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随着社会经济的高速发展，人类正面临着能源匮乏和水环境污染的双重危机，亟需开发环境友好、可重复再生的清洁能源。相较于化石能源，生物质能源因具有可再生性、原料丰富和环境友好等优点[1]，被认为是环境可持续发展框架下新能源的重要发展方向[2]。在众多生物质原料中，微藻具有生长周期短、光合效率高、适应污水生长以及“不与人争粮和不与粮争地”的优势，被认为是一种极具潜力的生物柴油生产原料[3]。当前，利用微藻制备生物柴油，已成为新型可再生清洁能源开发的研究热点，但高成本问题始终制约着微藻生物柴油的产业化进程[4]。因此，如何提升油脂产率，提高微藻工艺的综合效益已成为促进微藻生物燃料实现低成本、规模化生产的关键。
截止目前，营养盐调控仍是提高微藻产量及油脂含量的可靠方法[5]，通常情况下，培养体系中营养成分如碳、氮、硫等的变化会影响微藻生长与内部物质的积累[6]。碳是微藻生长必不可少的营养元素[7]，约占藻细胞干质量的50%，是藻细胞的主要组成部分。KHAWAJA等[8]研究表明，不同碳源对促进微藻生长存在较大差异，在异养情况下，小分子碳源更有利于微藻生长。氮是蛋白质合成的重要元素，对促进碳源代谢至关重要。ANAND等[9]研究表明，贫氮条件更利于微藻积累油脂，富氮条件更利于促进微藻生长，存在兼顾微藻生长与油脂积累的氮浓度。碳、氮的耦合作用对微藻生长的促进作用也不容忽视。ZHENG等[10]指出，C/N过低会抑制微藻生长，过高不利于释放微藻生长潜力，存在适宜微藻生长的最适C/N。此外，硫是微藻碳氮代谢的关键偶联元素，调控着微藻生长和细胞代谢过程。LV等[11]研究表明，硫酸盐缺乏会削弱微藻生长与污水净化的能力；王倩雅等[12]也指出，硫限制会导致藻细胞碳氮代谢途径重新调整。当前，针对营养元素影响微藻生长、油脂积累的研究主要集中于单一碳源、单一氮源方面，而对不同C/N条件下硫元素的影响研究较少，而从硫元素出发研究微藻的生长、胞内组分动态变化，对全面了解微藻光合产油机制具有重要意义。
因此，本研究以斜生栅藻为研究对象，探究了微藻生长、碳氮去除、油脂积累与脂肪酸分布对水体C/N变化的响应规律以及硫在其中的调控作用，旨在了解不同C/N条件下硫对微藻光合作用、碳氮利用和油脂积累的影响，以期为探究微藻碳流趋向油脂积累的光合营养机制提供参考。
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本实验选用由中科院淡水藻种库提供的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus，FACHB-12)作为受试藻种。斜生栅藻属于绿藻门，适应污水环境且对营养盐具有较高的吸收转化能力，是生产生物柴油的优势藻种[13]。实验前先将藻种在无菌条件下转接至装有BG11培养基的锥形瓶中，于(25±1) ℃、光照度4800 Lx，光暗比12 h:12 h的恒温培养箱(PGX-350B，宁波赛福实验仪器有限公司)中进行扩大培养，培养期间应每天随机变换锥形瓶位置以保证受光均匀，并按时摇动锥形瓶3次确保藻水混合均匀。实验中所用玻璃制品、培养基等均经高温高压灭菌后使用(温度121 ℃，时间20 min)。
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乙酸钠、氯化铵是促进微藻生长的优质营养盐[14-15]，因此，本实验选用乙酸钠和氯化铵分别作为实验用碳源、氮源，并结合前人已有研究配制实验用水[16]，即1 L实验用水中包含385 mg NaAc(300 mg·L−1 COD)；115 mg NH4Cl(30 mg·L−1
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N)；13 mg KH2PO4；0.55 mg FeCl2·4H2O；6 mg CaCl2；66 mg MgCl2·6H2O；1 mL A5溶液 (A5溶液为微量金属的混合液，1 L的A5溶液包括：0.08 g·L−1 CuCl2·2H2O、1.86 g·L−1 MnCl2·4H2O、0.22 g·L−1 ZnCl2、0.39 g·L−1 Na2MoO4·2H2O、0.05 g·L−1 Co(NO3)2·6H2O、2.86 g·L−1 H3BO3)。其中，根据调整配方中NH4Cl的质量配制氮元素浓度分别为0、5、10、20、40 mg·L−1的实验用水。此外，将配方中的FeCl2·4H2O、MgCl2·6H2O替换成等质量的FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，用于配制含硫实验用水。上述实验用水配制完毕随即置于高压灭菌锅(SN310C，日本雅马拓公司)中灭菌，隔夜冷却后使用。 -
本实验在已有研究基础上设置4种不同C/N水平[17](C/N水平为：7.5，15，30，60)及缺硫、含硫两种条件，对照组中不含NH4+-N，每组设置3个平行实验。首先，将藻液置于BG11培养基中培养10 d至对数生长期，再将对数生长期藻液置于高速冷冻离心机(TGL168，长沙湘智离心机有限公司)，在3500 r·min−1、4 ℃条件下离心8 min，舍弃上清液，用15 mg·L−1的NaHCO3溶液冲洗藻体并离心2次，以去除藻细胞表面吸附的营养盐；随后用无菌水冲洗、离心2次再将其转入无氮培养基培养3 d以耗尽藻细胞内营养盐并离心获取藻细胞；最后用无菌水冲洗、离心3次后用无菌水再悬浮，测定藻细胞密度后供实验使用。实验开始时，在已灭菌的锥形瓶里加入500 mL实验用水，再加入一定量上述实验藻液，保证初始接种密度为1×106 cells mL−1，实验周期设置为5 d。每天定时取样。在培养结束后，离心收集各平行实验微藻生物量并富集于50 mL离心管中，经冲洗和真空冷冻干燥(DZF-6020，上海煜南仪器有限公司)用于油脂与脂肪酸测定。
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取混匀的藻浓液1 mL于15 mL离心管中，用无菌水稀释至10 mL并摇匀，用滴管取适量藻液注入血球计数板(25×16)并利用显微镜(CX33，南京奥力科学仪器有限公司)计数3次，若3次误差大于10%，则重新计数直至符合实验标准。同时，保证每个计数格中的藻细胞数为5—8个，以便精准计数，否则应调整藻液稀释倍数重新计数。
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取适量藻密度已知的藻浓液按5倍梯度稀释7个样品(每个梯度下的藻密度可根据计算得到)，利用紫外可见分光光度计(DR 6000，美国哈希公司)在682 nm波长下进行测定，以得到的吸光度值为横坐标，藻密度为纵坐标绘制藻密度标准曲线(y=197.53x，R2=0.9999)。
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水质参数：污水pH采用pH计(FE 28，美国梅特勒-托利多公司)测定；水体COD采用COD快速消解仪(DRB 200，美国哈希公司)测定；水体
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N浓度采用纳氏试剂分光光度法(HJ535-2009)测定。油脂含量及脂肪酸：取适量真空冷冻干燥后的微藻混合样于试管中，加入10 mL盐酸溶液，在70 —80 ℃下水浴，至试样消解完全；取出试管，加入10 mL乙醇并混匀，将试管中的水解液转移到分液漏斗中，用乙醚石油醚混合液冲洗试管和塞子，冲洗液并入分液漏斗中，加盖振摇后静置，将醚层提取液收集到250 mL烧瓶中，按上述步骤重复提取水解液3次，再用乙醚石油醚混合液冲洗漏斗，并收集到已恒重的烧瓶中，将烧瓶置水浴上蒸干，最后置于 (100 ± 5) ℃干燥至恒重，计算油脂含量。然后对脂肪进行皂化以及脂肪酸甲酯化处理，再利用气相色谱仪(Agilent 7890A，美国安捷伦公司)进行脂肪酸分析，色谱柱为HP-88 (100 m×0.25 mm×0.20 μm)，检测器为FID，采用分流方式进样，分流比为0.8。
其中，
$ {M}_{t} $ 为收获时藻的生物质浓度(mg·L−1)，$ {L}_{t} $ 为收获时总脂含量，$ t $ 为培养时间。 -
实验数据采用SPSS 25进行单因素方差分析，采用LSD法进行统计检验，P<0.05表示差异有统计学意义；采用Origin 2017进行绘图。
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图1为无硫和含硫条件下，水体的C/N对微藻生长的影响情况。培养到第5天，含硫条件下各组别藻细胞密度显著高于无硫组(P<0.05)。
如图1所示，在无硫条件下，斜生栅藻在培养初始阶段经过短暂的适应期后加速生长，藻细胞密度不断升高，随着C/N的增大，藻细胞密度也逐渐上升，培养到第5天，C/N为60的组别藻密度达到最大，为6.46×106 cells·mL−1；而在含硫条件下，藻细胞密度在C/N为15时达到最高，为1.23×107 cells·mL−1，较无硫条件提升了90%。无硫条件下藻细胞密度较低主要是因为藻细胞内加氧酶的酶活性降低，并诱导活性氧的产生，从而抑制了生长[18]。硫作为叶绿素合成的重要因子，加入后可有效促进藻细胞合成叶绿素，进而增强微藻光合作用，促进了藻细胞生长[19]，使得含硫条件下藻细胞密度有了较大的提高。MICHAL等[1]通过实验也证实了这一点。此外，在高C/N条件下碳源充足，随着氮素的消耗，氮逐渐成为微藻生长的限制因子[20]，而氮元素作为氨基酸的重要组成部分，需要以适当的形式进行合成或外部补充[21]，培养环境中氮元素降低反而影响藻细胞利用碳源进行增殖，致使微藻生长受到限制。周涛等[22]通过实验还发现，
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N不宜过高，否则会对藻细胞产生毒害作用，影响其正常生长。因此，在微藻精细化培养过程中应综合考虑碳氮硫等的影响。图2为不同C/N下无硫、含硫条件对微藻生长系统pH变化的影响情况。由图2可以看出，在无硫条件下，各组别pH均呈现先上升后下降的趋势，且均在第2天达到最大，随后趋于稳定。这主要是由于：在无硫条件下藻细胞利用营养物合成生命活动必要的蛋白质、叶绿素等过程受到抑制，生长潜力无法释放，且在低C/N条件下系统中的NH4+-N表现出毒害性，进一步抑制细胞生长，进而导致系统pH下降[3]；在含硫条件下，各组别pH变化存在较大差异，C/N为30和60的实验组呈先升后降的趋势，C/N为7.5和15的实验组在培养周期内pH逐渐升高，表明这2组有较大的生长潜力。硫元素加入后，有效驱动藻细胞大量合成叶绿素等光合作用必要前体物，光合作用增强，光合作用产物增多，使得系统pH有一定提高。
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图3为不同C/N下无硫、含硫条件对微藻去除
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N能力的影响情况。由图3(a)可知，在无硫条件下，微藻对${\rm{NH}}_4^{+} $ -N的去除率随着C/N增大而升高；培养到第3天，C/N为60的实验组中微藻对${\rm{NH}}_4^{+} $ -N的去除率高达100%，高于低C/N组别。而由图3(b)可知，在含硫条件下，当C/N为15、30、60时，微藻对${\rm{NH}}_4^{+} $ -N的去除率均能达到100%，C/N为7.5的实验组微藻对${\rm{NH}}_4^{+} $ -N的去除率为73.6%，较在无硫时提升了1.49倍。对比无硫、含硫条件下，C/N为60的实验组去除率差异不明显，含硫条件下C/N为7.5、15和30的实验组中斜生栅藻对${\rm{NH}}_4^{+} $ -N去除能力显著优于无硫条件(P<0.05)。其原因是，硫元素加入后藻细胞生长加快，吸收利用${\rm{NH}}_4^{+} $ -N的能力增强，相较于无硫条件，能更多的利用${\rm{NH}}_4^{+} $ -N合成有机物质，从而提高${\rm{NH}}_4^{+} $ -N去除效率。图4为不同C/N下无硫、含硫条件对系统COD值的影响。由图4可知，含硫条件下微藻对有机物的去除效率优于无硫条件，且在培养前期微藻对营养物的利用效率更高。整体看来，COD去除率随着C/N降低而升高。培养到第5天，含硫条件下各实验组中微藻对营养物的去除率均高于50%，在C/N为7.5时COD值较初始下降了82.29%，去除效率达到80.33%，较无硫条件提升了63%；而在C/N为15、30、60时，微藻对营养物的利用效率分别是无硫条件的1.43、1.48、1.37倍。硫元素加入有效提升了微藻对碳源的利用效率。这主要是由于微藻从无氮培养基中转入含硫实验污水后大量合成叶了绿素、蛋白质等物质，藻细胞大量吸收营养物质以满足自身生理需求。GALINA等[23]也指出，藻细胞在合成蛋白质、油脂等过程中需要提供能量进行支撑，进一步促进藻细胞吸收有机物。此外，本研究的结果表明，当C/N在7.5—15时，微藻生长与碳氮利用的综合效益较好，但适宜不同种类微藻生长的条件存在差异，兼顾不同微藻碳氮利用与生长的C/N可能会有一定区别[24]。
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图5(a)为不同C/N下无硫、含硫条件对油脂含量的影响情况。由图5(a)可以看出，无硫条件下，实验组的油脂含量在11.8%—24.4%，且随着C/N的增大先升后降，在C/N为15时达到最大，为24.4%，低于无硫对照组的53.1%，在氮、硫双重限制下的油脂含量是单一硫限制的3.34倍。有研究表明，营养盐限制越多更有利于碳流趋向油脂积累[25]。而在含硫条件下，油脂含量在6.5%—15.4%，且随着C/N增大而减小，在C/N为7.5时最高，占细胞干质量的15.4%，但远低于无硫条件的23.1%。这说明硫元素加入反而不利于微藻积累油脂。其原因在于藻细胞受到营养盐限制等外界环境胁迫时更倾向于积累油脂[26]，当硫元素限制或缺乏时影响了藻细胞正常生长，油脂作为一种持久性储能物质，对藻细胞应对营养胁迫和维持正常生命活动具有重要意义[27]，因此，藻细胞在硫胁迫时油脂含量更高。此外，氮限制也有利于微藻积累油脂且较低的C/N更利于油脂合成，油脂含量最高可达15.9%。这主要是由于氮素缺乏降低微藻对氮的同化作用，引起藻细胞内部小分子前体物和还原力积累，更利于微藻细胞合成油脂。ANAND等[9]也指出，氮素限制会抑制蛋白质等物质的合成，驱使藻细胞趋向更多的油脂积累。
不同C/N水体中微藻油脂产率对比情况如图5(b)所示。在无硫条件下，油脂产率随着C/N增大先下降后上升，在C/N为60时达到最大，为3.35 mg·(L·d)−1。而在含硫条件下，C/N为7.5、15和30的实验组油脂产率均高于无硫条件，且随着C/N增大产率降低，油脂产率在C/N为7.5时达到最大值，为5.04 mg·(L·d)−1，较无硫条件提升了50.51%。其原因在于硫限制虽然有效提升了油脂含量，但同时加剧了生长和脂质合成的矛盾，外源硫加入后刺激了藻细胞生长，释放了微藻生长潜力，以此来弥补油脂含量降低带来的损失，从而提高了油脂产率；且随着C/N的降低，藻细胞利用营养物质促进生长的效率更高，增殖速率更快，从而能进一步弥补损失。黄怡等[28]通过研究发现，高硫条件更利于提升油脂产率，而本实验结果表明，高硫条件提升油脂产率不仅受硫浓度影响，还与培养体系的C/N息息相关。当C/N较高时，外源硫加入未能有效提升油脂产率，而随着C/N的降低，油脂产率才逐渐升高。因此，在进行微藻精细化培养时，既要关注硫浓度，也应综合考虑不同C/N的影响。
表1为不同C/N下无硫、含硫条件对斜生栅藻脂肪酸组成及相对含量的影响情况。由表1可知，十六烷酸(C16:0)、十八烷酸(C18:0)、十八碳烯酸(C18:1)、十八碳二烯酸(C18:2)、十八碳三烯酸(C18:3)占据脂肪酸的绝大多数。在无硫条件下，各实验组中C18:1相对含量较高，但均小于对照组，且随C/N增大先下降后上升，在C/N为60时最大，为47.11%。对含硫条件而言，C/N为7.5、15、30、60的组别培养5 d后C16—C18的脂肪酸对总脂肪酸的占比分别为97.11%、97.67%、97.63%和97.23%。单不饱和脂肪酸含量随C/N增大先升高后降低，在C/N为15时达到最大，为48.45%。有研究表明，生物柴油的理化性质与脂肪酸组分密切相关[29]，C16—C18的脂肪酸更适宜生产生物柴油[30]，并且高品位的生物柴油应尽量多地含有单不饱和脂肪酸且尽量减少饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量[31]，而单不饱和脂肪酸更有利于提升生物柴油的低温流动性、氧化安定性等性能[32]。因此，C/N为15时得到的油脂产物更利于生产高品质柴油。
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(1)外源硫加入有利于释放微藻生长潜力，且C/N较低时硫促进生长的效果更好。培养到第5天，C/N为15的达到最大，藻密度为1.23×107 cells·mL−1，较无硫条件提升了90%。
(2)外源硫加入可有效提升微藻对碳、氮源的利用效率。C/N为7.5时微藻对有机物的利用效率最高，为80.33%，较无硫条件提升了63%；C/N为7.5时，水体
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N的去除率为73.6%，较无硫条件提高了149%，其余各组${\rm{NH}}_4^{+} $ -N均能完全去除。(3)外源硫加入有利于提高油脂产率但不利于油脂积累。油脂产率随着C/N升高而降低且在C/N为7.5时达到最大，为5.04 mg·(L·d)−1，较无硫条件提升了50.51%；低C/N条件下油脂含量更高，C/N为7.5时油脂含量为15.4%，较无硫条件下降了33.3%；C/N为15时单不饱和脂肪酸含量最高，更适宜生产高品质生物柴油。
不同C/N下硫对斜生栅藻生长与油脂积累的调控
Regulation of sulfur on growth and lipid accumulation of Scenedesmus obliquus under different C/N ratio
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摘要: 为探究不同C/N污水下下硫对微藻生长、水体净化与油脂积累的调控作用，以斜生栅藻为研究对象，通过改变
${{\rm{NH}}_4^{+} }$ -N浓度配制了4种不同C/N的实验用水，对比研究了斜生栅藻在无硫和含硫条件下经5 d培养后的生长、碳氮利用与油脂合成情况。结果表明，外源硫添加可有效促进微藻的生长，当C/N为15时，藻细胞密度达到最大，为1.23×107 cells·mL−1，较无硫条件提高了90%；同时，外源硫也有助于提升藻细胞对碳氮的利用效率，微藻对有机物的利用效率随着C/N的降低而升高，并在C/N为7.5时最大，为80.33%，较无硫条件提升了63%；当C/N为7.5时${{\rm{NH}}_4^{+}} $ -N去除率为73.6%，较无硫条件提升了149%，其余实验组别${{\rm{NH}}_4^{+}} $ -N去除率均达100%；此外，在含硫条件下，油脂产率和油脂含量均随着C/N升高而降低，均在C/N为7.5时达到最大，油脂产率为5.04 mg·(L·d)−1，相较于无硫条件提升了50.51%，油脂含量为15.4%，较无硫条件下降了33.3%，表明硫加入可有效提升油脂产率但不利于油脂积累，在低C/N条件下促进作用更强。综合来看，当C/N在7.5—15时，外源硫加入取得的综合效益最佳。通过探究微藻生长、碳氮利用、油脂积累的适宜条件，可为微藻的精细化培养提供参考。Abstract: To explore the regulating effect of sulfur on the growth and lipid accumulation of Scenedesmus obliquus under different C/N ratio conditions, taked Scenedesmus obliquus as the research object, set 4 kinds of experimental water with different C/N ratios by changing the concentration of ammonia nitrogen, and comparatively studied the growth and lipid synthesis of microalgae after 5 days of culture under both sulfur-free and sulfur-containing conditions. The results showed that the addition of exogenous sulfur can effectively promote the growth of microalgae. When C/N ratio was 15, the density of microalgae reached the maximum, which was 1.23×107 cells·mL−1, it was 90% higher than the sulfur-free condition. Additional sulfur also helped to improve the carbon and nitrogen utilization efficiency of microalgae. The utilization efficiency of organic matter by microalgae increased with the decrease of carbon to nitrogen ratio, when C/N was 7.5, it reached 80.33%, which was 63% higher than that of sulfur-free conditions, while the ammonia nitrogen removal efficiency was 73.6%, which was 149% higher than the sulfur-free condition, and the removal efficiency of the remaining experimental groups reached 100%. In addition, under the sulfur-containing condition, the lipid yield and lipid content both decreased with the increase of carbon to nitrogen ratio. When C/N ratio was 7.5, the lipid yield was highest, which was 5.04 mg·(L·d)−1, it was 50.51% higher than that of sulfur-free conditions. When the C/N ratio was 7.5, the lipid content was 15.4%, which was 33.3% lower than the sulfur-free condition, indicating that sulfur addition can effectively increase the lipid yield but was not conducive to the accumulation of lipid, and exogenous sulfur had a stronger promoting effect under low carbon to nitrogen ratio conditions. In summary, when the C/N ratio was between 7.5 and 15, the overall benefits were relatively best. By exploring the appropriate conditions for microalgae growth, carbon and nitrogen utilization, and lipid accumulation,This research can provide references for the refined cultivation of microalgae.-
Key words:
- Scenedesmus obliquus /
- ammonia nitrogen /
- sulfur /
- growth and metabolism /
- lipid accumulation
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图 1 不同C/N下无硫（a）和含硫（b）条件对微藻生长的影响
Figure 1. Effects of sulfur-free（a） and sulfur-containing（b） on the growth of microalgae under different C/N ratio
图 2 不同C/N下无硫（a）和含硫（b）条件对微藻生长系统pH变化的影响
Figure 2. Effects of sulfur-free （a）and sulfur-containing （b）on pH changes of microalgae growth system under different C/N ratio
图 3 不同C/N下无硫（a）和含硫（b）条件对微藻去除
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N能力的影响Figure 3. Effects of sulfur-free（a）and sulfur-containing（b）on the ability of microalgae to remove
${\rm{NH}}_4^{+} $ -N under different C/N ratio
图 4 不同C/N下无硫、含硫条件对系统COD值的影响
Figure 4. Effects of sulfur-free and sulfur-containing conditions on the COD value of the system under different C/N ratio
图 5 不同C/N下无硫、含硫条件对油脂含量(a)和油脂产率(b)的影响
Figure 5. Effects of sulfur-free and sulfur-containing conditions on lipid content(a) and lipid yield(b) under different C/N ratio
表 1 不同C/N下无硫、含硫条件对斜生栅藻脂肪酸组成及相对含量的影响（%）
Table 1. Effects of sulfur-free and sulfur-containing conditions on the composition and relative content of fatty acids in Scenedesmus obliquus under different C/N ratio
组别Groups C/N C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 Others 无硫组
Sulfur-free group0 30.40 0.15 5.29 50.82 4.79 3.70 4.85 7.5 32.06 0.34 2.56 41.92 8.44 12.58 2.10 15 38.16 0.22 3.08 39.21 7.18 9.33 2.82 30 29.38 0.20 2.84 45.62 7.93 11.54 2.49 60 29.14 0.18 3.49 47.11 8.24 9.21 2.63 含硫组
Sulfur-containing group0 25.52 0.15 3.99 55.72 5.61 6.02 2.99 7.5 24.70 0.53 0.66 18.48 13.31 39.43 2.89 15 26.78 0.60 3.19 47.14 8.16 11.80 2.33 30 26.15 0.51 2.57 43.06 10.02 15.32 2.37 60 22.86 0.61 0.90 23.90 15.58 33.38 2.77 
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