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硝基呋喃类药物是一类包括呋喃西林（nitrofurazone，SEM）、呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）、呋喃它酮（furMtadone，AMOZ）和呋喃妥因（nitrofurantoin，AHD）等4种代谢产物的抗菌药物[1-2]，因其对部分革兰氏性菌、真菌和原虫具有抑制与杀灭作用而曾被广泛用于淡水养殖业[3-4]。研究表明残留的硝基呋喃类药物可能会通过食物链危害人体健康[5-6]。尽管我国农业农村部在193号公告中明确规定了硝基呋喃类药物及代谢物不得用于可食动物，但仍然存在部分淡水鱼养殖户在利益驱使下非法滥用硝基呋喃类药物[7-8]。因此，对硝基呋喃类药物进行严密监控很有必要。
目前，国内外报道用于检测水产品中硝基呋喃类药物的方法有酶联免疫法（ELISA）[9]、高效液相色谱法（HPLC）[10]、高效液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）[11-12]、高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）[13-15]等。其中ELISA法一般用于定性筛查且阳性样品需要进一步确证；而HPLC法与HPLC-MS法存在灵敏度较低问题；HPLC-MS/MS法可同时进行高质量定性和定量分析，已被相应标准所采用[16-17]，但该方法前处理及进样时间过长且多局限于单一基质样品[18-19]。此外，“农业部783号公告-1-2006”所述方法中，虽然4种硝基呋喃类代谢物保留得到增强且各目标物分离度较好，但峰形较宽，检测时间长效率较低，不利于大批量样品的快速检测。因此，探讨建立一种能够快速、准确检测多种鱼肉中硝基呋喃类代谢物的方法显得很有必要。
本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），在农业部783号公告-1-2006和GB/T 20752—2006的基础上，通过优化前处理步骤及色谱和质谱分析条件，构建用于快速检测乌鳢、鲫鱼、以及鲢鱼和草鱼等4种人工养殖淡水鱼中硝基呋喃类药物代谢物的检测方法。该方法简便、快捷、高效，可为人工养殖多种淡水鱼中硝基呋喃类代谢物的快速检测监控提供新的思路。
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UPLC Xevo TQ-S micro超高效液相色谱串联质谱仪（配置电喷雾离子源）（美国Waters公司）；ME204E型电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；BT 125D型精密天平（德国Sartorius公司）；MS3涡旋震荡搅拌器（德国IKA公司）；3K15高速冷冻离心机（美国Sigma Aldrich公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；5800H-C超声波仪（美国Branson公司）TurboVap LV多样品快速浓缩仪（瑞典Biotage）；绞肉机（德国HanJiaOurs公司）；色谱柱：ACQUIYUPLC BEH C18（1.7 μm ，2.1 mm×50 mm）。
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试剂：甲醇、乙腈、甲酸和正己烷均为色谱纯（美国Sigma Aldrich公司）；盐酸为优级纯；氢氧化钠、乙酸乙酯均为分析纯（广州化学试剂厂）；磷酸氢二钾为分析纯（阿拉丁公司）；邻硝基苯甲醛为分析纯（德国CNW公司）；试验用水均为超纯水。
标准物质：4种硝基呋喃类药物代谢物AMOZ、SEM、AHD、AOZ及同位素内标AMOZ-D5、SEM·HCl-13C-15N2、AHD-13C3、AOZ-D4的对照品纯度均高于99%（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）。
试验材料：从市场中随机采集乌鳢、鲫鱼、鲢鱼和草鱼等4种人工养殖的鲜活淡水鱼各9批次。
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活鱼制样：将鲜活鱼去鳞、去皮、去头尾后，沿鱼背脊对剖，取背脊两侧肌肉部分，再用绞肉机将制成肉泥状备用。
水解及衍生化：准确称取各鱼样3 g（精确到0.01 g），转置50 mL离心管中，加入10 mL甲醇-水（V/V ，1∶1）混合溶液，振荡5 min并离心5 min后弃去液体。继续加入10 mL 0.2 mol·L−1盐酸，10000 r·min−1均质3 min，再加入内标混合标准溶液100 μL、邻硝基苯甲醛溶液100 μL，超声5 min后涡漩混合30 s，再充分振荡20 min，16 h过夜衍生（37℃恒温箱）。
提取及净化：拾取离心管并放置冷却，至室温后加入3 mL 磷酸氢二钾溶液（1 mol·L−1），涡旋混匀，用氢氧化钠溶液（1 mol·L−1）调节pH值至7.0—8.0后，缓慢加入乙酸乙酯10 mL，经5 min振荡提取和5 min离心处理（8000 r·min−1），收集上清液转移至15 mL离心管中，用10 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并上清液并在40℃下氮气吹干，残渣用1.0 mL 0.1 %甲酸水溶液溶解，再用3 mL饱和乙腈正己烷去脂，下层水相过0.20 μm滤膜，上机测试。同时进行空白试验。
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单标储备液（1 mg·mL−1）：准确称取适量AMOZ、SEM、AOZ和AHD，用甲醇溶解并分别配制成浓度为1 mg·mL−1的单标储备液，4℃冷藏避光保存。
混合标准工作溶液（10 ng·mL−1、100 ng·mL−1）：准确吸取AMOZ、SEM、AOZ和AHD单标储备液，用甲醇逐级稀释为10 ng·mL−1、100 ng·mL−1的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存。
内标单标储备液（1 mg·mL−1）：准确称取适量AMOZ-D5、SEM·HCl-13C-15N2、AOZ-D4和AHD-13C3，用甲醇溶解并分别配制成浓度为1 mg·mL−1的内标单标储备液，4℃冷藏避光保存。
混合内标工作溶液（100 ng·mL−1）：准确吸取AMOZ-D5、SEM·HCl-13C-15N2、AOZ-D4和AHD-13C3同位素内标单标储备液，用甲醇逐级稀释为100 ng·mL−1的混合内标工作溶液，4℃冷藏避光保存。
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分别准确移取硝基呋喃代谢物10 ng·mL−1混合标准工作溶液10、50、100、200、100 ng·mL−1混合标准工作溶液50、100、200 μL至7支离心管中，配制成浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL−1系列混合标准工作液，按1.3.1操作并依次测定。
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色谱条件：采用ACQUIYUPLC BEH C18（1.7 μm ，2.1 mm×50 mm）为色谱分析柱，流动相为0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱见表1；流速：0.3 mL·min−1，柱温：35℃；进样量：1.0 μL。
质谱条件：离子化方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；检测方式：多重反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）3.0 kV；离子源温度（TEM）150℃；脱溶剂气温度和流量：400℃、800 L·h−1；锥孔气流量100 L·h−1；碰撞气流量0.15 mL·min−1。4种代谢物及内标物监测情况见表2。
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将4种硝基呋喃类代谢物标准品分别通过鱼肉基质以及甲醇制备为标准溶液，通过甲醇纯溶剂和基质溶液中同一物质的标准曲线斜率之比进行基质效应评价。基质效应（ME%）计算公式如下：
其中，80%≤ME%≤120%时，基质效应可忽略；ME%＜80%或ME%＞120%时，基质抑制或增强。
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利用UPLC Xevo TQ-S micro超高效液相色谱串联质谱仪系统配套的Waters MassLynx数据管理软件，并结合WPS和Origin 8.5进行数据处理与分析。
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“农业部783号公告-1-2006”和“GB /T 20752—2006”方法中均使用梯度洗脱法，前者中甲醇的初始比例为40%，高比例的有机相导致色谱保留不明显且出峰早峰形宽；后者用0.3%乙酸乙腈溶液和0.3%乙酸水溶液，各代谢物之间分离度适中，但AMOZ存在较弱保留问题。本研究在上述2个标准方法的基础上，对色谱、质谱条件和前处理方法进行了优化。
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0.1%的甲酸水溶液是优选流动相[20]，试验首先以0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相，分别考察在Agilent Eclipse Plus C18（1.8 μm ，2.1 mm×100 mm）和ACQUIYUPLC BEH C18（1.7 μm ，2.1 mm×50 mm）两种色谱柱中的分离效果。发现后者能获得更加尖锐对称的色谱峰和较高的灵敏度，且4种代谢物的分离效果更好；低浓度（0.1%）甲酸的添加能够获取更高的离子化效率，故以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈作为流动相；由于目标物与影响物难以完全分离在等度洗脱中持续存在，故采用梯度洗脱。多品类养殖淡水鱼样品的基质复杂，为避免大批量进样时色谱柱中蓄积未知杂质成分，该法设置初始比例为5%（0.1%甲酸乙腈）且在2 min内持续增加线性，使各化合物在C18柱中保留增强，随后将比例提高至90%， 以达到杂质的多量、快速洗脱目的。将乙腈的比例从90%降低为初始比例5%，充分平衡色谱柱，为下一针进样做准备。该法将进样分离时间提升至4.5 min内，相比于2个标准方法，各项评价指标均有所提高，优化后梯度洗脱程序见表1。
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采用正离子（ESI+）电离扫描模式，对4种硝基呋喃代谢物及其内标物分别进行一级质谱扫描并获得高响应的母离子[M+H]+，在确定准分子离子峰的基础上分别优化锥孔电压；借助氩气的能量化碰撞产生子离子，在优化碰撞能量的基础上使选定的特征碎片离子的响应强度达到最大，最终确定以m/z为291.185的准分子离子和166.100、134.089、134.069的3个碎片离子组成监测离子对，质谱监测条件满足欧盟657/2002/EC号指令要求（见表2）。
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乌鳢、鲢鱼、鲫鱼、草鱼中脂质含量均较高，前处理时应考虑脱脂[21]。现行标准中均采用甲醇水溶液去除脂质[22-23]，由于目前对洗涤液配比研究少有报道，本试验将甲醇与水的比例分别设置为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，考察回收率和精密度的受影响情况（见表3）。结果显示，不同比例的甲醇水洗涤液加标回收率在89.8%—95.8%之间，精密度在3.8%—6.3%之间。其中，比例为1∶1时，回收率和精密度均达到最高，分别为95.8%和6.3%。故洗涤液中甲醇与水比例选择为1∶1。
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衍生化产物往往受到光照条件的影响[24]。试验将同浓度硝基呋喃代谢物的衍生物分别放置于日间光照和夜晚避光条件下考察光照强度的影响，发现4种衍生物均呈现光敏性且敏感程度不一致。其中，AMOZ对光照最敏感，日间光照下放置6 h后衍生物几乎完全分解；AHD对光照最不敏感，日间光照下放置6 h前衍生物含量基本不变，而放置6 h后出现缓慢分解；SEM和AOZ相对稳定，但长时间日间光照会出现不同程度的分解。4种衍生物在夜晚避光条件下放置的衍生物含量几乎不变。因此选择过夜避光衍生化，以减少衍生物的分解，同时提高测定的灵敏度，避免假阴性的出现。
溶液的pH对回收率的影响较大且现行方法工作效率较低[25]，农业部783号公告-1-2006与文献方法中一般采用3—5 mL 1 mol·L−1磷酸氢二钾溶液或1 mol·L−1的氢氧化钠溶液来调节pH，这些方法在调节pH到最佳萃取范围难度较大，而在水解液中加入适量缓冲溶液可以保证萃取效率。故本实验在pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5等7个梯度下分别先加入3 mL 1 mol·L−1磷酸氢二钾溶液，充分涡旋混匀形成缓冲溶液，再用2 mol·L−1的氢氧化钠溶液调节pH，pH的首次调节时，需要逐滴加入氢氧化钠溶液并记录体积，经充分涡旋水解衍生化后的混合溶液，使试样中的酸充分释放。通过实验考察不同pH条件下4种硝基呋喃代谢物的回收率（见图1）。
由图1可知，不同pH条件下4种硝基呋喃代谢衍生物的回收率不同。其中AHD和AMOZ受pH的影响较大，当pH调节至弱碱性（7.0—8.0）时，均能达到90%及以上的回收率效果，而当pH偏低或过高时，均会对回收率造成不良影响回收率，原因可能是衍生物难以萃取造成。因此，溶液pH调节至7.0—8.0范围内，不仅缩短处理时间，有效提高工作效率，还能够获得更高的回收率。
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在选取适量萃取溶剂的基础上，适配最佳提取体积及次数。实验对比了4、6、8、10、12 mL不同体积条件下经乙酸乙酯提取1—3次与10 mL相同体积条件下经乙酸乙酯分2次（5 mL×2）和1次（10 mL×1）提取时，对回收率的影响（见表4）。实验表明，当以10 mL乙酸乙酯提取2次时回收率最高，这可能与非最优溶剂体积条件下提取时，药物提取不充分有关；而8 mL和10 mL乙酸乙酯3次提取时，回收率表现与10 mL乙酸乙酯提取2次相当，从节约成本和时间考虑，试验最终选择以10 mL乙酸乙酯提取2次。
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鱼肉样品基质较为复杂，UPLC-MS/MS分析过程中，目标共流物会对分析结果造成系统干扰。实验按照既定基质效应计算方法，对4种鱼肉样品开展基质效应评价。实验发现（见表5），在乌鳢和草鱼中，4种代谢物的基质效应均在80%—120%范围内，即基质效应不明显；在鲢鱼中，4种代谢物均表现为基质增强效应；在鲫鱼中，AMOZ、AHD表现为基质抑制效应，SEM、AOZ则表现为基质增强效应，从而可以判断本实验存在部分基质效应。本实验采用基质加标法构建标准工作曲线，结合同位素内标物使基质效应影响得到消减，从而提高定量检测水平。
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在UPLC-MS/MS优化条件分析中，分别以待测物浓度及对应离子峰面积为横纵坐标制作标准曲线，得到4类鱼肉样品基质中硝基呋喃类代谢物的线性方程（见表6）。表中数据显示，4种硝基呋喃代谢物在0.1—20 ng·mL−1线性范围内线性关系良好（r≥0.9953）。以响应信号分别大于3倍和10倍噪声时对应的物质含量作为方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），各物质方法检出限均为0.25 μg·kg−1，定量限均为0.80 μg·kg−1，表明本方法灵敏度较高。
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准确称取3 g乌鳢、鲢鱼、鲫鱼和草鱼样品，分别添加1.0、2.0、10.0 μg·kg−1的硝基呋喃代谢物，低、中、高的3个浓度水平下重复6次实验，计算方法回收率和精密度。结果显示，该方法在1.0—10.0 μg·kg−1添加水平下的平均回收率在97.6%—107.8%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在3.1%—9.6%之间，均符合标准检测分析的要求，试验结果见表7。空白鱼肉中添加10.0 μg·kg−1混标及其内标的衍生物色谱图见图2。
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采用本方法和国家标准方法GB/T 20752—2006分别对市场中随机抽取的36批次人工养殖淡水鱼（乌鳢、鲢鱼、鲫鱼、草鱼各9批次）和乌鳢中硝基呋喃类代谢物质控样品（AOZ特性值5.50 μg·kg−1，量值范围1.74—9.26 μg·kg−1；AMOZ特性值5.75 μg·kg−1量值范围1.94—9.56 μg·kg−1）进行检测，结果显示，除质控样品检出阳性外，其他市售样品均显示未检出。用本方法与标准方法分别测试质控样，检测值无显著性差异且均保持在量值范围内（见表8）。在符合检测需求的基础上，本方法较标准方法可以省略固相萃取柱，在同等条件下检测效率得到提升。
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本实验通过对样品前处理和仪器条件的优化，建立了一种基于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）对人工养殖淡水鱼中AHD、AMOZ、AOZ、SEM等4种硝基呋喃类代谢物的检测分析方法。硝基呋喃代谢物在0.1—20 ng·mL−1范围内线性关系良好，相关系数均>0.9953，检出限和定量限分别为0.25 μg·kg−1、0.80 μg·kg−1；在1.0、2.0、10.0 μg·kg−1的3个添加水平下，平均回收率在97.6%—107.8%之间，相对标准偏差RSD在3.1%—9.6%之间，方法学指标均能满足国家药物残留检测的要求。该方法简单高效、准确灵敏，为人工养殖淡水鱼中硝基呋喃类代谢物的快速检测提供了新的思路。
UPLC-MS/MS法快速检测人工养殖淡水鱼中硝基呋喃类代谢物
Rapid detection of nitrofuran metabolites in cultured freshwater fish by UPLC-MS/MS
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摘要: 建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）快速检测人工养殖淡水鱼中AHD、AMOZ、AOZ、SEM等硝基呋喃类代谢物的分析方法。向鲜活乌鳢、鲢鱼、鲫鱼和草鱼试样中分别加入甲醇-水标准混合溶液，震荡并离心后弃去液体，保留残留物，残留物经盐酸水解，邻硝基苯甲醛酸性条件下衍生，利用乙酸乙酯提取，再用ACQUIYUPLC BEH C18色谱分析柱洗脱，电喷雾离子源（ESI）下以多重反应监测（MRM）正离子模式扫描进行检测，内标法定量。乌鳢、鲢鱼、鲫鱼和草鱼中4种硝基呋喃代谢物浓度在0.1—20 ng·mL−1范围内线性关系良好，相关系数均>0.9953，检出限均为0.25 μg·kg−1；平均回收率在97.6%—107.8%之间，相对标准偏差RSD在3.1%—9.6%之间。该方法简单高效，具有准确性好、灵敏度高、重现性强等特点，适用于多种人工养殖淡水鱼中硝基呋喃类代谢物的快速检测。
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关键词:
- 超高效液相色谱串联质谱法 /
- 人工养殖 /
- 淡水鱼 /
- 硝基呋喃类代谢物 /
- 快速检测
Abstract: To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method for the rapid detection of nitrofuran metabolites such as AHD, AMOZ, AOZ and SEM in cultured freshwater fish. The samples of fresh snakehead fish, silver carp, crucian carp and grass carp were respectively added with methanol-water mixed solution for shock and centrifugation. After shaking and centrifugation, discard the liquid to retain the residue, the residues were hydrolyzed with hydrochloric acid, derived with o-nitrobenzaldehyde under acidic conditions, extracted with ethyl acetate, and then purified with ACQUIYUPLC BEH C18 chromatographic analysis column elution. Multiple response monitoring (MRM) positive ion mode scanning was used for detection under the electrospray ion source (ESI), and quantification was carried out by internal standard method. The linear range of four nitrofuran metabolites in mullet, silver carp, crucian carp and grass carp was 0.1 ng·mL−1 to 20 ng·mL−1, the correlation coefficients were >0.9953, and the detection limits were 0.25 μg·kg−1. The relative standard deviations (RSD) ranged from 3.1% to 9.6%, and the average recoveries ranged from 97.6% to 107.8%. The method is simple, efficient, accurate, sensitive and reproducible. It is suitable for the rapid detection of nitrofuran metabolites in a variety of cultured freshwater fish. -
苯扎氯铵(benzalkonium chlorides, BACs)主要由3种正烷烃基(n-C12H25、n-C14H29和n-C16H33)取代二甲基苄基氯化铵组成的同系物混合物[1]，因其具有较强的杀菌作用，常被作为洗涤剂、纺织物软化剂、界面转化活性剂、矿物浮选剂、杀菌剂以及个人护理品中的防护和抗静电成分[2]。由于杀菌剂生产及使用量的逐年递增，BACs被美国和加拿大列为高产量化学品[3]。BACs的大量生产和消耗，将不可避免地随着时空迁移进入环境中。近年来，BACs陆续在多种环境介质中被检出，如污水处理厂进水[4-5]、医院废水[6]、洗衣店出水[6](如表1所示)、天然水体[7-8]、污水厂污泥[9]、河口沉积物[10-11]以及土壤[12]中。其中，河水中BAC-12和BAC-14的含量分别达到2.7~5.8 μg·L−1和6.3~36.6 μg·L−1[7]；地表水中BAC-12、BAC-14和BAC-16的总量达到(3.24±14)~(72.5±14)μg·L−1[8]；RUAN等[9]在中国52个污水处理厂污泥中检测出BACs的含量为0.09~191 μg·g−1；LI等[10]在中国珠江口的沉积物中发现BACs的含量为49.3~1 050 ng·g−1；FERRER等[11]曾报道BAC同系物在美国的河水沉积物中的浓度为22~206 μg·kg−1。KANG等[12]在韩国土壤中检测到BACs的含量为0.001~8.5 mg·kg−1。
表 1 环境中BACs含量Table 1. Concentrations of BACs in the environmentμg·L−1 样品 BACs BAC-12 BAC-14 BAC-16 BAC-18 文献来源 WWTP1进水 306.8 170 110 18 8.8 [4] WWTP2进水 170.22 130 39 0.86 0.36 [5] 医院出水1 3 928.5 2 800 1 100 27 1.5 [6] 医院出水2 1 649.4 1 140 480 27 2.4 [6] 洗衣店出水 2 752 2 100 620 21 11 [6] | Show Table
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环境中BACs的存在对生物具有潜在的毒性风险。毒理学研究表明，BACs对哺乳动物和水生动物均有急性和慢性毒性。BACs对大鼠的半数致死量(LD50)为234~525 mg·kg−1[13-14]。MELIN等[15]发现，BACs能够干扰雌性小鼠的排卵系统和发情周期，并降低雄性小鼠的精子浓度和活动能力，从而降低小鼠的繁殖率。BACs对水生生物(如藻类、水蚤、轮虫和原生动物)均具有急性毒性，半数效应浓度(EC50)为21~2 940 μg·L−1[16-18]。在欧盟修订的(EC)No.1272/2008条例中，将BACs归类为“对水生生物毒性极大”的物质，并认为对与其共存污染物的迁移性和生物有效性具有显著影响[19]。
在水环境中发现的BACs主要来自城市污水处理厂[4]。季铵盐化合物的存在可能会引起活性污泥潜在的急性反应，影响污泥的微生物活性和生存能力，从而影响其去除污染物的能力[20-21]。迄今为止，有关BACs对活性污泥微生物活性影响的研究鲜有报道。本研究在序批式反应器(SBR)处理模拟废水的基础上，以BACs的主要成分十二烷基二甲基苄基氯化铵(dodecylbenzyldimethylammonium chloride, DDBAC)为研究对象，通过污泥的微生物活性指标、氧化还原酶活性以及DDBAC浓度变化的测定，探究在DDBAC暴露下活性污泥的急性反应及微生物活性变化，以期为评估BACs在污水处理厂中的行为及影响提供参考。
1. 材料和方法
1.1 接种污泥和进水水质
实验室所用的接种污泥取自某城市污水处理厂的回流污泥。母反应器SBR的工作体积为36 L，温度控制在(22±1)℃，污泥浓度(MLSS)控制在3 000~3 500 mg·L−1，每天包含2个周期的循环，每个周期运行方式为：进水阶段(15 min)、好氧曝气阶段(180 min)、缺氧搅拌阶段(300 min)、沉降阶段(90 min)、排水阶段(15 min)和闲置阶段(120 min)。好氧阶段使用曝气设备进行曝气，溶解氧控制在2 mg·L−1左右；搅拌阶段使用搅拌器进行搅拌，溶解氧控制在0.5 mg·L−1左右，使用1.0 mol·L−1 NaHCO3和1.0 mol·L−1HCl调节系统pH，使初始pH维持在7.0±0.2。运行3个月后，系统对氮的去除率达到99%左右，表明SBR运行状态稳定。
本研究采用模拟废水，水质特性为：化学需氧量(COD)为400 mg·L−1左右，氨氮(
NH+4 -N)为40 mg·L−1左右，溶解性磷(SOP)为5 mg·L−1左右。模拟废水主要由葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和微量元素组成，其中微量元素包括0.03 g·L−1CuSO4·5H2O、0.06 g·L−1 Na2MoO4·2H2O、0.12 g·L−1 ZnSO4·7H2O、0.12 g·L−1 MnCl2·4H2O、0.15 g·L−1H3BO3、0.15 g·L−1 CoCl2·6H2O、0.18 g·L−1 KI、1.5 g·L−1 FeCl3·6H2O、10 g·L−1EDTA。微量元素投加量为0.5 mL·L−1。1.2 实验方法
在进行DDBAC在SBR系统中的短期暴露实验时，从稳定运行的母反应器里取出适量污泥混合均匀，平均分配在7个完全相同的SBR子反应器中，每个反应器有效容积为3 L，7个反应器运行方式和母反应器相同。污泥浓度(MLSS)控制在3 000~3 500 mg·L−1，污泥负荷(以COD计)大约为0.3 kg·(kg·d)−1(以MLSS计)，污泥停留时间(SRT)大约为15 d，水力停留时间(HRT)为20 h。反应器中DDBAC浓度分别为0、0.1、1、2、5、10和20 mg·L−1，运行一个周期后，取上清液测定DDBAC在水相中的残余量，取底泥进行TCC-脱氢酶活性、CAT活性的测定，然后弃去上清液，重新换入模拟废水，然后进行污泥耗氧速率OUR的测定。
在进行DDBAC对硝化过程的影响实验时，取母反应器活性污泥静置倒掉上清液，用自来水重复清洗3遍，再用不含C、N、P的配水清洗3遍，以充分去除原水样中C、N、P的含量。污泥浓度控制在3 000~3 500 mg·L−1，平行操作2组实验，实验期间需要曝气，曝气量控制在2 mg·L−1。温度调整至(20±1)℃，通过1.0 mol·L−1NaHCO3和1.0 mol·L−1HCl，调节pH至7.0±0.2。起始基质(
NH+4 -N和NO−2 -N)浓度均为30 mg·L−1，其中DDBAC投加浓度与SBR子反应器中一致，每隔10 min取样分析NH+4 -N和NO−2 -N浓度变化，直到出水各指标稳定，实验结束。1.3 分析方法
本研究中的常规项目如混合液悬浮固体浓度(MLSS)、
NH+4 -N、NO−2 -N、NO−3 -N指标参照文献中的方法[22]测定，溶解氧采用便携式溶氧仪监测。污泥耗氧速率(OUR)采用有氧厌氧呼吸仪(美国RSA公司)测定。比氨氧化率(SAOR)、亚硝酸盐氧化率(SNOR)和硝酸盐还原率(SNRR)的测定方法参照文献中的方法[23]。
TCC-脱氢酶采用常温萃取法[22-24]测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法[25]测定。
低于0.2 mg·L−1的DDBAC浓度采用Agilent 1260 Infinity液相色谱/6410三重四极杆液质联用系统测定，色谱柱为ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 mm×50 mm, 1.8 μm，流动相为2种溶液的混合液，溶液A为20 mmol·L−1乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸)，溶液B为甲醇和乙腈的混合液(甲醇∶乙腈=3∶7)，流动相为A∶B=20∶80(体积比)，流速为0.3 mL·min−1，温度为25 ℃，进样体积为2 μL，雾化气压力为310 kPa，干燥器温度为350 ℃，干燥器流速为10 L·min−1，采用正离子扫描方式，根据峰面积计算出其含量。高于0.2 mg·L−1的DDBAC浓度采用改进的二硫蓝离子对提取方法[26]进行测定。
2. 结果与讨论
2.1 DDBAC浓度变化对污泥OUR的影响
OUR是指活性污泥在单位时间内所利用氧的量，是评价污泥微生物代谢活性的一个重要指标。根据不同系统运行12 h后测定相同体积活性污泥OUR的变化，可以判断不同浓度DDBAC暴露下污泥性质的变化，结果如图1所示。前1 h，OUR呈明显的上升趋势，不含DDBAC的系统中污泥OUR最高达6.48 mg·h−1。随着DDBAC浓度的增加，最高OUR呈下降趋势。在1 mg·L−1 DDBAC的系统中，OUR最大为4.86 mg·h−1。当DDBAC浓度达到20 mg·h−1时，污泥OUR上升缓慢，1 h时最高OUR为0.78 mg·h−1；1 h后，7组反应器中污泥的OUR均逐渐降低，且DDBAC浓度越高，OUR的降低趋势越明显。当DDBAC浓度达到20 mg·L−1时，经过5.5 h后，污泥的呼吸速率降为0。结果表明，随着DDBAC浓度的增加，活性污泥中呼吸酶活性越低，氧的吸收和利用率越低。DDBAC作为有机抗菌剂，与细胞膜具有较好的相容性，可损伤细胞膜，造成细胞裂解；或与细胞膜融合，损坏细胞中的酶、蛋白质，使氧化磷酸化过程和电子传递系统受到影响，导致呼吸作用受到抑制。ZHANG等[27]和CROSS等[28]亦认为呼吸酶活性的下降是由DDBAC引起细胞裂解所致。
图 1 投加不同浓度DDBAC后污泥耗氧速率的变化Figure 1. Change of sludge oxygen uptake rate with different DDBAC concentrations2.2 DDBAC对硝化过程的影响
DDBAC对硝化反应中的氨氮的降解过程影响如图2(a)所示，对亚硝氮的降解过程影响如图2(b)所示。从图2(a)中可以看出，当DDBAC浓度为0.1 mg·L−1和1.0 mg·L−1时，氨氮的转化速率大于空白对照组，即DDBAC的存在能够促进氨氮的氧化过程。当DDBAC浓度为2、5、10和20 mg·L−1时，氨氮的氧化速率随着DDBAC浓度的升高而逐渐下降，氨氮去除率分别为94.28%、81.61%、67.59%和59.92%。这表明，DDBAC的过量存在(≥2.0 mg·L−1)抑制了氨氧化菌的活性，影响好氧条件下氨氮的转化过程，且浓度越高，抑制效果越明显。此结果与SÜTTERLIN等[29]研究结果一致。从图2(b)中可以看出，低浓度DDBAC对亚硝酸盐氧化菌几乎无影响，20 mg·L−1的DDBAC短期暴露在系统中，使得亚硝氮降解率从100%降到(62.98±0.02)%，亚硝酸盐氧化菌受到一定抑制。此现象可能与微生物群落中氨氧化菌AOB与亚硝酸盐氧化菌NOB的相对丰度有关。与亚硝酸盐氧化菌相比，氨氧化菌的产率低、比增长速率小，更容易受到外界环境的影响[30]。
图 2 不同浓度DDBAC暴露下氨氮、亚硝氮的变化Figure 2. Changes of ammonia nitrogen and nitrous oxide with different concentrations of DDBAC2.3 DDBAC对污泥SAOR、SNOR、SNNR的影响
图3展示了不同浓度DDBAC对系统内SAOR、SNOR和SNNR的影响。当DDBAC浓度为0.1 mg·L−1和1.0 mg·L−1时，对系统内SAOR、SNOR和SNNR基本无影响。当DDBAC浓度为2 mg·L−1时，SAOR(以
NH+4 -N计)由(2.99±0.16) mg·(g·h)−1(以MLSS计)降至(2.82±0.15) mg·(g·h)−1，降低了5.72%；当DDBAC浓度为20 mg·L−1时，SAOR降至(1.79±0.09) mg·(g·h)−1，降低40.08%。DDBAC对SNOR的影响较小，当DDBAC浓度≤10 mg·L−1时，SNOR基本不受影响；当DDBAC浓度达到20 mg·L−1时，系统内SNOR受到较大影响，与对照组相比，下降了37.02%。当进水DDBAC浓度高于2 mg·L−1时，SAOR低于SNOR，此现象表明，氨氧化过程更易受到DDBAC的影响，与2.2节中的研究结果相呼应。由图3(b)可看出，当DDBAC浓度达到20 mg·L−1时，SNNR(以NO−3 -N计)由(23.69±0.61) mg·(g·h)−1(以MLSS计)降到(18.64±0.62) mg·(g·h)−1，下降了(21.32±0.59)%。此研究结果表明，与硝酸盐还原过程相比，DDBAC对硝化过程，尤其是氨氧化菌主导的氨氧化过程的抑制作用更加显著。这是由于与异养型微生物相比，主导硝化过程的硝化细菌世代时间长，增长速率低，一般只占活性污泥微生物总量的5%左右，对环境条件要求较为苛刻。因此，DDBAC对硝化过程的抑制性更强。
图 3 投加不同浓度DDBAC后SAOR、SNOR和SNNR的变化Figure 3. Changes in SAOR, SNOR and SNNR with different DDBAC concentrations2.4 DDBAC对氧化还原酶活性的影响
在有机化合物的好氧生物降解过程中，TCA循环是主要的代谢过程[31]。TCC-脱氢酶参与了TCA循环，能较好地反映微生物异养代谢行为。因此，在本研究中，脱氢酶活性可以作为有机化合物生物降解能力的指标之一，来评价DDBAC造成的急性效应[32]。TCC-脱氢酶活性的抑制率5%~25%属轻度抑制，25%~60%属中度抑制，大于60%属重度抑制[33-34]。DDBAC对污泥样品中TCC-脱氢酶活性的影响如图4所示。当DDBAC浓度低于2 mg·L−1时，DDBAC对TCC-脱氢酶活性的影响几乎可以忽略不计。当DDBAC浓度为2、5和10 mg·L−1时，TCC-脱氢酶活性与空白组对比，分别降低了(10.50±1.70)%、(24.20±0.01)%和(24.31±0.68)%。此时为轻度抑制；当DDBAC浓度增加到20 mg·L−1时，抑制率增加到(31.42±0.29)%，为中度抑制。根据以往的研究，季铵盐类化合物在活性污泥中的行为一般为3个过程：吸附、抑制和生物转化[35]。也有报道[26]认为，95%的季铵盐都会吸附于颗粒物，季铵盐浓度越高，对微生物的吸附量越大，对活性污泥活性的抑制作用越强。脱氢是微生物氧化分解有机物过程中的关键步骤，TCC-脱氢酶活性降低，降低了微生物对有机物的氧化分解速率，也反映了DDBAC对微生物种群的毒害作用。
图 4 DDBAC对TCCC-脱氢酶活性、过氧化氢酶活性的影响Figure 4. Effect of DDBAC on TCC-dehydrogenase activity and catalase activityCAT是生物呼吸和代谢过程中的末端还原酶，它能将对细胞有毒害作用的H2O2分解为水和氧气[36]。图4显示了DDBAC对TCCC-脱氢酶活性、过氧化氢酶活性的影响。当DDBAC浓度为1.0 mg·L−1和2.0 mg·L−1时，对CAT的影响几乎相同，抑制率在18%左右；DDBAC浓度达到5 mg·L−1时，抑制率为22.4%；DDBAC浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时，抑制率均为47%左右。此研究结果表明，含DDBAC废水的输入对污泥中的微生物的呼吸和代谢过程产生了负面影响，破坏了污泥的抗氧化机制。腾跃等[37]曾观察过苯扎溴铵与过氧化氢酶之间的微观作用机理，发现苯扎溴铵能够通过改变部分的氨基酸残基和蛋白质的二级结构，使过氧化氢酶的骨架结构变松散，进而抑制了过氧化氢酶的活性。
2.5 微生物对DDBAC的去除潜力
图5展示了微生物对不同浓度DDBAC的去除情况。当DDBAC的进水浓度为0.1 mg·L−1时，系统对DDBAC的去除率达到(92.30±2.97)%；当DDBAC初始浓度≥1 mg·L−1时，活性污泥微生物对DDBAC的去除潜力随着其浓度的增加而逐渐减弱，去除率由92.3%(初始浓度1 mg·L−1)降至(86.09±0.32)%(初始浓度20 mg·L−1)，出水中的DDBAC浓度由(0.008±0.003)mg·L−1增加到(2.78±0.06)mg·L−1。造成此结果可能的原因是，活性污泥处理系统具有一定的容纳、消化和去除DDBAC的潜力，但是能力尚有限，当DDBAC浓度逐渐增大时，系统中的微生物不能够在有限的处理时间内将DDBAC完全去除，因此导致了出水中DDBAC的残留。当DDBAC浓度较大时，水相中残留的DDBAC将随着出水排至流域水环境中，造成河流、湖泊等地表水以及沉积物中DDBAC的积累，且DDBAC具有生物毒性，将增加水环境健康管理负担和安全用水的风险。
3. 结论
1) DDBAC能够影响污泥的耗氧率，对污泥的呼吸产生抑制作用，且其浓度越高，抑制作用越强。
2)相对于反硝化过程，DDBAC对硝化过程，尤其是氨氧化菌主导的氨氧化过程的抑制作用更加显著。当DDBAC浓度≥2.0 mg·L−1时，即能够抑制氨氮的转化过程，且浓度越高，抑制效果越明显。
3)当2 mg·L−1≤DDBAC≤10 mg·L−1时，DDBAC对脱氢酶活性为轻度抑制；DDBAC浓度为20 mg·L−1时，对脱氢酶活性为中度抑制，严重影响污泥代谢过程。
4) DDBAC对过氧化氢酶活性的抑制作用随其浓度的升高而加强，可影响微生物的呼吸和代谢过程，破坏污泥的抗氧化机制。
5)活性污泥微生物对DDBAC具有一定的去除潜力，但处理能力尚有限，出水中残留的DDBAC将增加水环境健康管理负担，提高安全用水的风险。
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图 1 不同pH条件下4种硝基呋喃代谢物回收率
Figure 1. Recovery rates of 4 nitrofuran metabolites under different pH conditions
图 2 空白鱼肉中添加10.0 μg·kg−1混标及其内标的衍生物色谱图
Figure 2. Chromatograms of blank fish samples spiked with mixed nitrofuran metabolite standards （10.0 μg·kg−1）
表 1 梯度洗脱条件
Table 1. Gradient elution conditions
时间/min Time A/% B/% 0 95 5 0.6 95 5 2.5 10 90 3.0 10 90 4.5 95 5
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表 2 硝基呋喃代谢物及其同位素内标物质谱分析参数
Table 2. Analysis of nitrofuran internal standard and its metabolite mass spectrometry
化合物名称Compounds 母离子Parent ion（m/z） 子离子Daughter ion（m/z） 锥孔电压/VTaper voltage 碰撞能量/eVCollision energy 保留时间/minRetention time AMOZ 335 291*，262 28 11，20 1.64 AMOZ-D5 340 296 32 11 1.64 SEM 209 166*，192 30 14，9 1.93 SEM·HCl-13C-15N2 212 168 30 11 1.93 AHD 249 134*，104 30 9，12 1.96 AHD-13C3 252 134 28 15 1.96 AOZ 236 134*，104 28 11，20 2.05 AOZ-D4 240 134 30 12 2.05 注：带*的离子为定量离子. Note: The ion with " * " is qualitative ion.
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表 3 不同比例洗涤液对回收率和精密度的影响（n=6）
Table 3. The influence of different proportions of washing liquid on recovery rate and precision
序号 No. 甲醇∶水 Methanol∶Water 回收率/% Recovery 精密度/% RSD 1 1∶1 95.8 6.3 2 2∶1 89.8 5.9 3 4∶1 90.1 5.7 4 6∶1 93.1 6.0 5 8∶1 94.3 6.1 6 10∶1 93.7 3.8
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表 4 不同萃取溶剂体积与提取次数对回收率的影响（n=6）
Table 4. The influence of different extraction solvent volume and extraction times on recovery （n=6）
提取次数Extraction times 溶剂体积 Solvent volume 4 mL 6 mL 8 mL 10 mL 12 mL 5 mL×2 10 mL×1 1次 85.2% 84.7% 85.0% 88.0% 89.6% 92.6% 88.0% 2次 92.0% 94.3% 96.0 96.8% 94.2% 3次 87.9% 93.7 96.5 96.5% 93.4%
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表 5 4种硝基呋喃类代谢物在不同养殖鱼中的基质效应
Table 5. Matrix effects of four nitrofuran metabolites in different cultured fish
分析物Analytes 基质效应/% Matrix effect 乌鳢 Snakehead fish 鲢鱼 Silver carp 鲫鱼 Crucian carp 草鱼 Grass carp AMOZ 97.9 126.3 73.5 101.3 SEM 103.5 121.5 123.6 97.5 AHD 99.2 126.1 77.6 99.3 AOZ 106.3 130.2 129.6 112.7
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表 6 养殖鱼样品基质中硝基呋喃类代谢物的线性关系和方法检出限
Table 6. Linear relationships and detection limits of nitrofuran metabolites in the matrix of cultured fish samples
品种Varieties 分析物Analytes 线性方程Linear equation 相关系数（r）Correlation coefficient 检出限/（μg·kg−1）LOD 定量限/（μg·kg−1）LOQ 乌鳢 AMOZ y=0.715724 x + 0.0548122 0.997423 0.25 0.80 乌鳢 SEM y=0.660234 x + 0.070156 0.998871 0.25 0.80 AHD y=0.655721 x + 0.0891361 0.996414 0.25 0.80 AOZ y=0.851029 x + 0.0264705 0.996372 0.25 0.80 鲢鱼 AMOZ y=0.14741 x − 0.0440801 0.998282 0.25 0.80 SEM y=0.177392 x − 0.0182822 0.997467 0.25 0.80 AHD y=0.124583 x + 0.0116315 0.995397 0.25 0.80 AOZ y=0.169779 x − 0.0155245 0.999737 0.25 0.80 鲫鱼 AMOZ y=0.735794 x − 0.0498112 0.998424 0.25 0.80 SEM y=0.760354 x + 0.060856 0.995881 0.25 0.80 AHD y=0.605711 x + 0.0881371 0.995412 0.25 0.80 AOZ y=0.801019 x + 0.00674701 0.997370 0.25 0.80 草鱼 AMOZ y=0.14741 x − 0.0440801 0.998282 0.25 0.80 SEM y=0.177392 x − 0.0182822 0.997467 0.25 0.80 AHD y=0.124583 x + 0.0116315 0.995397 0.25 0.80 AOZ y=0.169779 x − 0.0155245 0.999737 0.25 0.80
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表 7 硝基呋喃代谢物在不同养殖鱼肉中的加标回收率与精密度（n = 6）
Table 7. Recovery and precision of nitrofuran metabolites in different cultured fish （n = 6）
分析物Analytes 品种Varieties 1.0 μg·kg−1 2.0 μg·kg−1 10.0 μg·kg−1 回收率/%Recovery 精密度/%RSD 回收率/%Recovery 精密度/%RSD 回收率/%Recovery 精密度/%RSD AMOZ 乌鳢 98.6 3.6 99.4 5.6 99.3 3.3 鲢鱼 99.1 4.2 98.4 6.1 99.6 4.1 鲫鱼 98.1 4.4 98.1 5.9 99.0 3.9 草鱼 102.4 3.9 99.4 7.1 97.8 4.4 SEM 乌鳢 98.5 7.1 97.9 6.0 98.3 6.3 鲢鱼 97.9 9.1 97.7 5.4 97.9 7.1 鲫鱼 97.7 8.3 99.2 6.0 100.6 6.3 草鱼 99.3 7.7 105.6 7.2 99.0 5.4 AHD 乌鳢 97.6 6.1 101.4 7.4 98.7 3.8 鲢鱼 97.9 4.3 99.0 8.2 99.4 4.5 鲫鱼 100.3 7.3 102.1 9.6 98.2 5.1 草鱼 107.8 6.3 99.7 8.1 99.6 5.5 AOZ 乌鳢 99.2 8.1 105.2 7.4 99.3 6.0 鲢鱼 98.1 8.5 99.8 7.9 98.6 6.3 鲫鱼 101.2 7.9 104.1 9.5 100.4 5.7 草鱼 99.3 8.0 100.9 8.2 107.7 5.2
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表 8 质控测试样品验证结果（n=2）
Table 8. Quality control test sample validation results
样品标号Sample label 分析物Analytes 检测结果/（μg·kg−1） Detection results GB/T 20752—2006 本方法 质控样# AOZ 5.70 5.80 质控样# AMOZ 5.40 5.55
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