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据估计，全球有超过25%—30%的人口患有过敏性疾病[1]. 近年来，世界范围内过敏性疾病的发病率仍在急剧上升，已成为世界上患病率增长速度最快的慢性疾病之一[2]. 尽管发病率增加的原因尚未完全被揭示，许多研究已经发现，空气污染会加剧过敏性哮喘等疾病[3-5]. Franze等[6]发现暴露于空气污染物中的桦树花粉过敏原发生了有效的硝基化反应，并提出了过敏原的硝基化在空气污染对过敏性疾病的促进作用中发挥了关键作用.
过敏原的硝基化通常是指过敏原蛋白质酪氨酸在硝化剂的作用下反应形成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine）[7]. 过敏原的硝基化会对其免疫原性产生影响[8]，硝基化可能导致本是过敏原的蛋白质的致敏性增强，或者导致细胞表位的暴露或新表位的产生[9-10]，从而增加其人体健康风险. Gruijthuijsen[11]以及 Karle等[12]通过动物实验和体外实验证实了硝基化反应会增强桦树花粉过敏原Bet v 1的致敏潜力. 然而，蛋白质的硝基化具有位点选择性，并非过敏原上所有酪氨酸都能发生硝基化反应[8]. 对过敏原硝基化过程中酪氨酸位点发生特异性反应的研究对于阐明硝基化影响过敏原致敏性的机制以及控制硝基化所带来的致敏性健康风险具有重要的意义.
目前，环境中已经检测到了硝基化的花粉过敏原[6]，对过敏原硝基化的分子机制以及敏化机制（对致敏性影响）的研究也多集中于花粉过敏原. 而环境中其它过敏原的硝基化状况鲜有报道. 尘螨（house dust mites, HDM）是人类生活和工作的各类室内环境中最为常见的过敏来源，其产生的过敏原可引起哮喘、特应性皮炎等多种过敏性疾病[13-14]. 高达50%的过敏患者对尘螨过敏原过敏[15]. 在至今已鉴定出的38组尘螨过敏原中，来自粉尘螨（Dermatophagoides farina，Der f）和屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p）的组分Ⅰ（Der f 1和Der p 1）和组分Ⅱ（Der f 2和Der p 2）为最主要的尘螨致敏原[16-18]. Der p 1和Der p 2的IgE抗体结合频率分别超过了80%[19]与90%[17]，长期以来，Der p 1和Der p 2被认为是诊断和治疗尘螨过敏疾病所必须关注的两种过敏原[16]. 在本课题组最近的研究中，已经检测出了环境灰尘样本中Der f 1和Der p 1的硝基化产物[20]. 然而，由于尘螨过敏原含有多个酪氨酸位点，其在硝基化过程中的位点选择性还有待进一步的研究.
以往的研究，通常使用基于免疫化学的酶联免疫吸附或蛋白质印迹法、紫外分光光度法、以及液相色谱与紫外-可见光吸收二极管阵列等方法，通过定量蛋白质中酪氨酸与硝基酪氨酸来测定蛋白质的平均硝基化程度（nitration degree，ND）[6,21-23]. 然而，这些方法均无法分析单个酪氨酸位点发生硝基化反应的情况. 虽然传统蛋白组学的方法可用于定性分析某些酪氨酸位点是否发生硝基化，但很难精确定量单个酪氨酸位点的硝基化程度[24-26]. 近年来，定向蛋白组学的发展为精确地定量分析过敏原中单个酪氨酸位点的硝化程度提供了技术手段[27]. 该方法可通过将过敏原蛋白质进行酶解后，利用液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）技术，测定过敏原酶解产物中各条含有酪氨酸或硝基化酪氨酸的多肽，从而对酪氨酸位点的硝基化程度（nitration degree of tyrosine，NDY）进行定量分析[28-29].
本文选择Ⅰ类和Ⅱ类尘螨过敏原为研究对象，建立基于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用技术，同时检测含酪氨酸的酶解多肽及其对应的硝基化多肽的方法，以此准确地定量分析两类尘螨过敏原在硝基化反应中各酪氨酸的NDY，并将该方法应用于经硝化试剂过氧亚硝酸盐（ONOO-）硝基化的尘螨过敏原，探究各过敏原发生硝基化反应的位点选择性.
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超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆串联质谱仪（UPLC/ESI-MS/MS，Xevo TQ-S；Waters，美国）；色谱柱Waters BEH C18柱（2.1 mm × 50 mm × 1.7 µm），前端串联保护柱VanGuardTM（C18柱，2.1 mm × 5 mm × 1.7 µm）；分析天平（220 g / 0.1 mg，ME204, Mettler Toledo，瑞士）；QL-901涡旋振荡器（Waters，美国）；高速冷冻离心机（Sorvall Legend Micro 17R, Thermo Fisher Scientific，德国）；金属恒温孵育仪（D1200-230V，Labnet，美国）；真空离心浓缩仪（RVC 2-18, Christ，德国）；超滤离心管（Amicon® Ultra 3K/10K超滤管，Millipore，爱尔兰）；无菌注射器（1 mL，华福，浙江）；聚四氟乙烯针式过滤器（滤膜）（φ13 mm×0.22 μm，津腾，天津）.
Ⅰ类尘螨过敏原Der f 1重组蛋白（Uniprot Accession：P16311，纯度>95%）与Der p 1重组蛋白（Uniprot Accession：P08176，纯度>95%）购自MyBioSource；Ⅱ类尘螨过敏原Der p 2重组蛋白（Uniprot Accession：Q1H8P8，纯度>95%）购自Raybiotech. 尘螨过敏原蛋白的理论胰酶酶解多肽及其相应的硝基化多肽委托吉尔生化（上海）有限公司合成（纯度均≥98%）. 过氧亚硝酸盐溶液（peroxynitrite，纯度≥90%）购自上海脉铂医药科技有限公司. 乙腈（LC-MS级）和Tween-20购买自美国Sigma-Aldrich公司. 质谱级胰蛋白酶购自北京生夏蛋白技术有限公司. 二硫苏糖醇（DL-1，4-Dithiothreitol，DTT，≥98%），碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA，纯度≥98%）和甲酸（纯度≥98%）均购买自北京百灵威科技公司.
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同一组类的粉尘螨和屋尘螨过敏原通常具有较高的序列同源性（80%—85%）和交叉反应性[30]. 比较Ⅱ类尘螨过敏原的结构，可以发现Der f 2和Der p 2的一级结构和二级结构极为相似，全序列均由146个氨基酸构成，蛋白质相对分子质量均约为16 kDa. 至于酪氨酸位点，Der f 2仅有两条胰酶酶解肽GQQYDIK（GK-7）和YTWNVPK（YK-7）含有酪氨酸残基Y103和Y107，而Der p 2除了拥有这两个相同的酪氨酸位点（Y103和Y107）外，主链（氨基酸序列18-146）上还有一个位于胰酶酶解肽ASIDGLEVDVPGIDPNACHYMK（AK-22）上的酪氨酸残基Y92. 因此在定量Ⅱ类尘螨过敏原各酪氨酸位点的硝基化程度时，只需对Der p 2进行分析. 尽管Ⅰ类过敏原Der f 1和Der p 1也有较高的同源性，但未发现完全相同的含酪氨酸位点的酶解肽，因此对于Ⅰ类尘螨过敏原，需要分别对Der f 1和Der p 1进行分析与讨论.
Ⅰ类和Ⅱ类尘螨过敏原蛋白Der f 1、Der p 1以及Der p 2的氨基酸序列见表1. Ⅰ类尘螨过敏原Der f 1和Der p 1的全序列分别由321和320个氨基酸构成，蛋白质相对分子质量均约为36kDa，且主链上（氨基酸序列19-321/320）均含有20个酪氨酸残基. 但是，由于质谱检测范围的有限性、目标多肽需要具备特异性、以及酶解过程中存在难以避免的化学诱导修饰，目前无法检测所有酪氨酸的硝基化程度. 为了尽可能多地监测酪氨酸位点的硝基化状况，本实验计算了所有含酪氨酸的理论胰酶酶解多肽，并利用蛋白数据库（www.uniprot.org/peptidesearch和www.peptideatlas.org）的搜索功能检查其特异性，选择具备特异性并且能被仪器检测（m/z < 2048）的理论酶解肽作为待测过敏原的目标肽段. 最终，12条含有酪氨酸的多肽（氨基酸序列信息见表1）及其对应的14条硝基化多肽被选作目标多肽并委托合成，这些目标多肽包含了Der f 1的7个硝基化位点，Der p 1的3个硝基化位点，以及Der p 2的3个硝基化位点.
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使用合成的目标多肽标准物质，建立同时测定含3种主要尘螨过敏原13个酪氨酸位点的硝基化和非硝基化的26条目标多肽的超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆串联质谱（UPLC/ESI-MS/MS，Xevo TQ-S；Waters，美国）检测方法. 通过自动调谐和参数优化，筛选出各目标多肽的定量以及定性离子对，并对其所对应的锥孔电压、碰撞压力等参数进行优化. 各目标多肽的仪器检测参数见表2. 其它仪器参数包括：离子源为正离子（ESI+）模式；毛细管电压设置为3.5 kV；碰撞气体为氩气；脱溶剂气为氮气，流速为800 L·h−1，温度为350 ℃. 待测溶液的进样量为30 μL. 二元洗脱流动相为含0.1%甲酸的乙腈（A相）和含0.1%甲酸的水（B相），色谱柱的温度为40 ℃，设置流速为0.2 mL·min−1的连续梯度洗脱：0 min：5% A；4 min：25% A；7min：95% A；7.5min：95% A；8min：5% A；8.5 min：5% A.
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根据REINMUTH-SELZLE等[32]的方法用过氧亚硝酸盐硝化尘螨过敏原蛋白Der f 1，Der p1和Der p 2. 首先，将ONOO-溶液在冰上缓慢解冻，将不同体积浓度为3.42 mmol·L−1的ONOO-溶液分别加入到含有10 μg 的3种过敏原的低蛋白吸附管中（其中Der f 1与Der p 1的浓度为1 mg·mL−1，Der p 2的浓度为0.34 mg·mL−1），配制成ONOO-与各蛋白质中酪氨酸摩尔浓度比值（ONOO-/Y）为0:1、1:1、3:1、5:1、10:1、15:1 和30:1的混合溶液. 3组混合溶液混匀后，在4 ℃条件下反应100 min. 最后通过超滤离心将蛋白质与硝化剂分离从而终止反应，Der f 1与Der p 1使用截留分子量为10 kDa的超滤管，Der p 2使用截留分子量为3 kDa的超滤管，并用50 mmol·L−1 的NH4HCO3缓冲溶液（pH 7.5—8.5）清洗2次，最终使蛋白质反应产物溶于20 μL的NH4HCO3缓冲液.
将同一反应条件下（ONOO-/Y相等）的3种尘螨过敏原反应产物各取10 μL混合之后在低蛋白吸附管中进行酶解. 首先，在混合蛋白溶液中加入40 μL乙腈，20 μL NH4HCO3 缓冲溶液以及10 μL 浓度为100 mmol·L−1的DTT，充分混匀后，60 ℃恒温孵育45 min；随后加入20 μL浓度为100 mmol·L−1的IAA，将还原后的蛋白质烷基化，涡旋混匀后，37 ℃恒温避光孵育45 min；孵育结束后，用280 μL的NH4HCO3缓冲液将乙腈的终浓度稀释至10%（V/V），并加入7.5 μL 浓度为40 ng·μL−1的胰蛋白酶，使蛋白质在酶/底物为1:50（W/W）的条件下进行酶解，37 °C恒温孵育15 h后，加入5 μL 50%的甲酸终止酶解反应. 将酶解后的混合溶液在真空离心浓缩仪中浓缩至近干，最后用 200 μL 5%乙腈复溶并过0.22 μm滤膜除杂，待进行仪器分析. 使用1.2节中建立的UPLC-MS/MS检测方法定量目标多肽，对某酪氨酸而言，通过公式（1）可计算得到该酪氨酸的硝基化程度（NDY）.
其中，Ca和Cb分别表示含有某酪氨酸的非硝基化多肽和硝基化多肽的浓度（ng·mL−1）；Mra和Mrb表示非硝基化多肽和硝基化多肽的相对分子质量.
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使用目标多肽的标准物质建立了包含Ⅰ、Ⅱ类尘螨过敏原蛋白Der f 1、Der p 1和Der p 2共13个酪氨酸硝基化位点的26条目标多肽的HPLC-MS/MS检测方法. 图1为该方法条件下100 ng·mL−1目标多肽标准溶液的总离子流出色谱图. 结果显示，该方法能够用于检测Der f 1的7个酪氨酸位点，Der p 1的3个酪氨酸位点，和Der p 2的3个酪氨酸位点的硝基化程度.
为了评价检测方法的可靠性，本文对26种目标多肽的仪器日内偏差、方法精密度以及加标回收率进行了测定，测定结果见表3. 结果显示，在标准多肽浓度为50 ng·mL−1和500 ng·mL−1时，仪器日内偏差≤7.6%（n=5），方法精密度≤15.2%（n=3），相对回收率在64.8%—95.3%之间（n=3），表明该方法使用UPLC-MS/MS定量分析尘螨过敏原的目标多肽，有良好的准确度和精密度，能有效地用于分析尘螨过敏原的硝基化状况.
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应用建立的检测方法，监测重组尘螨过敏原Der f 1、Der p 1和Der p 2在不同浓度的ONOO-溶液中各酪氨酸的硝基化反应状况，图2总结了各酪氨酸在不同硝化剂浓度下的NDY值. 随着ONOO-/Y物质的量比的增加，各尘螨过敏原的硝基化程度也在增加. 但由于硝基化反应的位点选择性，各酪氨酸有不同的硝基化反应性[8,25,32]，因此同一过敏原上的不同酪氨酸在相同ONOO-反应条件下会有不同的NDY，且NDY的增长速率也各不相同. 具体而言，对于Der f 1能检测到的7个酪氨酸位点，Y195的硝基化反应活性最高，在任何ONOO-/Y的物质的量比浓度下均有最大的NDY值. 当ONOO-/Y为30:1时，NDY能达到43.61%. 而酪氨酸Y37、Y79和Y181在ONOO-溶液中几乎不发生硝基化. 其余3个酪氨酸Y56、Y193和Y252在ONOO-溶液中的硝基化程度相似，当ONOO-/Y为30:1时，3种酪氨酸的NDY分别为19.42%、16.19%以及17.61%. 对于Der p 1能检测到的3个酪氨酸硝基化位点Y29、Y37和Y251，随着ONOO-浓度的增加，3个酪氨酸的NDY分别能增加到25.19%、13.97%以及9.82%（ONOO-/Y为30:1）. Y29是3个酪氨酸中硝基化反应活性相对较高的酪氨酸硝基化位点. 对于Der p 2的3个酪氨酸，仅Y92在ONOO-溶液中发生了明显的硝基化反应，NDY为0—25.46%.
蛋白质上不同的酪氨酸残基具有不同的硝基化反应性. 蛋白质的初级序列、二级结构以及酪氨酸的溶剂可及性均可影响酪氨酸的反应活性[8]. 在对尘螨过敏原的硝基化研究中，发现3种尘螨过敏原在ONOO-溶液中均发生了位点选择性的硝基化. Y195、Y92和Y29分别是Der f 1、Der p 2和Der p 1硝基化过程中的优势位点. 通过蛋白质结构预测网站（www.predictprotein.org）对3种尘螨过敏原的蛋白质结构进行预测，各酪氨酸的结构信息见表4. Der f 1 的Y195以及Der p 2的Y92均处于溶剂可及的蛋白质暴露表面，并且处于结构较为灵活的环状（Loop）区域，这可能是Y195和Y92能成为硝基化优势位点的主要原因[8,25]. 此外，有研究发现，酪氨酸附近存在带负电荷的氨基酸，如天冬氨酸（D）和谷氨酸（E），也会促进酪氨酸的硝基化[33,34]. 因此，在一级结构紧邻（-1与-2）的两个谷氨酸的促进作用下，Y29成为了Der p 1中硝基化反应活性相对较高的酪氨酸位点.
3种尘螨过敏原在硝基化条件下均发生了位点选择性的硝基化，而一些能/易发生硝基化的酪氨酸已经被证实是这些尘螨过敏原抗原决定簇（细胞表位）的组成部分，例如，酪氨酸Y92、Y103和Y107均是Der p 2的线性表位的组成部分[35,36]，而Y92极易发生硝基化，因此Y92可能在硝基化导致Der p 2致敏性变化的过程中发挥着重要作用. 此外，酪氨酸的硝基化可能改变蛋白质结构，导致细胞表位的暴露或新表位的产生，从而引过敏原的致敏性增强[9-11]. 因此尘螨过敏原硝基化所带来的致敏性健康风险不可忽视，而探究位点特异性的硝基化对尘螨过敏原致敏性的影响也将是进一步的研究重点.
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本文建立了定量尘螨过敏原各酪氨酸硝基化程度的分析方法，该方法可同时检测Ⅰ、Ⅱ类3种尘螨过敏原（Der f 1、Der p 1和Der p 2）共13个酪氨酸位点的硝基化程度，并成功运用于分析3种尘螨过敏原在ONOO-硝基化作用下各酪氨酸的硝基化状况以及各过敏原硝基化的位点选择性. 结果发现，在ONOO-作用下，3种尘螨过敏原均发生了位点特异性的硝基化，其中，Y195、Y29分别是Der f 1和Der p 1硝基化反应性较高的酪氨酸位点，Y92是Der p 2最容易发生硝基化的酪氨酸位点.
尘螨过敏原硝基化的位点选择性分析
Analysis of site-selective nitration in house dust mite allergens
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摘要: 过敏原的硝基化会引起其致敏潜能的增强，进而带来更大的致敏性健康风险. 过敏原蛋白质通常含有多个酪氨酸硝基化位点，分析过敏原硝基化的位点选择性是探究硝基化对过敏原致敏性影响的重要基础. 本文以尘螨过敏原为研究对象，建立了基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时定量分析3种尘螨过敏原（Der f 1、Der p 1和Der p 2）的13个酪氨酸位点硝基化程度的方法，并应用于分析3种尘螨过敏原在过氧亚硝酸盐硝基化作用下的位点选择性. 结果表明，3种尘螨过敏原均发生了位点特异性的硝基化，Y195、Y37和Y92分别为Der f 1、Der p 1和Der p 2中反应活性最高的硝基化位点. 尘螨过敏原位点选择性的硝基化表明，在评价硝基化尘螨过敏原的致敏性变化时应当考虑其位点特异性的硝基化状况.
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关键词:
- 尘螨过敏原 /
- 酪氨酸 /
- 硝基化 /
- 位点选择性 /
- 液相色谱-串联质谱.
Abstract: Nitration of allergens can enhance their allergenic potential, consequently contributing to higher allergenic health risks. Allergen proteins usually contain more than one tyrosine which could be nitrated. Analysis of site-selective nitration is critical for exploring the effect of nitration on allergenicity of allergen. In this study, a method was developed for the quantitative analysis of the nitration degrees of total 13 tyrosine sites of three house dust mite (HDM) allergens (Der f 1, Der p 1 and Der p 2) by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The method was then applied to analyze the site-specific nitration of tyrosine in the three HDM allergens under nitration of peroxynitrite (ONOO-). The results showed that HDM allergens were nitrated by ONOO- and the reactions were site-selectivity. Y195, Y37 and Y92 were the most reactive nitration sites of Der f 1, Der p 1 and Der p 2, respectively. The site-selective nitration of HDM allergens indicated that site-specific nitration should be considered and included when assessment of the changes of their allergenicity caused by nitration. -
挥发性有机污染物(VOCs)是指在常温常压下沸点为50 ~ 260 ℃、饱和蒸汽压大于133.13 kPa的有机化合物。VOCs 通常来源于包装印刷、石油化工等行业及机动车尾气排放，可能导致雾霾和光化学烟雾的形成和臭氧层破坏，而且也给人体健康带来威胁。
光催化通过光源照射在半导体催化剂表面，引发电子从价带转移到导带，并与空气及水反应，生成羟基自由基等强氧化性基团；与污染物反应，从而达到强化降解污染物的目的[1-3]。通常，由于光催化材料的吸附能力通常较弱，因此，通过将光催化剂负载到吸附剂表面有着广阔的研究前景[4-7]。在基于真空紫外的光催化氧化(VUV-PCO)工艺中，O3通过185 nm真空紫外光辐射产生，可用于进一步增强污染物的氧化。但若未充分利用，出口处的高浓度O3同时也是二次污染物。活性炭(AC)拥有出色的吸附性能[8-9]，具有一定的催化氧化作用，在减少O3污染排放的同时，可生成强氧化剂，增强对污染物的降解，并减少副产物的排放[10-11]。HUANG等[12]利用沸石良好的VOCs和臭氧吸收能力，以沸石作为载体制备了TiO2/ZSM-5催化剂，在提高苯吸收能力的同时，利用臭氧分解能力获得了较高的苯去除率。SHU等[13]制备0.1%Mn/40%TiO2/AC催化剂，在VUV-PCO工艺下，实现近86%的甲苯去除率，并可将O3催化转化为O(1D)和·OH高活性物种，辅助催化氧化。GUO等[14]和MATOS等[15]通过TiO2在活性炭上不同方式的负载，均得到了高效的气态甲苯去除率。采用溶胶-凝胶、浸渍法等原位负载或机械混合的方式负载活性炭[12]，一方面发挥活性炭出色的吸附性能，另一方面也能发挥其与催化剂的协同效应，在增强降解性能的同时减少二次污染问题。
本研究采用共沉淀法制备了Ce掺杂ZnO纳米催化剂，通过机械混合的方式将其负载在活性炭上，通过考察负载活性炭对光催化性能(污染物去除率、矿化率和O3消耗量)的影响，获得了Ce-ZnO和粉末活性炭最佳负载比例，提出了可能的降解机理，并探究了活性炭对催化剂使用寿命及降解产物的影响，最后对该工艺的能耗进行了分析，研究为VUV-PCO体系下增强催化性能和稳定性，优化能量利用率提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验药品与仪器
对二甲苯、Ce(NO3)3·6H2O、Na2CO3购于阿拉丁试剂有限公司，ZnSO4·7H2O购置于上海凌峰化工有限公司，活性炭购于溧阳市天顺活性炭有限公司，无水乙醇购于安徽安特食品股份有限公司。若无特别说明，所有药剂均为分析纯。
1.2 催化剂的制备
Ce-ZnO的制备：将4.34 g硝酸铈六水合物溶于100 mL超纯水中，并加至七水硫酸锌溶液中，制备摩尔比为0.96%的混合溶液，以300 r·min–1的搅拌速度搅拌3 h，从而获得Ce掺杂的ZnO复合物的前体物；用乙醇和超纯水利用超声波清洗机洗涤沉淀物3次至纯净，置于65 ℃烘箱中干燥后，在351 ℃下煅烧339 min，得到Ce-ZnO。
Ce-ZnO负载活性炭的制备：将Ce-ZnO和活性炭按不同比例加入无水乙醇，放至搅拌器中搅拌(100 r·min–1)，然后将其放入超声波清洗器中，混合搅拌30 min；将混合物均匀涂覆在石英舟上，并将其置于65 ℃下干燥10 h。
1.3 吸附-光催化性能测试
本研究中使用的性能测试系统见图1。测试系统主要由配气系统、光催化反应系统和检测系统3部分组成。通过配气系统产生不同浓度和湿度的对二甲苯废气。光催化反应系统由真空紫外灯管、光催化反应器和石英舟构成。光催化反应器包含圆形套管，内筒内放置紫外灯管，内筒(长44 cm)与外筒(长44 cm)夹层间放置涂覆有光催化剂的石英舟(长43 cm)。反应器的体积为600 cm3，长40 cm的紫外灯管(36 W，185+254 nm)置于反应器中，使VUV均匀辐射气流和光催化剂。实验中用无水乙醇将1 g催化剂均匀涂覆在石英舟上，涂覆面积为1 130 cm2。打开紫外灯的同时，连续通入对二甲苯混合气体，在一定时间内分别测定反应器出口处的对二甲苯浓度、二氧化碳浓度和臭氧浓度。实验中，通过调节配气比例和流量，控制对二甲苯浓度为150 mg·m–3，相对湿度为40%、停留时间为30 s。对二甲苯浓度和二氧化碳浓度由Agilent 6890气相色谱仪HP-Innowax型和HP-Plot-Q型毛细管柱定量分析，臭氧浓度利用德国德图(testo625)臭氧分析仪测定，中间产物由气相色谱-质谱联用(Agilent GC-7890，MS-5790)进行分析。
2. 结果与讨论
2.1 吸附-催化复合材料性能测试
许多研究[16-19]表明，Ce掺杂ZnO能够显著提高催化剂的光催化性能；但受制于其有限的活性位点，在较短的反应时间内，污染物无法与催化剂充分接触而被高效去除。活性炭作为一种有效的吸附材料，具有大比表面积和丰富的孔结构，通过表面碳原子与O3结合形成含氧基团，同时，其本身的催化活性也有一定的O3去除效果[20]。通过活性炭与Ce-ZnO的有效结合，有望获得较高的催化氧化性能。
为考察Ce-ZnO/AC的吸附性能，在没有紫外光的条件下对催化剂进行吸附稳定性测试(图2)。可以发现，复合材料对对二甲苯的吸附率持续下降。200 min后下降速率增加，并在9 h时降至60%以下。同时测定了反应器出气中的二氧化碳，发现其浓度与进气中二氧化碳浓度相似。这说明在没有紫外光照射时，复合催化材料对对二甲苯只存在吸附作用。
图 2 在暗反应过程中 Ce-ZnO∶AC=1∶2时对二甲苯的吸附Figure 2. Adsorption of p-xylene by composite catalyst with Ce-doped ZnO∶AC = 1∶2 during dark reaction为验证复合催化剂的催化性能，考察不同工艺(VUV+ZnO、VUV+ZnO/AC、VUV+Ce-ZnO和VUV+Ce-ZnO/AC)对对二甲苯的去除效率，同时测定了反应器出口O3浓度和CO2浓度。如图3 (a)所示，单独使用ZnO作为光催化剂，120 min后对二甲苯的去除率从60%降低至40%左右，表明ZnO在反应过程中缓慢失活，催化稳定性较差，对照实验表明，ZnO失活后的降解效率来自真空紫外的贡献。当Ce掺杂到ZnO内部后，对二甲苯的去除率升高到70%以上，并且在120 min之后没有出现明显下降，表明Ce-ZnO具有良好的催化稳定性。ZnO负载活性炭时，对二甲苯的去除率在80%以上，并在160 min后开始有下降趋势；而当Ce-ZnO/AC放入反应器中时，对二甲苯的去除率进一步提高至98%以上，并在测试时段内保持稳定。这说明吸附-催化混合型催化剂具有优异的对二甲苯降解性能及稳定性。如图3 (b)所示，在单独VUV体系中，反应器出气中O3浓度为3 002.5 mg·m−3。当使用ZnO作为催化剂时，O3浓度降至340 mg·m–3，同时产生150 mg·m–3的CO2。当ZnO负载活性炭后，出气中O3浓度迅速降低至60 mg·m−3，但CO2生成量提升幅度较小。这说明，虽然活性炭具有较好的污染物富集能力[21-22]，但富集到活性炭表面的对二甲苯不能被催化剂彻底矿化，因而CO2没有大幅提升。同时，活性炭具有一定的臭氧分解能力[23-25]，使得出气中O3浓度大幅下降。当Ce-ZnO作为催化剂时，O3分解加快，CO2生成量达到170 mg·m−3。当Ce-ZnO与活性炭混合之后，出气中O3浓度进一步降低至20 mg·m−3，同时对二甲苯的矿化率进一步提高，CO2产生量达到190 mg·m−3。这些结果说明，活性炭的加入不仅对光催化氧化反应起促进作用，提高对二甲苯的降解效率，而且在臭氧的分解中也起到积极作用。
图 3 VUV-PCO系统不同工艺下CO2产量、出口O3浓度和对二甲苯去除率Figure 3. CO2 production, outlet O3 concentration and p-xylene removal efficiency under different processes of VUV-PCO system2.2 负载比例的影响
虽然吸附-催化复合材料对对二甲苯具有良好的降解效果，但当催化剂在活性炭上的负载量过高时，部分催化剂将占据活性炭表面的微孔，抑制活性炭的吸附性能；当负载量过低时，光催化剂就无法发挥较大的作用，从而降低催化氧化的效果。因此，催化剂在活性炭上的负载比例尤为重要。因此，实验考察了Ce-ZnO与活性炭的质量比分别为1∶4、2∶4、3∶4和4∶4的催化性能，实验结果如图4(a)所示。当光催化剂与活性炭比例为1∶2时，对二甲苯去除率最高，且出口的O3浓度最低，为20 mg·m–3左右，CO2生成量达到175 mg·m–3。此后随着催化剂比例的增加，降解性能和矿化率都有所下降，出口气体中的臭氧残留较多。当催化剂负载比例较低时，在反应初始阶段，吸附催化性能较高，去除效果较好；但随着时间的推移，去除率缓慢下降。这是因为低负载比例下催化剂的降解性能有限，而活性炭的吸附作用占主导地位。当催化剂负载比例较高时，活性炭表面的催化剂含量相对较高，初始阶段的降解效果较好。但由于活性炭内部的部分孔径被催化剂所占据，无法与对二甲苯充分接触，发挥不了其富集作用，导致降解效率迅速降低。
图 4 在不同Ce-ZnO负载活性炭的比例下CO2产量、出口O3浓度和对二甲苯去除率Figure 4. CO2 production, outlet O3 concentration and p-xylene removal efficiency under different ratios of Ce-doped ZnO to activated carbon此外，在考虑负载比例时，既要充分利用O3的氧化性能，又要防止出口气体中O3浓度过高。由图4(b)可以看出，光催化剂与活性炭的比例为1∶2时，对二甲苯的转化率更高，矿化率更高，O3的排放量也更少。这说明在该比例下，催化剂充分利用了O3的氧化性能，污染物降解率有所提高。
2.3 VUV辐射下对二甲苯的催化氧化
与传统的PCO工艺相比，VUV-PCO体系具有更多的降解途径。VUV(λ=185 nm) 辐射产生的高能光子可以使氧和水蒸气直接解离[26]，反应见式(1)和式(2)。Ce-ZnO催化剂带隙激发产生的激发态导带电子和价带空穴，与吸附的电子供体得到受体发生电子转移反应[27-28]，反应见式(3))。VUV辐射还将产生O3，并在后续降解过程中发挥重要作用[26-29]，反应见式(4)~式(6)。
H2O+hν→H+⋅OH (1) O2+hν→O(1D)+O(3P) (2) Ce−ZnO+hν→h+vb+e−vb (3) O(1D)+M→O(3P)+M(M=O2或N2) (4) O(3P)+O2+M→O3+M (5) O(1D)+H2O→2⋅OH (6) VUV辐射产生的O3不仅具有一定的氧化作用，O3作为强氧化剂和良好的电子受体还可有效防止电子-空穴对的复合，从而延长光催化作用中空穴的寿命。同时，O3能在Ce-ZnO催化剂的作下，分解产生激发态的氧原子O(1D)和羟基自由基(·OH)等自由基[12, 26-30]。负载的活性炭可以将O3吸附至其表面，捕获电子形成臭氧化物离子(
O⋅−3 )，然后形成·OH[13, 30-31]，反应见式(7)~式(9)。O3分子也可以通过VUV辐射分解为O (1D) 和一个氧分子[32]，反应见式(10)。以上反应过程中产生的激发态氧原子和自由基等均将增强VOC的降解效果。O3+e−→O⋅−3 (7) H++O⋅−3→HO⋅3 (8) HO⋅3→O2+⋅OH (9) O3+hν→O(1D)+O2 (10) O3与活性炭之间存在的化学相互作用将生成羧基等含氧官能团。在催化剂负载过量的情况下，活性炭上活性位点被催化剂部分占据，此时官能团的迅速积累会导致活性炭表面更少的活性位点参与O3的分解(2个O3分子与表面位点相互作用以产生3个O2分子)[33-34]。而当负载量过少的情况下，虽然活性炭表面空余的活性位点相对增加，但此时Ce-ZnO的含量也相对较低，对吸附物质的催化氧化能力降低，协同效果不明显。
在VUV-PCO体系中，Ce-ZnO/AC作为催化剂时对二甲苯的降解效率最优。由图3(a)可以看出，未负载活性炭时，VUV + Ce-ZnO对对二甲苯降解率约为70%，其中单独VUV作用时的降解率为40%，而活性炭的加入可将其提升至99%，降解效率提高了29%。同时，活性炭的加入能够产生更多的二氧化碳。如图3(b)所示，与未负载的Ce-ZnO催化剂相比，复合催化剂在降解过程中的矿化率提升了11.8%。复合催化剂的吸附催化机理可总结如下：1) 185 nm VUV产生高活性物质(如羟基自由基和O3)并对污染物产生降解作用；2)残留的对二甲苯及大量中间产物通过吸附在活性炭和Ce-ZnO表面延长接触时间，并通过光催化氧化和臭氧辅助氧化进一步降解；3)活性炭本身的催化氧化性能在分解臭氧减少二次污染的同时，产生的高活性物质也能进一步促进污染物的转化。活性炭的强吸附性能和Ce-ZnO的催化氧化性能共同形成了复合催化剂的高催化活性，两者的协同作用导致了对二甲苯的高效降解。
利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对反应器出口尾气中的成分进行检测，考察活性炭的负载对对二甲苯在VUV-PCO体系下中间产物生成的影响。如图5所示，尾气中除了未参与反应的对二甲苯外，还有大量的降解中间产物。当采用Ce-ZnO/AC时，中间产物中部分大分子物质(如2,3-环氧丙酸乙酯、3-甲基-1-庚醇、壬醛和2,5 -二甲基环己烯等)几乎被完全去除，一些小分子物质的种类也有所减少。说明活性炭的存在能够减少难降解中间产物的生成，促进对二甲苯向小分子物质和二氧化碳转变，验证了矿化率的增加。
图 5 对二甲苯在不同工艺下光催化降解的气相中间产物Figure 5. Gas phase intermediates of p-xylene photo photocatalytic degradation under different processes2.4 催化剂稳定性考察
许多研究探讨了催化剂的稳定性，如Pt-ZnO-HAP[35]、Si-GO/ZnO[36]和胶体Au-CeO[37]催化剂在降解气态苯时，分别在400、1 260、300 min后均保持了较好的催化活性。为评价本研究制备催化剂的稳定性，将Ce-ZnO/AC (Ce-ZnO∶AC=1∶2) 放入光催化反应器中连续运行6 h。由图6 (a)可以看出，污染物的去除率在6 h内从99%降低到97%，虽然活性炭的负载可促进中间产物的进一步转化，但仍有部分小分子有机物积聚在催化剂表面，导致其降解效率略有下降[38]。在停留时间为60 s，相对湿度为50%时，采用VUV对Ce-ZnO/AC进行再生，3 h，后催化剂可恢复其原始催化活性，并且该操作可进行5个循环以上。再生过程中，VUV产生的O3等活性物质可以氧化去除催化剂表面覆盖的有机中间产物，恢复位点活性。由图6 (b)可以看出，反应器出口O3的浓度变化幅度较小，这进一步证明了该复合材料具有稳定的O3分解能力。这些结果表明，制备的负载活性炭的Ce-ZnO催化剂具有较好的稳定性，这对其潜在的工业应用具有重要意义。
2.5 能耗分析
吸附-催化复合催化剂的催化活化需要利用紫外光，因此，催化剂的选择须考虑能量的利用情况。以降解单位污染物所需能量为指标，对不同工艺在降解过程中能耗的利用情况进行分析，计算过程见式(11)。
E=PQ(CInlet−Coutlet) (11) 式中：Cinlet为对二甲苯进口浓度，mg·m–3；Coutlet为对二甲苯出口浓度，mg·m–3；Q为进气流量，L·min–3；P为紫外灯管功率，W；E为降解单位所需能量，Wh·(mg)–1。
不同处理工艺的能耗情况差异较大，在相同的紫外光源照射下，仅使用VUV处理对二甲苯时，降解1 mg对二甲苯需要(12.400 ± 0.512 4) Wh的能量；加入ZnO后，所需能量为(9.300 ± 0.131 8) Wh；使用Ce-ZnO催化剂时，需要(5.300 ± 0.393 4)Wh能量；当使用活性炭作为载体的复合催化剂时，所需能量降至(3.900 ± 0.212 8)Wh。相对于单独VUV，使用了吸附-催化复合材料后的能量利用率提升了近3倍。
3. 结论
1) Ce-ZnO负载于活性炭上对对二甲苯的降解具有良好的促进作用。负载活性炭时，催化剂对二甲苯的去除率可达99%，相对未负载前矿化率提高了11.8%，同时提高了对真空紫外光解产生臭氧的利用效率，减少了出口气体中臭氧浓度。
2)当Ce-ZnO与活性炭的负载比例为1∶2时，能够使吸附-催化降解的协同效果达到最大化。此时，复合催化剂具有较高的稳定性，能够在原位再生恢复其原始催化活性，在5次循环后对二甲苯的去除率仍可达到94.8%。
3) VUV、光催化氧化和活性炭促进的臭氧辅助氧化的协同作用导致对二甲苯的高效去除。中间产物的分析表明，活性炭的负载能够促进对二甲苯转化为小分子物质，减少难降解中间产物的比例。
4)吸附-催化降解工艺的能量利用效率较高，相对单独催化工艺能耗节省了近1/3，仅为单独VUV工艺的1/4。
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图 1 目标多肽标准品总离子流色谱图（100 ng·mL−1）
Figure 1. TIC Chromatograms of standard solution of targeted peptides （100 ng·mL−1）
图 2 尘螨过敏原Der f 1 （a）、 Der p 1 （b） 和 Der p 2 （c）各酪氨酸的硝基化程度（NDY）
Figure 2. Site-specific nitration degrees （NDY） of house dust mite allergens Der f 1 （a）, Der p 1 （b） and Der p 2 （c））.
表 1 尘螨过敏原Der f 1、Der p 1和Der p 2的氨基酸序列
Table 1. Amino acid sequences of HDM allergens Der f 1, Der p 1 and Der p 2
蛋白质Protein 氨基酸序列Amino acid sequences 非硝基化的目标多肽Non-nitrated target peptides 粉尘螨Ⅰ类过敏原Der f 1 MKFVLAIASLLVLSTVY17ARPASIKTFEEFKKAFNKNY37ATVEEEEVARKNFLESLKY56VEANKGAINHLSDLSLDEFKNRY79LMSAEAFEQLKTQFDLNAETSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAY146LAY149RNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEY181IQQNGVVEERSY193PY195VAREQRCRRPNSQHY210GISNY215CQIY219PPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHY252DGRTIIQHDNGY264QPNY268HAVNIVGY276GSTQGDDY284WIVRNSWDTTWGDSGY300GY302FQGNNLMMIEQY315PY317VVIM NY37ATVEEEEVAR（NR-12）Y56VEANK（YK-6）Y79LMSAEAFEQLK（YK-12）GIEY181IQQNGVVEER（GR-14）SY193PY195VAR（SR-7）AFQHY252DGR（AR-8） 屋尘螨Ⅰ类过敏原Der p 1 MKIVLAIASLLALSAVY17ARPSSIKTFEEY29AKAFNKSY37ATFEDEEAARKNFLESVKY56VQSNGGAINHLSDLSLDEFCNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAY145LAY148RNQSLDLAEQELVDCAQHGCHGDTIPRGIEY180IQHNGVVQESY191Y192RY194SVAREQSCRRPNAQRFGISNY214CQIY218PPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHY251DGRTIIQRDNGY263QPNY267HAVNIVGY275SNAQGVDY283WIVRNSWDTNWGDNGY299GY301FAANIDLMMIEEY314PY316VVIL TFEEY29AK（TK-7）SY37ATFEDEEAAR（SR-12）HY251DGR（HR-5） 屋尘螨Ⅱ类过敏原Der p 2 MMY3KILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNAGHY92MKCPLVKGQQY103DIKY107TWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD ASIDGLEVDVPGIDPNAGHY92MK（AK-22）GQQY103DIK（GK-7）Y107TWNVPK（YK-7） 
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表 2 目标多肽的仪器检测参数
Table 2. Instrumental parameters of targeted peptides in UPLC/ESI-MS/MS
多肽Peptides 硝基酪氨酸Nitrotyrosine 保留时间/minRT 反应离子对（锥孔电压/V，碰撞能量/eV）Transition （Cone, Collision energy） 检测限*/（ng·mL−1）LOD NR-12 4.28 705.4 > 861.4** （64, 25）; 705.4 > 1061.6 （64,28） 0.035 NO2-NR-12 Y37 4.83 727.7 > 861.4** （32, 25）; 727.7 > 960.5 （32,28） 0.077 YK-6 2.35 362.1 > 461.3** （4, 10）; 362.1 > 560.4 （4, 15） 0.002 NO2-YK-6 Y56 3.11 384.5 > 461.2** （4,10）; 384.5 > 332.2 （4, 10） 0.003 YK-12 6.10 715.5 > 1154.0** （22, 20）; 715.5 > 1022.6 （22, 25） 0.010 NO2-YK-12 Y79 6.21 737.9 > 147.1** （22, 15）; 737.9 > 1022.5 （22, 20） 0.021 GR-14 4.81 817.6 > 143.1** （24, 52）; 817.6 > 802.7 （24, 25） 0.022 NO2-GR-14 Y181 5.34 839.8 > 433.2** （70, 30）; 839.8 > 802.4 （70, 25） 0.015 SR-7 4.09 428.2 > 605.5** （6, 15）; 428.2 > 303.3 （6, 10） 0.004 NO2-SR-7（1） Y193 4.36 450.6 > 605.5** （10, 10）; 450.6 >508.3 （10, 20） 0.010 NO2-SR-7（2） Y195 4.74 450.6 > 650.3** （10, 10）; 450.6 > 553.3 （10, 20） 0.015 NO2-SR-7（3） Y193、Y195 4.76 473.1 > 695.3** （10, 10）; 473.1 > 175.1 （10,10） 0.013 AR-8 3.24 497.3 > 647.3** （60, 20）; 497.3 > 232.1 （60, 30） 0.011 NO2-AR-8 Y252 3.91 519.8 > 692.3** （60, 20）; 519.8 > 820.3 （60, 20） 0.012 TK-7 3.26 472.7 > 696.5** （34, 18）; 472.7 > 275.2 （34, 25） 0.025 NO2-TK-7 Y29 3.94 495.0 > 471.4** （14, 15）; 495.0 > 147.1 （14, 25） 0.020 SR-12 4.44 695.1 > 819.3** （16, 20）; 695.1 > 966.4 （16, 20） 0.010 NO2-SR-12 Y37 5.06 717.6 > 819.3** （70, 25）; 717.6 > 268.1 （70, 25） 0.014 HR-5 1.30 324.0 > 232.1** （16, 15）; 324.0 >510.2 （16, 15） 0.001 NO2-HR-5 Y252 2.42 346.4 > 232.1** （8, 15）; 346.4 > 347.2 （8, 6） 0.007 AK-22 6.10 771.4 > 931.5** （25, 35）; 771.4 > 86.0 （25, 30） 0.025 NO2-AK-22 Y92 6.14 786.4 > 976.5** （8, 30）; 786.4 > 86.0 （8, 60） 0.025 GK-7 3.57 426.4 > 260.2** （25, 15）; 426.4 > 147.1 （25, 20） 0.025 NO2-GK-7 Y103 4.36 448.5 > 260.1** （8, 16）; 448.5 > 147.1 （8, 25） 0.020 YK-7 5.01 454.4 > 244.2** （25, 20）; 454.4 > 643.5 （25, 15） 0.015 NO2-YK-7 Y107 5.65 476.5 > 244.0** （16, 20）; 476.5 > 643.4 （16, 15） 0.006 *由EPA[31]推荐的方法测定. *Determined based on the methods recommended by EPA.
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表 3 目标多肽方法学参数
Table 3. Methodology parameters of targeted peptides
多肽Peptides 仪器日内偏差/%Instrument intraday deviation （RSD）/% 方法精密度/%Method precision （RSD）/% 相对回收率（平均值±SD）/%Relative recovery （Mean±SD） 5 ng·mL−1 50 ng·mL−1 5 ng·mL−1 50 ng·mL−1 5 ng·mL−1 50 ng·mL−1 NR-12 5.3 5.1 6.1 3.9 75.1±4.5 78.9±3.1 NO2-NR-12 6.1 3.5 6.1 6.5 77.6±4.7 79.1±5.1 YK-6 0.4 0.6 2.2 4.8 91.4±2.0 91.9±4.4 NO2-YK-6 4.7 2.4 5.3 4.3 95.3±5.0 93.1±4.0 YK-12 1.0 1.3 9.1 12.8 79.0±7.2 79.4±10.1 NO2-YK-12 2.6 3.3 4.9 6.9 78.8±3.9 85.5±5.9 GR-14 1.8 4.9 5.1 1.0 86.4±4.4 81.7±0.8 NO2-GR-14 2.3 3.1 4.7 1.6 85.1±4.0 86.1±1.4 SR-7 2.0 2.8 4.3 3.1 94.1±4.1 85.2±2.6 NO2-SR-7（1） 5.6 1.3 7.1 7.7 81.0±5.7 87.6±6.8 NO2-SR-7（2） 2.0 1.5 4.1 5.2 90.7±3.7 88.0±6.8 NO2-SR-7（3） 1.8 2.8 3.3 5.8 94.4±3.2 90.4±5.3 AR-8 2.0 3.5 3.0 2.4 87.0±2.6 88.5±2.1 NO2-AR-8 2.0 4.1 2.4 3.0 86.9±2.1 87.3±2.6 TK-7 3.1 3.9 5.8 4.2 86.5±5.0 90.2±3.8 NO2-TK-7 3.1 5.2 1.4 3.6 88.3±1.2 89.3±3.2 SR-12 5.7 3.2 14.2 2.8 79.9±11.3 92.2±2.6 NO2-SR-12 7.6 1.2 4.3 3.8 84.4±3.6 90.3±3.4 HR-5 4.4 3.7 3.0 1.5 88.6±2.6 87.5±1.3 NO2-HR-5 1.6 2.8 1.5 9.1 89.1±1.3 85.8±7.8 AK-22 4.3 6.2 14.4 6.6 64.8±9.3 75.6±5.0 NO2-AK-22 2.5 4.9 15.2 9.5 74.5±11.3 79.1±7.5 GK-7 5.4 2.6 14.6 2.8 74.4±10.8 82.0±2.3 NO2-GK-7 2.7 2.8 4.1 2.4 83.7±3.5 94.1±2.3 YK-7 3.7 1.4 9.0 4.3 78.3±7.1 88.8±3.8 NO2- YK-7 4.0 1.9 5.1 3.0 85.8±4.3 89.3±2.7
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表 4 Der f 1、Der p 1和Der p 2的酪氨酸的结构预测
Table 4. Predicted structure of tyrosines in Der f 1, Der p 1 and Der p 2
蛋白质Protein 酪氨酸Tyrosine 酶解肽的氨基酸序列Amino acid sequence of tryptic peptide 二级结构Secondary structure 溶剂可及性Solvent Accessibility Der f 1 Y37 NYATVEEEEVAR Loop Buried Y56 YVEANK Helix Exposed Y79 YLMSAEAFEQLK Helix Buried Y181 GIEYIQQNGVVEER Helix Buried Y193 SYPYVAR Loop Buried Y195 SYPYVAR Loop Exposed Y252 AFQHYDGR Strand Buried Der p 1 Y29 TFEEYKK Helix Helix Y37 SYATFEDEEAAR Loop Buried Y251 HYDGR Strand Buried Der p 2 Y92 ASIDGLEVDVPGIDPNACHYVK Loop Exposed Y103 GQQYDIK Strand Buried Y107 YTWNVPK Strand Exposed 注：加粗字母“Y”代表酪氨酸，倾斜的字体代表带负电荷的氨基酸：天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）. Note: The bold character is the tyrosine residue and the slanted characters are the negatively charged amino acids （aspartate D and glutamate E）.
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