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我国产业结构的优化升级和城市化进程的加速，促使传统工业企业转型，纷纷由城市中心搬迁至工业园区[1]. 然而原有企业在运营期间，环保意识淡薄、管理不当，使原址场地中的土壤和地下水受到不同程度的污染，不仅给周边环境和居民健康带来威胁和风险，也使遗留场地的再次开发利用受到限制. 企业生产工艺的多元化与生产活动的长期性，导致了大多遗留场地属于污染物种类复杂、风险程度高且累积性强的复合污染场地[2-3].
重金属与多环芳烃复合污染是典型的无机-有机型复合污染，不仅来源广泛、危害性大，且物化性质稳定，会长期滞留在土壤和地下水中，难以去除，因此受到国内外诸多学者的关注. 王耀锋等[4]对我国焦化场地中PAHs和重金属进行污染评价，发现山西与河北地区的焦化场地危害程度最高；刘颖等[5]研究重复合污染场地中重金属与PAHs的空间分布特征和健康风险评估，以此提出各类污染物的风险管控值；杨悦锁等[6]提出，目前针对重金属与PAHs复合污染场地的修复方法主要有淋洗修复、生物修复和联合修复，但行之有效的方法较少；Wong等[7]认为石油与焦化行业的废水排放是土壤复合污染的重要原因. 重金属与PAHs在土壤环境中，经过迁移至某一区域后，相互作用相互影响，从而形成复合污染，会对人体健康和土壤环境产生更大的危害[8-9]，因此研究重金属与PAHs的污染特征及风险评价能够为复合污染场地提供理论科学依据，具有重要的理论与实际意义[10].
本文以湖南某焦化厂遗留的重金属-多环芳烃复合污染场地为研究对象，通过场地环境调查和地质勘探，明确了该场地的地层结构和地下水特征；通过对场地不同功能区的不同深度土壤样品中重金属及多环芳烃含量测试，分析了场地主要污染物的含量与空间分布特征；通过对重金属与多环芳烃的相关性分析，阐述了其共存特征与来源；通过内梅罗综合污染指数法、质量基准法分别对重金属、多环芳烃进行生态风险评价，以期为该焦化场地的土壤污染治理和修复提供科学依据.
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本文研究的焦化场地属于丘岗地形，地表起伏较大，地势北高南低，属构造侵蚀红岩丘陵地带，场地内地层由上而下分别为：人工填土（Q4ml）、粉质粘土（Q4al）、强风化泥质粉砂岩（Kdld）. 地下水主要有上层滞水和碎屑岩类孔隙裂隙水，地下水流向受单斜构造影响，整体呈北东流向南西，径流条件复杂，水位水量季节性变化明显，区域蓄水保水性能差，属于地下水贫乏区.
该焦化厂于1988年开始生产，2008年9月份停产，生产原料包括主焦煤、瘦煤、气煤、燃料煤、硫酸、轻柴油、纯碱和水等. 焦炉生产的荒煤气，经过鼓冷-脱硫-冼氨-洗苯脱苯等工艺，产生包括煤气、焦炭、焦油、硫铵、粗苯和硫磺等产品，原场地功能区布置如图1所示. 由于原工厂环境管理措施不当，存在废水乱排、废渣乱堆乱放等现象，造成场地污染. 目前，场地建（构）筑物拆除清理完毕，场地主要规划为住宅区，按照《土壤环境质量标准》（GB36600-2018），划分为第一类用地.
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采样点布设参照《建设用地污染状况调查技术导则》（HJ25.1-2019），采用判断布点法，调查区域平均土壤布点密度为40 m×40 m，污染严重区域以20 m×20 m网格布点控制，共布设64个采样点位，采集463份土壤样品，样品深度范围0—5 m，每个采样点深度依污染源情况而定. 0—3 m 深度每隔0.5 m采集1个样品，深度超过3 m 时根据地层特性和光离子化检测仪（PID）快速检测数据，决定土壤样品的采集深度. 采样过程中，通过手持式GPS进行定位，SH-30型钻机钻取土壤样品，土壤样品从钻具中取出后，撇去植物根系与石块等杂物，装入250 mL棕色顶空瓶，加入保护剂，将样品瓶放入冷藏保温箱中低温避光保存（温度不超过4 ℃），当天送往实验室进行检测.
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依据《土壤和沉积物 12种金属元素的测定 王水提取-电感耦合等离子体质谱法》（HJ803-2016）测定土壤样品的重金属含量. 土壤研磨充分，过100目尼龙筛后，取0.1 g土样于消解罐中，加入6 mL王水（由1.19 g·mL−1的HCL溶液和1.42 g·mL−1的HNO3溶液按照体积比3 : 1混合配制而成），放入微波消解仪进行消解. 冷却后，将提取液收集于50 mL容量瓶，加蒸馏水定容，使用820—MS 型ICP—MS 质谱仪对重金属含量进行测定[11].
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参照《土壤和沉积物 多环芳烃的测定 气相色谱-质谱法》（HJ805-2016） 测定土壤中多环芳烃的含量.
（1）样品前处理
土壤样品中加入适量无水硫酸钠，进行脱水研磨成细粒状（约1 mm）；取20 g土样于离心管，加入适量体积比为1:1的丙酮-正己烷混合溶液（ρ=500 µg·mL−1）进行加压流体萃取；将提取液转移至浓缩器皿中，浓缩至2.0 mL，并经硅酸镁净化小柱净化后，用丙酮-正己烷混合溶剂定容至1.0 mL，混匀后转入2 mL样品瓶中，待测[12].
（2）仪器分析与质量控制
土壤样品中的PAHs采用色谱-质谱仪（GC-MC）检测，色谱条件为：进样口温度为280 ℃，流量为1 mL·min−1，进样量1.0 μL，氦气为载气，不分流进样. 升温程序：柱起始温度80 ℃，保持2 min，然后以20 ℃·min−1速率上升至180 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min−1的速率上升至290 ℃，保持5 min. 质谱条件：离子轰击电离源（EI源），电子能力70 eV，传输线温度为280 ℃，离子源温度为250 ℃，扫描范围（m/z）45—450 amu，全扫描模式.
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为评价污染物生态风险，对土壤中重金属采用内梅罗综合污染指数法评价，对多环芳烃污染物采用质量基准法评价.
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内梅罗综合污染指数法是当前国内外进行综合污染指数计算的最常用方法之一[13-14]，该方法能够突出污染物最大含量对环境质量的影响和作用，综合反映多种重金属的联合污染水平. 计算公式如下：
式中，Ci、C0、Pi分别为土壤样品中污染物的实测值、《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB366000-2018）中第一类用地筛选值（下文称筛选值）以及单因子污染指数；P、Pmax、Pave分别是内梅罗综合污染指数、单因子指数的最大值和平均值，依据《土壤环境监测技术规范》（HJ/T 166-2004），其分级标准见表1.
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采用国内外常用的质量基准法对场地不同功能区的多环芳烃生态风险进行评价[4, 15]，公式如下：
式中，QME为平均效应区间中值商；Ci为土壤中多环芳烃的实测值，mg·kg−1；Ei为多环芳烃的效应区间中值，mg·kg−1，见表2；n为多环芳烃的种类，此处为16；质量基准法风险等级划分见表3.
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采用SPSS 22.0和Excel 2019对土壤中重金属和多环芳烃含量数据进行统计分析，结合origin 2018制图；采用反距离插值法（IDW）[16]对场地的重金属和多环芳烃空间分布特征进行分析，并采用surfer 15绘制场地污染物空间分布图.
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场地中0—3 m土壤样品中的污染物含量如表4所示. 与筛选值相比，重金属中仅有Pb和As两种超过筛选值，最大检测值分别为1190 mg·kg−1和956 mg·kg−1，最大超标倍数分别为1.98、22.9，样品超标率分别为17%、8.33%；与湖南省土壤元素背景值[17]（Pb＝29.7 mg·kg−1、As=14 mg·kg−1）相比，最高含量分别是背景值的40.07倍和68.3倍. 多环芳烃中Nap、Phe、BaA及BaP超过筛选值，最大检测值分别为255、266、8.5、8.5 mg·kg−1，最大超标倍数分别为9.2、52.2、0.55及14.5，样品超标率分别为8.3%、14.3%、13.3%和15%，且场地内0—3 m土壤中的低环PAHs（2—3环）含量明显高于土壤高环PAHs（4环及以上）含量.
变异系数的大小能够反映污染物在土层间的平均变异程度以及污染物受外界因素的影响程度[18]. 如表4所示，场地表层、中层和下层的污染物变异系数范围分别为0.83—2.92、0.77—2.32、0.72—2.0，均属于高度变异，表明场地内污染物含量受焦化厂生产活动的影响很大，在土层间均具有波动幅度较大、连续性变化差的特点. 研究区整体偏弱碱性，0—1 m、1—2 m、2—3 m深度的土壤pH值范围分别为5.86—7.62、6.43—7.84、6.72—8.87，平均值分别为6.83、7.35和7.94.
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运用反距离插值法（IDW）分析获取了厂区土壤重金属的污染羽分布图（图2）. 重金属Pb和As的污染主要集中在煤库/煤棚、焦炉、鼓冷车间等区域. Pb集中分布在B2点位（焦炉）、B13点位（鼓冷车间）、B15点位（煤库）及B26点位（气柜），以B2点位和B13点位的0.5 m污染物浓度最高，为1190 mg·kg−1，超标倍数为2.96倍，污染超标最大深度为2 m；As的污染范围较广，浓度最高值在煤棚附近S15点位的0.5 m，浓度为956 mg·kg−1，超标倍数为22.9倍，最大污染超标深度为4 m；另外，As在气柜、脱硫车间及食堂等区域零星分布，超标较轻，污染超标深度不超过2 m. 经调查分析可知，在本场地中，Pb和As集中分布在土壤表层，浓度随深度增大而逐渐减小，中层和下层的重金属浓度远小于表层，尤其在煤棚附近区域更加明显.
场地内土壤污染物的空间分布特征与土壤理化性质及污染物本身物化性质息息相关. Pb、As集中分布的土壤浅层，垂向上浓度随深度增大而减小，这可能与土壤质地有关，场地浅层（0—3 m）土壤以杂填土为主，渗透系数K较小，在一定程度上限制污染物的运移；而场地内表层土壤（0—1 m）的pH值在5.86—7.62之间，基本呈现弱酸性，较中层和下层的土壤pH小，有利于重金属在表层迁移[19]；重金属污染深度一定程度上能够反映其在土壤中的迁移能力，Pb和As的最大污染深度分别为2 m和4 m， 即砷的迁移能力强于铅，这与Zheng关于郴州某大型有色冶炼厂重金属空间分布的研究一致[20-21].
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通过反距离插值法（IDW）分析厂区土壤PAHs的空间分布特征（图3）. 场地PAHs的污染主要集中在场地的煤库/煤棚、鼓冷车间、洗苯脱苯车间、制冷站、沉淀池及气柜等区域. 场地不同区域中低环PAHs和高环PAHs分布存在着明显差异. 以Nap和Phe为代表的低环PAHs集中分布在洗苯脱苯车间、沉淀池及鼓冷车间附近区域，整体上随深度的增大呈现先升高再降低的变化规律，在深度3—4 m时出现最大值，最大污染深度为5 m. 以BaA和BaP为代表的高环PAHs分布在鼓冷车间和焦炉、煤仓附近，集中在表层土壤，浓度随深度增加而减小，最大污染深度为3 m. 总体来看，所有点位的低高环PAHs比值均大于1，且深层土壤的低环与高环PAHs比值高于表层，说明低环PAHs是场地多环芳烃污染的主体，这与孟祥帅等关于某工业区焦化厂PAHs分布特征的研究成果一致[22].
与低环PAHs相比，高环PAHs水溶性较低，不易随地下水迁移至土壤深部. 另外，土壤中有机质与高环PAHs通过Π-Π键结合更为紧密[23]，阻止其向下迁移，因此多集中于土壤表层或次表层. 而低环PAHs水溶性强，具有较好的迁移性能[24]，这使低环PAHs污染深度大于高环PAHs的污染深度. 低环PAHs浓度随深度增大呈现先增大后减小的变化规律，主要是因为场地内3—5 m内粉质粘土的阻隔作用，相对杂填土而言，粉质粘土具有更小的渗透系数和孔隙比，能够有效阻止低环PAHs的运移. 因此，粉质粘土层中的PAHs含量较少，而在杂填土和粉质粘土交界处，往往会出现低环PAHs的富集现象.
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污染物的来源是否一致可通过相关性分析进行确定[25]，利用皮尔逊相关系数对重金属Pb、As及PAHs中的Nap、Phe、BaA和BaP进行相关性分析（表5）. 结果表明，PAHs之间均为显著正相关，低环PAHs之间的相关系数达0.94，高环PAHs之间的相关系数达0.802，而低高环PAHs之间的相关系数均小于0.6，为弱相关. 重金属之间也呈现显著正相关性，Pb、As之间的相关系数达0.648，重金属污染物与PAHs基本不相关，相关系数较低. 由此分析可知，重金属Pb与As可能具有相同的来源，各多环芳烃来源一致，但重金属与多环芳烃的来源不相同.
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主成分分析是判别污染物来源的有效手段. 采用KMO和Bartlett法对土壤中重金属和PAHs含量进行检验，得到KMO为0.545（＞0.5），Bartlett球度检验的相伴概率为0.000（＜0.005），表明可以进行主成分分析[26]. 提取出两个特征值大于1的成分[27]，为了提高数据真实性，使用最大方差法，计算出旋转后的成分矩阵，累计方差贡献率为75.28%，具有较高的代表性，结果如表6所示.
第一主成分的贡献率最高，为49.06%，4种PAHs在第一主成分上具有较大荷载. 结合表6可知，4种PAHs具有显著相关性，4种PAHs受到相同污染源的影响. 经分析判断认为，研究区焦化过程中的鼓冷、脱硫、冼氨、洗苯脱苯及沉淀过程产生的废气、废水和废渣都是PAHs的主要来源.
另外，在已有的研究中，可用低环PAHs与高环PAHs的比值来指示PAHs的来源，有研究认为[28-30]，低环PAHs主要来源于石油、化石燃料的低温分解，而高环PAHs主要来自各类煤的高温燃烧. 综合场地PAHs污染羽的分布和场地环境调查结果，场地各个功能区的低环PAHs/高环PAHs的比值均大于1，推断认为这是焦油渣及萘油、苊油等油液副产品作为中间产物在堆存和生产过程中发生了遗撒泄露. 而高环PAHs主要来源为焦煤、气煤等生产原料的不充分燃烧. 在炼焦过程中，排放的烟尘为高环PAHs的富集相，在受到干、湿沉降作用后分布于表层土壤[31- 32]，这也是造成高环PAHs主要集中于浅层土壤的原因之一.
第二主成分的贡献率为26.22%，较大荷载为重金属Pb和As，表6也显示Pb和As具有极显著相关性. 结合场地历史调查，认为重金属Pb、As主要来自厂区煤库/煤棚及仓库区堆存的铅精矿粉，由于厂区的煤仓处于半封闭状态，矿粉长期遭受雨水淋滤，其中的重金属成分在地表径流作用下水平运移和下渗扩散，导致周边环境的Pb和As污染.
图4中污染物间的距离也反映了污染物之间的相关性，重金属Pb和As表现出较强的相关性；4种PAHs之间距离较近，具有很强的相关性，而重金属与PAHs则显示出较强的异源性.
由污染物污染羽分布状况分析，具有不同来源的重金属及PAHs在煤库/煤棚、制冷站及鼓冷车间等区域的土壤环境中相互共存，这种复合污染主要是由于重金属和高环PAHs均容易被吸附沉淀，在经过迁移后在场地部分区域形成复合污染[33]，也可能由生产原料及废弃物的随意堆砌等多方面原因造成的.
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根据内梅罗综合污染指数法评价了场地土壤污染水平，如图5所示. 由5（a）图可以看出，重金属Pb的单因子污染指数在0.396—2.975之间，平均值1.49，基本上处于清洁—轻度污染，As的单因子污染指数范围为1.015—23.9，平均值4.34，整体上处于轻度—重度污染. 由图5（b）分析可知，场地大部分区域为清洁—轻度污染，中度风险及重度风险主要集中在煤棚/煤库、鼓冷车间及气柜等区域，与重金属Pb、As的空间分布具有高度一致性，表明场地土壤重金属污染主要受Pb、As元素的影响，进一步证实了Pb和As是场地重金属污染的主要元素.
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采用质量基准法，计算场地土壤PAHs的QME值，计算结果如表7所示. 场地整体上处于低生态风险或无生态风险. 其中，洗苯脱苯车间、煤库/煤棚、制冷站的QME值分别高达21.07、15.69及3.36，远高于1.51，为高生态风险；气柜的QME值为1.42，属于中生态风险. 高生态风险区域与PAHs高浓度区域基本一致，洗苯脱苯车间为低环PAHs集中分布区域，其QME值为场地最高值，也证实了场地多环芳烃污染主要以菲、萘等低环PAHs为主.
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（1）场地0—3 m土壤中，重金属Pb和As的最大超标倍数分别为1.98、22.9，超标率分别为17%和8.33%，PAHs中Nap、Phe、BaA及BaP的最大超标倍数分别为9.2、52.2、0.55及14.5，超标率分别为8.33%、14.3%、13.3%及15%. 重金属和PAHs污染在场地中分布均表现出明显的空间差异性，集中分布在煤库/煤棚、鼓冷车间、洗苯脱苯车间等区域.
（2）重金属Pb、As及高环PAHs集中分布在土壤表层，浓度随深度增加而呈现减小趋势；低环PAHs浓度随深度增加呈现先增大后减小的变化规律，浓度最大值分布在杂填土层与粉质粘土层交界处.
（3）污染物主要来源于原企业的生产活动，4种PAHs具有相同的来源，重金属与PAHs的来源不相同，但来源不同的重金属与PAHs经过土壤迁移后在场地的煤库/煤棚、鼓冷车间及制冷站等区域形成复合污染.
（4）内梅罗综合污染指数表明，场地大部分区域的重金属污染为轻度污染，气柜、煤库/煤棚、制冷站等区域基本处于中度—重度生态风险，质量基准法显示场地内PAHs在大部分区域为低生态风险或无生态风险，在气柜、制冷站、煤库/煤棚、鼓冷车间及洗苯脱苯车间等区域处于中—高生态风险状态.
某焦化场地重金属与多环芳烃复合污染特征与评价
Co-contaminated characteristics and assessment of heavy metal and polycyclic aromatic hydrocarbons in a coking site
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摘要: 调查与分析焦化遗留场地的土壤复合污染特征是土地安全再利用的基础. 以某焦化场地为例，采集0—5 m深度范围内的土壤样品，测定其中的重金属与PAHs含量，并运用反距离插值法分析场地重金属与PAHs的污染特征，采用内梅罗综合污染指数法评估焦化场地重金属的污染程度，质量基准法评价PAHs的生态风险. 结果表明：污染物分布的空间差异性明显，重金属与高环PAHs集中分布在0—1 m表层土壤，低环PAHs在杂填土与粉质粘土交界处呈现富集状态；重金属与PAHs的来源不同，但经迁移后在场地煤库、鼓冷车间及制冷站等区域共存形成复合污染；内梅罗综合污染指数评价表明，场地内气柜、煤库/煤棚、制冷站区域为中度—重度污染，质量基准法表明气柜、鼓冷车间、洗苯脱苯车间及煤库/煤棚处于中—高生态风险. 本研究结果能够为焦化场地的后续土壤修复工程及生产工艺优化提供参考.Abstract: Investigating and analyzing the compound pollution characteristics of coking site is the basis of land safe reuse. Taking a coking site as an example, soil samples at 0—5 m depth were collected to measure the content of the heavy metals and PAHs, The pollution characteristics of heavy metals and PAHs in the site are analyzed by using the inverse distance interpolation method, and the pollution degree of heavy metals in the coking site is evaluated by using the Nemero comprehensive pollution index method, the ecological risk of PAHs is evaluated by using the quality benchmark method. The results show that the distribution of pollutants has obvious spatial differences. Heavy metals and high molecular weight PAHs are concentrated in the 0—1 m surface soil, then the concentration of low molecular weight PAHs presents an enrichment state at the junction of miscellaneous fill and silty clay; The sources of heavy metals and PAHs are different, but they coexist and form compound pollution in coal bunker, blast cooling workshop and refrigeration station of the coking site after migration. The evaluation results of the Nemero comprehensive index show that they are moderately—severely polluted in gasholder, coal depot/coal shed, refrigeration station. The quality benchmark method shows that the gasholder, refrigeration station, coal depot/coal shed, drum cooling workshop, and benzene washing and debenzylation workshop are in medium—high ecological risk. The results of this research can provide guidance for the subsequent soil remediation project and production process optimization of coking site.
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Key words:
- co-contaminated site /
- PAHs /
- heavy metal /
- distribution characteristics /
- pollution assessment.
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邻苯二甲酸酯类化合物（phthalate esters， PAEs）是邻苯二甲酸酐与醇反应生成的化合物，它是提高聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）弹性的重要添加剂，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是目前使用量最大的一种邻苯二甲酸酯，用量高达80%[1]. DEHP广泛应用于儿童玩具、塑料包装、化妆品及各类医疗器械[2-3]. DEHP的广泛使用导致了不可避免的环境释放以及人体摄入. 大量实验指出我国人群DEHP的暴露剂量约为11—116 μg·kg−1·d−1，接近DEHP的每日可耐受摄入量（TDI）（20—140 μg·kg−1·d−1），表明 DEHP对人群的健康构成重大危害[4].
DEHP具有内分泌干扰效应，可以诱发生殖发育毒性、肝脏毒性、胚胎毒性等多种毒性[5-6]. DEHP通过消化道进入人体后在胃肠道的脂肪酶作用下水解成初级代谢物乙基己醇（2-EH）和邻苯二甲酸单乙基己基酯（mono-ethylhexyl phthalate，MEHP），再通过尿液排出体外[7]. 通过对尿液的单酯类物检测发现，原尿和酶解后的尿液中 MEHP 的检出率最高，平均检出率超过60% [8]. 此外，试验结果表明DEHP的毒性主要来源于其代谢物 MEHP，其毒性作用高达DEHP的10倍[9]. 同时，MEHP的动物实验表明，其主要分布在肾脏、膀胱和肝脏，其中肝脏为MEHP最主要的靶器官[10]. Thomas等的研究中，大鼠口服500 mg·kg−1 DEHP，30 min后，肝脏MEHP水平为12.5 mg·g−1 [11]. MEHP毒性作用主要体现在增加肝脏亲脂活性，导致肝脏中出现脂肪堆积，继而引发肝细胞脂肪变性[12].
肝脏在体内发挥着外源物质解毒和代谢脂类物质的主要作用. 肝脏内游离脂肪酸增加和甘油三酯沉积是肝脏脂质代谢紊乱的主要表现. 近年来，全球肥胖病与非酒精性脂肪肝患病率快速上升. 体内体外实验提示脂肪代谢紊乱会增加肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝病的患病危险度. 流行病学和毒理学研究报告称，接触DEHP会影响机体脂肪代谢，从而促进肥胖[13]. 体内实验表明大鼠用DEHP处理后，肝脏重量增加，主要机制可能与肝代谢酶改变有关[14]. 有体外实验表明，MEHP处理HepG2细胞后，激活了PPARα使脂肪酸的氧化分解受到抑制[9]，导致肝细胞内的脂质堆积并造成肝脏损伤. 在本课题组的前期研究发现，MEHP 处理后的HepG2 细胞的乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的亚型ACC1蛋白表达水平增加，最终使肝脏细胞中脂肪酸合成增加. 这些结果表明，MEHP 可能通过影响脂质合成相关基因或蛋白的表达，从而导致肝细胞脂肪代谢出现紊乱. 为此，本实验以HepG2细胞为实验对象，通过MEHP染毒，观察细胞内脂质代谢情况，并通过基因芯片高通量筛查差异基因，探讨MEHP对体外脂质合成的影响及其可能的作用机制.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 细胞培养与染毒
从中国科学院上海生命研究院细胞资源中心购买HepG2细胞. 细胞培养基含 10%胎牛血清、1%青霉素庆大霉素双抗. 细胞培养条件为37 ℃、5% CO2. 取指数生长期的细胞进行染毒，参考相关文献[9]及我国人群接触水平设置染毒浓度. 共设置5个染毒浓度 ：阴性对照（完全培养基）、阳性对照（1 mmol·L−1油酸）、0.01 、1 、10 μmol·L−1MEHP. 染毒48 h后进行相关实验.
1.2 细胞油红 O 染色
为了研究细胞中脂滴的蓄积，用油红O法对HepG2细胞进行染色. 5个实验组的细胞染毒48 h后进行染色. 主要步骤为：弃去孔中废弃培养基，用 PBS 漂洗细胞，4%（质量分数）多聚甲醛固定细胞，油红O染色30 min，60%（体积分数）异丙醇洗去多余染料，苏木精复染细胞核10 s. 用显微镜获取图像并观察细胞内脂滴情况.
1.3 芯片数据以及数据前处理
用1 μmol·L−1 MEHP处理的细胞进行芯片分析，Agilent （人）表达谱芯片由博奥晶典公司完成. 步骤如下：以待检测样品的 total RNA 为起始，进行体外扩增和荧光标记，然后用Oligo（dT）Primer 引物合成cRNA并进行纯化和反转录得到cDNA. 最后用 Klenow Fragment 酶合成带有荧光基团的DNA 进行芯片杂交. 用 Feature Extraction 提数软件对芯片杂交扫描后的图片数据进行处理分析.
1.4 差异基因的筛选
通过Ｒstudio limma包将芯片基因的数据进行处理，以表格格式导出并进一步筛选差异表达基因. 差异表达基因（DEG）定义为差异倍数 FC大于 1.5或小于0.67且 P值小于 0.05的基因.
1.5 DEG功能富集分析
将上述分析得出的DEG导入 DAVID在线数据库（
https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp ），进行GO分析. 通过对显著表达的基因进行功能注释分析，包括生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），进而了解差异表达基因的生物学意义. 以 P<0.05认为具有显著性.1.6 PCR验证
按照1.1节对处于指数生长期的细胞进行染毒，每个实验组设置6个平行对照，染毒48 h后提取RNA. 细胞样品用Trizol试剂裂解，提取总RNA. 用超微量分光光度计测定RNA的含量和纯度. 将符合条件的RNA （A260/A230>2.0，和A260/A280=1.8—2.0）样本用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA备用.
从具有显著性且参与脂质代谢过程的差异基因中选取丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基2（PDP2）、磷脂酶A2组 IVE（PLA2G4E）、脂肪酸去饱和酶 6（FADS6）、Q型蛋白酪氨酸磷酸酶受体（PTPRQ）、CD28、甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）作为目的基因，检测mRNA表达水平（荧光定量PCR仪为Line Gene 9600）. 引物信息如表1所示. 以GAPDH为内参，数据分析时取Ct值的平均值，用相对定量法2−△△ct法计算目的基因表达的变化情况. 采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，多组间比较使用单因素方差分析，事后比较用LSD 检验进行，P<0.05认为具有统计学意义.
表 1 实时定量PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time quantitative PCR基因Gene 引物Primer PDP2 S——GAAGATGAGGTGACAAGGAA F——GCCAGCACAAG MVD GAACTTA PLA2G4E S——TTCTGTCCTATGGCTCCTT F——GTTCTTCACTCGGCTCTG FADS6 S——CCTCAACCGCTATGTCTAC F——CGATGTGCTGGAAGATGT PTPRQ S——ATGTCTATATTGCGGCTGAA F——TTCTTACTTGCGTGGATTCT CD28 S——GCTCTTGGCTCTCAACTTA F——CCTGCTCCTCTTACTCCT SC5D S——CTTGCTGGAGATAAGAGGTT F——TATGGTGGTCTGTATGATGAG MVD S——CAAGGACTTCACCGAGGA F——GTAGGCTAGGCAGGCATA | Show Table
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1.7 基因表达谱数据动态分析
将细胞脂质代谢通路的基因输入 GEPIA 在线分析网站（http://gepia.cancer-pku.cn/），分析其在肝癌组织中的表达. P<0.05认为具有统计学意义.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 油红O 染色结果
如图1所示，阴性对照组细胞有明显的边界，细胞内没有脂滴存在. 油酸染毒的细胞可见大量明显着色的脂滴，主要分布在细胞膜内侧区域，大小不等. 与阴性对照组相比，0.01 μmol·L−1 MEHP剂量组未见明显改变；1、10 μmol·L−1 MEHP剂量组可观察到少量红色脂滴，且随着染毒浓度的增大，脂滴的数量也逐渐增加，暂时未见对细胞边界的影响. 在前期实验中本课题组对MEHP染毒的HepG2细胞中的甘油三酯（TG）含量进行了定量检测， TG含量结果与油红O染色结果相一致，提示较高剂量 MEHP 暴露可提高细胞中的脂质水平[8]. 这一结果表明， MEHP暴露后，导致HepG2细胞中的甘油三酯蓄积，从而引起肝细胞中的脂质沉积.
图 1 不同浓度MEHP染毒对HepG2细胞内脂肪积累的影响（×400）Figure 1. Effects of different concentrations of MEHP on lipid accumulation in HepG2 cells（×400）A:光镜下未染色HepG2细胞；B:阳性对照组；C:阴性对照组；D、E、F：0.01、1、10 μmol·L−1 MEHP组. →为 HepG2 细胞内红色脂滴.A: HepG2 cells were not stained under light microscope; B: Positive control group; C:Negative control group; D、E and F: 0.01、1 and 10 μmol·L−1 MEHP groups; →represents red lipid droplets.2.2 差异基因筛选
如图2所示，根据P<0.05，FC>1.5或<0.67的筛选标准，共筛选出93个差异表达基因（表2），其中上调的基因57个，下调的基因36个.
表 2 差异基因的表达情况Table 2. The expression of differentially expressed genesUp Down symbol lgFC P.Value symbol lgFC P.Value DPPA3 0.743871 0.000032637 TTTY14 −0.75345 0.000683968 MYLIP 0.685596 0.000320629 XLOC_008352 −0.691 0.001413602 XLOC_000888 0.664559 0.000498704 LOC100129112 −0.83639 0.001799658 LOC100127994 0.609364 0.00056601 SC5D −0.92097 0.002090916 SYT17 0.650856 0.000986627 XLOC_004178 −0.72657 0.002192512 XLOC_008003 0.727595 0.00115933 C14orf119 −0.78947 0.003595082 LOC100506487 0.589801 0.001543009 XLOC_l2_012082 −0.61338 0.004605101 FADS6 0.784036 0.002373877 XLOC_012908 −0.92876 0.006283058 AQP10 0.603687 0.00355145 GABRG1 −1.01945 0.007994 XLOC_001387 0.675839 0.003916862 NUMB −0.57939 0.008775398 KCNE4 0.831973 0.003949384 FLJ21408 −0.61905 0.009899712 XLOC_005215 0.65671 0.004608305 LOC100505657 −0.89616 0.010826125 OR5L1 0.922639 0.004609802 ZNF554 −0.60913 0.011699612 C14orf180 0.649561 0.005207664 XLOC_012871 −0.78553 0.01385829 RHOXF1 0.622636 0.007822227 XLOC_007131 −0.7273 0.014006601 PTPRQ 0.739332 0.008548009 XLOC_l2_014785 −0.66169 0.01855114 LOC286382 0.586815 0.008726912 PRO0611 −0.78996 0.018748849 ACOD1 0.61305 0.008957375 CREG2 −0.70749 0.018758137 LOC100130744 0.85844 0.009748146 XLOC_l2_004857 −0.66225 0.023632428 ZAP70 0.625018 0.010183849 PDP2 −0.80976 0.023933353 PLA2G4E 1.427762 0.011394311 XLOC_l2_011207 −0.57923 0.026335268 LOC652586 0.614123 0.011818286 XLOC_007761 −0.58384 0.027416794 XLOC_006019 0.666199 0.012002598 GNL3LP1 −0.6286 0.027632132 SLAMF7 0.896594 0.013447959 XLOC_l2_013646 −0.89314 0.028992205 XLOC_005433 0.588529 0.014072632 MVD −0.63712 0.031037423 KRTAP13-2 0.681023 0.014111061 LOC728065 −0.58089 0.031598939 XLOC_008237 0.804098 0.01445258 XLOC_l2_011011 −0.60147 0.033573436 XLOC_008244 0.677154 0.01652238 XLOC_001687 −1.03697 0.037696163 LOC100505966 0.836326 0.01818776 XLOC_004804 −0.68571 0.039579631 XLOC_001422 2.454291 0.018227482 LOC100507110 −0.60107 0.041523521 CSN2 1.0231 0.020348553 CACNG8 −0.61314 0.041704333 XLOC_003782 0.639271 0.021116476 SNORD70 −0.92894 0.044259091 XLOC_005572 0.585382 0.02204518 LOC100128126 −1.05439 0.044856832 XLOC_003349 1.233979 0.022738339 NPPA-AS1 −0.59523 0.048087643 XLOC_l2_00770 0.610547 0.023106187 XLOC_001550 −0.64752 0.04894801 SNORD115-48 0.719119 0.024508996 INE1 −1.017 0.0496582 SNORD115-4 0.688309 0.026211298 XLOC_001755 0.605516 0.028061446 ANK2 0.906401 0.029169596 CD28 0.589859 0.029610282 LOC100506563 1.019834 0.029837404 ANXA10 0.626939 0.030222491 CYBB 1.151916 0.03336549 XLOC_012064 1.019834 0.0345969 XLOC_013649 0.624561 0.035226312 XLOC_010183 1.380268 0.035959747 XLOC_006983 0.862151 0.040708371 XLOC_004274 0.720596 0.040795527 XLOC_008690 0.686422 0.041491936 XLOC_007888 0.852148 0.04152697 XLOC_l2_011145 0.704819 0.042378972 SLC24A4 0.757531 0.043335006 XLOC_013458 0.71734 0.043999913 TREML1 0.800135 0.047577606 TRIM49 0.796312 0.048328175 ANKDD1B 0.683738 0.049447534 DUSP21 0.604901 0.049510457 | Show TableDownLoad:
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2.3 差异基因的功能富集分析
通过对差异基因进行GO分析探讨差异基因所涉及的生物学过程，包括基因的３个部分：分子功能（MF）、细胞组分（CC）、生物过程（BP）. 结果显示，可以识别的基因一共有48个，显著富集的GO条目一共有13条（P<0.05），其中生物过程7条（图3）. 前5条通路及具体信息见表3，主要包括细胞脂质代谢过程（cellular lipid metabolic process）、T细胞阴性选择（negative T cell selection）、跨膜运输（transmembrane transport）、跨膜转运的调控（regulation of transmembrane transport）、先天免疫反应（innate immune response）；分子功能2条,包括被动跨膜转运活性（passive transmembrane transporter activity）、基质特异性跨膜转运蛋白活性（substrate-specific transmembrane transporter activity）；细胞组分4条，包括膜的外部成分（extrinsic component of membrane）、等离子体膜（plasma membrane）、质膜部分（plasma membrane part）.GO 分析表明, 最显著激活的通路是细胞脂质代谢通路，他由上调基因 FADS6、PTPRQ、CD28、 PLA2G4E 和下调基因 SC5D、PDP2、MVD 组成.
图 3 DAVID分析中生物过程通路的GO条目与基因Figure 3. Chord plot depicting the relationship between genes and GO terms of biological process表 3 DAVID分析中前5个通路（BP）与基因Table 3. Top 5 GO terms （BP） of the genes with the DAVID analysisGO TermGO 条目 Count数量 Genes基因 Fold Enrichment富集倍数 P Value P值 GO:0044255cellular lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 3.85628326776209 0.0068 GO:0045087innate immune response 5 TREML1, ZAP70, CYBB, ACOD1, SLAMF7 3.042438312 0.0494 GO:0055085transmembrane transport 7 SLC24A4, CACNG8, KCNE4, AQP10, CYBB, ANK2, GABRG1 3.024137931 0.0204 GO:0006629lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 5.660947851 0.0210 GO:0034762regulation of transmembrane transport 4 CACNG8, KCNE4, CYBB, ANK2 3.43652037617554 0.0300 | Show TableDownLoad:
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2.4 PCR验证
MEHP染毒后相关基因mRNA表达水平的变化如图4所示. 与阴性对照组相比，基因FADS6 在1 μmol·L−1 MEHP染毒样品内基因表达水平明显增加（P<0.05）；基因SC5D、PDP2在1 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05），MVD在10 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05）. 其中，基因SC5D、PDP2、MVD、FADS6的mRNA表达水平与芯片结果表达一致，基因PTPRQ、CD28、PLA2G4E结果不一致.
图 4 不同浓度MEHP染毒对 HepG2 细胞相关基因mRNA表达水平影响Figure 4. Effects of different concentrations of MEHP on mRNA expressions of relative genes in HepG2 cells本研究通过转录组数据分析探讨MEHP在HepG2细胞脂质代谢过程中发挥作用的基因，发现细胞脂质代谢通路上的基因FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E在代谢过程中起重要作用. 脂肪酸去饱和酶（FADS6）在多不饱和脂肪酸（PUFA）的合成途径中起关键作用，参与了PUFA合成过程中的限速步骤，并调节PUFA的代谢通量[15]. 据报道，FADS6的活性是调节生物体中多不饱和脂肪酸比例的主要因素,其活性改变会影响一些疾病，如炎症和肿瘤发生，2型糖尿病，心血管疾病，代谢紊乱和神经精神疾病[16]. Montell的研究发现，含不饱和脂肪酸的二脂酰甘油（DAG）比饱和脂肪酸的DAG对二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）有更强的亲和力，即肝脏合成 TG 首先利用不饱和脂肪酸, 更容易导致甘油三酯积累，而饱和脂肪酸多以 DAG 的形式蓄积[17].
本实验富集分析与PCR的结果显示，FADS6的mRNA表达水平升高，促进了HepG2细胞中多不饱和脂肪酸合成，这可能是HepG2细胞中甘油三酯合成增多进而出现脂肪堆积的原因. 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）参与胆固醇生物合成过程中的早期步骤. 通过Jump实验中转录组数据的KEGG分析显示，MVD参与SREBP激活基因表达、SREBP调节胆固醇生物合成、脂类和脂蛋白代谢等胆固醇代谢相关的通路，MVD的变化可调控乙酰乙酰-辅酶A的变化，进而改变）胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）的表达水平[18]，已有研究证明SREBP的上调导致肝细胞内胆固醇合成增加 [19] . 甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）是一种胆固醇生物合成酶，它催化乳甾醇（lathosterol）转化为7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol），参与胆固醇合成中的酶促反应通路[20]. 有文献报道SC5D基因缺陷会引起乳甾醇症（Lathosterolosis），一种罕见的常染色体隐性胆固醇生物合成障碍疾病[21]. SC5D基因在HepG2细胞中表达水平的改变导致细胞内胆固醇合成发生紊乱. 磷脂酶A2（PLA2）是一种参与脂蛋白代谢和炎症途径的酶，所产生的脂质介质对细胞代谢起重要调控作用. 有文献报道NAFLD病人血浆中PLA2水平和肝脏的脂肪变性程度呈显著正相关,这说明PLA2可能参与肝细胞代谢过程中[22]. 有研究证实PLA2过表达的肝脏甘油三酯（TG）含量显著增加，同时增加趋势与PLA2的表达趋势相一致[23]. PLA2G4E作为PLA2的一种，对肝脏细胞的代谢也有调控作用. 本研究中发现，芯片结果中PLA2G4E表达水平升高，提示PLA2G4E是MEHP诱导甘油三脂含量增加，扰乱肝细胞脂质代谢的原因之一.
2.5 关键差异基因的在肝癌中的表达
利用在线分析工具GEPIA分析以上基因在肝细胞癌组织的表达水平，如图5所示. 这7个基因在肝细胞癌组织中的表达变化对比正常组织没有显著性. 但是以上基因在HepG2肝癌细胞脂质代谢过程中的表达水平均具有明显改变，导致肝癌细胞脂质代谢紊乱、脂肪堆积.
图 5 关键基因在肝癌中的表达水平Figure 5. Relative expression comparison of key genes in liver cancer samples in GEPIA database非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种可逆性的疾病，但随着研究的不断深入， NAFLD的发病范围由单纯脂肪肝、脂肪肝、肝硬化发展到原发性肝细胞癌[24]. 多项研究证明NAFLD可逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH），从而导致肝硬化[25]，而肝硬化是除HBV、HCV引起原发性肝癌的另一主要原因. 因此假如高龄、胰岛素抵抗、肥胖等危险因素持续存在，NAFLD最终可引起肝癌. 同时Iris [26]的动物实验和Ertle[27] 的研究证实，NAFLD可不经肝硬化阶段发展为原发性肝癌. 由此可知，虽然以上基因在肝癌组织中的表达没有明显变化，但是对肝癌的前身——NAFLD发生发展具有重要作用.
3. 结论（Conclusion）
本研究以HepG2细胞为研究对象，结合油红O染色以及基因芯片等技术，发现MEHP暴露影响了细胞脂质代谢等信号通路，改变了关键因子FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E的表达水平，导致肝脏细胞中甘油三酯与胆固醇的合成增加，肝脏细胞出现脂肪蓄积. 综上所述，MEHP暴露可以通过改变细胞代谢相关基因引起肝脏细胞内脂质代谢紊乱.
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图 5 研究区单因子指数分布（a）及内梅罗综合污染指数空间分布（b）
Figure 5. Distribution of the single factor pollution index （a） and the Nemero comprehensive pollution index （b） in study area
表 1 土壤污染分级标准
Table 1. Soil pollution classification standard
单因子污染指数Single pollution index 污染水平Pollution grade 内梅罗综合污染指数Nemerow comprehensive pollution index 污染水平Pollution grade Pi≤1 清洁 P≤0.7 清洁 1<Pi≤2 轻度污染 0.7<P≤1.0 尚清洁 2<Pi≤3 中度污染 1.0<P≤2.0 轻度污染 Pi＞3 重度污染 2.0<P≤3.0 中度污染 P＞3.0 重度污染
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表 2 土壤中多环芳烃效应区间中值（Ei）参考值[4]（ mg·kg−1）
Table 2. Reference value of PAHs effect range median in soil（mg·kg−1）
多环芳烃 Polycyclic aromatic hydrocarbons Ei 多环芳烃 Polycyclic aromatic hydrocarbons Ei 萘（Nap） 2.10 苯并（a）蒽（BaA） 1.60 苊烯（Acy） 0.64 䓛（Chry） 2.80 苊（Ace） 0.50 苯并（b）荧蒽（BbF） 1.62 芴（Flu） 5.10 苯并（k）荧蒽（BkF） 1.62 菲（Phe） 1.50 苯并（a）芘（BaP） 1.60 蒽（Ant） 1.10 二苯并（a,h）蒽（DahA） 0.26 荧蒽（Fla） 0.54 苯并（g,h,i）苝（BghiP） 1.60 芘（Pyr） 2.60 茚并（1,2,3-cd）芘（InP） 1.60
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表 3 质量基准法风险等级划分
Table 3. Soil average effect interval quotient QME risk classification
Q ME≤0.1 0.1—0.5 0.5—1.5 ≥1.5 风险等级（Ecological risk） 无 低 中等 高
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表 4 焦化厂遗留场地污染物含量分析
Table 4. Pollutants concentration in soil of coking site
土层Soil layer 污染物Pollutant 含量范围/（mg·kg−1）C 平均值/（mg·kg−1）Cave 变异系数Coefficient of variation 筛选值/（mg·kg−1）Cfil 最大超标倍数Maximum exceedance 上层（0—1 m） Pb 8.5—1190 703.2 0.83 400 1.98 As 2.96—956 123.6 2.92 40 22.9 Nap 0.12—28.6 3.74 1.77 25 0.15 Phe 9.2—128 55.23 1.1 5 24 BaA 0.28—8.5 1.86 1.95 5.5 0.55 BaP 0.6—6.4 2.18 1.46 0.55 10.6 中层（1—2 m） Pb 10.2—298 194.64 0.77 400 — As 1.23—800 249.88 2.32 40 7.95 Nap 0.09—47.7 8.3 1.86 25 0.91 Phe 6.3—35.2 12.45 1.34 5 6.04 BaA 0.3—6.6 1.61 2.26 5.5 — BaP 0.6—4.4 0.84 1.35 0.55 7.0 下层（2—3 m） As 8.47—126 94.9 0.72 40 2.15 Nap 0.1—255 48.2 0.98 25 9.2 Phe 0.2—266 80.1 1.79 5 52.2 BaA 0.13—4.9 1.33 2.0 5.5 — BaP 1.1—8.5 3.7 1.05 0.55 14.5 注：场地调查区域土壤属于红壤/黄棕壤，砷的筛选值为40 mg·kg−1. Note: The soil in the site investigation area belongs to red soil/yellow brown soil, the filter value of As is 40 mg·kg−1.
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表 5 土壤多环芳烃相关性分析
Table 5. Correlation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil
因素Element Pb As Nap Phe BaA BaP Pb 1 As 0.648** 1 Nap −0.274 −0.163 1 Phe −0.161 −0.177 0.940** 1 BaA −0.048 −0.135 0.420* 0.418* 1 BaP −0.220 −0.111 0.594** 0.548** 0.802** 1 **. P＜0.01; *. P＜0.05.
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表 6 污染物主成分分析矩阵
Table 6. Component matrix of principal component analysis of pollutant
因素Element 初始因子荷载Initial factor load 旋转后因子荷载Factor load rotation PC1 PC2 PC1 PC2 Pb 0.224 0.889 0.209 0.893 As −0.192 0.861 −0.207 0.858 Nap 0.894 0.085 0.892 0.100 Phe 0.872 0.010 0.871 0.025 BaA 0.744 −0.181 0.747 −0.169 BaP 0.862 0.019 0.862 0.034 特征值 2.944 1.573 2.072 1.793 累计方差贡献率% 49.06 75.28 40.06 75.28
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表 7 场地土壤QME评价结果
Table 7. Soil QEM evaluation results of the site
项目Project 煤库/煤棚Coal depot 鼓冷车间Drum cooling workshop 制冷站Refrigeration station 气柜Gas holder 洗苯脱苯车间Benzene washing and debenzylation workshop QME 15.69 18.91 3.36 1.42 21.07 污染程度 高生态风险 高生态风险 高生态风险 中生态风险 高生态风险
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