碳酸酐酶的固定化及其在二氧化碳转化中的应用

詹悦; 王新; 宋雨轩; 时翔宇

doi:10.7524/j.issn.0254-6108.2022040302

碳酸酐酶的固定化及其在二氧化碳转化中的应用

沈阳工业大学环境与化学工程学院，沈阳，110870

通讯作者: E-mail: wangxin110870@sut.edu.cn;

基金项目:
国家自然科学基金（21976124）和辽宁省应用基础研究计划项目 (2023JH2/101300059)资助.

Immobilization of carbonic anhydrase and its application in carbon dioxide conversion

School of Environmental and Chemical Engineering, Shenyang University of Technology, Shenyang, 110870, China

Corresponding author: WANG Xin, wangxin110870@sut.edu.cn ;

Fund Project: the National Natural Science Foundation of China (21976124) and Applied Basic Research Plan of Liaoning Province (2023JH2/101300059)

摘要: 碳酸酐酶（CA）作为生物系统中典型的含锌金属酶，可高效催化CO₂的可逆水合反应. 为了提高CA在实际工业应用中的利用率，本文介绍了传统固定化方法和新型固定化方法（交联酶聚集体和纳米花），阐述了CA催化CO₂的水合机理，总结了固定化CA矿化CO₂生成CaCO₃；CA促进单一溶剂（纯水、碳酸盐溶剂和醇胺溶剂）和混合溶剂吸收、解吸CO₂；固定化多酶级联（碳酸酐酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶）催化CO₂生产甲酸和甲醇的过程，以及其实际工业应用的最新进展. 未来的研究方向应集中于从转基因生物中提取大量CA，进一步研究CAs相关基因的生理作用和代谢途径，制备高性能的载体和研发先进的固定化方法.
- 碳酸酐酶 /
- 固定化 /
- 二氧化碳转化.
Abstract: Carbonic anhydrase (CA), as a typical zinc-containing metalloenzyme in biological systems, which can efficiently catalyze the reversible hydration of CO₂. In order to improve the utilization of CA in practical industrial applications, traditional immobilization methods and novel immobilization methods (cross-linked enzyme aggregates and nanoflowers) are introduced in this paper, and the mechanism of CA-catalyzed CO₂ hydration is described. The process of immobilized CA mineralizing CO₂ to generate CaCO₃ is expounded. The procedure of CA to promote the absorption and desorption of CO₂ in single solvent (pure water, carbonate solvent and alcohol amine solvent) and mixed solvent is summarized. The procedure of immobilized multi-enzyme cascades (carbonic anhydrase, formate dehydrogenase, formaldehyde dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, and glutamate dehydrogenase) catalyzing CO₂ to produce formic acid and methanol, and the latest progress in its practical industrial application are reviewed. Future research directions should focus on extracting large amounts of CA from transgenic organisms, further studying the physiological roles and metabolic pathways of CAs-related genes, as well as preparing high-performance carriers and developing advanced immobilization methods.
- carbonic anhydrase /
- immobilization /
- carbon dioxide conversion.

铅锌矿在中国矿产资源体系中占据着至关重要的地位，是工业领域的“关键基石”. 我国已勘铅锌资源主要集中于7个省区，储量约占全国66%，其中就包含甘肃省^[1]. 在矿业开采与工业加工进程中，废液未经妥善处理随意排放，废渣堆积成山，加上雨水冲刷，致使 Cd、Hg等有害成矿、伴矿元素不断迁移、扩散，对周边土壤造成污染. 同时，由于土壤重金属污染的累积性^[2]，使其在土壤中的浓度越来越高，最终对生态系统造成危害^[3]. 统计数据显示，我国有超过2000万 hm²的农田土壤存在重金属污染情况，当中被工业废渣污染的农田约10万 hm²，因采矿而污染的土壤面积约20万 hm^2[4]. 一旦土壤重金属富集至特定程度，便会对农作物质量产生直接影响，有研究表明，国内每年由于土壤重金属污染而导致的粮食安全损失高达1.2×10⁸ t，直接造成的经济损失逾 200 亿元^[5]. 其毒性效应可经食物链传递至人体，引发骨骼疼痛、肾脏疾病等健康问题，对人类健康构成了极大的威胁^[6].

目前国内外学者对土壤重金属源解析的方法主要包括判别污染源类别和精准解析污染源两部分^{[7 − 9]}，前者包括相关性分析法、主成分分析法和聚类分析法等，后者包括绝对因子得分-多元线性回归法和正定矩阵因子分解法（positive matrix factorization，PMF）等. PMF是对污染源进行精确分析的首选方法，该方法操作简单，可同时满足不确定性和非负性约束^[10]，能够自动化地处理错误和缺失数据，不需要源组分图就能得到精确、可信的结果，因此被美国环保署优先推荐使用^[11]. PMF 源解析虽能识别土壤重金属污染源，但难以精准量化其生态风险和健康风险，从而无法确定首要管控要素^[11]. 为此，学者们将PMF模型与生态风险、健康风险评价模型进行整合，成功提出重金属污染特定源的风险评价方法^[12]. 马杰等^[13]将PMF模型和健康风险模型结合，探讨了不同污染源影响下重庆市农产品主产区的土壤健康风险，确定研究区工业源和As为首要管控要素，重金属源解析成为后期尾矿库及其周围土壤修复或复垦的重要依据.

甘肃省陇南市矿产资源丰富，尾矿库数量多，以铅锌矿和金矿尾矿为主，占比分别为72.54%和15.5%^[14]. 当前，铅锌尾矿库及周边农田是土壤重金属污染的重点关注区域. 本文以此为研究对象，测定其土壤重金属含量，分析其污染状况，并在源解析的基础上结合生态风险和健康风险评估模型来量化各污染源相应风险贡献率，从而确定首要控制因素. 研究结果将为尾矿库周边农田土壤污染现状的调查和评价提供科学有效的理论依据.

1. 材料与方法（Materials and methods）

1.1 研究区概况

研究区地处徽县江洛镇赵湾村，隶属于甘肃省陇南市. 县名源自城北徽山之下的徽山驿，在北纬33°32'—34°10'、东经105°34'—106°26'之间，东接两当县，南连陕西省略阳县，西接成县，北通天水市秦州区与麦积区，西北衔西和县，总面积2699 km². 江洛镇处于徽县北部山地向中部河谷丘陵过渡区域，地势自北向南渐次降低，地形分为东南部河谷区，西北部山区；境内最高峰海拔2002 m. 江洛镇属暖温带大陆性气候；多年来气温的平均值为11 ℃，无霜期平均每年可达180 d，降水量的平均值为700 mm，降雨每年集中在7—9月. 2022年全县耕地总面积38.98万亩. 江洛镇境内已探明地下矿藏有铅、锌、硫、铁、金、煤等矿产资源，特别是铅、锌矿储量较大^[15]. 该尾矿库为山谷型，采用湿式排放方式，尾矿库现状总坝高26 m，初期坝坝高为15 m，堆积坝坝高11 m，库内堆存尾砂量约为23万m³. 该尾矿库未填埋，在工矿生产和矿渣储存过程中，土壤中的粉尘会在大气中沉积，受降雨和径流的影响，对矿区周围环境造成了严重影响，从而可能会引发一系列的生态环境安全问题.

1.2 样品的采集与处理

本文于2023年8月在甘肃省陇南市某铅锌尾矿库及其周边农田（北纬33°53'27''—33°53'43''、东经105°48'27''—105°48'41''）进行样品采集. 采用了简单随机布点法并结合专业判断法来布点. 为确保采样点布局的科学性与均匀性，本研究充分借助了地理信息系统的空间分析能力，结合网格化精密的划分手段，对整个研究区域进行布局（采样面积约为3.22 km²）^[1]. 采样时用GPS定位采样点经纬度，并根据样点采集顺序对其编号，在现场共布置了41个采样点，其中尾矿库8个，周边农田33个，如图1所示. 在每个采样点采集表层土壤（0—20 cm），样品放在密封袋里保存. 采集的样品经自然风干、去除杂物、研磨和筛分后，一份用于测定土壤pH，一份用于测定土壤重金属含量. 采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，NexION 2000）测定经盐酸-硝酸-氢氟酸-高氯酸微波消解（CEM MARS6）后样品中的镉（Cd）、铬（Cr）、铜（Cu）、镍（Ni）、铅（Pb）和锌（Zn）含量，其检出限分别为0.03、2.00、0.70、2.00、1.00 mg·kg⁻¹和5.00 mg·kg⁻¹；采用原子荧光光度计（AFS-930d）测定经硝酸-盐酸消解后样品中的砷（As）和汞（ Hg）含量，其检出限分别为0.20 mg·kg⁻¹和0.002 mg·kg⁻¹. 样品测试环节均进行空白实验与平行样测定，结果精密度符合实验允许误差要求，同时用国家标准土样予以质量管控，所测元素的加标回收率为95%—106%，分析误差为±5%.

图 1 研究区域布点图

Figure 1. Distribution plot of the study area

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1.3 评价标准

由于农田研究区土壤pH值范围为6.00—8.18，平均值为7.85，中位数为7.75，其中pH > 7.5占比达93.94%，且变异系数小于0.1. 故选用《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》（GB15618-2018）中pH>7.5的风险筛选值（mg·kg⁻¹）和风险管制值（mg·kg⁻¹）分别作为农田土壤的一级和二级评价标准. 《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》（GB36600-2018）中第二类用地的风险筛选值（mg·kg⁻¹）和风险管制值（mg·kg⁻¹）分别作为尾矿库土壤的一级和二级评价标准，如表1所示.

表 1 土壤环境质量评价标准

Table 1. Soil environmental quality evaluation criteria

指标Index	风险筛选值Risk filter value		风险管制值Risk control value
指标Index	尾矿库（第二类用地）	农田（pH>7.5）	尾矿库（第二类用地）	农田（pH>7.5）
Cu	18000	100	36000	−
Cr	−	250	−	1300
Ni	900	190	2000	−
Zn	−	300	−	−
As	60	25	140	100
Cd	65	0.60	172	4.0
Pb	800	170	2500	1000
Hg	38	3.40	82	6.0
注：“−”表示无此项，下同. Note: "−" means that there is no such item, the same below.

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1.4 污染负荷指数法

污染负荷指数法在土壤重金属污染水平评估中应用广泛，既能考量单个样点污染状况，又可评定多重金属污染区域状况^[16]. 污染负荷指数法的计算如下式（1–3）：

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(1)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(2)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(3)$

式中， $\text{CF}\mathrm{\mathrm{\mathit{\mathit{_{i}}}\mathrm{\mathrm{ }}}}$ 是某一重金属的污染因子； ${C}_{i}$ 是重金属的测定值，mg·kg⁻¹； ${B}_{i}$ 是甘肃省土壤重金属元素背景值^[17]，mg·kg⁻¹；n为重金属污染种类总数，m为采样点个数. PLI 和 ${\text{PLI}}_{\text{zone}}$ 分别是某个采样点和整个研究区的污染负荷指数，污染负荷分级标准^[18]见表2.

表 2 污染负荷指数分级标准

Table 2. Classification standard of the pollution load index

CF	PLI	等级Level	污染程度Contamination degrees
CF<1	PLI<1	0	无污染
1≤CF<3	1≤PLI<3	1	轻度污染
3≤CF<6	3≤PLI<6	2	中度污染
6≤CF	6≤PLI	3	重度污染

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1.5 PMF源解析

PMF模型是将重金属含量矩阵分解为因子得分矩阵、因子载荷矩阵和残差矩阵^[19]. 见式（4–7）：

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(4)$

式中， ${X}_{ij}$ 为第j个样品中第i个元素的含量（mg·kg⁻¹）； $\mathrm{ }{G}_{jk}$ 为j个样品在源k中的含量（mg·kg⁻¹）； ${F}_{ki}$ 为第k个源中第i个元素的含量（mg·kg⁻¹）； ${E}_{ij}$ 和p分别为残差矩阵和因子个数. 通过Multilinear Engine 模型迭代运算，因子数设定的多少均会显著影响解析结果. 因此，要进行多次调整和改进，以便得到最小的Q 值和最优解^[19]，以此确定具有代表性的因子数及其相对贡献率.

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(5)$

式中， ${U}_{ij}$ 为第j个样品中第i个元素的不确定度，n为元素种类，m为采样点数. MDL为方法检出限. 当土壤重金属含量小于或等于MDL时， ${U}_{ij}$ 可由公式计算得出：

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(6)$

当土壤重金属含量高于MDL时，则由式（6）计算得出：

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(7)$

式中， ${c}$ 为重金属元素含量实测值（mg·kg⁻¹）； $\textit{δ}$ 为不确定度百分数.

1.6 基于源导向的土壤重金属生态风险评估

本研究将PMF模型与综合生态风险评价指数法（Nemerow integrated risk index，NIRI）有机结合，来量化各污染源对生态风险的贡献^[20]. 具体计算公式如下（8–12）：

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(8)$

式中， ${{C}}_{ij}^{k*}$ 为样品j中污染源k对元素i的贡献值（mg·kg⁻¹）， ${C}_{i}$ 为样品中重金属i元素的实测值（mg·kg⁻¹）.

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(9)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(10)$

式中， $\mathrm{ER}_{ij}^k$ 为样品j中污染源k对元素i的生态风险； ${{B}}_{{i}}$ 为甘肃省土壤元素背景值； ${{E}}_{{r}}^{{i}}$ 为重金属i元素的潜在生态风险，重金属毒性响应系数直观展现了重金属的毒性强弱以及水体对其敏感程度， ${{T}}_{{r}}^{{i}}$ 一般取值Zn=1，Cr=2，Cu=Ni=Pb=5，Cd=30，Hg=40，As=10 ^[21].

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(11)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(12)$

式中， ${\text{EIRI}}_{{ij}}^{{k}}$ 为样品j中污染源k对多种元素的生态风险， ${\text{NIRI}}_{{ij}}$ 为样品j的综合生态风险评价， ${\text{ER}}_{ij\text{max}}^{{k}}$ ， ${E}_{\text{rmax}}^{{i}}$ 和 ${\text{ER}}_{\text{ijave}}^{{k}}$ ， ${E}_{\text{rave}}^{{i}}$ 分别为同一样品中所有元素生态风险值的最大值和平均值. 基于 ${E}_{{r}}^{{i}}$ 和 $\text{NIRI}$ 值的生态风险等级划分标准^[22]见表3.

表 3 生态风险指数分级标准

Table 3. Ecological risk index classification criteria

$E\mathit{_{\mathrm{\mathit{r}}}^i}$	生态风险等级Ecological risk level	NIRI	生态风险等级Ecological risk level
${E}_{r}^{i}$ ＜40	轻微	NIRI＜40	轻微
40≤ ${E}_{r}^{i}$ ＜80	中等	40≤NIRI＜80	中等
80≤ ${E}_{r}^{i}$ ＜160	强	80≤NIRI＜160	强
160≤ ${E}_{r}^{i}$ ＜320	很强	160≤NIRI＜320	很强
${E}_{r}^{i}$ ≥320	极强	NIRI≥320	极强

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1.7 基于源导向的土壤重金属健康风险评估

采用美国环保署（USEPA）推荐的健康风险评估模型，量化土壤重金属对人体健康造成的风险^[23]. 土壤重金属健康风险评估模型中暴露参数和不同暴露途径的参考剂量（RfD）和致癌斜率因子（SF）值参照中国生态环境部发布的HJ 25.3-2019中的风险评估模型参数推荐值和美国环保署发布的相关参数^{[24 − 26]}. 对于致癌风险，致癌风险值低于10⁻⁶时，表示对人体健康风险不显著，视为风险可以忽略不计；致癌风险值为10⁻⁶—10⁻⁴时，表示对人体健康有风险；致癌风险值大于10⁻⁴时，表示有显著风险，认为风险是不可接受的^[27]. 基于源导向的土壤重金属风险评估是先根据PMF模型得到不同源的贡献率，并结合研究区健康风险评估结果，计算不同源对人体健康风险的贡献率^[28]，具体计算公式如下（13–16）：

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(13)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(14)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(15)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(16)$

式中， ${\text{HQ}}_{j}$ 为第j类源的非致癌风险； ${F}_{ij}$ 为第i种重金属在第j类源的贡献率； $\text{HQ}_{i}$ 为第i种重金属的非致癌风险； $D_{j,\text{HQ}}$ 为第j类源的非致癌风险贡献率； $\text{CR}_{j}$ 为第j类源的致癌风险； $\text{CR}_{i}$ 为第i种重金属的致癌风险； $D_{j,\text{CR}}$ 为第j类源的致癌风险贡献率.

1.8 数据处理与分析

研究数据处理采用SPSS 27和EXCEL，进行描述性统计分析，利用EPA PMF 5.0软件进行溯源解析，使用Origin 2024和ArcGIS软件处理数据并绘制图形.

2. 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 土壤重金属污染评价

土壤中As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn和Hg元素含量描述性统计结果如表4所示，研究区尾矿库土壤中As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn和Hg含量范围分别为21.64—43.69、0.25—1.04、11.23—16.95、26.07—51.85、7.13—14.61、653.99—925.67、412.96—603.57 mg·kg⁻¹和7.65—9.45 mg·kg⁻¹，其中只有Pb有50.00%的样点超出一级标准. 研究区农田土壤中As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn和Hg的含量范围分别为10.20—26.85、1.35—3.30、68.76—134.98、12.64—23.60、11.44—29.20、39.12—92.61、66.65—139.35 mg·kg⁻¹和2.48—4.33 mg·kg⁻¹. 根据评价标准（表1），农田土壤中Cd所有样点的含量均超过一级标准，As有3.03%的样点超过了一级标准，Hg有39.39%的样点超过了一级标准，Cr、Cu、Ni、Pb和Zn含量均未超过一级标准. 尾矿库和农田土壤中所有重金属含量均未超过二级标准. 污染负荷指数法结果（图2）表明，农田土壤中8种重金属的 $\text{CF}_i$ 平均值由大到小依次为：Hg（56.08）>Cd（19.40）>Pb（3.02）>Cr（1.41）>Zn（1.30）>As（1.27）>Cu（0.75）>Ni（0.57）. Hg和Cd全部样点属于重度污染；Pb有66.67%的样点属于轻度污染，33.33%的样点属于中度污染；Cr、Zn和As大部分样点属于轻度污染；Cu和Ni的全部样点均属于无污染. 农田的 $\text{PLI}$ 值介于2.45 $\text{—}$ 3.09之间，均值为2.71，总体上属于轻度污染，占比为 93.94%. 尾矿库土壤中8种重金属的 ${\text{CF}}_{i}$ 平均值由大到小依次为：Hg（137.98）>Pb（42.32）>Zn（7.33）>Cd（5.80）>As（2.54）>Cu（1.81）>Ni（0.29）>Cr（0.21）. Hg和Pb的全部样点为重度污染，Zn有87.50%的样点属于重度污染；Cd分别有62.5%和37.5%的样点属于中度污染和重度污染；Cu的全部样点属于轻度污染，As有75%的样点属于轻度污染；Ni和Cu的全部样点属于无污染. 尾矿库研究区域的 $\text{PLI}$ 值介于3.34—4.46之间，均值为3.96 ，总体上属于中度污染，占比为100%. 总体来说，尾矿库土壤重金属污染程度要高于农田. 由于该尾矿库表层未客土，有毒有害的尾矿粉尘会随大气迁移，继而受降雨的影响，会对矿区周围环境造成一定影响. 铅锌尾矿的堆积使得尾矿库及其周边农田土壤中的Pb和Zn污染严重，但农田土壤中Cd和Cr元素含量均值高于尾矿库土壤. 据调查，陇南农业特色产业的种植规模约1000万亩^[29]，农业活动频繁，结合PMF的结果，说明这2种重金属污染与农业活动和成土母质有关. 这与李多杰等^[30]对内蒙古兴安盟某铅锌矿的研究结果相似，矿区周围的土壤受到明显的Zn和Pb污染，而铅锌矿周边土壤中的Cd和Cr污染归因于成土母岩风化和人为活动的共同作用.

表 4 土壤重金属含量描述性统计分析

Table 4. Descriptive statistical analysis of soil heavy metal content

项目Item	采样地Sampling site	最小值/（ mg·kg⁻¹）Minimum	最大值/（ mg·kg⁻¹）Maximum	平均值/（ mg·kg⁻¹）Average value	标准差Standard deviation	变异系数Standard deviation	超标率Excess ratio
项目Item	采样地Sampling site	最小值/（ mg·kg⁻¹）Minimum	最大值/（ mg·kg⁻¹）Maximum	平均值/（ mg·kg⁻¹）Average value	标准差Standard deviation	变异系数Standard deviation	以一级标准为评价标准	以二级标准为评价标准
As	尾矿库	21.64	43.69	32.04	7.26	22.66%	0%	0%
As	农田	10.20	26.85	16.04	2.86	17.83%	3.03%	0%
Cd	尾矿库	0.25	1.04	0.67	0.25	37.31%	0%	0%
Cd	农田	1.35	3.30	2.25	0.41	18.22%	100%	0%
Cr	尾矿库	11.23	16.95	14.57	2.38	16.33%	−	−
Cr	农田	68.76	134.98	98.66	18.37	18.62%	0%	0%
Cu	尾矿库	26.07	51.85	43.70	10.23	23.41%	0%	0%
Cu	农田	12.64	23.60	18.17	1.98	10.89%	0%	−
Ni	尾矿库	7.13	14.61	10.19	2.48	24.34%	0%	0%
Ni	农田	11.44	29.20	20.04	4.61	23.01%	0%	−
Pb	尾矿库	653.99	925.67	795.70	101.05	12.70%	50%	0%
Pb	农田	39.12	92.61	56.68	12.93	22.81%	0%	0%
Zn	尾矿库	412.96	603.57	508.20	60.45	11.89%	−	−
Zn	农田	66.65	139.35	90.25	17.36	19.23%	0%	−
Hg	尾矿库	7.65	9.45	8.28	0.60	7.24%	0%	0%
Hg	农田	2.48	4.33	3.37	0.50	14.84%	39.39%	0%
pH	尾矿库	8.26	8.58	8.42	0.16	1.90%	−	−
pH	农田	6.00	8.18	7.85	0.75	9.59%	−	−

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图 2 研究区域土壤重金属污染因子和污染负荷指数箱型图

Figure 2. Box plot of soil heavy metal contamination factors and pollution load index in the study area

（a）农田（b）尾矿库

（a） agricultural land （b） tailing ponds

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变异系数（coefficient of variance，CV）是一种反映重金属元素含量空间分布离散程度的指标^[31]，根据CV值的大小，可分为低度变异（CV<0.1）、中度变异（0.1≤CV<0.36）、高度变异（0.36≤CV<1）和极度变异（CV>1）^[32]. 由表4可知，尾矿库研究区域土壤中Cd属于高度变异；As、Cu、Ni、Cr、Pb和Zn属于中度变异；Hg属于低度变异. 农田研究区域表层土壤中重金属的变异系数均在0.1—0.36之间，均属于中度变异. 因此，研究区域土壤中重金属含量的空间分布差异显著，地理环境和人类活动对其影响较大.

2.2 农田土壤重金属污染源解析

本研究设定4至7个因子数量，经多番运行调试，最终选定5个因子，获取了较低的Q值 42.43，此时实测值与预测值拟合效果最好，且多数残差处于−3—3区间. 8 种元素的R²系数为0.545—0.951，表明PMF的整体拟合效果较好，能够很好地满足研究需求，并解释了原始数据中包含的信息. PMF模型的解析结果如图3所示，5个污染源的占比分别为 21.26%、22.77%、17.91%、16.61%和 21.44%.

图 3 基于 PMF 模型的农田土壤重金属溯源解析

Figure 3. Traceability analysis of heavy metals in farmland soil based on PMF model

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由图3可知，因子1主要载荷元素包括Cr、Cu、Ni、Pb和Zn，其贡献率分别为28.05%、29.16%、28.88%、24.43%和30.65%. 据报道，Ni和Cr含量的变化与成土母质、成土过程和地质活动密切相关^[33]. 农田土壤中Cr、Cu和Ni均未超过一级评价标准，且含量较低，这表明Cr、Cu和Ni主要是受成土母质的影响，属于自然源. 而农田土壤中Pb和Zn的含量较高，且有研究表明铅锌矿影响区土壤中Pb、 Zn和Cu主要来自于矿山开采活动^[34]，故污染主要来源于周边的铅锌尾矿库. 故因子1是由自然源和尾矿库源的混合源.

因子2主要载荷元素包括Ni、Pb、Zn和Hg，其贡献率分别为35.66%、32.50%、33.35%和25.02%，变异系数分别为0.23、0.23、0.19和0.15，均属于中度变异，受人类活动影响较大. 有研究表明，铅锌矿区在开采和冶炼活动中所产生的三废中含有大量的Zn、Pb、Cd、As和Hg等元素^[7]，排放后通过大气降尘进入周围土壤，导致土壤污染. 经调查，农田研究区右侧是废弃工厂，工矿活动及矿渣堆存期间的扬尘会通过大气沉降在土壤中积累，受降雨等影响导致Ni、Pb、Zn和Hg的二次富集. 故因子2是工业降尘源.

因子3 主要载荷元素包括Pb、Cd、Zn和Cr，其贡献率分别为29.04%、24.61%、21.43%和21.64%. 汽车发动机、镀锌构件及轮胎等因机械摩擦、化学侵蚀引发的磨损与腐蚀，以及燃油燃烧或泄露和尾气排放等交通活动，都会将Cd、Pb和Zn元素释放到周边环境中^[35,36]. 由因子1可知，Cr含量变化与成土过程显著相关，但研究区Cr的超标率96.97%，表明受到了人类活动的影响. 研究发现Cr还与金属零件和镀铬配件磨损有关^[37]. 考虑研究区农田周围有交通运输道路及汽修厂，故因子3是交通源.

因子4主要载荷元素包括As、Cd 和Cu，其贡献率分别为29.60%、31.16%和25.43%，变异系数分别0.18、0.18和0.11，属于中度变异，受人类活动影响较大. 除草剂和杀虫剂的大量使用会造成As的大量积累，磷肥中含有的微量As也是土壤As的重要来源之一^[38]. 农家肥中含有较多的Cu、Cd元素，农药、化肥长期投入到农用地中会导致重金属Cu、Cd元素的大量积累^[39]. 故因子4是农业源.

因子5主要载荷元素包括As、Cd、Cr、Cu、Ni和Hg，其贡献率分别为21.62%、21.24%、35.42%、22.18%、18.30%和38.93%. Cd污染的主要来源包括汽油燃烧、农药和化肥、垃圾堆积、铅锌矿开采和冶炼等^[40]. Cr、Cu、Ni主要受成土母质的影响，同时也有研究表明，农业投入品（化肥、农药、有机肥等）中含有的Hg、As、Cu、Zn、Cd、Cr等元素易残留在土壤中，如磷肥中Cr含量在几十到几百mg·kg^−1[8]，As含量在20到50 mg·kg⁻¹，施用不合理时，土壤中Cr、As这类元素含量会升高^{[39, 41]}. 长期的尾矿库堆存、物料转运及加工等人为活动也会向周围环境释放Cd、Hg、As等元素^[42]，故因子5是由多种类型的活动组成的综合源.

2.3 农田土壤重金属特定源-综合生态风险评估

研究区农田土壤中重金属的 ${{E}_{r}^{i}}$ 和 $\text{NIRI}$ 评价结果见表5， $E_{r}^{i}$ 的平均值从大到小排序为：Hg（2243.04）>Cd（582.06）>Pb（15.08）>As（12.73）>Cu（3.77）>Ni（2.85）>Cr（2.82）>Zn（1.30）. 除了属于极强生态风险的Hg和Cd元素之外，其余元素均属于轻微生态风险，说明造成研究区生态风险的首要污染元素为Hg和Cd. 这与陈希瑶等^[43]人研究中国土壤重金属的生态风险结果一致，对土壤造成生态风险的主要元素是Hg和Cd. 此外，研究区农田土壤重金属的综合生态风险指数（ $\text{NIRI}$ ）范围为1673.76—2921.86，平均值为2271.48，属于极强生态风险.

表 5 农田土壤重金属潜在生态危害系数（

${E}_{r}^{i}$

）和Nemerow综合生态风险指数（NIRI）评价结果

Table 5. Evaluation results of potential ecological hazard coefficients （

${E}_{r}^{i}$

） and Nemerow integrated ecological risk index （NIRI） of soil heavy metal in farmload

	As	Cd	Cr	Cu	Ni	Pb	Zn	Hg
${E}_{r}^{i}$ 最小值	8.10	348.44	1.96	2.62	1.62	10.40	0.96	1651.74
${E}_{r}^{{i}}$ 最大值	21.31	853.45	3.86	4.90	4.15	24.63	2.01	2883.33
${E}_{r}^{i}$ 平均值	12.73	582.06	2.82	3.77	2.85	15.08	1.30	2243.04
NIRI	1673.76 $—$ 2921.86

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研究区特定源-综合生态风险的评价结果如图4所示，按其贡献率的高低对5 种污染源进行排序：因子5（综合源）（38.37%）> 因子2（工业降尘源）（24.67%）> 因子3（交通源）（17.62%）> 因子1（自然源和尾矿库源的混合源）（10.47%）> 因子4（农业源）（8.86%），表明综合源对农田研究区影响的贡献率最大. 由于Hg元素自身毒性很高，且在研究区土壤中，Hg为首要的生态危害元素，在因子5中贡献率达到了38.93%，导致因子5是对综合生态风险贡献最高的污染源. 本研究中对综合生态风险贡献最高的污染源与以工业降尘源为主要污染源的PMF源解析结果不一致. 这与李军等^[21]对敦煌市主城区的土壤重金属的研究结果一致，Hg元素负荷高的工业降尘源虽然不是重金属的最高贡献源，但却是综合生态风险的最高贡献源. 这表明重金属贡献率高的污染源并不一定具有高生态风险.

图 4 农田土壤重金属不同污染源对综合生态风险的贡献率

Figure 4. Contribution of different pollution sources of heavy metals in agricultural soils to the integrated ecological risk

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2.4 农田土壤重金属特定源-人体健康风险评估

图5a 显示了针对特定来源的人体健康风险评估模型的结果. 对于非致癌风险，不同污染源对儿童总 $\text{HI}$ 值为 1.49，大于阈值1，表明农田土壤中的重金属在不同污染源下会对儿童健康造成非致癌健康风险. 成人的总 $\text{H}\text{I}$ 值为 2.13×10⁻¹，小于阈值1，表明农田土壤中的重金属在不同污染源下不会对成人健康造成非致癌健康风险. 儿童的总 $\text{HI}$ 值大于成人的总 $\text{HI}$ 值一个数量级，这可能与儿童较低的体重、生活习惯和对污染物的敏感性比较高有关^[26]. 这一结果与方嘉等^[44]研究基于PMF模型的农田土壤重金属源暴露风险综合评价的结果一致，可能与儿童对污染物的敏感性比较高有关. 与石文静等^[45]对矿区周边土壤重金属的健康风险结果也一致，儿童非致癌及致癌风险较成人相比明显偏高，可能与儿童较低的体质量和生活习惯有关. 各个污染源的重金属对当地成人和儿童的 $\text{HI}$ 排序均为：1>As>Cr>Pb>Hg>Cd>Ni>Cu>Zn，表示在不同污染源下，每种重金属元素不会对当地居民造成非致癌健康风险. 不同污染源对成人和儿童的总 $\text{TCR}$ 值分别为2.72×10⁻⁵和4.58×10⁻⁵，表明农田土壤重金属在不同污染源下对当地人群健康有致癌健康风险. 各个污染源的重金属对当地成人和儿童的 $\text{T}\text{CR}$ 排序均为：10⁻⁴>As>Cd>Cr>10⁻⁶>Pb>Ni，其中As、Cd和Cr有致癌健康风险，因为其有较低的RfD和较高的SF，致癌和非致癌效应较强^[46]. Pb和Ni元素对当地人群身体的风险可以忽略不计.

图 5 农田土壤重金属特定源-人体健康风险评价

Figure 5. Source-specific human health risk assessment of heavy metals in agricultural soil

（a）健康风险（b）贡献率；注：白色区域表示无相关数据.

（a） health risk （b） contribution rate Note: The white area indicates no relevant data.

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对于研究区农田土壤重金属、污染源与健康风险关系如图5b所示，就致癌风险而言，因子4（农业源）是导致成人和儿童致癌风险的首要污染源，贡献率分别为25.87%和26.92%. 其次是因子5（综合源），对成人的贡献率是23.77%，对儿童的贡献率是23.12%，污染因子以As为主，对成人的贡献率是51.79%，对儿童的贡献率是54.70%；对于非致癌风险而言，污染源贡献率的排列顺序：因子5（综合源）> 因子3（交通源）> 因子1（自然源和尾矿库源的混合源）> 因子4（农业源）> 因子2（工业降尘源）. 因子5（综合源）是导致儿童非致癌风险的首要污染源，贡献率为25.17%，最主要的污染因子也是As元素，贡献率为43.57%. 这可能与As元素本身毒性有关，其有较低的RfD和较高的SF^[46]. 这一结果不仅与杨杰等^[47]研究鄂西某铜铅锌尾矿库周边农田土壤重金属风险评估的结果一致，还与张丽瑞等^[48]研究甘肃省农田土壤潜在有毒元素污染的典型区域白阴市东大沟的健康风险评价结果一致，As元素是造成当地人群致癌风险影响的主要因子. 考虑到农业源和多种类型活动共同作用的综合源是造成研究区人体健康风险的主要因子，因而工业和农业等人类活动排放的重金属对人体存在健康风险，未来可通过提升工业废物排放标准，建立合适的管控机制以及减少农药和化肥用量等途径减少污染物进入环境的量，从而减少重金属对人体的危害^[45].

3. 结论（Conclusion）

1）研究区尾矿库和农田土壤中重金属含量均低于国家风险管制值，但尾矿库土壤中Pb有50.00%的样点超出国家风险筛选值，农田土壤中Cd、As和Hg分别有100%、3.03%和39.39%的样点超出国家风险筛选值. 总体而言，尾矿库土壤中重金属的污染程度较农田土壤明显偏高，其中尾矿库土壤以Hg、Pb、Zn和Cd污染为主，整体上属于中度污染水平，占比为100%；农田土壤以Hg和Cd污染为主，整体上属于轻度污染水平，占比为93.94%.

2）研究区农田土壤重金属分别受自然源及尾矿库源的混合源（贡献率为21.26%）、工业降尘源（贡献率为22.77%）、交通源（贡献率为17.91%）、农业源（贡献率为16.61%）和由多种类型活动组成的综合源（贡献率为 21.44%）的共同影响.

3）综合源对研究区生态风险贡献率为38.37%，为优先控制污染源，Hg为生态风险优先控制污染元素；农田重金属对成人不构成非致癌健康风险，但综合源是引起当地儿童非致癌风险的优先控制污染源，贡献率为25.17%，农业源是引起当地成人和儿童致癌风险的优先控制污染源，贡献率分别为25.87%和26.92%，健康风险的优先控制污染元素均为As.

表 1 CA固定化方法优缺点

Table 1. Advantages and disadvantages of CA immobilization methods

固定化方法Immobilization methods	优点Advantages	缺点Disadvantages	参考文献Reference
吸附	易于操作；固定化酶构象变化小	酶易从载体中泄漏	[6]
共价结合	酶和载体之间紧密结合；提高了固定化酶的稳定性	引起酶构象的变化；酶的活性通常在固定化后降低	[7]
包埋	操作简单；可以减少酶浸出和变性	酶被限制在载体材料中，减弱了酶的表观活力	[6]
交联酶聚集体	无需载体；对酶纯度要求不高	机械强度不高	[21]
纳米花	固定化酶具有高比表面积和高酶活性	纳米花晶体的生长时间较长	[26]

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表 2 CA在二氧化碳捕集中的矿化性能

Table 2. Mineralization performance of CA in carbon dioxide capture

碳酸酐酶种类Types of carbonic anhydrase	矿化特性Mineralization properties	CaCO₃晶相CaCO₃ crystal phase	参考文献Reference
牛CA（bCA）	固定化细胞比游离细胞的CaCO₃产量增加了1.35倍；固定化细胞和游离细胞的CaCO₃ 相对产量在10个循环后分别为53.46%和22.15%	球霰石和方解石	[35]
bCA	17 μg固定化CA产生12 mg CaCO₃	方解石	[29]
CA	CA@ZIF-8获得的CaCO₃的产量是游离 CA的22倍	球霰石	[40]
硫化氢碳酸酐酶（SazCA）	固定化CA转化CO₂形成碳酸钙的时间比游离CA缩短了33%	球霰石和方解石	[19]
SazCA	工程菌株矿化CO₂产生的CaCO₃质量（241 mg）高于细胞内表达菌株（173 mg）	—	[38]
周质水生弧菌CA（hmCA）	固定化CA将填充床反应器中的CO₂捕集速率提高了80%	—	[36]
CA	PVA/CS@CANF膜转化CO₂产生的CaCO₃ 量是游离CA的9倍	—	[22]
bCA	添加EPC的系统与含有25 mmol·L⁻¹ NaHCO₃和不含碳源的对照相比，分别使微藻生长加速了134%和231%	—	[32]
bCA	与（22.7±0.5）mg·L⁻¹·d⁻¹的自然生长速率相比，游离CA和CA-GA珠粒分别将微球藻的生长速率提高到（37±3）mg·L⁻¹·d⁻¹和（40±1）mg·L⁻¹·d⁻¹	—	[34]
Sulfurihydrogenibium yellowstonense CA（SyCA）	固定化粗CA的CaCO₃总产量是游离CA的5.8倍	—	[11]
CA	固定化CA产生的CaCO₃质量是空白实验的5倍	—	[31]
bCA	CA@ZIF-8和PVA/CS/CA@ZIF-8水凝胶膜获得的CaCO₃产量分别为游离CA的20倍和32.6倍.	球霰石和方解石	[41]
Mesorhizobium loti CA（MICA）	具有固定化全细胞生物催化剂的系统可在3.5 min内有效地将CO₂100%转化为CaCO₃	—	[39]

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表 3 CA在二氧化碳吸收中的催化性能

Table 3. Catalytic performance of CA in carbon dioxide absorption

吸收剂成分Absorbent ingredients	温度Temperature	催化特性Catalytic properties	参考文献References
100 mg的固定化CA（固载量为2 mg·g⁻¹）+H₂O	30 ℃	反应进行30 min，CO₂吸收量G_v=1.858×10⁻⁴ L	[31]
CA-m-PVDF复合膜+0.25 m·s⁻¹ H₂O	25 ℃	CA-m-PVDF复合膜CO₂通量值为2.5×10⁻³ mol·m⁻²·s⁻¹	[43]
0.05 g·L⁻¹ CA/ZIF-L-1+20 mL 1 mol·L⁻¹ MDEA	40 ℃	MDEA中的CO₂吸收率提高了2.5倍	[44]
CA/ZIF-8+MDEA	40 ℃	CO₂吸收到含有不同粒径的ZIF-8的MDEA溶液中，MDEA溶液的吸收率增加到2.4倍	[45]
10 mg MNP-CA纳米凝胶+100 mL 1 mol·L⁻¹ MDEA	30 ℃	反应3 h后，MNP-CA纳米凝胶的CO₂吸收率为不含CA时的170%	[46]
0.3 kg m⁻³工业级碳酸酐酶（NovoCA）+2—3 mol·L⁻¹ K₂CO₃（碳酸盐转化度0—40%）	25 ℃和40 ℃	当加入的酶浓度低于0.018 kg·m⁻³时，K_cat/K_m值介于0.50×10² L·mol⁻¹·s⁻¹和0.39×10³ L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[49]
0.2×10⁻²—1.5×10⁻² kg NovoCA·m⁻³ Fe₃O₄纳米颗粒固定化CA+0.5 mol·L⁻¹ Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液（pH=9.6）	25 ℃和40 ℃	固定化CA的K_cat/K_m值介于4.87—8.06 L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[10]
0.2×10⁻²—1.5×10⁻² kg NovoCA·m⁻³ Fe₃O₄纳米颗粒固定化CA+10%wt K₂CO₃溶液（碳酸盐转化度0—40%）	25 ℃	固定化CA的K_cat/K_m值介于3.24—6.73 L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[10]
嗜热细菌的全细胞固定（INPN-SspCA）+0.5 mol·L⁻¹ Na₂CO₃/NaHCO₃	25 ℃	INPN-SspCA的K_cat/K_m值介于9.94×10⁻¹—3.09 L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[48]
2 g·L⁻¹ CA+20% wt K₂CO₃	40 ℃	与未添加CA相比，CO₂总传质系数（K_G）提高了约5倍	[50]
0.22 g·L⁻¹ CA+30% wt K₂CO₃（pH~11—12）	50 ℃	CA的K_cat/K_m值为5.3×10⁸ L·mol⁻¹·s⁻¹	[52]
0.2% wt CA+30% MDEA/15% K₂CO₃	17—50 ℃	添加CA显著增加了MDEA和K₂CO₃的液侧传质膜系数	[17]
0.2% wt CA+30% wt MEA + 7.5% wt PZ+15% wt K₂CO₃	30 ℃	含有CA/Zn-Im: HFS的混合溶剂（21.65% wt）在20 min内CO₂的吸收量高于纯混合溶剂（13.75% wt）	[51]
0.2% wt CA+30% wt MEA +7.5% wt PZ+15% wt K₂CO₃	90 ℃	含有CA/Zn-Im: HFS的混合溶剂比纯混合溶剂的CO₂相对解吸率高1.57倍.	[51]

吸收剂成分Absorbent ingredients	温度Temperature	催化特性Catalytic properties	参考文献References
100 mg的固定化CA（固载量为2 mg·g⁻¹）+H₂O	30 ℃	反应进行30 min，CO₂吸收量G_v=1.858×10⁻⁴ L	[31]
CA-m-PVDF复合膜+0.25 m·s⁻¹ H₂O	25 ℃	CA-m-PVDF复合膜CO₂通量值为2.5×10⁻³ mol·m⁻²·s⁻¹	[43]
0.05 g·L⁻¹ CA/ZIF-L-1+20 mL 1 mol·L⁻¹ MDEA	40 ℃	MDEA中的CO₂吸收率提高了2.5倍	[44]
CA/ZIF-8+MDEA	40 ℃	CO₂吸收到含有不同粒径的ZIF-8的MDEA溶液中，MDEA溶液的吸收率增加到2.4倍	[45]
10 mg MNP-CA纳米凝胶+100 mL 1 mol·L⁻¹ MDEA	30 ℃	反应3 h后，MNP-CA纳米凝胶的CO₂吸收率为不含CA时的170%	[46]
0.3 kg m⁻³工业级碳酸酐酶（NovoCA）+2—3 mol·L⁻¹ K₂CO₃（碳酸盐转化度0—40%）	25 ℃和40 ℃	当加入的酶浓度低于0.018 kg·m⁻³时，K_cat/K_m值介于0.50×10² L·mol⁻¹·s⁻¹和0.39×10³ L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[49]
0.2×10⁻²—1.5×10⁻² kg NovoCA·m⁻³ Fe₃O₄纳米颗粒固定化CA+0.5 mol·L⁻¹ Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液（pH=9.6）	25 ℃和40 ℃	固定化CA的K_cat/K_m值介于4.87—8.06 L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[10]
0.2×10⁻²—1.5×10⁻² kg NovoCA·m⁻³ Fe₃O₄纳米颗粒固定化CA+10%wt K₂CO₃溶液（碳酸盐转化度0—40%）	25 ℃	固定化CA的K_cat/K_m值介于3.24—6.73 L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[10]
嗜热细菌的全细胞固定（INPN-SspCA）+0.5 mol·L⁻¹ Na₂CO₃/NaHCO₃	25 ℃	INPN-SspCA的K_cat/K_m值介于9.94×10⁻¹—3.09 L·mol⁻¹·s⁻¹之间	[48]
2 g·L⁻¹ CA+20% wt K₂CO₃	40 ℃	与未添加CA相比，CO₂总传质系数（K_G）提高了约5倍	[50]
0.22 g·L⁻¹ CA+30% wt K₂CO₃（pH~11—12）	50 ℃	CA的K_cat/K_m值为5.3×10⁸ L·mol⁻¹·s⁻¹	[52]
0.2% wt CA+30% MDEA/15% K₂CO₃	17—50 ℃	添加CA显著增加了MDEA和K₂CO₃的液侧传质膜系数	[17]
0.2% wt CA+30% wt MEA + 7.5% wt PZ+15% wt K₂CO₃	30 ℃	含有CA/Zn-Im: HFS的混合溶剂（21.65% wt）在20 min内CO₂的吸收量高于纯混合溶剂（13.75% wt）	[51]
0.2% wt CA+30% wt MEA +7.5% wt PZ+15% wt K₂CO₃	90 ℃	含有CA/Zn-Im: HFS的混合溶剂比纯混合溶剂的CO₂相对解吸率高1.57倍.	[51]

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1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 研究区概况
1.2 样品的采集与处理
1.3 评价标准
1.4 污染负荷指数法
1.5 PMF源解析
1.6 基于源导向的土壤重金属生态风险评估
1.7 基于源导向的土壤重金属健康风险评估
1.8 数据处理与分析
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 土壤重金属污染评价
2.2 农田土壤重金属污染源解析
2.3 农田土壤重金属特定源-综合生态风险评估
2.4 农田土壤重金属特定源-人体健康风险评估
3. 结论（Conclusion）

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碳酸酐酶（CA）是一种普遍存在的含锌金属酶，其主要功能是催化CO₂的水合反应，反应式如下所示：CO₂+H₂O↔HCO₃⁻+H⁺，它是目前已知的催化最快的酶之一^[1]. 由于游离CA在高温、强酸或强碱溶剂和化学杂质等条件下容易失活，限制了其大规模的工业应用. 因此，采用分子修饰^[2]、定向进化^[3]、酶固定化^[4]等策略来提高其稳定性和活性. 在上述方法中，酶固定化因其操作简单、方便的特点而被广泛应用.

通过选择良好的载体和合适的固定化方法对游离CA进行固定是降低催化剂成本、提高稳定性和可重复使用性的有效途径^[5]. 基于固定化CA的生物催化剂因其低耗能和高效率被认为是转化CO₂的环境友好的候选方法. 固定化CA主要通过酶促反应吸收^[6]，CO₂矿化生成金属碳酸盐^[7]和多酶级联反应^[8]来进行CO₂转化. 吸收是目前应用最为广泛的CO₂捕集技术之一^[6]. 然而，吸收溶剂具有再生所需能量高、吸收速率慢和稳定性低等缺点^[9]. CA作为促进剂可以提高CO₂吸收反应速率，从而降低反应器尺寸和成本. 在某些情况下，CA还用于促进酶催化的CO₂转化. CA参与的多酶级联反应用于生产甲酸盐和甲醇等高价值产品^[7].

无论CA是以何种方式转化CO₂，CO₂转化实验始终以烟气为基础，而烟气中具有高温和其他化合物（NO_x和SO_x等）^[10]. 这些可能会影响CA的活性和稳定性，进而减缓CA转化CO₂实际工业应用中的反应速率.

1. 碳酸酐酶的性质和催化机理（Properties and catalytic mechanism of carbonic anhydrase）

2. 碳酸酐酶的固定化（Immobilization of carbonic anhydrase）

酶固定化的催化活性和稳定性在很大程度上取决于载体和固定化方法的选择，首先应在固定化过程中保持酶活性^[21]. 近年来，各种材料已被用作固定化CA的载体，包括水凝胶^[22]、壳聚糖^[23]、二氧化硅^[19]和金属有机框架（MOFs）^[24]等. 酶可以通过多种方法固定在载体上，例如包埋、吸附、交联、共价结合、交联酶聚集体（CLEAs）^[25]和纳米花型酶-无机杂化固定化酶（简称纳米花）^[26]等. CA固定化方法优缺点如表1所示.

吸附是一种简单有效的固定化方法，通过氢键、疏水键、离子键和范德华力的相互作用将酶固定在载体表面. 在多数情况下，与载体的温和相互作用可确保固定后酶的微小构象变化^[27]，这在很大程度上取决于载体的性质. Yin等^[24]结合了磁性材料易于回收和可重复使用性，以及MOF具有高孔隙率、大比表面积和良好稳定性的优点，构建了核壳磁性ZIF-8@Fe₃O₄复合材料. CA通过吸附固定在ZIF-8@Fe₃O₄上. 游离CA和CA@ZIF-8@Fe₃O₄分别在40 ℃的1 mol·L⁻¹ MDEA中储存9 d，CA@ZIF-8@Fe₃O₄的活性随着储存时间的延长而逐渐降低，但其活性始终高于等量游离CA. 包埋是一种将酶限制在载体材料中的固定化方法，可以有效防止酶浸出和变性^[6]. Hsieh等^[19]将二氧化硅缩合肽（R5）与硫化氢碳酸酐酶（SazCA）融合形成R5-SazCA，再把R5-SazCA包埋到二氧化硅纳米颗粒（R5-SazCA-SP）中. 在70 ℃培养3 h后，R5-SazCA和R5-SazCA-SP的残余活性分别为49%和60%，表明CA固定化后热稳定性得到改善. 增强的热稳定性通常归因于二氧化硅交联网络施加的空间约束，这有助于维持CA的立体结构.

共价结合是一种常用的固定化方法，可以显著增强和提高酶的稳定性. 改性载体表面的胺基、羟基、羧基或环氧基等官能团和CA的氨基酸残基之间可以形成共价键，从而使得酶和载体中间具有很强的相互作用^[28]. Shamna等^[29]将CA通过共价结合固定在胺官能化的铝-硅氧烷气凝胶珠（BCA-Al/Si-NH₂）上. BCA-Al/Si-NH₂杂化珠的动力学参数与游离酶相当. 固定化CA具有热稳定性、pH稳定性和储存稳定性，这是由于酶的多点附着和酶与载体之间的相互作用导致酶刚性增加，从而减少了构象变化. Sun等^[30]将CA通过戊二醛（GA）共价连接到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和聚乙烯膜（PE）的表面，这些膜固定化CA之前通过聚乙烯亚胺（PEI）和多巴胺（DA）的共沉淀进行了修饰. PEI/PDA-PE的活性回收率高于PEI/PDA-PVDF，因为PE具有更大的孔结构和改性后更好的亲水性，从而引起更高的酶负载量和更好的酶亲和力. 此外，固定化后，CA的储存稳定性和可重复使用性得到很大提高.

考虑到载体材料的物理和化学性质、操作条件等，通常需要多种固定化方法的协同作用从而获得高效的固定化CA^[6]. Chang等^[31]将CA通过吸附-交联法固定在地质聚合物微球上，与游离CA相比，固定化CA的最适pH值从7.5增加到8.0，最适温度从25 ℃增加到30 ℃. Effendi等^[11]将Sulfurihydrogenibium yellowstonense CA（SyCA）共价结合在新型聚丙烯腈（PAN）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纳米纤维上，所得复合材料通过戊二醛（GA）进一步交联. 固定化粗SyCA在60 ℃下保留了超过100%的相对残余活性，这归因于粗SyCA的胺基和纳米纤维的羟基之间的共价结合，而且固定化粗SyCA和GA之间交联也会形成共价键. 此外，测定了固定化CA对SO_x和NO_x的耐受性. 固定化SyCA在50 mmol·L⁻¹ HNO₃和H₂SO₄存在下的残余酶活性分别为57.1%和61.6%.

CLEAs是一种无需载体的新型固定化酶制备技术，该方法包括沉淀和交联两个主要步骤^[26]：（1）通过沉淀剂（盐、水溶性有机溶剂或非离子聚合物）在溶液中形成酶聚集体；（2）聚集体中酶分子通过交联剂交联，使它们在去除沉淀剂后不溶. 然而，对于工业应用来说，CLEA柔软且容易断裂，为了提高CLEA的机械性能，Jun等^[32]使用纳米纤维共价连接bCA，然后交联并进行沉淀，以获得bCA沉淀涂层（EPC）. EPC在剧烈摇动下868 d后仍保留其活性的65.3%，EPC的高稳定性可以通过酶沉淀和交联的结合来解释，使酶分子之间通过化学键紧密的链接，从而有效防止酶变性和浸出. 纳米花型酶-无机杂化固定化酶由2012年Ge等^[33]首次提出，通过将酶与硫酸铜在磷酸盐缓冲溶液中共沉淀，从而形成典型的花瓣状结构. Wen等^[22]对此固定化方法进一步研究，将双金属离子（Cu²⁺和Zn²⁺）代替单个金属离子来固定CA，然后将双金属基杂化纳米花（CANF）复合材料嵌入到聚乙烯醇（PVA）/壳聚糖（CS）水凝胶膜（PVA/CS@CANF）中. 水凝胶膜在8个循环后仍保持其原始活性的75%以上，在60 ℃下仍有超过80%的相对活性. 此外，PVA/CS@CANF膜转化CO₂产生的CaCO₃量是游离CA的9倍.

3. CA转化CO₂的应用（Application of CA to CO₂ conversion）

4. 结论与展望（Conclusions and prospects）

为了改善游离CA在高温、强酸或强碱溶剂和化学杂质等条件下容易失活的特性，使用合适的载体和固定化方法对CA进行固定. CO₂可通过酶促反应吸收，或通过CA一步催化或级联催化转化为无机碳酸盐、甲酸和甲醇等高价值产品. 固定化CA转化CO₂的应用取得了一定的成效，但是仍存在一些技术瓶颈，可总结为以下几个方面：（1）CA价格昂贵. （2）CA对烟气中存在的高温、SO_x和NO_x耐受性差. （3）固定化方法尚不完善和载体的酶负载量低导致固定化CA活性低.

针对上述问题，未来的研究方向应集中于：（1）从转基因生物中提取大量CA，降低CA生产成本. （2）进一步研究CAs相关基因的生理作用和代谢途径，以提高化学和热稳定性. （3）研发先进的固定化方法和制备具有良好的机械强度、稳定性和对酶亲和力高的载体，提高固定化CA活性.

参考文献 (65)

碳酸酐酶的固定化及其在二氧化碳转化中的应用

通讯作者: E-mail: wangxin110870@sut.edu.cn;

Immobilization of carbonic anhydrase and its application in carbon dioxide conversion

Corresponding author: WANG Xin, wangxin110870@sut.edu.cn ;

1. 材料与方法（Materials and methods）

1.1 研究区概况

1.2 样品的采集与处理

1.3 评价标准

1.4 污染负荷指数法

1.5 PMF源解析

1.6 基于源导向的土壤重金属生态风险评估

1.7 基于源导向的土壤重金属健康风险评估

1.8 数据处理与分析

2. 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 土壤重金属污染评价

2.2 农田土壤重金属污染源解析

2.3 农田土壤重金属特定源-综合生态风险评估

2.4 农田土壤重金属特定源-人体健康风险评估

3. 结论（Conclusion）

期刊类型引用(5)

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出版历程

碳酸酐酶的固定化及其在二氧化碳转化中的应用

通讯作者: E-mail: wangxin110870@sut.edu.cn;

English Abstract

Immobilization of carbonic anhydrase and its application in carbon dioxide conversion

Corresponding author: WANG Xin, wangxin110870@sut.edu.cn ;

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1.1. 碳酸酐酶的性质

1.2. 碳酸酐酶的催化CO2水合机理

3.1. CA在CO2矿化中的应用

3.2. 液体吸收法捕集CO2

3.3. 多酶复合级联催化CO2

3.4. CA转化CO2的工业应用

目录

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1.1. 碳酸酐酶的性质

1.2. 碳酸酐酶的催化CO2水合机理

3.1. CA在CO2矿化中的应用

3.2. 液体吸收法捕集CO2

3.3. 多酶复合级联催化CO2

3.4. CA转化CO2的工业应用

1.2. 碳酸酐酶的催化CO₂水合机理

3.1. CA在CO₂矿化中的应用

3.2. 液体吸收法捕集CO₂

3.3. 多酶复合级联催化CO₂

3.4. CA转化CO₂的工业应用

1.2. 碳酸酐酶的催化CO₂水合机理

3.1. CA在CO₂矿化中的应用

3.2. 液体吸收法捕集CO₂

3.3. 多酶复合级联催化CO₂

3.4. CA转化CO₂的工业应用