空白样品和平行样品进行质量控制，标准物质的平均回收率为98.9%（92.3%—102.8%），其结果符合质控要求.
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本研究使用的in vitro实验方法为PBET法（胃和小肠阶段）结合SHIME模型（结肠阶段），其中结肠阶段中肠道微生物样本来源于两名健康宿主（1名6岁儿童与1名24岁成人）的新鲜粪便样品（两名自愿者在本实验开始前6个月均未服用抗生素等药物）. 将含有大量结肠微生物的新鲜粪便菌液分别接种于SHIME模型的结肠阶段，并利用智能溶出仪（RC-6）进行培养. 培养期间，每天定时向溶出罐中输入食物营养液，同时实时调节pH和搅拌速率，恒温水浴槽维持37 ℃恒温状态. 每6 小时向溶出罐中通入氮气以保证定植过程中的厌氧环境. 经过3周至4周的培养，结肠阶段肠道微生物的发酵活性（乙酸（1748.10±51.11） mg∙L−1，丙酸（530.60±22.07） mg∙L−1）和群落组成（包含（8.69±0.12） lg CFU∙mL−1总好氧菌、（7.62±0.09） lg CFU∙mL−1总厌氧菌）符合后续开展的实验要求[17-18]. 实验具体步骤如下：
（1）胃阶段：准确称取3 g蔬菜样品于灭菌离心管中，加入模拟胃消化液（内含柠檬酸、苹果酸、乳酸、冰乙酸和氯化钠）与胃蛋白酶，并使用盐酸（优级纯）调节pH至1.5. 每个蔬菜样品设置3个平行，置于37 ℃恒温水浴振荡箱中匀速振荡1 h，胃模拟消化结束后吸取反应液，并使用0.22 μm无机微孔滤膜过滤，4 ℃保存待测.
（2）小肠阶段：向胃模拟阶段结束后的消化液中加入模拟小肠消化液（内含胰蛋白酶和胆汁盐），并使用饱和的NaHCO3溶液调节反应液的pH值至7.0，继续置于37 ℃恒温水浴振荡箱中匀速振荡，4 h后吸取小肠反应液，过0.22 μm无机微孔滤膜，4 ℃保存待测.
（3）结肠阶段：将小肠模拟阶段结束后的消化液和蔬菜残渣迅速转移至无菌厌氧血清瓶内，分别从成人和儿童SHIME模型的结肠阶段中吸取含有人体肠道微生物的结肠液加入，并立即通入氮气冲洗，以保证厌氧条件；继续置于37 ℃恒温水浴振荡箱中匀速振荡，48 h后吸取结肠消化液，过0.22 μm无机微孔滤膜，4 ℃保存待测.
模拟胃、小肠和结肠阶段反应液中的重金属Cr含量采用ICP-OES进行测定，每个消化阶段设置空白样品和平行样品进行质量控制，同时在分析过程中为确保仪器的稳定性，重复测量标准样品（BY400032，Cr：1.80 mg∙L−1）24次，平均回收率为（103.52%±0.57%），结果符合质控要求.
蔬菜中重金属Cr在模拟胃、小肠与结肠阶段的生物可给性（BA）由公式（1）计算[19]：
式中，C1为胃、小肠和结肠阶段中重金属Cr浓度（mg·L−1），V为各阶段消化液的总体积（L），C2为蔬菜样品总Cr浓度（mg·kg−1），M为蔬菜样品称取质量（kg）.
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为了评估蔬菜中Cr的膳食健康风险，采用美国环境保护署开发的健康风险评估模型（USEPA），并根据蔬菜中重金属Cr的生物可给性对评估计算方法进行修正，基于每日摄入量（EDI）和危害商指数（HQ），对不同暴露人群（成人和儿童）的健康风险进行评估. 同时，考虑到评估过程中所选用的暴露参数的区域特性和人种特征会造成评估结果具有不确定性，因此，引入蒙特卡罗（Monte Carlo）随机模拟，即将风险评估过程与概率模型相联系，以降低风险评估结果的不确定性[20].
蔬菜中Cr的估计每日摄入量（EDI）由公式（2）计算[21-22]：
式中，Ci为蔬菜中重金属Cr含量（mg·kg−1）；BA为蔬菜中Cr的生物可给性（%）；IR为蔬菜人均摄入量（kg）；EF为暴露频率（d·a−1）；ED为暴露周期（a）；BW为人群平均体重（kg）；AT为平均暴露时间（d），具体参数取值见表1.
蔬菜中Cr的危害商指数（HQ）由公式（3）计算[21, 23]：
式中，EDI取值为公式（2）中计算结果，RfD为蔬菜中Cr每日参考剂量3.0×10−3 mg·kg−1[24]，当HQ>1时，认为食用该蔬菜存在健康风险. 由于熟蔬菜更能反映人的真实饮食摄入情况，因而选用熟蔬菜中Cr的含量与生物可给性来进行健康风险评估.
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本研究使用Microsoft Excel 2010和SPSS20（IBM）对数据进行统计分析；图制作由Origin2017和SigmaPlot（16.0）软件完成. 为了最大限度地减少健康风险评估过程中暴露参数的不确定性，运用Crystal Ball（11.1，Oracle）软件中的蒙特卡罗模拟进行迭代计算.
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从铅锌矿区采集到的4种蔬菜样品中Cr含量（干重）如表2所示，表现为小白菜（13.86±7.33）mg·kg−1>芥菜（9.84±1.79）mg·kg−1>甘蓝（9.53±1.60）mg·kg−1>辣椒（5.28±2.48）mg·kg−1，不同种类蔬菜间Cr的吸收积累量存在差异（P<0.05），其中叶类蔬菜表现出较强的富集能力，这与前人的研究结果相似[30]. 这可能是归因于叶片不仅是叶菜类蔬菜重要的可食部分，同时也是植物器官中具有较为吸收敏感的一个器官，叶面的蒸腾作用能有效促进蔬菜根部对土壤Cr的吸收并转运至地上部分[4]；同时叶类蔬菜对大气颗粒物中Cr具有较强的捕获率，来源于大气降尘和土壤扬尘中的这类元素沉降到叶片表面后，部分会通过气孔进入叶菜中富集[31]. 通过对比国家食品污染物限量标准（GB2762—2017）发现，4种蔬菜Cr含量均远超国家限定阈值（0.5 mg·kg−1）. 此外，蔬菜采用高温水煮方式进行处理后的Cr含量范围为（1.93±0.76）—（5.07±0.61）mg·kg−1，与生蔬菜中Cr含量对比分析发现，高温水煮方式可以显著降低各类蔬菜Cr的平均含量水平（P < 0.05）. 其中，辣椒和小白菜经高温水煮后的平均下降比例较高，约为63.44%，其次为芥菜和甘蓝，平均下降比例分别约为60.90%和54.98%. Zhuang等[32]和Xu等[15]的研究也发现，高温水煮方式对蔬菜中重金属的含量水平影响较大，其主要原因是由于高温水煮过程可以使植物组织软化，导致水煮过程中Cr可以从蔬菜中析出至烹饪水中，从而降低了蔬菜中Cr含量.
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通过PBET法结合SHIME模型对4种蔬菜中重金属Cr的生物可给性进行研究发现（图1），胃阶段中生蔬菜中Cr生物可给性的平均值（8.77%±4.07%）—（12.78%±2.56%）略高于小肠阶段（5.42%±2.60%）—（11.12%±3.23%）. 这一结果与前人的研究结果相似[5]. 多项研究结果表明，胃肠的消化环境特征是影响重金属生物可给性的重要因素，胃液的酸性环境有助于提高重金属Cr的溶解性[33-34]；但从胃转移至小肠阶段，添加的NaHCO3使消化液pH值从1.5升至7.0，同时伴随CO2- 3的增加，导致肠液中溶解的Cr容易在弱碱性环境中发生共沉淀或再吸附反应，降低了Cr的移动性，Cr生物可给性出现降低的趋势[35]. 同时，胃肠消化液中的消化酶对重金属的生物可给性也具有重要影响[36]. 胃蛋白酶作为一种蛋白质能够释放H+，使其表面带负电荷后能够通过络合作用与胃液中带正电荷的金属Cr离子形成复合物，这有助于Cr保持溶解状态[37]，特别是胃液的酸性环境有利于提高胃蛋白酶活性，在一定程度上能够促进胃液中络合物的形成，从而可以进一步提高蔬菜中Cr的溶解度及其生物可给性；胰蛋白酶也是一种蛋白质，对Cr离子的作用与胃蛋白酶相同[38]，但肠液的弱碱性环境并不利于金属离子络合物的形成，且依靠电荷吸附在胃蛋白酶表面的Cr离子进入肠液后容易发生水解生成沉淀，从而使其溶解度和生物可给性降低. 通过与生蔬菜中Cr的生物可给性对比发现，经高温水煮后蔬菜中Cr在胃阶段（23.89%±13.35%—34.86%±6.44%）和小肠阶段（13.15%±4.23%—26.80%±4.88%）生物可给性的平均值整体高于生蔬菜，平均升高比例范围分别约为55.17%—63.33%和52.81%—58.78%，这可能归因于高温水煮过程会造成植物细胞壁膨胀、果胶溶解/解聚和细胞分离，导致食物基质遭到破坏[39-40]，因此可以进一步促进蔬菜中Cr在胃肠消化过程的溶出释放，提高其生物可给性.
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由小肠至结肠阶段，生熟两种处理蔬菜样品中Cr生物可给性的平均值范围分别为成人：（22.56%±9.23%）—（36.04%±11.45%）；儿童：（19.74%±8.26%）—（34.53%±10.82%）（图1），分别是小肠阶段的1.10—6.00倍和1.05—5.77倍，结果表明结肠阶段中肠道微生物作用下显著增加了蔬菜中重金属Cr的生物可给性（P<0.05），且蔬菜高温处理后也增加了结肠阶段Cr的生物可给性（6.11%—21.51%）. 对比小肠阶段，结肠中含有丰富的肠道微生物，这些肠道微生物具有较强的代谢能力，食糜中未被胃肠道消化酶所消化完全的蛋白质和碳水化合物可被肠道微生物所代谢利用[41]. 因此，肠道微生物在代谢蔬菜残渣中有机质时，也可将吸附在残渣中的重金属Cr释放进入消化液中，增加结肠阶段中Cr的生物可给性，从而导致结肠阶段高于小肠阶段. 此外，蔬菜中重金属Cr在消化阶段中的生物可给性还取决于不同的化学形态[42]，且受到人体肠道微生物的影响. 例如人体肠道中的硫酸盐还原菌（SRB）、铁还原菌（IRB）和乳酸杆菌等可诱导Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ）形式[43-45]. Cr（Ⅲ）能够以溶解态在酸性溶液中稳定存在[46]，而肠道微生物在代谢过程中所产生的代谢产物（如短链脂肪酸、支链脂肪酸和氨类等）会影响人体肠道环境，其中短链脂肪酸（SCAFs）主要包括乙酸、丙酸、丁酸等有机酸可降低肠道的pH值[41,47]，从而可能促使Cr（Ⅲ）的溶解，导致结肠阶段中Cr的生物可给性高于小肠阶段. 对比两名自愿者（成人和儿童）结肠阶段中Cr的生物可给性发现，在大多数蔬菜样品中，成人结肠阶段Cr的生物可给性高于儿童，这可能是由于宿主肠道微生物的代谢差异所致. Yin等[48]研究也报道了两个健康的不同宿主（成人和儿童）肠道微生物对土壤中As的代谢具有差异. 综上，结肠阶段中肠道微生物可增加蔬菜中重金属Cr的生物可给性，且受宿主肠道微生物代谢差异的影响.
食物基质中的污染物水平被认为是影响生物可给性的主要因素之一，前人研究中报道了大量食物中重金属全量与胃和小肠阶段生物可给性之间的剂量比例关系[23,49]，但未考虑到结肠阶段中肠道微生物对于重金属生物可给性的影响. 本研究发现，生熟不同处理蔬菜样品中重金属Cr含量与结肠阶段生物可给性呈显著负相关（P<0.01），相关系数R2：0.383—0.483，即高Cr含量蔬菜在结肠阶段未表现出较高的生物可给性（图2），这可能是由于结肠阶段肠道微生物的作用影响了蔬菜中重金属Cr的溶出释放. Yin等[12]研究结果也展示了土壤Cr含量与结肠阶段（成人和儿童）生物可给性呈负相关. 同样，Wang等[50]使用小鼠模型发现小白菜、空心菜和苋菜中重金属镉全量与生物有效性之间存在显著的负相关关系（R2=0.430，P<0.05）. 表明在考虑结肠阶段中肠道微生物作用下高Cr含量蔬菜不会表现出较高的生物可给性.
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利用USEPA的风险评估模型，并借助蒙特卡罗模型迭代模拟降低风险评估模型中各参数的不确定性[20]，以计算出基于熟蔬菜中Cr总量和3个消化阶段中Cr生物可给性的HQ和HQ的累积概率，结果见表3、图3. 当只考虑4种蔬菜中重金属Cr总量而不考虑生物可给性时，成人的HQ指数范围为（1.17×10−2±2.68×10−7）—（1.45×100±3.95×10−5），儿童为（1.25×10−2±5.50×10−6）—（2.27×100±1.21×10−3）. 结果表明，除甘蓝外其余3种蔬菜的平均HQ值均未超过安全阈值1，但根据累计概率发现所有HQ值中分别约有36.19%（成人）和37.83%（儿童）超过了1，且儿童的危险商指数整体高于成人. 当用生物可给性修正风险评估结果后，基于成人和儿童胃阶段（23.89%±13.35%）—（34.86%±6.44%）、小肠阶段（13.15%±4.23%）—（26.80%±4.88%）与结肠阶段（25.15%±9.48%）—（36.04%±11.45%）4种熟蔬菜的平均生物可给性（图1b）计算出的平均HQ值（1.53×10−3±3.90×10−8）—（5.19×10−1±1.52×10−5）整体降低至安全阈值内，但累计概率统计发现所有HQ值中仍有3.96%—16.68%（成人）和2.81%—18.37%（儿童）超过了风险阈值1，表明生物可给性修正后可降低蔬菜中Cr的健康风险，但食用所引起的健康风险仍然不可忽视. 此外，对比小肠和结肠阶段的数据发现，基于结肠阶段计算的暴露风险指数和累计概率较高，相比小肠阶段提高了约6.17%—62.12%. 这一结果与本文中蔬菜Cr在消化阶段中生物可性的变化规律相同，即结肠阶段大于小肠阶段. 尹乃毅等[51]研究也得到类似的结果，他们发现土壤中重金属镉（Cd）、铬（Cr）和镍（Ni）在结肠阶段的健康风险高于小肠阶段. 表明结肠阶段中肠道微生物可增加蔬菜中Cr的生物可给性和提高人体健康风险. 综上，在蔬菜Cr暴露所引起的人体健康风险中，人体肠道微生物对Cr的代谢起着重要作用.
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（1）从贵州省某铅锌矿区采集的4种蔬菜样品，在生和熟不同条件下样品中Cr含量均超过了我国国家食品卫生标准中的标准限值（GB 2762—2017，0.5 mg·kg−1），虽然煮熟处理显著降低了蔬菜样品中Cr含量（P<0.05），但却明显增加了各消化阶段中Cr的生物可给性.
（2）结肠阶段，4种蔬菜中重金属Cr的生物可给性高于胃和小肠阶段，且两名宿主（成人和儿童）结肠阶段中Cr的生物可给性具有差异. 表明肠道微生物可促进蔬菜中Cr的溶出释放，且受宿主肠道微生物代谢差异的影响.
（3）人体健康风险评价中，对比了各消化阶段的膳食暴露风险发现，基于结肠阶段生物可给性计算的健康风险较高. 表明在蔬菜Cr暴露所引起的人体健康风险中，肠道微生物对Cr的代谢起着重要作用. 因此，在未来开展人体健康风险评估时，考虑食物中重金属在结肠阶段生物可给性的健康风险评估结果将可能更加科学和准确.
肠道微生物对蔬菜中铬生物可给性的影响及人体健康风险评价
Effect of gut microbiota on bioaccessibility of chromium in vegetables and human health risk assessment
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摘要: 为更加全面、准确评估蔬菜中重金属铬（Cr）生物可给性及对人体健康风险的影响，本文利用生物原理提取法（physiologically based extraction test，PBET）联合微生物生态系统（simulator of human intestinal microbial ecosystem，SHIME）模拟实验，系统分析了贵州某铅锌矿区4种常见蔬菜（辣椒、芥菜、小白菜和甘蓝）在不同食用条件（生和熟）下Cr的含量变化，探究在肠道微生物影响下蔬菜Cr在不同消化吸收阶段（胃、小肠和结肠）中生物可给性差异，并对比了各消化阶段的膳食暴露风险. 结果表明，4种蔬菜样品中Cr的含量（干重）表现为小白菜(13.86±7.33)mg·kg−1>芥菜（9.84±1.79）mg·kg−1>甘蓝（9.53±1.60）mg·kg−1>辣椒（5.28±2.48）mg·kg−1；虽煮熟处理可显著降低4种蔬菜样品中的Cr含量（降低范围54.98%—63.44%，P<0.05），但生熟蔬菜样品中Cr含量仍超过国家食品卫生标准中的标准限值（GB 2762—2017：0.5 mg∙kg−1）. 此外，研究发现结肠阶段中Cr的生物可给性最高，分别为成人：（22.56%±9.23%）—（36.04%±11.45%）；儿童：（19.74%±8.26%）—（34.53%±10.82%），分别是小肠阶段的1.10—6.00 倍和1.05—5.77 倍，且蔬菜高温处理后增加了结肠阶段Cr的生物可给性（6.11%—21.51%）. 对比各消化阶段的危害商指数（HQ）发现，基于结肠阶段生物可给性计算的HQ累计概率较高，相比小肠阶段提高了约6.17%—62.12%，表明结肠阶段中肠道微生物作用下可增加蔬菜中Cr的生物可给性和提高人体健康风险. 因此，在未来开展人体健康风险评估时，需综合评估不同食用条件下食物中重金属在结肠阶段中生物可给性的健康风险，以期为我国膳食重金属暴露的人体健康风险评估提供更多科学参考.Abstract: To more comprehensively and accurately assess the bioaccessibility of Chromium (Cr) in vegetables and its human health risk, the PBET method combined with SHIME model was used to determine the vegetable concentration of Cr in different treatments (raw and cooked) and the effects of gut microbiota on Cr bioaccessibility. Four common vegetables (pepper, mustard, pakchoi and cabbage) were collected from Lead-Zinc mining region in Guizhou Province. The results showed that the contents (dry weight) of Cr in the four varieties of vegetables were pakchoi (13.86±7.33) mg·kg−1 >mustard (9.84±1.79) mg·kg−1 >cabbage (9.53±1.60) mg·kg−1 >pepper (5.28±2.48) mg·kg−1. Although the cooking process could significantly reduce the contents of Cr in vegetables (range of 54.98%—63.44%, P<0.05), the contents of Cr both in raw and cooked vegetable samples were still exceeds limit standard of Cr stipulated in the National Food Hygiene Standard (GB 2762—2017: 0.5 mg·kg−1). In addition, the study found that the highest bioaccessibility of Cr in the colon phase, adult: (22.56% ± 9.23%)—(36.04% ± 11.45%); child: (19.74% ± 8.26%)—(34.53% ± 10.82%), which was 1.10—6.00 times and 1.05—5.77 times higher than those in the small intestine phase, respectively. And the cooking process significantly increased the bioaccessibility of Cr in the colon phase (6.11%—21.51%). Compared with the hazard quotient (HQ) in different digestion phases, the cumulative probability of HQ calculated based on the bioaccessibility of Cr in the colon phase showed higher health risk, which was about 6.17%—62.12% higher than in the small intestinal phase. The result indicated that the gut microbiota in the colon phase could increase the bioaccessibility of Cr in vegetables and improve human health risk. Therefore, it was necessary to comprehensively evaluate the bioaccessibility of heavy metals in foods in the colon phase under different edible conditions in future research, to provide more scientific reference for human health risk assessment of dietary heavy metal exposure.
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Key words:
- vegetables /
- chromium /
- bioaccessibility /
- gut microbiota /
- health risk.
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邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）作为增塑剂，被大量添加在塑料、涂料、化肥和化妆品等商品中. 根据信息处理服务公司（Information handling services，IHS）的一份报告，2014年全球生产和消费的增塑剂为840万吨，其中PAEs类占了70%[1]. 预计2017—2022年全球对PAEs的需求将以年均1.3%的速度增长[2]. 目前，PAEs在中国每年的生产量和消费量大约为130万吨，占全球总量的20%[3]. 鉴于PAEs不是通过稳定的化学键与产品结合，此类化合物很容易通过多种方式释放到环境中，例如工业和市政废水排放、固体废物处置和浸出、产品使用过程中的迁移和挥发[4-6]. 研究表明全球大多数人群均已暴露于PAEs中，并且已在人体血清和脂肪中发现PAEs的存在[7]. 人体暴露于PAEs的主要途径为食物和饮用水的摄入[8-9]，其中饮用水作为每日必须摄入的介质，其中含有的PAEs对人体的影响近年来受到了广泛关注[5，10-11].
邻苯二甲酸二甲酯（dinethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（di-n-phthalate，DBP）、邻苯二甲酸丁苄酯（butylbenzyl phthalate，BBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）和邻苯二甲酸二辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）已被联合国列入优先管控污染物[12]，DMP、DBP和DEHP也已被列入我国水环境优先控制污染物黑名单，但均未列入我国2017年和2020年出台的两批《优先控制化学品名录》中. 我国《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）、《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）、《城市供水水质标准》（CJ/T206-2005）中也规定了部分PAEs的限值. DEHP由于存在最多的健康和环境问题，已被归类为国际癌症研究机构（IARC）确定的可能对人类致癌的物质[13]. 尽管近几年来，PAEs在各类饮用水环境中的检出引起了人们的重视，研究范围涉及水源水、自来水和瓶装水等样品，但针对江苏省沿江城市居民住宅自来水的研究几近空白.
本研究选取江苏省不同区域居民自来水中的PAEs作为研究对象，分析PAEs的污染特征，检验加热煮沸过程对自来水中的PAEs是否具有去除效果，评估经口摄入的人体健康风险，以期为全省饮用水健康安全管控提供科学支撑.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 样品的采集
于2017年3月至4月，分别采集江苏省沿江8市（南京、无锡、常州、苏州、南通、扬州、镇江、泰州）居民住宅自来水，采样点位如图1所示. 每个城市选取5户居民进行取样（n=40），采样体积为2 L，所有水样均置于棕色玻璃瓶中，4 ℃避光保存，并于24 h内运回实验室分析. 为了研究加热煮沸过程对水中PAEs的去除效果，从每个城市选取两份水样在实验室煮沸，冷却至室温后保存待测（n=16）.
图 1 江苏省不同城市居民住宅自来水采样点Figure 1. Sampling points for residential tap water from different cities in Jiangsu1.2 仪器与试剂
超高效液相色谱/串联质谱（Waters Acquity/TQD），Masslynx工作站，ODS液相色谱柱（waters, BEH C18, 50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；HLB玻璃材质固相萃取柱（200mg/5cc,Waters,美国）.
6种PAEs（DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DNOP）混合标准品储备液，质量浓度为100 μg·mL−1（德国Dr. Ehrenstorfer公司），纯度在98.5%—99.5%之间;替代标准物氘代邻苯二甲酸二正丁酯（d4-DBP）和内标物氘代邻苯二甲酸二乙酯（d4-DEP），质量浓度均为100 μg·mL−1（美国Accustandard公司），实验用甲醇、正己烷、乙腈、丙酮等试剂均为农药级或LC-MS级.
1.3 样品的前处理
取1L水样，加入回收率指示物（d4-DBP），以10 mL·min -1的流速通过HLB固相萃取柱. 上样前依次用10 mL乙醚、5 mL乙腈和5 mL超纯水活化萃取柱. 水样过柱后，用高纯氮气吹干HLB小柱，再用体积95:5的乙醚-乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩至近干，用乙腈定容至1 mL，加入内标化合物（d4-DEP）后置于进样瓶中，等待进样.
1.4 仪器分析
本研究采用超高效液相色谱/串联质谱仪（Waters Acquity/TQD）、BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）对目标化合物进行定性和定量分析. 进样量为10 μL，流动相为水（A相，含0.2%甲酸）和甲醇（B相），流速为0.4 mL·min−1，色谱柱温度为40 ℃，流动相梯度设置如下: 0 min，A相比例为90%，保持2 min; 2—12 min，A相比例由90%降为0%，保持4 min; 16—18 min，A相比例恢复至60%. 质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描方式，多离子反应监测（MRM）模式，监测条件见表1. 离子源温度120 ℃，毛细管电压4.0 kV，去溶剂温度400 ℃.
表 1 目标化合物的多反应监测条件Table 1. MRM parameters for target compounds化合物Compounds 母离子Precursor ions（m/z） 子离子Product ions （m/z） 解簇电压/VDeclustering potential 碰撞能量/VCollision energy DMP 195.3 163.0＊ 40 12 195.3 77.1 40 46 DEP 223.1 177.4＊ 50 25 223.1 149.3 50 12 BBP 313.3 91.3＊ 68 27 313.3 205.2 68 12 DBP 279.1 149.3＊ 72 20 279.1 205.2 72 12 DEHP 391.1 167.0＊ 84 18 391.1 149.0 84 32 DNOP 391.3 261.1＊ 60 10 391.3 149.0 60 20 | Show Table
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1.5 质量保证与质量控制（QA/QC）
实验过程中发现采用液质联用分析PAEs时，存在较大的系统空白干扰，为解决该问题，参考已有研究方法并进行优化完善[14]：在液相输液泵和进样阀之间加入一根吸附分配柱，通过六通阀切换，流动相经过该分配柱后，进入定量环，将定量环中样品带入色谱柱进行分离分析; 由于色谱系统产生的干扰经过吸附分配柱后可以进行短暂的吸附保留，再进入色谱柱，而定量环中的样品则直接经过色谱柱被吸附保留. 因此，系统产生的干扰和目标化合物可以产生出峰时间差，从而减少误差干扰.
实验过程中避免使用塑料和橡胶器皿，所使用的玻璃容器均在马弗炉中400 ℃高温烘烤4 h后经正己烷、丙酮和乙腈清洗. 所有水样均添加回收率标样，每5份样品添加1个程序空白. 自来水中6种PAEs的加标回收率范围为86.5%—109%. 以3倍空白水样加标样测定结果的标准偏差计算各种物质的方法检出限（detection limit，DL），6种PAEs化合物的DL范围为0.1—0.5 μg·L−1.
1.6 健康风险评价
本研究采用美国环保署（USEPA）推荐的水环境健康风险评价模型，分别评估了通过饮用水途径暴露的DEHP致癌风险和∑PAEs非致癌风险. 通过饮用水摄入的日均PAEs剂量（CDI）可以通过公式（1）计算:
CDI=C×IR/BW (1) 式中， CDI为每天通过饮水摄入的PAEs平均剂量（mg·kg−1·d−1）; C为饮用水中PAEs的含量（mg·L−1）; IR为每日饮用水的摄入量（取2 L·d−1）; BW为人均体重（取60 kg）.
通过饮用水途径暴露的DEHP致癌风险（RDEHP）通过公式（2）计算:
RDEHP=CDI×SF (2) 式中，SF为经口摄入致癌斜率因子，DEHP的SF值为0.014 kg·d·mg−1.
PAEs非致癌风险采用危险指数（HI）进行评估，通过公式（3）计算:
HI=CDI/RfD (3) 式中，RfD为法规或指南中给出的PAEs非致癌危害的参考剂量（mg·kg−1·d−1），DEP、BBP、DBP、DNOP和DEHP的RfD分别为0.8、0.2、0.1、0.01、0.02 mg·kg−1·d−1，DMP缺少RfD参考剂量数据，HI小于1表示处于安全范围.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 江苏城市饮用水中PAEs的含量与组成
江苏省8个城市居民自来水水样中PAEs检出率为100%，PAEs含量如图2所示，∑PAEs检出范围为4.10—14.23 μg·L−1，平均值为（8.43±2.76）μg·L−1，其中镇江市自来水中∑PAEs含量最高，达到（10.76±2.10）μg·L−1，苏州市其次（（9.39±2.08）μg·L−1），泰州市最低（（7.14±3.39）μg·L−1）.
图 2 江苏省不同城市居民自来水中PAEs含量Figure 2. Concentrations of PAEs in tap water from different cities in JiangsuDBP在所有水样中均有检出，且平均含量最高（（2.10±1.65）μg·L−1），17.5%的自来水样品中DBP浓度超过《生活饮用水规范》（GB5749-2006）限值（3 μg·L−1）. 所有自来水样品中DEHP浓度均未超过《生活饮用水规范》（GB5749-2006）与世界卫生组织（WHO）《饮用水水质准则》限值（8 μg·L−1）或美国瓶装水中的标准限值（6 μg·L−1）[15]，说明江苏省部分城市居民自来水已受到PAEs污染，存在一定的潜在健康风险，该结论与我国其他已有研究结果相似[16-17]. 然而，根据美国环保署1997年出台的饮用水法规和健康建议，由于DEHP致癌性，美国对DEHP的最终管理目标是零暴露风险[18]. 同时有研究表明，长期饮用含有微量PAEs的水，即使其含量满足饮用水标准，也可能对人体健康造成危害[19-20]. 从组成成分来看，DBP和DMP是造成自来水中PAEs含量差异的最主要因素.
表2列出了全球其他国家和地区饮用水中PAEs的污染情况，本研究结果与沙特阿拉伯（0.2—30.8 μg·L−1）和墨西哥（0.6—45.1 μg·L−1）等国家瓶装水中PAEs的含量相近[5]，比葡萄牙（0.02—0.35 μg·L−1）、法国（0.03—0.35 μg·L−1）和伊朗（0.07—0.52 μg·L−1）等西方国家自来水中浓度高近两个数量级[11，21-22]，比我国天津市居民饮用水（（2.41±0.39）μg·L−1）高一个数量级[23]，但低于河南省的研究结果（0.24—82.2 μg·L−1）[24]，这与河南饮用水取样点位受到污染河流水平扩散、垂直渗透和雨水溶解有关. 已有研究表明江苏居民自来水中PAEs来源广泛，包括水源水赋存、生产过程带入和塑料管道析出等[25].
表 2 世界其他国家和地区自来水中PAEs含量Table 2. Concentrations of PAEs in other countries and regions around the world国家和地区Country and region BBP/（μg·L−1） DBP/（μg·L−1） DEP/（μg·L−1） DMP/（μg·L−1） DNOP/（μg·L−1） DEHP/（μg·L−1） ∑PAEs/（μg·L−1） 参考文献Reference 江苏省Jiangsu nd—7.39（0.71） 0.34—7.40（2.01） nd—6.41（1.40） nd—8.40（1.93） nd—5.23（1.23） nd—6.87（1.93） 4.10—14.23（8.43） 本研究 天津市Tianjin 0.44—0.71 0.38—0.68 — — — 1.10—1.78 1.92—2.78（2.41） [23] 河南省Henan nd 0.93 44.04 38.19 — 12.49 — [24] 武汉市Wuhan — 0.60 0.90 nd — — — [26] 葡萄牙Portugal 0.03 0.52 0.19 0.04 — 0.06 0.02—0.35 [21] 德国Germany 0.05 0.64 0.16 — — 0.06 0.02—0.60 [27] 西班牙Span nd nd—0.91 nd—0.38 nd—0.03 — nd 0.38—0.73 [10] 西班牙Span nd nd 0.19 nd — nd nd—0.19 [28] 法国France nd 0.04 0.03 nd — 0.35 — [22] 希腊Greece — 1.04 0.30 — — 0.93 0.30—1.04 [29] 捷克Czech 0.002 0.05 0.07 0.08 nd 0.66 — [30] 越南Vietnam 0.20—4.21 0.01—2.56 nd—2.57 nd—0.54 nd—1.93 1.01—14.50 2.10—18.00（11.2） [31] 伊朗Iran 0.05—0.15（0.10） nd—0.14（0.09） nd—0.09（0.05） 0.08—0.67（0.37） nd—0.11（0.01） nd—0.38（0.15） 0.07—0.52 [11] 注：nd，未检出，not detected；—，未参与检测，not included；（ ），平均值，mean level | Show TableDownLoad:
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图3比较了自来水与煮沸后冷却至室温的水样中PAEs的浓度，结果与其他研究类似[32]，加热或煮沸后的自来水中，PAEs含量有所下降，但下降程度有限，其中DBP平均降低程度最高（21.6%），其次是BBP（18.6%），DNOP最低（9.1%）. 值得注意的是，有研究报道，若将开水立刻倒入塑料杯，高温会加速塑料中PAEs的析出，导致饮用水中PAEs含量显著升高[23].
图 3 自来水和煮沸水中PAEs含量变化Figure 3. Changes of concentrations of PAEs in tap water and boiled water2.2 PAEs健康风险评价
2.2.1 致癌风险评估
江苏省不同地区通过饮用水摄入导致的DEHP致癌风险如图4所示，所有自来水和煮沸冷却水中DEHP的致癌风险均低于USEPA推荐的健康风险可接受最大水平（1×10−6），其中苏州、南通和泰州水样中DEHP致癌风险较高. 煮沸后的自来水在一定程度上降低了DEHP的致癌风险，降幅达到78%. 但在高温情况下DEHP会从塑料包装中迁移至水体，导致DEHP的致癌风险有超过1×10−6的可能[23，33]，另外随着储存时间的增加，水中DEHP的含量也会随之上升[22]. 因此，长期饮用存放在高温环境中的瓶装水，例如高温天气车内长时间放置的瓶装水，对人体健康危害极大，应引起高度重视.
图 4 自来水和煮沸水中DEHP的致癌风险Figure 4. Carcinogenic risks of DEHP via tap water and boiled water2.2.2 非致癌风险评估
5种PAEs（DEP、BBP、DBP、DNOP和DEHP）的非致癌风险采用危险指数如图5和表3所示. 结果显示，江苏省8个城市自来水中∑PAEs的HI范围在8.26×10−3（无锡市）—3.25×10−2（南通市），均远小于1，表明江苏省不同地区自来水中PAEs摄入对人体造成的非致癌健康风险可忽略不计. 煮沸后的自来水PAEs非致癌风险与致癌风险变化情况类似，均有不同程度的降低，该结果与Wang[23]和Li[20]在天津市和黄海沿海城市的研究结果一致. DBP在自来水中占总非致癌风险的47.3%，而BBP和DEHP仅占1.60%和1.58%，该结果与天津市自来水中PAEs的非致癌风险占比（DEHP占比最大）有较大差别[23]，主要原因是尽管DEHP毒性最大，但在江苏省8个城市自来水样中DEHP的含量相对较低，因此对∑PAEs非致癌风险贡献较小.
Figure 5. Non-carcinogenic risks of PAEs via tap water and boiled water图 5 自来水和煮沸水中PAEs非致癌风险除了通过饮用水的暴露方式，PAEs还可以通过食物摄入和皮肤接触等途径对人体健康造成负面影响. 此外，自来水中可能存重金属、农药、消毒副产物和个人护理产品等多种污染物，它们之间的协同效应可能会对人体健康产生多重负面影响. 因此，建议进一步研究并持续监测这些化学物质在不同条件下的自来水和瓶装水中的赋存特征，以期更好地管控生态环境健康风险.
表 3 江苏省不同城市居民自来水中PAEs非致癌风险Table 3. Non-carcinogenic risks of PAEs in residential tap water from different cities in Jiangsu Province城市 City HIBBP HIDBP HIDEP HIDMP HIDNOP HIDEHP ∑HI 南京Nanjing 1.67×10−5 4.67×10−3 9.36×10−5 na 4.77×10−3 4.17×10−5 9.59×10−3 无锡Wuxi 1.27×10−3 4.72×10−3 2.66×10−4 na 1.07×10−3 9.36×10−4 8.26×10−3 常州Changzhou 1.67×10−5 2.48×10−3 1.23×10−4 na 5.02×10−3 1.64×10−3 9.28×10−3 苏州Suzhou 1.67×10−5 8.69×10−3 4.17×10−5 na 8.33×10−5 3.60×10−3 1.24×10−2 南通Nantong 1.67×10−5 1.58×10−2 4.17×10−5 na 1.26×10−2 3.09×10−3 3.15×10−2 扬州Yangzhou 3.97×10−4 1.15×10−2 4.17×10−5 na 6.66×10−3 1.97×10−3 2.06×10−2 镇江Zhenjiang 1.55×10−4 8.65×10−3 2.86×10−4 na 8.33×10−5 1.18×10−3 1.04×10−2 泰州Taizhou 3.24×10−4 1.60×10−2 4.17×10−5 na 5.91×10−3 2.73×10−3 2.50×10−2 注：na，无参考数据，no reference data | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusion）
（1）江苏省8个城市40份居民自来水中均检出了PAEs，检出范围为4.10—14.23 μg·L−1，其中镇江市自来水中PAEs的含量最高. 与其他国家和地区相比，本研究区域自来水中PAEs含量处于中等偏上水平，其污染来源有待进一步明确.
（2）与自来水相比，煮沸后冷却至室温的水样在一定程度上降低了PAEs浓度和此类化合物的致癌风险与非致癌风险.
（3）研究区域内DEHP致癌风险指数小于最大可接受风险水平（1×10−6），∑PAEs的非致癌风险指数远小于1，但部分水样中DBP含量超过《生活饮用水规范》（GB5749-2006）限值，存在潜在的生态环境健康风险.
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图 1 生（a）熟（b）蔬菜中Cr在胃、小肠、成人结肠和儿童结肠阶段的生物可给性
Figure 1. Bioaccessibility of Cr in raw （a） and cooked （b） vegetables in gastric, small intestine, adult colon and child colon phase
图 2 生熟蔬菜样品中Cr含量与结肠阶段（成人和儿童）Cr的生物可给性之间的相关关系
Figure 2. The regression relationship between the total concentration of Cr in raw and cooked vegetable samples and the bioaccessibility of Cr in colon phase （adult and child）
图 3 基于蒙特卡罗模拟成人和儿童暴露于Cr的危害商指数的累计概率分布
Figure 3. Cumulative probability distribution of the hazard quotient index based on Monto Carlo simulation of adults and children exposure to Cr
表 1 风险暴露计算参数及其分布类型
Table 1. Parameters used in the risk calculation and distribution pattern
变量 Variable 定义 Define 参考值 Reference value 分布类型 Distribution pattern 数据来源 Data sources 成人 （> 18岁） 儿童 （2—18岁） IR/ （g·d−1） 摄入率Uptake rate 辣椒 Pepper 2.88 1.44 对数正态分布 Yang等[25];吴永宁等[26] 芥菜 Mustard 200.00 100.00 小白菜Pakchoi 111.60 55.80 甘蓝Cabbage 300.0 150.00 ED/a 暴露周期Exposure cycle 0—24 0—6 均匀分布 环境保护部[27-28] BW/kg 体重质量Weight quality 0.00, 60.61, 3.19 9.52, 29.14, 28.97 对数正态分布 AT/d 平均暴露时间Mean exposure time ED×365 单点分布 EF/（d·a−1） 暴露频率Exposure frequency 180, 350, 365 三角分布 Huang等[29] C/（mg·kg−1） 重金属含量Heavy metal content 本研究 对数正态分布 本研究 BA/% 生物可给性Bioaccessibility 本研究
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表 2 4种蔬菜中重金属Cr含量（干重）
Table 2. Total concentrations of Cr in the four vegetables （dry weight）
蔬菜名称 Vegetable name 含量 /（mg·kg−1）Contents 生Raw 熟Cooked 辣椒 Pepper 5.28±2.48Ad 1.93±0.76Bd 芥菜 Mustard 9.84±1.79Ab 3.84±0.79Bc 小白菜 Pakchoi 13.86±7.33Aa 5.07±0.61Ba 甘蓝 Cabbage 9.53±1.60Ac 4.29±0.33Bb 标准限值 Limits 0.5 mg·kg−1 （GB 2762−2017） 注: 表中数据为样本均值±标准偏差; 不同大写字母表示蔬菜样品Cr含量在生熟处理间差异性显著（P<0.05）, 不同小写字母表示不同蔬菜样品Cr含量差异性显著（P<0.05）. Note: The data were expressed as sample mean±standard deviation; Different capital letters indicate that the significant difference of contents of Cr between the raw and cooked treatments of vegetable samples （P<0.05）; Different lowercase letters that indicate significant differences of contents of Cr between the different vegetables （P<0.05）.
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表 3 蔬菜中重金属Cr的健康风险评估
Table 3. Health risk assessment of Cr in vegetables
蔬菜名称 Vegetable name HQ 总量 Total contents （胃） 生物可给性 （Gastric） Bioaccessibility （小肠） 生物可给性 （Small intestine） Bioaccessibility （结肠） 生物可给性 （Colon） Bioaccessibility 成人Adults 儿童Children 成人Adults 儿童Children 成人Adults 儿童Children 成人Adults 儿童Children 辣椒Pepper 1.17×10−2±2.68×10−7 1.25×10−2±5.50×10−6 2.83×10−3±8.74×10−8 3.85×10−3±8.09×10−8 1.53×10−3±3.90×10−8 1.89×10−3±1.45×10−7 2.25×10−3±7.90×10−8 4.99×10−3±5.31×10−7 芥菜Mustard 8.79×10−1±2.51×10−5 9.93×10−1±6.66×10−5 3.01×10−1±8.98×10−6 4.09×10−1±1.19×10−5 2.28×10−1±6.76×10−6 2.82×10−1±1.70×10−5 2.43×10−1±7.37×10−6 3.08×10−1±2.87×10−5 小白菜Pakchoi 6.48×10−1±1.80×10−5 7.89×10−1±6.83×10−5 1.57×10−1±4.52×10−6 2.10×10−1±6.26×10−6 1.44×10−1±4.13×10−6 1.51×10−1±4.27×10−6 1.64×10−1±5.11×10−6 1.69×10−1±5.28×10−6 甘蓝Cabbage 1.45×100±3.93×10−5 2.27×100±1.21×10−3 3.59×10−1±1.12×10−5 4.90×10−1±1.45×10−5 3.28×10−1±9.39×10−6 3.38×10−1±9.59×10−6 4.85×10−1±1.40×10−6 5.19×10−1±1.52×10−5 注: 图中数据为样本均值±标准偏差. Note: The data in the figure are the ± standard deviation of the sample mean.
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