主要试剂：β-HBCD标准品（50 μg·mL⁻¹）购于AccuStandard公司。流动相甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

主要仪器：高效液相色谱（HPLC，岛津LC-20AD）、紫外-可见分光光度计（岛津UV-2550）、高速冷冻离心机（Multifuge X1R，Thermo公司）、恒温培养箱（A1000，Conviron公司）、多功能酶标仪（SPARK，德国TECAN公司）、电子天平（精度±0.0001g，上海双杰有限公司）。

选择β-PM手性柱（200 mm×4 mm，5 μm，德国MN公司），采用高效液相色谱法（HPLC）优化得到最佳色谱分离条件：流动相为95%甲醇：5%水，流速0.4 mL·min⁻¹，柱温25 ℃，检测器波长220 nm。在最佳分离条件下制备单一对映体，根据紫外检测器出峰信号和保留时间手动收集相应的流出液，并采用外标法进行定量。根据Zhang等^[16]的研究，流出检测器的对映体依次为（−）β-HBCD、（+）β-HBCD对映体。分离后的对映体纯度均在98%以上，最终获得的（+）和（−）β-HBCD浓度分别为1.81 μg·mL⁻¹和1.63 μg·mL⁻¹。分离谱图如图1所示。

选取均匀且饱满的玉米种子（购于中国农业科学研究院），去离子水清洗后，用10%H₂O₂的消毒溶液浸泡10 min，用去离子清洗干净后，将玉米种子均匀平铺在覆盖有湿滤纸的托盘上，置于（27±0.5）℃的恒温培养箱中于暗处发芽，保持相对湿度在60%—80%。配置不同浓度梯度（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg·L⁻¹）的（+）β-HBCD、（rac）β-HBCD和（−）β-HBCD暴露液。挑选培养4 d后长势均一的玉米幼苗转移至盛有150 mL HBCD溶液的黑色玻璃水培罐中进行暴露，每盆放置5棵幼苗，每24 h更换1次暴露液，更换暴露液前检测溶液中对映体外消旋化的比率（< 9%），确定对映体转化的影响可忽略不计。恒温培养箱每天设置14 h光照时间，相对湿度为60%—80%，每天改变玉米幼苗的位置以减少光照和温度的空间差异。暴露3 d后进行毒性指标测定。实验中，每个处理设置3个平行，每个实验重复3次，设置去离子水和甲醇空白对照，两组对照结果一致，说明溶剂甲醇未对植物生长产生影响。

将玉米幼苗用去离子水清洗并用滤纸吸干，分别称取0.5 g玉米根部与地上部，置于研钵中，在冰浴下加入6 mL磷酸缓冲液（0.05 mol·L⁻¹、pH =7.8）研磨成匀浆，于4 ℃，5000 r·min⁻¹离心15 min，提取上清液，即得到样品粗酶液。

采用Bradford的方法^[17]，以100 μg·mL⁻¹牛血清蛋白为标准溶液，0.005%的考马斯亮蓝G-250溶液为染料，在595 nm下绘制标准曲线，检测样品中的蛋白水平。超氧化物歧化酶（SOD）的测定参照Beauchamp等^[18]的方法并略作改动。采用氮蓝四唑（NBT）光还原法进行检测，将粗酶液与显色液（50 mmol·L⁻¹磷酸缓冲液（pH =7.8）、130 mmol·L⁻¹甲硫氨酸、750 μmol·L⁻¹氮蓝四唑、100 μmol·L⁻¹ EDTA-Na₂及20 μmol·L⁻¹核黄素）混匀，将1支对照管避光放置作为空白，其它于4000 lx光照下反应15—30 min，在560 nm处测定各管吸光值。抗坏血酸过氧化物酶（APX）的测定参照Nakano^[19]的方法，0.5 mL上清液混于1 mL反应体系（包含50 mmol·L⁻¹磷酸钾，0.5 mmol·L⁻¹抗坏血酸，0.1 mmol·L⁻¹过氧化氢以及0.1 mmol·L⁻¹ EDTA），在290 nm处测定各管吸光值以确定抗坏血酸活性。

称取幼苗叶片0.10 g，剪成1—2 mm碎片，置于5 mL 2%的盐酸甲醇溶液中，于37 ℃恒温箱中放置3 h，直到叶片用肉眼观察已完全变白，取出过滤获得上清液，于530 nm下测花青素的含量，由于可溶性糖和叶绿素的干扰，需要在620 nm下测可溶性糖和650 nm下叶绿素的光密度值。计算公式为：

其中，ε为花青素的摩尔消光系数值为4.62×10⁶；V为所取上清液体积（mL）；m为所取样品质量（g）；nmol·g⁻¹为每克样品中的花青素含量。

植物样品的提取和粗酶液的提取方法一致，获得的上清液采用NBT法^[20]检测。取0.5 mL样品、0.5 mL 65 mol·L⁻¹的磷酸缓冲液和1.5 mL 1.0 mol·L⁻¹的盐酸羟胺混匀，于25 ℃保温1 h，加入2 mL 17 mmol·L⁻¹对氨基苯磺酸和2 mL 7 mmol·L⁻¹1-萘胺，摇匀后在25 ℃保温20 min，在波长530 nm下测吸光度。

根系活力采用TTC法^[21]并略作改动。在0.1 mL 1%的2,3,5－三苯基氯化四氮唑溶液中加入少许Na₂S₂O₄粉末，无水甲醇定容至10 mL，即得到三苯甲月替（TTF）标准溶液，以空白作参比，在485 nm下测定吸光度值绘制标准曲线。称取0.3 g根样品于小烧杯中，加入5 mL 1% TTC和5 mL 0.1 mol·L⁻¹磷酸缓冲液（pH =7.0）摇匀，使溶液完全浸没根，37 ℃无光保温2 h，加入2 mL 1 mol·L⁻¹硫酸停止反应。取出根，用滤纸吸干反应液并切段置于10 mL甲醇中，于40 ℃恒温箱中放置，使根尖切段完全变白为止（4—6 h），在485 nm下测定吸光度值，通过标准曲线计算出四氮唑还原量。

所有数据均为3次重复实验所得结果，实验数据以平均值±标准偏差（Mean±SD）来表示。采用Origin 8.0对数据进行回归分析，SPSS 17.0对数据进行显著性检验。

SOD是生物体抗氧化系统的第一道防线，可催化${\rm{O}}_2^{\cdot -} $自由基发生歧化反应，生成氧气（O₂）和过氧化氢（H₂O₂），APX以抗坏血酸（ASA）为电子供体，将H₂O₂转化为H₂O^[22]。它们在植物体内可清除过量的活性氧，使植物在一定程度上减缓伤害。

随着β-HBCD暴露浓度的增加，玉米体内SOD和APX活性（除（−）β-HBCD处理外）均呈现显著的先增加后减少的趋势（图2），表明β-HBCD诱发了玉米机体的氧化应激效应。图2a显示玉米根部SOD活性在（+）、（rac）和（−）β-HBCD最低暴露浓度下（0.5 μg·L⁻¹）即显著增加到最大值（P < 0.05），分别为对照组的1.85倍、1.71倍和1.63倍，但三者之间未呈现出显著性差异，可能是因为低浓度的污染物对玉米SOD活性的影响较小；在最高浓度5.0 μg·L⁻¹时，SOD活性降到最低，但仍比对照组增加了58.7%、56.0%和26.8%，表明β-HBCD对玉米产生了氧化胁迫，且不同立体构型产生的毒性为（+）β-HBCD > （rac）β-HBCD > （−）β-HBCD。在（+）和（rac）β-HBCD暴露下，玉米地上部SOD活性分别在3.0 μg·L⁻¹与2.0 μg·L⁻¹时达到最大（图2b），较对照组分别增加了15.6%和9.5%，表明根部受到的影响更大。（−）β-HBCD处理的地上部SOD活性与对照组相比无显著差异，可见（−）β-HBCD对玉米的影响较小。

β-HBCD及其对映体均诱导了玉米根部和地上部APX活性增加（图2c和d）。玉米根部在暴露浓度为1.0 μg·L⁻¹时APX活性最高，（+）、（rac）和（−）β-HBCD处理分别是对照组的5.26倍、4.91倍和3.90倍，随后与浓度呈现负相关关系。地上部分，APX活性在（+）和（rac）β-HBCD浓度为3.0 μg·L⁻¹时达到最大值，较对照组分别增加了114.6%和97.6%，随后逐渐降低；（−）β-HBCD处理的玉米地上部APX活性在低浓度下无显著差异，仅在最大暴露浓度（5.0 μg·L⁻¹）时显著增加到对照组的1.45倍。可见，APX活性变化结果与SOD类似，均表现出了（+）β-HBCD的影响最大，其次是（rac）β-HBCD，（−）β-HBCD影响最小。Fang等^[23]在甲霜灵对映体对烟草幼苗的影响研究中发现：R-对映体比S-对映体对SOD活性的促进作用更高，对幼苗的影响更大，说明同种物质不同立体构型对生物体产生的毒性作用亦是存在差异的。

外源污染物会影响植物体内的活性氧（ROS）平衡，ROS的大量生成，可以激发植物自身的抗氧化防御系统，显著诱导酶活性增加以消除过量的ROS^[24]。本研究中β-HBCD诱导了玉米体内ROS的产生，使细胞抗氧化酶SOD和APX活性增加以清除玉米体内的${\rm{O}}_2^{\cdot -} $与H₂O₂。随着胁迫的加深，SOD和APX活性逐渐降低，可能是由于植物机体内其他抗氧化机制也被诱发，而使得SOD和APX活性所受的影响变小，但其活性并未降到对照组以下，说明SOD和APX仍对β-HBCD有响应。由于根部先于地上部接触暴露液，且有研究表明，在培养玉米的过程中，地上部对β-HBCD的积累主要来源于根部吸收和茎向传输，且总富集量低于根部^[25]，因此使得根部SOD和APX活性在较低浓度下即产生应激响应，且变化量均高于地上部的最大变化量。与α-HBCD^[14]和γ-HBCD^[15]的玉米毒性研究对比，在异构体水平上，对SOD酶活性的影响为β-HBCD>α-HBCD>γ-HBCD；在对映体水平上，α-、β-和γ-HBCD均分别表现出（+）体>（rac）体>（−）体，且对于毒性较强的（+）构型，又呈现（+）α-HBCD>（+）β-HBCD>（+）γ-HBCD的顺序，（−）构型则为（−）β-HBCD>（−）α-HBCD>（−）γ-HBCD。因此，在生物体内不同异构体和对映体可能表现出不同的效应程度。同时，数据结果显示玉米体内APX活性的变化程度明显高于SOD活性的变化，可能是β-HBCD诱发了sod基因表达量上升^[26]，从而减轻了对SOD活性的影响压力，也可能是由于抗氧化酶APX比SOD更加敏感导致。

植物在受到氧化胁迫时，为保护自身生理发育及新陈代谢的正常进行，形成了一套复杂完善的抗氧化保护系统，包括抗氧化酶系统和非酶系统，花青素是非酶系统中一种重要的抗氧化剂，属于生物类黄酮物质，主要存在于植物叶片中，和酚类化合物的作用机理相似，花青素可通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应^[27]。

随着β-HBCD暴露浓度的增加，玉米地上部花青素含量与抗氧化酶类似，亦呈现先增加后减少的趋势（图3）。1.0 μg·L⁻¹的（+）、（rac）和（−）β-HBCD处理下玉米叶片中花青素含量最高，分别达到对照组的3.55倍、3.22倍和2.28倍；在最高浓度5.0 μg·L⁻¹时，花青素含量最低，（+）、（rac）和（−）β-HBCD处理组分别比对照组增加了77.6%、94.2%和43.9%。研究表明，花青素具有清除自由基、促进激活抗氧化酶系统的能力，是植物抗氧化的基础^[27]，本研究中植物体内抗氧化酶系统和非酶系统随β-HBCD暴露的变化趋势一致，说明其在植物防御外源氧化胁迫过程中同样起到非常重要的作用。不同对映体处理组相比，与抗氧化酶系统的SOD和APX活性检测结果一致，均表现出对玉米的毒性作用大小顺序为（+）β-HBCD > （rac）β-HBCD > （−）β-HBCD。

β-HBCD的暴露诱导了玉米体内SOD、APX酶活性和花青素含量的增加，那么这种应激响应是否对机体内部的ROS进行了有效的控制呢？本研究进一步考察了玉米组织中的${\rm{O}}_2^{\cdot -} $水平，以衡量植物对逆境抗性的防御程度。

结果显示（图4），玉米体内的${\rm{O}}_2^{\cdot -} $含量随暴露浓度的增加呈现先增后降趋势，且不同对映体之间存在显著差异（P < 0.05）。玉米根部${\rm{O}}_2^{\cdot -} $含量在最低暴露浓度（0.5 μg·L⁻¹）的（+）和（−）β-HBCD、1.0 μg·L⁻¹的（rac）β-HBCD处理下达到最大值，分别是对照组的2.70、2.14、2.39倍；在最大暴露浓度5.0 μg·L⁻¹时，(rac)和（−）β-HBCD处理组玉米根部${\rm{O}}_2^{\cdot -} $水平与对照组无显著差异，(+)β-HBCD处理组仍高于对照组，(+)构型的β-HBCD对机体影响更大；在玉米地上部中，（+）β-HBCD处理的${\rm{O}}_2^{\cdot -} $含量在2.0 μg·L⁻¹时最高，达到空白对照组的2.02倍，且不同浓度间无显著差异，（rac）和（−） β-HBCD处理组的地上部${\rm{O}}_2^{\cdot -} $水平分别在1.0 μg·L⁻¹和0.5 μg·L⁻¹时达到最高，分别是空白对照组的1.86倍和1.71倍，随后显著下降。

在外界胁迫下，生物体内更多的分子氧经过单电子还原反应转变为${\rm{O}}_2^{\cdot -} $，进而衍生出羟基自由基等一系列的ROS物质^[28]，破坏植物细胞膜及蛋白、核酸等生物大分子。本研究发现β-HBCD能显著诱导玉米体内的${\rm{O}}_2^{\cdot -} $水平，进而机体抗氧化系统被激活，高效清除过量的ROS，然而仅高浓度的（rac）和（−）β-HBCD处理组的植物根部${\rm{O}}_2^{\cdot -} $含量恢复到对照组水平，相比而言，（+）β-HBCD胁迫下的玉米体内${\rm{O}}_2^{\cdot -} $增加得最快、水平最高、恢复得也最慢，表明（+）β-HBCD对玉米的毒性作用更强。这与Zhang等^[16]关于β-HBCD对肝细胞毒性作用的结果（+）β-HBCD毒性更强一致。

根系是植物获得营养和水分，维持稳定较大生物量的关键部位，根系活力的高低直接影响作物的正常生长并间接干扰叶片的光合效率^[29-30]。本研究中玉米根系是直接接触暴露液的部位，根部${\rm{O}}_2^{\cdot -} $的变化程度比地上部更显著，为了明确植物中${\rm{O}}_2^{\cdot -} $的失衡是否会影响其健康状态，本研究进一步开展了植物根系活力的检测。

由图5可以看出，经（+）和（rac）β-HBCD胁迫后，幼苗根系活力在0.5 μg·L⁻¹时与空白对照组无显著差异，在1.0 μg·L⁻¹时显著下降，于最大浓度（5.0 μg·L⁻¹）时降到最低，分别较对照组减少了65.1%和39.7%；（−）β-HBCD胁迫下，幼苗根系活力仅在最大浓度胁迫下，较空白对照组显著下降了28.5%，其余处理均与空白无显著差异。显然，尽管植物机体存在庞大的抗氧化保护系统，但β-HBCD及其对映体仍降低了玉米幼苗的根系活力，影响了其健康状态，且不同对映体对幼苗根系活力的抑制作用为（+）β-HBCD > （rac）β-HBCD > （−）β-HBCD。植物根系活力反映根系整体的代谢强度，包括根系呼吸、氧化、还原和合成能力等^[31]，植物处于逆境生理环境时，其呼吸代谢关键酶表达量会发生改变，进而影响植物的呼吸过程^[30]。本研究中β-HBCD很可能是通过诱导ROS的变化影响了玉米根部代谢关键酶的表达或活性，从而导致其代谢强度的改变，根系活力发生变化。这与Zhang等^[32]关于碱环境胁迫下大米机体ROS累积导致根系损伤的作用结果一致。不同的β-HBCD对映体对幼苗根系活力的抑制作用存在显著差异，可能与其空间立体构型有关。有文献报道，不同立体构型的HBCD与细胞内代谢相关酶的结合位点具有差异性，其中（−）β-HBCD能够选择性进入玉米代谢相关酶-细胞色素氧化酶（CYP）和谷胱甘肽转移酶（GST）亚型酶CYP71C3v2、GST31的活性位点并与其键合，进而被转化成不同的代谢产物，从而降低了其在植物体内的浓度^[25]，这可能是（−）β-构型产生的毒性效应较小的主要原因。

手性化合物β-HBCD对玉米的生长代谢具有显著的对映体选择性影响，毒性大小为（+）β-HBCD>（rac）β-HBCD>（−）β-HBCD，主要源于植物抗氧化酶系统和非酶抗氧化系统未能有效控制玉米体内${\rm{O}}_2^{\cdot -} $水平，ROS自由基平衡被打破，进而幼苗根系活力显著下降，这是导致植物生长代谢受阻的重要影响因素。本研究从植物角度出发，在对映体水平上评价了β-HBCD对植物生长代谢的影响，为评价HBCD的环境行为和毒理提供重要数据，对综合评估其环境生态风险具有重要意义。