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土壤重金属污染是影响人类健康和生态环境质量的世界性问题[1-2]. 固定/稳定化和直接去除是重金属污染土壤修复的两种主要方法[1,3]. 修复技术主要有固定化、玻璃化、电动修复、植物修复和化学淋洗修复[1-3]. 土壤淋洗修复技术可以将重金属转移至液相以达到永久去除土壤中重金属的目的，是一种高效、低成本的方法，尤其适用于重度污染土壤[2,4-5]. 尽管淋洗剂（乙二胺四乙酸（EDTA）、谷氨酸N, N-二乙酸（GLDA）、乙二胺二琥珀酸（EDDS）和柠檬酸）对土壤中重金属去除效率高，但产生大量的淋洗废液中重金属主要以稳定的络合物形式存在，在较宽的pH范围内均有较高的稳定性，易造成二次污染问题[6]. 去除络合态重金属常用的方法有化学沉淀法、化学氧化法和离子交换法，但普遍存在产泥量大、处理条件复杂、费用较高等问题[6-8]. 与传统的化学处理方法相比，生物处理具有微生物来源广泛、适应性强、成本低、效率高、对环境友好等优点而有广阔应用前景[9].
近年来，学者们对硫酸盐还原菌（SRB）处理重金属污染废水进行了广泛的研究[9-11]. 研究表明，SRB可以去除传统废水中90%以上的Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+和Cr6+[9-11]. 一般来说，SRB去除废水中重金属离子主要通过硫化物沉淀和死菌体吸附[11-12]. 硫化物沉淀的形成过程分为两个阶段：（1）SRB利用硫酸盐作为电子受体氧化简单有机化合物生成碳酸氢根离子和硫化氢；（2）生物生成的硫化氢与游离重金属阳离子反应生成金属硫化物沉淀[9]. 此外，死菌体通过细胞壁上的官能团直接吸附重金属，有利于废水中重金属的去除[12].
虽然SRB对传统废水中的重金属离子具有很高的去除效率，但淋洗废液中的重金属主要以络合态形式存在[7]，有研究报道SRB可以通过还原反应机理有效地去除Fe（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的络合形态[13-14]，与高价态重金属相比，对于二价态重金属络合物去除的报道较少. Hakansson等[15]利用SRB产生的H2S处理络合态Pb和Cu的沉淀率达98%. 然而，据我们所知，二价重金属络合物的去除机理还不清楚. 不同络合剂如何影响SRB对络合态重金属的去除率，除形成金属硫化物沉淀外，细菌对络合态重金属的吸附效率几乎没有报道.
为了深入了解SRB对二价态重金属络合物的去除机理，利用不同络合剂形成Cu（Ⅱ）络合物，研究了分离SRB （Shewanella sp. JN01）对不同络合态Cu的去除效果及不同途径对菌株去除Cu（Ⅱ）络合物的贡献及其机理，以期达到淋洗废液的资源化再生和无害化处理提供科学依据.
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采集自山西省山阴县大营村（39°22′20.12″ N, 112°52′54.69″ E）地下井挖掘过程中21 m深的土柱. 将土柱置于手套箱（Whitley DG250，英国Don Whitley Scientific）中30 ℃下厌氧培养1周. 将土柱中央的土样置于无菌水中，用稀释涂布法富集培养菌株1周. 然后用富集培养基进一步的扩大培养. 每周更换新鲜培养基，连续培养4周后获得实验菌株. 将培养基（表1）调至pH=7.2，121 ℃高压灭菌30 min. 在富集培养基中加入2%的琼脂（W/V）制备固体培养基. 将纯化后的菌株JN01按平板划线法接种在固体培养基上. 使用DNA提取试剂盒（Sangon Biotech，生工生物工程（上海）股份有限公司）提取总DNA. 采用热循环仪（Bio-Rad，C1000 Touch，美国Bio-Rad公司）进行聚合酶链反应（PCR）. 用细菌通用引物从总DNA中扩增16S rRNA基因. 采用上游引物（27F 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'）和下游引物（1492R 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'）扩增菌株16S rRNA基因. PCR反应体系：2×Taq PCR Master 12.5 μL，DNA模板1 μL，上游引物2 µL，下游引物2 µL，dd H2O 7.5 μL. 扩增条件：95 ℃保持5 min；95 ℃保持1 min；54 ℃保持1 min；72 ℃保持2 min；72 ℃保持10 min；30次循环. 将16S rRNA基因序列在ClustalX 2.0[16]和GenBank核酸数据库中比对. 用Mega 6.0进行邻接法（NJ）、最大似然法（ML）和最大简约法（MP）分析.
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所用试剂参照之前的研究[17]. 以5% V/V将SRB菌液分别接种至初始pH值为7.0的培养基中，加入高浓度Cu2+、EDTA、GLDA、CA和MC储备溶液. Cu2+浓度为50 mg·L−1. n （Cu2+）: n （EDTA）分别为1:0、1:1、1:5、1:10和1:25. 当物质的量比超过1:25，混合溶液将会出现体积变化较大或EDTA溶解度较低. n （Cu2+）: n （GLDA、CA或MC）分别为1:0、1:1、1:5、1:10、1:25、1:50、1:75和1:100. 处理1、3、5、7 d后，测定溶液中Cu2+浓度. 所有处理设置3组平行，并做空白对照.
死菌体吸附实验将厌氧培养24 h后的SRB悬浮液在121 ℃下灭菌30 min，然后混匀分装至装有不同络合态Cu溶液（C （Cu2+）=50 mg·L−1；n （Cu2+）:n （络合剂）=1:10）的锥形瓶中，pH调至5.5. 于0、0.17、0.5、1、2、4、8、20 h后取样，测定溶液中Cu2+浓度. 所有处理设置3组平行，并做空白对照.
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采用火焰原子吸收光谱仪（AAS，Z-2300，日本Hitachi）测定样品中Cu浓度；扫描电子显微镜（SEM-EDS，S-3400 N，日本Hitachi）和X射线衍射仪（XRD，Empyrean，荷兰PANalytical）对Shewanella sp. JN01处理不同络合态Cu的沉淀物进行表征.
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采用Excel、SPSS 22.0和Origin 2018进行数据整理、统计分析及作图. 采用Duncan检验确定各处理之间的统计学差异（α = 0.05）.
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SRB与希瓦氏菌16S rDNA基因序列同源性达99%，构建系统发育树如图1所示，因此，分离菌株命名为Shewanella sp. JN01. Shewanella sp. JN01菌落形态在固体培养基上边缘规则，光滑圆润，中间呈凸起的黑色菌落（图2）. Shewanella sp. JN01的SEM图表明，菌体为杆状、质地略光滑，聚集较多，宽×长约为0.5 μm×（2—5） μm（图2）.
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Shewanella sp. JN01对水溶液中不同络合态Cu （Cu-EDTA、Cu-GLDA、Cu-CA和Cu-MC）的去除率与反应时间、络合剂类型和Cu与络合剂的物质的量比有关（图3）. 不同物质的量比下，Shewanella sp. JN01对Cu-EDTA和Cu-GLDA的去除率均低于Cu2+ （1:0）的去除率（图3）. 与 Cu-EDTA 和 Cu-GLDA相比，游离Cu2+更易与H2S反应形成金属硫化物沉淀，并被细菌细胞活性成分吸附[18]. 在物质的量比较低的情况下（n （Cu2+）: n （EDTA/GLDA）=1:1—1:10），Shewanella sp. JN01对Cu-EDTA和Cu-GLDA的最佳去除率一般在90%以上. 但是，随着EDTA与GLDA物质的量比增加（除n （Cu2+）: n （GLDA）=1:25外），Shewanella sp. JN01对Cu-EDTA和Cu-GLDA的去除率显著降低至10%以下. 溶液中大量游离的EDTA和GLDA对Shewanella sp. JN01的毒性大于其络合形态，因为络合剂可通过抑制酶活性和改变细胞膜渗透压导致细胞死亡[19]. 此外，在Cu-EDTA和Cu-GLDA溶液中，EDTA和GLDA能抑制硫化物沉淀的形成，降低Cu2+的去除率[19-20]. 当n （Cu2+）: n （EDTA/GLDA）=1:25时，Shewanella sp. JN01对Cu-GLDA的去除率为64.07%，而对Cu-EDTA的去除率小于10%，这可能是由于GLDA对微生物的毒性小于EDTA[5,21]. 同时，Cu-GLDA的稳定性（lg KCu-GLDA=13.03）低于Cu-EDTA（lg KCu-EDTA=18.80），表明Shewanella sp. JN01更易破络Cu-GLDA生成CuS沉淀[6,21].
Cu-CA的去除率随CA物质的量比的增加而变化，与Cu-EDTA和Cu-GLDA的去除率差异显著. 当n （Cu2+）:n （CA）为1:1—1:25时，Cu-CA的最佳去除率由83.83%提高到99.11%. 随着CA物质的量比的进一步增加，Cu-CA的去除率由不足10%显著提高到97%以上，并保持相对稳定. 在CA的高物质的量比条件下，Shewanella sp. JN01对Cu-CA的高去除效率的延迟可能是由于CA浓度过高，Shewanella sp. JN01需要时间来适应其环境[18]. 与EDTA和GLDA不同，过量的CA并不会对Cu-CA的去除产生负面影响. 这很可能是由于Shewanella sp. JN01以CA为碳源，促进Shewanella sp. JN01的生长，从而去除Cu-CA[13].
Shewanella sp. JN01对Cu-MC的最佳去除率明显低于其他络合态Cu. 当n （Cu2+）: n （MC）= 1:1—1:25时，Shewanella sp. JN01对Cu-MC的最佳去除率由85.50%降至69.40%. 当n （Cu2+）: n （MC）= 1:50时，络合态Cu的去除率先显著升高后降低，5 d后Cu-MC的去除率为0. 这可能与Shewanella sp. JN01死后释放Cu有关. 尽管CA对Shewanella sp. JN01的生长没有明显抑制作用，但MC中的EDTA和GLDA会破坏其细胞结构的完整性[19]. Cu-CA在物质的量比为1:25和1:50时的去除率高于Cu-EDTA和Cu-GLDA，这说明MC对Shewanella sp. JN01的毒性作用低于EDTA和GLDA.
Cu与络合剂物质的量比较低时，Cu-GLDA和Cu-CA在3 d后的去除率下降，主要是受Cu和络合剂的胁迫所致. Shewanella sp. JN01细胞表面活性成分受损，导致累积的Cu再次释放[22]. 此外，细胞表面附着的硫化物沉淀，由于传质阻力增加，对菌株的代谢产生不利影响[23].
在一定的Cu与络合剂的物质的量比下，第7天的去除率基本稳定，Shewanella sp. JN01对不同络合态Cu的去除率为Cu-CA > Cu-MC > Cu-GLDA > Cu-EDTA. 这主要与他们的稳定常数有关，其稳定性为lg KCu-EDTA（18.80） > lg KCu-GLDA（13.03） > lg KCu-CA（5.95）[6,21,24]. 络合态Cu稳定越高，Shewanella sp. JN01破络难度越大，去除效果越差[15,18]. 结果表明，Cu-CA的去除率最高，尤其是在络合剂的物质的量比较高时. 与GLDA和EDTA相比，CA对菌株生长代谢和硫酸盐还原途径的抑制作用较小[13-14]. 此外，CA是小分子、可降解的络合剂，为微生物生长提供碳源[13,18]. 这进一步说明，MC对Shewanella sp. JN01的毒性较EDTA和GLDA温和，是因为MC中减少了EDTA和GLDA的用量，CA所占比例较大.
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死菌体对络合态Cu的最佳去除率低于游离Cu2+ （图4）. 死菌体对Cu2+的吸附率缓慢增加，20 h后达到8.92%. 死菌体对Cu2+的去除主要是由于Cu2+直接吸附在细胞壁上[18]. 高压灭菌后，许多带负电荷的官能团（如羟基、氨基或羧基）暴露在菌体表面，增加了对带正电荷离子如Cu2+的结合位点[22].
死Shewanella sp. JN01对络合态Cu的吸附去除率趋势与Cu2+明显不同（图4）. 对于络合态Cu，死Shewanella sp. JN01对Cu-CA的吸附率在1 h内迅速增加，之后基本保持不变. 死菌体对Cu-CA的吸附去除率高达7.99%，与Cu2+的吸附率相当（P > 0.05）. 这是因为CA是易降解的有机物，对细菌表面损害较小[13,18]. Cu-CA主要以CuL− （H3L代表柠檬酸）的形式存在，通过静电吸引与氨基结合[24-25]. 死菌体对Cu-GLDA的吸附率在1 h内达到最佳值（5.65%），随后逐渐下降后平稳；对Cu-EDTA的吸附率仅为0.44%；对Cu-MC的吸附率介于两者之间. Cu-EDTA的吸附去除率较差，这是由于Cu-EDTA在pH=5.5时主要以CuEDTA2-形式存在[6]，CuEDTA2-络合物为六配位八面体结构，Cu2+被包裹于络合物内部，无法与吸附位点接触[26-27]. Cu-GLDA的吸附去除率高于Cu-EDTA，这是因为Cu-GLDA对死菌细胞的结合亲和力强[28].
Cu-EDTA和Cu-GLDA的吸附去除率达到最佳后下降，很可能是EDTA和GLDA的毒性作用使细胞壁破坏，导致吸附的络合态铜又释放回水溶液中[19,22]. 相比而言，络合态Cu经过破络后形成硫化物沉淀的途径去除率高（> 80%，图3），死菌体对络合态Cu的吸附去除率只占Shewanella sp. JN01对络合态Cu总去除率的一小部分（< 8%，图4）.
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考虑到Shewanella sp. JN01去除络合态Cu的主要途径是先破络进而形成硫化物沉淀，实验收集并表征了Shewanella sp. JN01处理含Cu络合物水溶液后的沉淀. XRD衍射仪分析了所得沉淀物的晶体结构（图5）. 沉淀物的无定型（2θ值为20°）很可能是由于菌体细胞中多糖、蛋白质和脂质的存在[12]. 在2θ值为28.68°、47.71°和56.62°处有较强的衍射峰，对照CuS标准图谱（PDF No.89-2073）中的（111）、（220）和（311）晶面. Shewanella sp. JN01只在47.71°处有微弱的峰. 然而，Cu2+处理后的沉淀物在28.68°和47.71°处的峰强度低于络合态铜，这可能是细菌在Cu2+处理过程中产生的硫化铜颗粒较小[15]. 此外，在金属离子的胁迫下，菌株分泌的代谢物能吸附铜离子并与铜离子络合，阻碍了结晶度高的硫化铜的形成[29]. 尽管培养基中存在磷酸盐，但对Cu的沉淀影响较小. 一方面，每个处理组接菌量均为5%，因此，每个实验组的磷酸盐含量相同；另一方面，磷酸根的浓度远远低于硫酸根（表1）. 在XRD衍射图中也未检出Cu的磷酸盐沉淀物. 因此，培养基中磷酸盐对不同处理组Cu沉淀差异的影响很小.
SEM图像进一步证实了Shewanella sp. JN01处理不同络合态Cu溶液后存在沉淀颗粒[12]. EDS结果表明，沉淀物中存在Cu和S，不同处理的Cu和S的含量变化较大（图6）.
Shewanella sp. JN01沉淀物中O和S的原子比分别为29.85%和6.85%，其中未检测到Cu的含量. 加Cu2+处理后的沉淀物中O的原子比降低到19.45%，S和Cu的含量增加到9.07%和4.34%. 其中O的原子比下降很可能是由于Cu2+抑制了Shewanella sp. JN01的生长，因为沉淀物中O主要来自菌株的生长. S和Cu原子比的增加是由于加入CuSO4后，Shewanella sp. JN01在氧化还原反应中生成了CuS. 不同络合态Cu处理后的沉淀物中O、S和Cu的原子比分别为16.13%—23.28%、1.57%—6.64%和1.07%—5.38% （表2）. O的含量与细菌活性密切相关，这在一定程度上可以解释菌株对Cu的去除效率随细菌活性的降低而降低[18]. 与其他Cu络合物相比，Cu-CA处理后的沉淀物中O原子比最高，说明柠檬酸可以作为碳源，提高细菌的代谢活性，从而产生更多的H2S，对Cu络合物去除率更高. 由于Cu和S的化学计量比为1:1，但S的原子比略高于Cu，这一结果很可能是由于Shewanella sp. JN01通过硫酸盐还原产生大量的硫化氢，使溶液中的Cu几乎都生成硫化铜沉淀被去除[30]（图3）. 不同络合态Cu处理后沉淀物中Cu和S的强峰表明，沉淀物中CuS是主要产物，这与XRD结果一致. 此外，无论溶液的pH值如何，CuS （Ksp=6.3×10−36）的溶解度低且稳定性高[31]. 实验结果表明，模拟淋洗废液中Cu络合物的去除机理主要是经Shewanella sp. JN01破络后生成硫化物沉淀.
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SRB （Shewanella sp. JN01）对水溶液中的Cu络合物具有较高的去除效率，主要通过先破络后形成硫化物沉淀. Shewanella sp. JN01对不同Cu络合物的最佳去除率为Cu-CA （99.11%） > Cu2+ （97.69%） > Cu-EDTA （95.90%） > Cu-GLDA （94.22%） > Cu-MC （85.5%）. 络合剂对Shewanella sp. JN01的抑制作用为EDTA > MC > GLDA > CA. 本研究的结果为从水溶液中去除Cu络合物提供了一种有效、节约成本和环境友好的方法. 然而，由于实际淋洗废液中所含物质比模拟淋洗废液更为复杂，因此有必要进一步探索SRB （Shewanella sp. JN01）对实际淋洗废液中多种重金属络合物的最佳去除效率.
Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理
Removal efficiency and mechanism of different kinds of copper complexes from aqueous system by Shewanella sp. JN01
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摘要: 土壤淋洗废液处理难点在于废水中含有高浓度的稳定重金属络合物. 本研究分离了一株硫酸盐还原菌(Shewanella sp. JN01)，探讨了其对模拟淋洗废液中不同络合态Cu (Cu-乙二胺四乙酸(Cu-EDTA)、Cu-谷氨酸N，N-二乙酸(Cu-GLDA)、Cu-柠檬酸(Cu-CA)和Cu-混合淋洗剂(Cu-MC))的去除效果及机理. 结果表明，活菌体和死菌体对不同络合态Cu的去除率分别大于80%和小于8%. 显然，死菌体细胞表面吸附作用对络合态Cu去除效率的贡献十分有限. 因此，Shewanella sp. JN01去除络合态Cu的主要机制是先破络，再形成CuS沉淀. Shewanella sp. JN01对不同络合态Cu的去除率为Cu-CA >Cu-MC >Cu-GLDA >Cu-EDTA，这一变化趋势与它们的稳定性常数和毒性的变化趋势相反，结果进一步证实了破络是微生物去除络合态重金属的限制性步骤. Shewanella sp. JN01能够有效去除土壤淋洗废液中重金属络合物，在淋洗废液再生利用方面具有潜在应用前景.
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关键词:
- 土壤淋洗废液 /
- 络合态Cu /
- Shewanella sp. JN01 /
- 硫化物 /
- 沉淀.
Abstract: The difficulty in the treatment of soil washing effluent lies in its high concentrations of stable heavy metal complexes. This study isolated a strain of sulfate-reducing bacteria (Shewanella sp. JN01) to explore the removal efficiency and mechanism of different heavy metal complexes [Cu-ethylenediaminetetraacetic acid (Cu-EDTA), Cu-N, N-bis(carboxymethyl) glutamic acid (Cu-GLDA), Cu-citrate (Cu-CA) and Cu-mixed chelator (Cu-MC)] from the simulated soil washing effluent by Shewanella sp. JN01. The results showed that removal efficiencies of different Cu complexes by the alive and dead Shewanella sp. JN01 were above 80% and below 8%, respectively. Evidently, the contribution of sorption of Cu complexes by cell surface of the dead strain to its total removal efficiency was limited. Therefore, the dominant removal mechanism of Cu complexes by Shewanella sp. JN01 was related to dechelation first and then formation of CuS precipitation. The removal efficiencies of different Cu complexes by Shewanella sp. JN01 varied as the trend of Cu-CA > Cu-MC > Cu-GLDA > Cu-EDTA, which was opposite to the trend of their stability constants and toxicity. This finding further confirmed that the dechelation was a limiting step to remove heavy metal complexes by microorganisms. Collectively, the results of this study indicate that Shewanella sp. JN01 can effectively remove the heavy metal complexes from soil washing effluent, which has potential application prospects for recycling use of soil washing effluent.-
Key words:
- soil washing effluent /
- copper complexes /
- Shewanella sp. JN01 /
- sulfide /
- precipitation.
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底泥是湖泊及其流域中重金属等污染物的重要归宿和蓄积库，底泥中的重金属形态和分布不仅能够反映自然和人类活动对湖泊的影响，也反映底泥对水体生态系统的威胁[1-3]。重金属在底泥的垂向分布与水平分布研究同样重要，它们在底泥某层位中的分布可反映某一历史时段内湖泊流域自然和人为活动所造成的重金属流失与污染强度 [4]。重金属是相对保守的物质，具有潜在危害性，一般认为底泥中重金属的毒性几乎与总量无关，而与间隙水中可生物利用的金属组分相关，间隙水中重金属离子浓度与底泥中重金属形态关系紧密[5-6]。底泥中重金属形态主要为金属可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质及硫化物结合态和残渣晶格态，它们各自表现出不同的物理化学稳定性、生物可利用性及潜在生态毒害性 [7-8]。重金属的可交换态最易被生物利用，毒性最强，碳酸盐结合态也较易重新释放进入水相，因而可以用底泥中金属可交换态及碳酸盐结合态重金属占重金属总量的百分数来评价底泥中重金属的稳定程度 [6, 9]。
南四湖是我国华北平原上面积最大的淡水湖，湖泊面积1266 km2，自北向南依次由南阳、独山、昭阳和微山4个湖串联而成，平均水深约1.46 m。作为华东最重要的煤炭能源基地，南四湖周边地区的城市发电、民用煤燃烧，造纸、食品、化工、医药等行业企业的迅速发展，以及航运交通等方面的影响，南四湖近20年来底泥中Hg、Pb 、Cd和As的含量呈快速增长趋势，尤其是Hg和Pb的污染最为严重 [10-11]。底泥典型重金属对环境的危害除了与其总量有关外，更大程度上取决于其在环境系统中的形态和分布，其元素赋存形态是判断底泥中重金属的毒性响应以及生态风险的重要指标[3, 8]。作为南水北调东线工程最重要的输水通道和京杭大运河最重要的航运路段，对南四湖底泥典型重金属污染物的形态和污染程度进行分析评价具有重要意义[3]。然而，目前针对南四湖不同湖区底泥重金属污染研究多集中在总量水平分布上，而对其形态和垂向分布研究则较少[3, 12]。
本文以南四湖4个湖区为研究对象，在探讨4种典型重金属元素（Pb、Cd 、Hg 、As）主要生物有效形态垂向分布特征的基础上，对其表层底泥（0—4 cm）重金属污染程度、潜在生态风险性及稳定性进行评价，揭示南四湖近年来的重金属污染状况，为其水环境保护和底泥污染治理提供参考依据。
1. 材料与方法（Materials and Methods）
1.1 采样点布设
为充分反映南四湖不同湖区底泥性质的差异，结合现场环境条件，在南阳、独山、昭阳和微山等4个湖区的湖心分别设置代表性采样点，采样点布设应避免航运船只扰动及人工养殖的影响，具体采样点见图1。4个采样点位置及经纬度从北向南依次为：南阳湖区（NSH1，35°9′5.64″N，116°39′39″E）、独山湖区（NSH2，35°2′13.08″N，116°50′31.8″E）、昭阳湖区（NSH3，34°50′12.96″N，117°2′8.5″E）和微山湖区（NSH4，34°41′16.26″N，117°13′18.3″E）。
1.2 底泥的采集与预处理
2015年1月采集底泥样品，ϕ85 mm×600 mm有机玻璃管的柱状采样器每点采集3根平行样，上部用原样点水样注满后两端用橡皮塞塞紧，垂直放置，小心带回实验室[3]。在室内按10 cm以内间距为2 cm和10 cm以下间距为5 cm进行切样，自然风干至恒重，研磨后过100目筛备用。
1.3 底泥重金属形态分析
用Tessier分级提取法对底泥重金属进行形态含量分析[13]，本文主要分析生物效应较强的3种形态：金属可交换态、碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态。因通过分级提取重金属各形态含量总和往往与实际总量有差异，本文采用三酸提取法对相应重金属总量进行一次性提取[14]。用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES VISTA-MPX，美国Varian公司）检测重金属Pb、Cd、Hg和As总量及各形态含量。ICP-OES 工作前采用双内标Rh 和Re 对分析信号进行校正，RSD 在3%以下，测定前验证标准曲线，每种元素的线性相关系数达到0.9999以上，每批样品做1个平行空白和2个标准参考物质，全程采用空白样品进行对照，用以验证数据的准确性[15]。ICP-OES 测定Pb、Cd、Hg、As 等4种元素的检出限分别为0.01、0.01、0.02、0.05 μg·L−1。
1.4 重金属污染评价方法
底泥重金属污染评价方法很多，地积累指数法[16]与潜在生态危害指数法[17]因简单易行而被广泛应用[3]。地积累指数法能直观的判定重金属污染级别，但该法侧重单一金属元素，潜在生态危害指数法能够综合反映底泥中重金属对生态环境的影响，但其生物毒性加权系数存在主观性，因此将地积累指数（Igeo）和生态危害指数（RI）相互补充进行风险评价更为合理[3, 5]。
南四湖流域原为黄河泛滥平原，本文综合考虑黄河干流底泥和南四湖流域未受污染土壤的化学元素含量选取湖泊底泥中元素分析的环境背景值[3, 18]。参照相关研究，各重金属生物毒性响应因子分别为： Pb5、 Cd30、 Hg30、As10[3, 19]。
2. 结果与讨论（Results and Discussion）
2.1 底泥重金属形态的垂向分布
底泥重金属中的金属可交换态和碳酸盐结合态因其生物有效性大，能够更直接的反映底泥重金属的赋存现状与风险；铁锰氧化物比表面积大，吸附重金属能力强，在特定年份受铁锰浓度及重金属污染影响而沉积在相应层次中，铁锰氧化物结合态能反映出沉积各层对应年份的外源污染状况[20-21]。南四湖4个湖区采样点底泥典型重金属Pb、Cd、Hg、As的金属可交换态、碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态含量及总量的垂向分布见图2。重金属在底泥的垂向分布特征可反映某一历史时段内湖泊流域自然和人为活动所造成的重金属流失与污染强度，由图2可见，南四湖的4个湖区不同采样点典型重金属形态与含量在垂向分布上差异较大，各元素各形态未表现出一致的变化规律，说明各湖区采样点典型重金属近年来的污染状况亦有所差异。
图 2 南四湖底泥重金属形态与含量垂向分布Figure 2. Vertical distributions of sediment heavy metal forms and their contents in Nansi Lake4个湖区采样点Pb的金属可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态含量较低，且差异不大，都在1 mg·kg−1的范围内波动，各形态仅占Pb总量的2%左右，底泥Pb的潜在风险相对较小。垂向上，南阳湖区采样点Pb的3种形态和总量有较为一致的变化趋势，即随深度增加呈波动下降，但存在15—20 cm处的相对高值，表明南阳湖区Pb在该层年份污染较重，而且近几年污染未有明显降低，南四湖东部地区是我国重要的煤田能源基地，煤炭燃烧过程和冶金、电镀等工业产生的大量废水是底泥Pb的主要来源[22]。独山湖和昭阳湖采样点表层底泥Pb的金属可交换态与碳酸盐结合态含量较底层明显降低，Pb的总量在表层亦表现出降低趋势，表明近几年这两个湖区Pb污染有所降低；微山湖采样点Pb各形态垂向分布较为复杂，可交换态随深度增加而增加，碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态随深度波动较大，无明显规律，从总量上看，微山湖表层底泥Pb含量有增加趋势。总体上，随着近几年南四湖的综合治理，独山湖和昭阳湖底泥Pb污染有所降低，南阳湖和微山湖降低不明显，但南四湖底泥Pb的含量总体不高，污染风险相对较低。
南四湖各湖区采样点Cd的金属可交换态占比较高，约占总量的15%左右，说明底泥Cd具有较高的释放风险，研究表明，冶金、电镀等工业产生的大量废水和湖区周边农药与化肥的大量使用等是南四湖底泥Cd 的主要来源[22]。垂向上，各湖区差异明显，南阳湖、昭阳湖、微山湖的金属可交换态及碳酸盐结合态有随深度增加呈波动下降的趋势，而独山湖表层6 cm内该赋存形态含量明显小于下层，表明独山湖表层底泥Cd的生物有效性明显降低。铁锰氧化物结合态变化趋势可以看出，南阳湖、独山湖表层赋存含量明显小于深层底泥，表明这两个区域当前污染状况有所好转，而微山湖、昭阳湖则相反，近年表现出一定程度的污染，且波动性大。总量上，南阳湖、独山湖、昭阳湖Cd含量峰值出现在6—8 cm，微山湖Cd含量峰值出现在15—20 cm，4个湖区表层0—2 cm含量均略小于2—4 cm，这一现象也见于以上3种结合态，表明近几年湖区外源Cd污染负荷有降低趋势。
南四湖各湖区样点底泥Hg的金属可交换态和碳酸盐结合态占总量的比例在20%以上，底泥中Hg的迁移性较强，具有较大的释放风险，值得关注。垂向上，南阳湖采样点Hg的金属可交换态及碳酸盐结合态呈现出随深度增加而减小的趋势，铁锰氧化物结合态15 cm以上含量也明显高于下层，表明该湖区近几年Hg污染没有得到缓解；独山湖金属交换态与碳酸盐结合态有较为一致的变化趋势，即8—10 cm含量最高；昭阳湖三形态垂向分布规律不明显，整体各赋存形态含量要小于其他湖区。微山湖采样点金属交换态与碳酸盐结合态表层含量均较下层低，该湖区近年Hg污染有所降低。总量上，南阳湖、独山湖Hg均有随深度增大而波动减小的趋势，微山湖则相反，昭阳湖不明显，总体上，南阳湖底泥Hg污染较为严重，且近几年未见明显好转，而独山湖、昭阳湖和微山湖Hg污染有降低趋势。南阳湖位于南四湖最北段，靠近济宁市区，除城区煤炭燃烧产生大量Hg外，城区生活污水和工业废水的大量排放应亦是其Hg含量增加的主要原因[22]。
南四湖各湖区采样点As的垂向分布特征明显，除独山湖外，其他湖区金属可交换态及碳酸盐结合态均有随深度增加而呈波动减小的趋势；独山湖三种形态含量在6—8 cm层出现峰值，采样点位该层As污染曾经较重，这和当时地方大力发展水产养殖，鱼类饵料中含有微量的As有关，该湖区禁渔后，As污染有所好转，这从总量的垂向分布中亦能得到验证。总量上，虽然4个湖区采样点As有随深度增加而波动递减，但As污染峰值均出现在2—8 cm区间，说明近几年南四湖各湖区As污染开始逐步降低。
2.2 表层底泥重金属的分布与污染风险评价
表层底泥对上覆水影响最为直接，研究表明，风力等动力扰动对底泥理化指标的影响主要集中在表层0—3 cm[23-24]。本研究选择0—4 cm深度的表层底泥作为分析对象，即取0—2 cm和2—4 cm底泥重金属含量的平均值，具体结果见表1。从表1可见，Pb、Cd、Hg、As的4种重金属在4个湖区的含量分别为21.31—28.46、0.16—0.50、0.037—0.079和12.91—20.81 mg·kg−1，对比《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准（GB15618—2018）》，4种重金属含量均低于该标准水田风险筛选值（6.5<pH<7.5）。根据底泥富集系数法[25]对4种重金属进行污染程度评价，4种重金属的富集系数均大于1，4个湖区采样点底泥均受到不同程度的重金属污染，Cd和Hg富集最明显，其次为As和Pb。4个湖区采样点Cd富集系数均在2以上，其中以微山湖污染最为突出，富集系数达到6.44，为显著污染，其次是昭阳湖、南阳湖和微山湖，富集系数依次为3.95、3.03和2.07，均为中度污染。4个湖区采样点Hg污染程度也较重，富集系数均在2以上，污染大小顺序为南阳湖>独山湖>微山湖>昭阳湖，南阳湖富集系数为5.26，为显著污染。各采样点As污染程度由高到低依次为微山湖、南阳湖、昭阳湖和独山湖，微山湖富集系数为2.78，为中度污染。南阳湖Pb的富集最明显，富集系数为1.9，然后依次是微山湖、昭阳湖和独山湖，均为无—弱污染等级。总体上，底泥富集系数法显示，南四湖底泥典型重金属Hg、Cd、As和Pb均有一定程度污染，污染较重的区域为南阳湖和微山湖，独山湖和昭阳湖相对较轻，这与刘良等的研究结果一致[11]。
表 1 南四湖表层底泥（0—4 cm）重金属含量及富集系数Table 1. Heavy metal contents and enrichment factors in surface sediments （0—4 cm） of Nansi Lake项目 Project Pb Cd Hg As 南阳湖 含量/（mg·kg−1） 28.46±4.17 0.23±0.01 0.079±0.011 18.64±2.01 富集系数 1.90 3.03 5.26 2.49 污染程度 无—弱污染 中度污染 显著污染 中度污染 独山湖 含量/（mg·kg−1） 21.31±0.89 0.16±0.02 0.058±0.007 12.91±0.29 富集系数 1.42 2.07 3.87 1.72 污染程度 无—弱污染 中度污染 中度污染 无—弱污染 昭阳湖 含量/（mg·kg−1） 25.14±3.86 0.30±0.03 0.037±0.019 15.50±1.84 富集系数 1.68 3.95 2.43 2.07 污染程度 无—弱污染 中度污染 中度污染 中度污染 微山湖 含量/（mg·kg−1） 26.51±1.28 0.50±0.01 0.041±0.003 20.81±3.02 富集系数 1.77 6.44 2.72 2.78 污染程度 无—弱污染 显著污染 中度污染 中度污染 农用地土壤污染风险管控标准值（水田，6.5<pH<7.5） 140 0.6 0.6 25 环境背景值/（mg ·kg−1） 15 0.077 0.015 7.5 注：富集系数为底泥重金属含量同环境背景值的比值. Note: Enrichment coefficient is the ratio of sediment heavy metal contents to environmental background values. | Show Table
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通过相关公式[26]计算出的南四湖各采样点表层底泥（0—4 cm）重金属地积累指数Igeo和潜在生态风险因子Ei、生态风险指数RI结果见表2。由表2看出，根据地积累指数Igeo进行评价，南四湖4个湖区表层底泥普遍受到Hg、Cd、As污染，Pb相对较轻。昭阳湖和微山湖Cd污染较重，分别达到中等污染和中-强污染等级，其中微山湖最严重，南阳湖和独山湖Cd污染相对较轻，为轻-中等级。南阳湖Hg污染最为突出。As在4个湖区均为轻-中污染水平，独山湖最轻。Pb污染独山湖最轻，其他3个湖区均为轻-中污染等级，其中南阳湖最重。
表 2 南四湖表层底泥（0—4 cm）重金属地积累指数Igeo及潜在生态风险指数RITable 2. The index of geoaccumulation （Igeo） and potential ecological risk index （RI） of heavy metals in surface sediments （0—4 cm） of Nansi Lake区域District 潜在生态风险因子EiPotential ecological risk index Ei RI 地积累指数IgeoIndex of geoaccumulation Igeo Pb Cd Hg As Pb Cd Hg As 南阳湖 9.49 80.93 156.44 24.85 272.97 0.34 0.85 1.80 0.73 轻微 强 强 轻微 重污染 轻—中 轻—中 中 轻—中 独山湖 7.10 59.88 115.40 15.61 199.09 −0.08 0.41 1.36 0.06 轻微 中 强 轻微 中等污染 无 轻—中 中 轻—中 昭阳湖 8.38 134.61 69.15 20.67 233.88 0.16 1.58 0.62 0.46 轻微 强 中 轻微 中等污染 轻—中 中 轻—中 轻—中 微山湖 8.84 186.95 80.41 27.75 304.99 0.24 2.05 0.84 0.89 轻微 很强 强 轻微 重污染 轻—中 中—强 轻—中 轻—中 | Show TableDownLoad:
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从潜在生态风险因子评价可以看出，4种元素在4个湖区的污染风险等级与地积累指数法得到的污染等级较为接近，但因引入了生物毒性响应因子，生物毒性较强的元素污染风险等级较地积累指数法的污染等级高，说明潜在生态危害指数法更注重污染对生态的危害，同时，生物毒性加权系数亦具有一定的主观性。从表2中Ei看出，4个湖区采样点都明显受到Hg和Cd的污染，为中—强污染风险等级，As、Pb相对较轻，为轻微生态污染风险等级。具体来看，南阳湖区Hg污染风险最强，微山湖Cd污染风险最强，均达到很强等级。从潜在生态风险指数RI看，南阳湖、微山湖达到了重污染生态风险等级，其中Hg和Cd分别是最主要的生态风险贡献因子，昭阳湖、独山湖为中等污染生态风险强度，各湖区污染风险强度大小顺序表现为：微山湖>南阳湖>昭阳湖>独山湖。这与孟祥华等[10]和刘良等[11]的研究基本一致，但也有差异，主要在于微山湖重金属Cd污染因子的贡献加大。另外，底泥中重金属元素各形态组成差异较大，各形态迁移转化能力不同，评价时综合考虑以上因素，才能对其生态风险做出更科学的评价[27]，由各湖区底泥Pb、Cd、Hg、As的形态分析得知，南阳湖和独山湖区Cd和Hg的金属可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态含量占比分别高达36%和33%，具有较高的迁移性，存在生态风险相对较大，应予以重视。
2.3 底泥重金属稳定度评价
底泥中重金属的形态分布不是一成不变的，它们会随着周围环境条件的变化，如：水体温度、pH、底泥有机质和外源重金属等的改变而发生转化[6]。基于重金属可交换态最易被生物利用，毒性最强，碳酸盐结合态也较易重新释放进入水相的特点，很多学者用底泥中金属可交换态及碳酸盐结合态重金属占重金属总量的百分数来评价底泥中重金属的稳定程度[6, 9]。本文采用该法得到的南四湖各湖区表层0—4 cm底泥重金属的稳定度（SAC）见表3。由表3看出，Pb、Cd、Hg、As等4种重金属元素的稳定度差异较大，Hg、Cd、As的稳定性较小，Pb相对比较稳定。结合表1重金属富集系数及表2重金属污染评价发现，重金属的稳定性评价与总量污染评价有一定相关性，但并不一致，如微山湖Cd富集系数为6.44，南阳湖为3.03，微山湖Cd污染要明显重于南阳湖，但其稳定度（18.6%）却明显小于南阳湖（25.0%），说明南阳湖底泥Cd中金属可交换态和碳酸盐结合态占比更高、更活跃，对湖泊水环境的变化更敏感，释放风险亦更大 [28]。4个湖区Pb虽然受到一定程度的污染，但考虑到稳定度，其二次释放潜力较小，潜在生态危害并不高。Hg在南阳湖采样点最不稳定，稳定度大小顺序为昭阳湖>微山湖>独山湖>南阳湖。4个湖区各采样点As稳定度均为中等稳定，大小顺序为昭阳湖>独山湖>南阳湖>微山湖，其中，微山湖最不稳定。
表 3 南四湖各采样点表层底泥（0—4 cm）重金属稳定程度Table 3. The stable risks of heavy metals in surface sediment （0—4 cm） of Nansi Lake区域District Pb Cd Hg As 南阳湖 SAC 2.4% 25.0% 32.7% 13.6% 分级 稳定 中等稳定 不稳定 中等稳定 独山湖 SAC 0.8% 14.9% 28.6% 11.0% 分级 极稳定 中等稳定 中等稳定 中等稳定 昭阳湖 SAC 1.6% 18.1% 16.9% 10.9% 分级 稳定 中等稳定 中等稳定 中等稳定 微山湖 SAC 2.1% 18.6% 18.6% 15.7% 分级 稳定 中等稳定 中等稳定 中等稳定 | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusion）
（1）底泥富集系数法显示，典型重金属Pb、Cd、Hg、As在南四湖4个湖区表层底泥（0—4 cm）中富集系数均大于1，均受到不同程度的污染，其中，Cd、Hg富集最为明显，其次为As和Pb，4个湖区采样点表层底泥污染较重的为南阳湖和微山湖，独山湖和昭阳湖相对较轻。
（2）南四湖4个湖区采样点Pb的金属可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态含量较低，在1 mg·kg−1的范围内波动，约占Pb总量的2%左右，潜在风险较小，Cd的金属可交换态占比较高，约占总量的15%左右，Hg的金属可交换态和碳酸盐结合态占总量的比例在20%以上，Hg和Cd的潜在风险较大。垂向分布上，4个湖区各重金属形态差异较大，无明显规律，有的随深度增加而波动下降，如As在南阳湖、昭阳湖和微山湖的垂向分布，总体上，除南阳湖表层底泥Hg含量外，其他湖区采样点表层底泥Cd、Hg、As含量均下降，近几年南四湖各湖区重金属污染有降低趋势。
（3）地积累指数评价结果显示，南四湖4个湖区采样点表层底泥普遍受到Hg、Cd、As污染，Pb污染相对较轻。微山湖Cd污染最重，南阳湖Hg污染最为突出，As在4个湖区均为轻—中污染水平，独山湖污染最轻。从潜在生态风险指数RI看出，南阳湖、微山湖为重污染生态风险强度，昭阳湖、独山湖为中等污染风险强度，污染风险程度大小顺序为：微山湖>南阳湖>昭阳湖>独山湖。
（4）南四湖各采样点表层底泥Pb、Cd、Hg、As的稳定度差异较大，其中，Hg、Cd、As稳定性较小，Pb最为稳定。4个湖区Cd均为中等稳定，稳定度大小顺序为独山湖>昭阳湖>微山湖>南阳湖。Hg在南阳湖最不稳定，各湖区大小顺序为昭阳湖>微山湖>独山湖>南阳湖。As的稳定度大小为昭阳湖>独山湖>南阳湖>微山湖。综合比较，南阳湖区底泥Hg污染应引起足够重视。
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图 1 菌株Shewanella sp. JN01的系统发育树
Figure 1. The phylogenetic position of Shewanella sp. JN01
图 3 Shewanella sp. JN01对不同物质的量比的络合态Cu的去除率（a. Cu-EDTA，b. Cu-GLDA，c. Cu-CA，d. Cu-MC）
Figure 3. Remove efficiency of Cu in different molar ratios
图 4 相同物质的量比下（1:10）死菌体对不同络合态Cu的吸附去除效率
Figure 4. Sorption removal efficiency of different Cu complexes by dead bacteria at the same molar ratio （1:10）.
图 5 不同处理中沉淀物的XRD图谱（Cu与络合剂物质的量比为1:10）
Figure 5. XRD patterns of precipitates from different treatments （molar ratio of Cu and complexing agent =1:10）.
图 6 不同处理中沉淀物的SEM-EDS图谱（Cu与络合剂物质的量比为1:10）
Figure 6. SEM-EDS image of precipitates from different treatments （molar ratio of Cu and complexing agent =1:10）.
表 1 SRB富集培养基的组成
Table 1. Composition of SRB enrichment medium
药品名称Pharmaceutical ingredients 质量浓度/（g·L−1）Mass concentration K2HPO4 0.5 （NH4）2SO4 2.5 NaHCO3 0.5 CaCl2 0.2 MgSO4 1 乳酸钠sodium lactate 20 mL·L−1 L-抗坏血酸L-Ascorbic acid 0.1 L-半胱氨酸盐酸盐L-Cysteine hydrochloride monohydrate 0.5 酵母膏yeast extract 1.5 （NH4）2Fe（SO4）2·6H2O 0.5
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表 2 不同处理中沉淀物中的原子比（Cu与络合剂物质的量比为1:10）
Table 2. The atomic ratios of precipitates from different treatments （molar ratio of Cu and complexing agent =1:10）.
元素Element 原子比/%Atom Shewanella sp. JN01 Cu2+ Cu-EDTA Cu-GLDA Cu-CA Cu-MC C 63.30 67.13 78.21 71.85 72.00 75.19 O 29.85 19.45 19.03 16.13 23.28 21.69 S 6.85 9.07 1.70 6.64 3.36 1.57 Cu ND 4.34 1.07 5.38 1.36 1.56 ND.，未检出. ND., not detected.
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