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传统生物脱氮的硝化过程可分为两个阶段，第一阶段：氨氧化菌（AOB）将氨氮（NH4+-N）氧化为亚硝酸盐（NO2--N）；第二阶段：亚硝酸盐氧化菌（NOB）将亚硝酸盐氧化为硝酸盐（NO3- -N）。因此，硝化反应是由两类微生物独立完成的生化反应过程。
废水中的氨氮因pH值的不同有分子态和离子态两种存在形式。游离氨（FA）是氨氮的分子态形式，通常存在于城市污水和工业废水中。游离氨（FA）浓度可通过Anthonisen 等[1]提出的公式计算得出：
由公式可以看出，FA浓度是氨氮浓度、温度T和pH值三者的函数，并且与三者呈正相关。高氨氮废水的特征是氨氮浓度高，同时还具有较高的pH值，这导致废水中产生较高浓度的FA。高浓度的FA对AOB和NOB的活性具有一定的抑制作用[2-3]，降低了生物脱氮硝化过程的生化反应速率，导致系统运行费用增加。几十年来，众多学者针对FA抑制硝化菌的活性方面开展了大量研究[4-11]，大多集中于FA选择性抑制 AOB和NOB活性实现短程硝化。此外，FA对AOB和NOB的分解代谢和合成代谢过程均具有一定程度的抑制作用，这揭示了FA抑制其代谢能力的机制[12-14]。
微生物组成是影响生物脱氮效能的关键因素[15]。高通量测序技术是第二代测序技术[16]，借助这项技术，许多研究人员研究了生物脱氮硝化过程中FA对细菌种群结构的影响[17-19]。这些研究清楚地表明，随着FA浓度的增加，微生物多样性和硝化细菌丰度均会降低。此外，FA对AOB和NOB活性的抑制阈值的差异[20-22]，很可能是由于细菌种群结构的不同引起的。然而，在众多文献中，用于分析微生物群落的活性污泥大多源于FA浓度有差异的生物反应器和污水处理厂，对于在精确/受控条件下驯化的微生物群落的研究较少。为了补充这一研究内容，本试验应用16S r RNA 基因-Illumina MiSeq 高通量测序技术，研究了4种FA浓度（0.5、5、10、15 mg·L−1）条件下长期驯化的活性污泥细菌种群结构的差异以期揭示FA影响生物脱氮硝化过程的生物学机制，为生物脱氮技术的应用提供微生物理论支撑。
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试验用水采用人工模拟废水，主要成分包括：氯化铵（115 mg·L−1），乙酸钠（385 mg·L−1），磷酸二氢钾（26 mg·L−1）和微量元素浓缩液。接种污泥取自兰州市安宁污水处理厂A2/O工艺好氧段。试验装置为包括SBR反应器（有效容积为4 L）、水浴加热系统及自动控制系统在内（以溶解氧DO、pH值和氧化还原电位ORP为控制参数）的3部分。
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试验通过控制NH4+ -N浓度，温度和PH值使进水FA浓度分别达到0.5、5、10、15 mg·L−1，对应4个编号为R0.5、R5、R10和R15的SBR反应器。各反应器的溶解氧置于相同水平。具体运行参数见表1。当SBR系统运行稳定时，分别从每个反应器中取3个活性污泥平行样品，共有12个样品。提取所有样品的微生物DNA并进行高通量测序。
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采用Water DNA Isolation Kit试剂盒提取12个样品中的微生物DNA，将其作为PCR模板， 对16S rRNA 通用引物进行V4 区扩增，在4 ℃下保存。委托上海派森诺生物科技有限公司进行高通量测序。
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Mothur软件用以计算菌群的Chao1、ACE、Shannon、Simpson多样性指数，RStudio用以获得UniFrac距离矩阵，QIIME2软件用以对样品菌群数据进行流程化分析并生成各分类水平的OTU丰度表。通过Galaxy平台进行LEfSe分析。
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表2展示了4组样品的α多样性指数。Chao1指数[23]和ACE指数[24]用以评估样本菌群的丰富度，Shannon指数[25]和Simpson指数[26]用以评估样本菌群的均匀度。表2显示4个多样性指数在R0.5中均为最高，而在R15均为最低。这表明R0.5具有最高的微生物多样性，而R15的微生物多样性最低。此外，4组活性污泥样品中序列数和OTU数也基本呈现随FA浓度的增加而逐渐降低的趋势，反映出微生物多样性在R0.5中最高，在R15中最低的特点。
图1为4组活性污泥样品的Chao1和Shannon指数稀疏曲线。随着测序量的深入，Chao1指数稀疏曲线趋于平缓，但还没有饱和。Shannon指数稀疏曲线在后半段非常平缓，说明测序量已足够反映微生物的多样性特征。
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基于UniFrac距离的非度量多维尺度分析（NMDS）方法用以评估样品微生物β多样性的差异。Unifrac距离分为Unweighted和Weighted两种。Unweighted UniFrac只考虑物种在样品中存在与否 [27]；Weighted UniFrac不仅考虑物种的存在与否，还考虑其丰度[28]。
图2为两种基于UniFrac距离的NMDS二维排序图。两两样品之间的距离远近代表样品间菌群结构的相似程度。4组样品组间距离较大，说明不同FA浓度条件下菌群结构差异较大。图2（a）和图2（b）中，R0.5和R5样品的距离较近，说明R0.5和R5的物种组成及丰度较为相似。
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在门水平上，4组活性污泥样品中共鉴定出32个菌门，其中相对丰度大于0.5%的优势菌门共有9种（表3）。
图3为门水平下的细菌种群结构及分布。可以看出，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、Parcubacteria、浮霉菌门（Planctomycetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、Ignavibacteriae、绿菌门（Chlorobi）和Omnitrophica的相对丰度较高，约占总菌门的95.20%—99.62%。这项研究中观察到的细菌种群结构与Cao等[29]的相似, 他利用SBR处理白葡萄酒生产废水。主要区别在于，变形菌门（54.50％）和拟杆菌门（25.95％）的平均相对丰度略低。
FA能够显著影响微生物在门水平上的种群结构和丰度。变形菌门是活性污泥样品中最优势菌门，相对丰度为45.90%—70.46%。众多研究表明，在城市污水处理厂的活性污泥系统中，变形菌门的相对丰度约占27.5%—65%[30]，这与本研究获得的结果几乎一致。4 组活性污泥样品中变形菌门的相对丰度均为最高。该菌门在R15（70.46%）的相对丰度最高，在R0.5（45.90%）最低。拟杆菌门的相对丰度在R10（41.25%）最高，在R15（11.84%）最低。此外，一些菌门的相对丰度随着FA浓度的变化表现出独特的变化趋势，如Parcubacteria和Omnitrophica仅在R5中以较高的相对丰度（13.35%和3.37%）存在，而在其它3组活性污泥样品中的相对丰度均低于0.1%。浮霉菌门和绿菌门在R0.5（6.80%和1.24%）和R15（3.96%和2.28%）中具有较高的相对丰度，在R5（1.35%和0.40%）和R10（0.49%和0.03%）的相对丰度较低。Ignavibacteriae在R0.5（1.24%）和R5（2.54%）中均具有较高的相对丰度，在R10（0.38%）和R15（0.89%）的相对丰度较低。需要指出的是，参与硝化反应的主要门类硝化螺旋菌门在R15（0.96%）的相对丰度最低。因此，过高的FA浓度不利于其增殖。
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在属水平上，4组活性污泥样品中共得到406个菌属。其中陶厄氏菌属（Thauera，31.97%）、腐螺旋菌属（Saprospiraceae，8.78%）、噬纤维菌属（Cytophagaceae，8.38%）、赖文氏菌属（Lewinella，4.86%）和动胶菌属（Zoogloea，4.60%）等相对丰度大于1.0%的菌属共有14种，构成了属水平上的优势菌群（表4）。
图4为4组样品中丰度前50的属的分层聚类热图，展示了菌属的丰度分布趋势以进一步比较样品间的物种组成差异。基于列聚类（组间和组内）分析，相同FA浓度下平行样品之间的相关性最强，微生物的群落结构组成更相似。列聚类分析表明不同FA浓度下各自形成了特有的菌群。基于行聚类分析，50种菌属可划分为两大分支，进一步划分为4个显著的微生物区域，分别对应4个FA浓度，其中R0.5对应Longilinea—Zoogloea，R5对应SM1A02—Acidovorax，R10对应Lewinella—Nitrospira，R15对应Comamonas—Thauera。
亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）分别进行氨氮氧化和亚硝酸盐氧化过程[31-33]，它们在R10中的丰度最高。需要指出的是，动胶菌属（Zoogloea）和陶厄氏菌属（Thauera）共存于4个SBR系统中，且它们的丰度均较高。此外，这两类菌属的相对丰度与FA浓度之间呈现显著的线性关系。首先，对于动胶菌属，它是污水生物处理中重要的化能异养型兼性好氧菌，对有机物和氮均有一定去除能力，并且是形成菌胶团的主导功能菌属[34-35]。随着FA浓度的增加，动胶菌属的相对丰度逐渐降低，两者呈显著的负相关（y=13.31-3.5x, R2=0.806; Pearson’s ρ=-0.933）。因此，FA浓度增加显著降低了动胶菌属的相对丰度。
对于陶厄氏菌属，它是属于变形菌门的一类革兰氏阴性菌，具有高效的反硝化作用，是污水生物处理中重要的反硝化菌。此外，它还具有降解芳香族化合物的功能[36]。陶厄氏菌属利用污水中的有机物进行新陈代谢活动，在缺氧条件下利用硝态氮作为电子受体进行反硝化，使自身得到增殖[37]。与动胶菌属变化趋势相反，陶厄氏菌属的相对丰度与FA浓度呈显著的正相关（y=-8.72+16.2x, R2=0.97, Pearson’s ρ=0.986）。也就是说，FA对陶厄氏菌属的相对丰度具有显著的促进作用。本研究中，4组样品中陶厄氏菌属的相对丰度（5.05％%—56.29％）远高于Srinandan等 [38]和Du等 [39]的结果。这可能是环境条件和进水质量的差异所致。Cao等的研究中，在FA浓度分别为2.9、5.6、11.1、 19.5 mg·L−1的条件下，陶厄氏菌属（相对丰度< 0.1）并不是优势菌属。这可能是因为其研究中的C / N（4个反应器中的C / N分别为16.5、8.3、4.1和2.4）高于本研究（4个反应器中的C / N为2、0.9、0.6和1.5）。此外，从陶厄氏菌属的生化反应过程来看，在R0.5和R5中，系统硝化结束时硝态氮为主要产物（50 mg·L−1），而在R10和R15中，硝化结束时亚硝态氮为主要产物（30 mg·L−1）。结合陶厄氏菌属相对丰度的变化规律，推断其在还原硝态氮和亚硝态氮的过程中，其更倾向于利用亚硝态氮作为电子受体。
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LEfSe（LDA Effect Size）分析方法用以发现4组样品组间在丰度上有显著差异的物种，即微生物标记物。LEfSe分析设定LDA阈值为4.3，P值小于0.05（图5b）。结果表明，共得到24个具有显著差异的微生物标记物（α= 0.01）。R0.5的微生物标记物共有11个，包括鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）、鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae）、动胶菌属（Zoogloea）等；R5的微生物标记物共有3个，包括Parcubacteria、伯克氏菌目（Burkholderiales）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）；R10的微生物标记物共有5个，包括噬纤维菌目（Cytophagales）、噬纤维菌属（Cytophagia）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、噬纤维菌科（Cytophagaceae）、赖文氏菌属（Lewinella）；R15的微生物标记物共有5个，包括陶厄氏菌属（Thauera）、红环菌科（Rhodocyclaceae）、红环菌目（Rhodocyclales）、变形菌门（Proteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）。相对丰度最高的微生物标记物分别是R0.5中的鞘脂杆菌纲（28.37％），R5中的Parcubacteria（13.35％），R10中的噬纤维菌目（31.42％）和R15中的陶厄氏菌属（56.29％）。而这4种微生物标志物各自在其他样品中并不显著。从定量的角度来看，4种FA浓度都有利于各自特定的微生物标记物的培养。这表明FA对生物脱氮硝化过程的菌群结构有深刻影响。
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（1）基于微生物多样性指数，R0.5系统的细菌种群的丰富度和均匀度最高，而R15的细菌种群的丰富度和均匀度最低。FA对系统微生物多样性有显著影响。
（2）在4种FA浓度条件下，细菌种群在门水平上差异显著。最优势菌门变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度与FA浓度呈正相关，硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度与FA浓度呈负相关。拟杆菌门（Bacteroidetes）等其他优势菌门的相对丰度也受FA浓度显著影响。
（3）在4种FA浓度条件下，属水平上形成了不同的优势菌群。亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）的丰度在R10中丰度明显高于其它3个系统。动胶菌属（Zoogloea）和陶厄氏菌属（Thauera）是两类优势菌属，它们分别与FA浓度呈现显著的负相关和正相关。
（4）LEfSe分析共获得24种具有显著差异的微生物标记物。其中，R0.5中的微生物标记物最多（11个），而R5中的微生物标记物最少（3个）。不同FA浓度条件下，4组样品的关键微生物标记物分别是R0.5中的鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia），R5中的Parcubacteria，R10中的噬纤维菌目（Cytophagales）和R15中的陶厄氏菌属（Thauera）。
游离氨对生物脱氮硝化过程细菌种群结构的影响
Effect of free ammonia on microbial community structure in biological nitrification process
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摘要: 为揭示游离氨（FA）对硝化过程影响的生物学机制，本试验以人工模拟废水为研究对象，采用4组平行的SBR反应器（R0.5、R5、R10和R15），基于16S rRNA基因-IlluminaMiSeq高通量测序技术，考察了4种FA浓度（0.5、5、10、15 mg·L−1）对SBR反应器中的细菌种群结构的影响。结果表明，FA会显著影响系统内的微生物多样性和菌群结构。R0.5的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数均为最大，其具有最高的微生物多样性，而R15的微生物多样性最低。在微生物门水平上，最优势菌门变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度与FA浓度呈正相关，硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度在R15中最低。在微生物属水平上，亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）的相对丰度在R10中显著较高，动胶菌属（Zoogloea）和陶厄氏菌属（Thauera）的相对丰度与FA浓度呈显著的线性相关。基于LEfSe分析共获得了24种具有显著差异的微生物，从而得到了4种FA浓度条件下的关键微生物标记物。本研究加深了对生物脱氮硝化过程菌群结构的认识，为深入研究生物脱氮硝化的抑制机理提供了借鉴。
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关键词:
- 游离氨 /
- Illumina MiSeq高通量测序 /
- 硝化过程 /
- 微生物多样性 /
- LEfSe组间差异
Abstract: Based on 16S rRNA genes-Illumina MiSeq high-throughput sequencing, this study is to investigate the community and structure of characteristic microbial communities related to nitrification under four FA concentrations (0.5, 5, 10, 15 mg·L−1) settled in four parallel laboratory-scale sequencing batch reactors (SBRs, denoted as R0.5, R5, R10, R15) to reveal the biological mechanism of how does FA influence the nitrification. Results indicated that FA concentration significantly affects the microbial diversity and community structure in the system. The largest α-diversity values of Chao1, ACE, Shannon and Simpson were achieved in R0.5, which represents with highest diversity of bacterial community, while the lowest was achieved in R15. At the the phylum level, the relative abundance of Proteobacteria which is the predominant phylum, increased with the increasing of FA concentration. The relative abundance of Nitrospira in the nitrification process was the lowest in R15. At the genus level, the relative abundance of Nitrosomonas and Nitrospira was significantly higher in R10. The relative abundance of Zoogloea and Thauera showed a significant linear correlation with FA concentration. A total of 25 groups of microorganisms with significant differences were obtained based on LEfSe analysis, thereby key biomarkers of the microflora were obtained at the microbiological classification level under four FA concentrations. This study has deepened the understanding of the microbial community structure in the biological nitrification process, and provided a reference for in-depth study of the inhibition mechanism of biological nitrification process. -
磷是地球生态构成的关键基础元素，过量输入时会导致水体富营养化等问题[1]。已有研究表明，人类活动与磷污染密切相关，其中，磷化工三废处置不当是重要驱动力[2-3]。作为磷酸工业的主要副产物，磷石膏因产量大、利用率低被大量堆存处置。在缺乏规范管理的长期堆放过程中，磷石膏中的毒性成分 (可溶性F、P2O5、Cr、Pb等) 可随雨水淋滤下渗，污染库区周边土壤及水体[4-6]。目前磷石膏堆场渗漏污染问题已相当严峻，为高效修复治理污染，需要准确判断出污染程度及范围。因此选取一种便捷的方式监控堆场渗滤液污染过程，圈定污染边界以便进行针对治理是关乎磷化工产业可持续发展的重要课题。
目前常用的渗滤液污染监测方法有地下水监测井法、示踪剂法、取样分析法、电阻率法等 [7-8]。对于地下水监测井法、取样分析法，其能直观反映出场地的污染物类别及污染程度，但观测缺乏连续性，且难以确定漏点及扩散范围大小。示踪剂法仅可定性判断渗漏方位，无法对优势渗流通道边界进行识别，使用不当易造成二次污染。基于渗漏体与周围介质的电学性质差异，电阻率法可以高效、无损地获取污染场地的电阻率信息，进而推测渗漏体空间分布[9-10]。目前已有学者开展了相关方面的研究，如BALBARINI等[11]在制药废渣填埋场开展了高密度电法 (Electrical Resistivity Tomography, ERT) 监测实验，并通过取样分析对比得出，在化学采样点不足的情况下，ERT结果相对更精准。CATERINA等[12]对地下柴油泄露修复场地进行3年的ERT监测实验，得出该方法更适用于长期监测污染羽流。潘玉英等[13]借助ERT监测模型箱内原油运移及重分布过程，结果表明电阻率反演图像可以反映原油受污染后的运移情况。吕美彤等[14]对固化重金属污染土电阻率进行研究，得出电阻率值与固化土碳化时间存在较好的一致性，随着碳化过程进行，污染土的电阻率值不断增加。李培华等[15]联合图像法与ERT对二维砂箱模型中重非水相液体 (DNAPL) 污染运移过程进行监测，所拍摄实际污染区域图像与电阻率反演结果吻合，证实了电阻率法的准确性。HELENE等[16]在垃圾填埋场开展了ERT监测试验，其二维反演图像清晰反映了电阻率随渗漏时间的变化过程，且渗滤液渗透区域与低阻剖面吻合度较高。以上研究分别从污染物电性特征、物理模拟、污染场地监测等方面进行深入分析，探讨了不同种类污染物的电阻率特性及电法污染监测的应用可能，有力推动了电阻率法在污染调查领域的发展应用。
然而，现阶段针对电阻率法在磷石膏堆场渗漏监测的系统研究相对较少，特别是结合表层单点渗漏与岩溶管道多点渗漏情况的深入研究。在西南喀斯特地区，碳酸盐岩广泛分布，但成土过程缓慢导致土层较薄，渗滤液极易溶穿碳酸盐岩地层进入岩溶管道，并在快速运移过程中污染地下水，造成更大范围的污染 [17-18]。基于此，本研究拟首先在改变浓度条件下对滤液及其污染土样进行电阻率测试，讨论稀释过程的电阻率变化规律。之后，针对喀斯特地区常见的2种污染模式依次开展渗滤液表层单点渗漏、内部管道多点渗漏物理模拟监测实验，通过分析电阻率剖面及切片，总结渗滤液在不同渗漏模式下的运移特征，并对比相同实验条件下岩溶水的渗漏过程。最终，利用场地实验，拟验证电阻率法在磷石膏堆场渗漏监测的应用效果。
1. 材料与方法
1.1 实验原理
电阻率法是一种以岩土体电性差异为基础，借助仪器测量地下介质导电性获取电阻率值，通过分析电阻率变化推测地下介质异常分布的方法[19]。在场地污染调查中，传统电阻率测量主要采用点测方式，其在圈定深部污染区域时难以确定电极布设方位与异常体是否达到最佳契合，因此常需要多点位测量以圈定渗漏区域，探测效果难以保障[20-21]。为简化流程，提高工作效率，高密度电法 (ERT) 步入大众视野，相较于传统方式的四电极阵列，ERT能够同时布设几十至上百根电极，通过一次测量即可获取区域内的连续性电阻率信息，提高数据采集密度的同时减少了电极重复设置带来的误差，在渗漏监测领域优势显著[22-23]。基于此，研究中电性实验采用对称四极法完成，模拟实验及场地实验部分采用ERT完成。均匀介质条件下ERT电阻率计算方法如式 (1) [24] 所示。
ρ=KΔUI (1) 式中：ρ为电阻率，Ω·m；K为装置系数，m，与AB和MN之间的距离有关，具体计算公式见式 (2) ；△U为电极MN之间的电压，V；I为电极AB之间的电流，A。
K=2π1AM−1AN−1BM+1BN (2) 1.2 实验材料
实验用磷石膏渗滤液分别取自贵州省福泉摆纪磷石膏堆场(107°32′22″, 26°38′45″)及贵州省息烽县磷石膏堆场 (106°49′49.25″, 27°15′23.09″) ，岩溶水取自贵州大学校内地下河露头。为模拟西南地区主要土层结构，实验选用红黏土作为多孔介质的代表，黏土取样地点位于贵州大学物探实验场(106°39＂, 30.11＂, 26°26＂, 38.31＂)，取土深度1~3 m，取样后过3 mm筛，按照《土工实验规程》测定土壤基本参数，结果见表1。
表 1 实验土样基本物性参数Table 1. Basic physical parameters of experimental soil samples塑性指数 液性指数 土样天然密度 土粒相对密度 土壤最大干密度 20.9 0.29 1.86 g∙cm-3 2.74 g∙cm-3 1.9 cm3 | Show Table
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1.3 实验装置
磷石膏渗滤液及污染土的电性实验采用多功能激电仪 (WDJD-4，重庆奔腾数控技术研究所) 完成电阻率测量，选择自制四极装置作为电阻率测试装置，装置结构如图1 (a) 所示。为模拟渗滤液在土体表层的入渗过程，设计如图1 (b) 所示的点渗漏模型，装置采用200 cm×100 cm×100 cm的透明钢化玻璃制作，内部填有50 cm厚红黏土以模拟西南地区土层结构，渗漏源位于电极阵列中心，通过加装流速控制阀的7.5 L容积水箱进行渗滤液注入。为模拟渗滤液下渗进入岩溶管道后的渗漏过程，设计图1 (c) 所示的管道渗漏模型，该实验选择室外开拓尺寸200 cm×70 cm×60 cm的坑槽方式以避免玻璃边壁效应对反演结果造成影响，选用直径3 cm、长150 cm的PVC管模拟岩溶管道，管道中部65~85 cm范围预制多排细孔用于污染物渗漏，垂直测线走向将其埋至15 cm深处，通过两端的注入管将滤液注入管道内。模拟实验采用集中式高密度电法测量系统 (WGMD-4，重庆奔腾数控技术研究所) 完成电阻率数据采集，由4列平行分布的微型电极组成测量阵列，列间距10 cm，每列共30个电极，相邻电极间距5 cm，数据采集方式选择Wenner装置。
1.4 实验过程
电性实验采用纯净水对两种滤液进行梯度稀释，首先配置以10%浓度梯度递进的10%~100%浓度区间滤液20组，分别测试其电阻率值；随后进行土样电阻率测定，将采集土样按105 ℃预设温度烘干10 h，冷却后进行颗粒级配筛分，筛选出0.2、0.5、1.0 mm 3种粒径土各100 g组成混合土样。配置完成后将不同浓度滤液样品按30%土壤含水率喷洒至干土上，搅拌均匀后压入四极装置中，共配置不同浓度土壤样品20个。样品制作完成后静置5 min，待水气混合均匀后测量其电阻率值。
物理模拟实验方面，模型装置准备完成后需首先开展一次背景值电阻率扫描作为空白对照，之后开始注入滤液，在注入10、30、60、90、120 min，停止注入后静置60、120 min各进行1次电阻率扫描。岩溶水对照实验的过程与滤液模拟实验一致。
2. 结果与讨论
2.1 磷石膏渗滤液及其污染土体电性特征分析
渗滤液浓度是引起介质电阻率差异的主控因素[25]。图2 (a) 为本研究中2个采样点所采集的渗滤液在不同稀释浓度情况下电阻率随浓度的变化关系曲线。由图可见，尽管取样地点不同，但2种渗滤液在100%初始浓度下的电阻率曲线非常接近，说明不同堆场产生的渗滤液导电组分趋同。在提高浓度过程中，2种渗滤液的电阻率值均呈指数降低，且曲线拐点都在40%浓度附近，随着滤液浓度增加，在0~40%浓度区段，滤液电阻率对浓度的反映更灵敏，高于40%时电阻率曲线逐步趋缓。
图 2 磷石膏渗滤液及其污染土体电阻率随浓度的变化曲线Figure 2. Change curve of electrical resistivity of phosphogypsum leachate and polluted soil with porosity图2 (b) 为渗滤液污染土电阻率随浓度变化的关系曲线。由图可见，随着渗滤液浓度提高，土体电阻率呈指数降低。低浓度区段电阻率降幅最大，由于离子浓度发生变化，此时滤液浓度小幅变化也可导致试样电阻率值大幅降低，当滤液浓度较高时，提高浓度对电阻率无明显影响，该现象可以借助土体双电层理论进行解释[26]。渗滤液污染土导电通路的形成是孔隙液、土颗粒共同作用的结果，土体被污染后，滤液充填土颗粒孔隙提高了孔隙液中的导电离子数量，由于离子载流导电作用导致电阻率出现降低。但由于黏土独特的双电层结构，当渗滤液浓度较低时导电阳离子会优先进入黏土表面的吸附层，增加土颗粒表面电荷数，导致黏土导电性明显提高，此阶段电阻率与浓度值之间的关联更为灵敏。伴随孔隙液浓度升高，渗滤液中导电离子浓度持续增加，进而加速导电离子扩散，此时孔隙传导占主体，导电离子进入扩散层。在此过程中，渗滤液与黏土颗粒发生理化反应，改变了土体结构及孔隙胶结状态，逐步形成孔隙大、接触面小的面-边絮状结构，增加了离子迁移阻力。因此，此阶段继续增加渗滤液浓度对土体电阻率影响较小，且渗滤液污染土电阻率会逐步趋于一个定值。
2.2 点渗漏模式下渗滤液运移过程分析
开展点渗漏模拟试验，选取靠近注入点的中心测线L2绘制二维电阻率剖面等值线图，如图3所示。0 min为注入滤液前的土壤背景值，该剖面电阻率成层性较好，底部出现的大面积高阻异常分析是由于玻璃箱边壁效应导致测量结果偏高。注入滤液10 min后，在横向距离(X)0.60~0.80 m，深度(Y)0~0.05 m处出现漏斗状低阻体，电阻率(ρs)由背景值的200 Ω·m降至40 Ω·m，且低阻体所处位置与注入点吻合，证实磷石膏渗滤液是以低阻形态赋存于多孔介质内。注入30、60 min阶段，低阻体面积出现横向拉伸，表明此时渗滤液主要进行以横向运移为主、垂向运移为辅的扩散，该现象一直维持到停止注入。分析是由于表层土壤密实、渗透性差，滤液在短时间内无法快速下渗到土壤内部，导致注入滤液沿土壤表层进行横向运移。注入90、120 min阶段，低阻体已达12 cm深度，并沿剖面横向运移25 cm。停止注入滤液，静置60 min后再次观测，可以看出低阻体仍保持漏斗形态，但面积出现变化，表现为低阻分层增多且注入点位置的低阻面积减小。随着静置时间延长，在静置120 min后，渗漏源位置仅存在极小范围低阻带，这一过程说明在停止注入后ERT也能描绘出渗滤液在土体内的再分布过程。
图 3 磷石膏渗滤液点渗漏模型电阻率剖面Figure 3. Resistivity profile of phosphogypsum leachate under point leakage situation为直观展示渗滤液在空间上的运移规律，选择0、10、60 min、停止注入60 min的电阻率监测结果绘制三维电阻率切片 (图4) 。由图4 (a) 、图4 (b) 可见，注入滤液10 min后，2条中心测线L2、L3已出现明显低阻异常，说明注入初期被污染的范围较小，仅限于注入位置周边浅表层。边界测线L1出现的轻微低阻异常分析是由于L1处填土高度略低于中心位置，滤液在重力作用下加快了向L1线的运移过程。注入60 min后 (图4 (c) ) ，2条中心测线的电阻率变化更明显，且L1、L4也出现浅部低阻异常，验证了前述点渗漏模式下滤液主要沿土层表面发生横向运移的结论。停止注入60 min后 (图4 (d) ) ，4条测线均呈现漏斗型低阻特征，说明随着深度的增加，污染区范围也在不断减小，电阻率切片清晰展现出滤液由浅入深，由中心向四周扩散的过程。
图 4 磷石膏渗滤液点渗漏模型三维电阻率切片Figure 4. 3D Resistivity slice of phosphogypsum leachate under point leakage situation由于含水体的存在同样会引起低阻异常，为对比具有相同含水率但并未受到渗滤液污染时同一剖面上电阻率的分布特征，我们将渗滤液替换为岩溶水开展了重复实验，结果如图5所示。由图可见，岩溶水在点渗漏模式下的渗漏形式与渗滤液一致，均以横向运移为主，但2者的低阻体面积及电阻率值存在显著差异，表现为相同时段内岩溶水的低阻面积更小，且电阻率更高。进一步提取注入120 min时段渗滤液及岩溶水在渗漏中心处的电阻率数据，绘制图6所示的电阻率曲线图，可以看出滤液污染区域的电阻率最低值为40 Ω·m，而注水剖面低阻区域的电阻率值高达185 Ω·m，说明在场地含水情况下电阻率反演结果仍能准确识别出渗滤液污染区域。
图 5 岩溶水点渗漏模型电阻率剖面Figure 5. Resistivity profile of karst water in point leakage experiment
图 6 岩溶水与磷石膏渗滤液在点渗漏模式下的电阻率曲线对比Figure 6. Comparison of resistivity curves of karst water and phosphogypsum leachate under point leakage situation2.3 管道渗漏模式下渗滤液运移过程分析
由于地下岩溶发育的隐蔽性、随机性，致使岩溶区污染渗漏通道的识别更为复杂[27-28]。针对岩溶区堆场渗漏引发的环境风险问题，进一步开展了管道渗漏模拟实验，结果如图7所示。由图可见，0 min时段电阻率背景值出现条带状高阻异常，这是管道引发的高阻响应。与点渗漏相比，管道渗漏在注入10 min后剖面未出现低阻反映，仅电阻率出现小幅降低。分析是由于内部土壤密实度相对表层土较低导致土壤孔隙度高，滤液扩散速度较点渗漏更快，在注入初期难以汇聚成含水率高的滤液聚集区，故无法形成明显低阻异常反映。注入30 min后，横向距离0.74 m，深度0.12 m处出现小范围低阻体，且伴随滤液注入，低阻体面积向四周迅速增大，并于注入120 min到达剖面底部。注入过程中渗滤液的扩散形式与点渗漏模型存在明显差别，剖面上表现为低阻体以四周扩散方式为主，并非沿某一方向扩展。
图 7 磷石膏渗滤液管道渗漏实验电阻率剖面Figure 7. Resistivity profile of phosphogypsum leachate under pipeline leakage situation进一步分析渗滤液管道多点渗漏模型的电阻率切片，如图8 (b) 所示，相较于点渗漏，管道渗漏在注入10 min后4条测线的电阻率值均出现不同程度的降低，这是由于滤液在渗漏过程中并非沿单点渗漏源运移，而是通过管道预制的若干细孔向四周扩散。由图8 (c) 、图8 (d) 可见，随着实验进行，4条测线展现的低阻体形态在空间分布上无显著规律，与点渗漏过程形成的漏斗状模型形成鲜明对比。分析是土体非均质性导致其内部渗透性并非完全一致，当四向扩散的渗滤液在流经某一处渗透性较好的介质时会加速渗滤液流动，并在该处产生1个细微扰动，该扰动会随渗滤液注入量增多而发育形成优先流渗漏通道，在剖面上以低阻体呈现。以上结果可以得出，管道多点渗漏模式下，渗滤液在土体内的空间分布呈现非均匀性，且ERT能够清晰、无损地捕捉到渗滤液在此过程的空间分布。
图 8 磷石膏渗滤液管道渗漏模型三维电阻率切片Figure 8. 3D Resistivity slice of phosphogypsum leachate under pipeline leakage situation针对管道渗漏模型开展岩溶水对照实验，结果如图9所示。可以看出，管道渗漏模式下的岩溶水电阻率剖面低阻变化范围较小，在低阻分布上与岩溶水点渗漏过程趋同。结合图10所示的电阻率变化曲线讨论，管道位置处的低阻体电阻率为183.60 Ω·m，而相同位置下渗滤液的电阻率为48.29 Ω·m，2者仍存在明显差异。
图 9 岩溶水管道渗漏模型电阻率剖面Figure 9. Resistivity profile of karst water under pipeline leakage situation
图 10 岩溶水与磷石膏渗滤液在管道渗漏模式下的电阻率曲线对比Figure 10. Comparison of resistivity curves of karst water and phosphogypsum leachate under pipeline leakage model2.4 堆场电阻率实测分析
为了进一步验证电阻率法在磷石膏堆场渗漏监测的应用效果，选取贵州省息烽县磷石膏堆场作为现场ERT测试对象，为直观反映堆场污染区与正常环境的电阻率差异，将测线前半段布设在堆场内，后半段布设在外界自然环境中。场地实验电极距设置为1.5 m，共布设电极60根，采用Wenner装置进行数据采集，测试完成后对数据进行反演成像，结果见图11。
图11反映了地表以下14 m深度内的土层电阻率差异，由图可见，测区电阻率分布跨度较大 (14~330 Ω·m) ，并呈现出两极分化的特点。在横向距离47~90 m和0~5 m深度处存在连续的高阻异常 (ρs≥180 Ω·m) ，这是由于该处区域位于堆场外部，且地表覆盖有碎砾石。低阻异常分布在横向距离0~27 m范围的堆场内，该区域表层被磷石膏覆盖，且未见明显干扰物。参照前述实验结果，将电阻率低于40 Ω·m的低阻异常界定为渗滤液污染区，并推测该处异常可能与磷石膏渗滤液侵入迁移有关。从深度角度分析，图中低阻区域已延伸至地下10 m处，依据低阻带深度，可以判断场地滤液污染深度约为10 m。
为确定ERT剖面上的低阻异常所对应的地下含水层实际污染情况，在监测实验结束后，对堆场内监测井及外界环境中河流、监测井等水体进行取样分析，其结果如表2所示，结合表2与图11可知，堆场低阻异常区域对应的污染物浓度更高，而外界高阻区域对应污染物浓度较低，取样分析结果与ERT结论一致。
表 2 堆场污染物浓度分析Table 2. Analysis of pollutant concentration in storage yard取样位置 堆场监测井1 堆场监测井2 堆场外充水落水洞 堆场外河流上游 总磷/ (mg∙L−1) 6.53 1.23 <0.02 <0.02 氟化物/ (mg∙L−1) 4.8 0.79 <0.1 <0.1 | Show TableDownLoad:
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综上所述，场地实验证实了在土层情况不明确的情况下，ERT仍能有效揭示渗滤液的运移路径、受污染区域的深度分布。
3. 结论
1) 不同堆场采集渗滤液的电阻率测试结果一致。随着浓度增加，滤液及土样电阻率均出现先大幅下降，后逐步放缓的特点。
2) 渗滤液污染土体在电阻率图像上表现为低阻异常，点渗漏下渗滤液以横向运移为主，表现为漏斗型运移模式。管道渗漏下渗滤液向四周扩散趋势明显，且渗漏速率更快，但低阻体的空间分布较不均匀，ERT能够捕捉渗滤液在不同渗漏模式下的运移过程。
3) 由于岩溶水与渗滤液的电阻率数值相差较大，可以通过反演电阻率剖面划分相同含水条件下的污染区与未污染区，进而识别滤液在土层内的分布情况。
4) 场地实验反演结果中低阻体范围与堆场位置对应较好，且低阻体电阻率值与模拟实验结果一致，证实电阻率法能够识别磷石膏堆场渗滤液的渗漏范围。
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图 2 基于NMDS分析的二维排序图（a）Unweighted UniFrac，（b）Weighted UniFrac
Figure 2. 2D distribution figure based on NMDS analyses
图 3 门水平上的菌群结构及分布
Figure 3. The structure and distribution of flora at the phylum level
图 5 （a）微生物群落的5级进化分支图，（b）基于LEfSe分析结果（LDA值设为4.3）的微生物标记物
Figure 5. （a）Five-level cladogram of microbial communitiesand ,（b）Biomarker based on the analyse results of LEfSe (LDA score set as 4.3)
表 1 SBR反应器运行条件
Table 1. Operating conditions of SBR reactors
FA/（mg·L−1） 初始运行参数Initial operational parameters 运行周期及各阶段反应时间/minPhase time of the SBR COD/（mg·L−1） NH4+-N /（mg·L−1） 温度/ ℃Temperature pH 周期时间One cycle 进水Filling 曝气Aeration 缺氧Anoxia 沉淀排水Setting 0.5 80 40 20±2.0 7.5±0.2 520 5 270 180 45 5 80 90 25±2.0 8.0±0.2 570 5 300 200 25 10 80 130 30±2.0 8.0±0.2 660 5 360 240 25 15 80 55 35±2.0 8.5±0.2 490 5 240 160 45
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表 2 4组活性污泥样品中微生物群落的丰富度及多样性
Table 2. Four groups in activated sludge samples the richness and diversity of microbial communities
样品Samples 有效序列数Amount of effective sequencing OTUs 微生物数量Amount of microbial groups 细菌群落的α多样性α-diversity of bacterial community 门Phylum 纲Class 目Order 科Family 属Genus 种Species Chao1 ACE Shannon Simpson R0.5 45637 2766 27 55 69 101 137 54 1915 1915 8.83 0.99 R5 40901 2521 20 48 58 79 107 47 1731 1732 7.85 0.97 R10 44160 1349 17 31 44 57 68 33 1238 1268 6.24 0.94 R15 38423 1438 20 39 59 74 79 41 1169 1179 5.68 0.86
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表 3 门水平上样品中的主要菌群
Table 3. The main flora in the samples at the phylum level
门水平微生物Taxon 总计Total 样品Samples R0.5 R5 R10 R15 变形菌门（Proteobacteria） 54.50% 45.90% 53.49% 48.17% 70.46% 拟杆菌门（Bacteroidetes） 25.95% 31.17% 19.55% 41.25% 11.84% 绿弯菌门（Chloroflexi） 4.05% 4.40% 3.85% 3.10% 4.86% Parcubacteria 3.59% 0.95% 13.35% 0.06% 0.01% 浮霉菌门（Planctomycetes） 3.15% 6.80% 1.35% 0.49% 3.96% 硝化螺旋菌门（Nitrospirae） 2.78% 6.15% 2.44% 1.57% 0.96% Ignavibacteriae 1.27% 1.24% 2.54% 0.38% 0.89% 绿菌门（Chlorobi） 0.99% 1.24% 0.40% 0.03% 2.28% Omnitrophica 0.60% 0.01% 2.37% 0.00% 0.00%
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表 4 属水平上样品中的主要菌群
Table 4. The main flora in the samples at the genus level
属水平微生物 Taxon 总计 Total 样品Samples R0.5 R5 R10 R15 陶厄氏菌属（Thauera） 31.97% 5.05% 28.76% 37.78% 56.29% 腐螺旋菌属（Saprospiraceae） 8.78% 21.45% 13.08% 0.36% 0.24% 噬纤维菌属（Cytophagaceae） 8.38% 1.46% 0.09% 31.10% 0.85% 赖文氏菌属（Lewinella） 4.86% 1.21% 1.44% 9.03% 7.76% 动胶菌属（Zoogloea） 4.60% 11.23% 5.12% 1.09% 0.94% 厌氧绳菌属（Anaerolineaceae） 3.21% 3.28% 3.16% 2.22% 4.16% 硝化螺旋菌属（Nitrospira） 2.78% 1.57% 0.96% 6.14% 2.44% 脱氯菌属（Dechloromonas） 2.40% 0.04% 9.51% 0.05% 0.00% 丛毛单胞菌属（Comamonadaceae） 1.63% 2.66% 2.32% 1.20% 0.33% OM190 1.42% 4.46% 0.88% 0.30% 0.05% 固氮弓菌属（Azoarcus） 1.30% 3.68% 0.85% 0.38% 0.30% 食酸菌属（Acidovorax） 1.27% 1.08% 3.88% 0.09% 0.03% 亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas） 1.25% 0.13% 1.09% 3.17% 0.60% 浮霉菌属（Planctomycetaceae） 1.01% 0.12% 0.11% 0.07% 3.76%
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