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樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）是我国“三北”地区营建防护林的优良树种，具有适应性强、耐寒耐旱、根系发达等特性。因其可以将土壤中的水分紧紧留住，固定沙丘的流动从而起到防风固沙作用，在辽西北章古台地区有着大面积的栽植。近年来，学者们分别从土壤水分[1]、土壤养分[2]、土壤物理性质[3-4]、土壤酶活性[5-6]等方面对樟子松人工林的合理经营进行了研究。
土壤微生物作为土壤有机及无机复合体的组成部分，在森林生态系统的物质循环和能量流动中具有明显促进作用[7]。土壤微生物易受到环境条件的影响而发生变化，能产生快速灵敏的响应[8-10]，其中土壤微生物量通常可以反映土壤肥力状况。土壤微生物量主要包括土壤微生物量碳、氮、磷、硫，与土壤有机质、全氮等养分指标存在相关性[11]。土壤微生物量碳（MBC）能够体现土壤中有机碳的活性，周转周期较短，可以较为敏捷地指示土壤环境的细微变化，可用于预测土壤有机质早期变化[12]。而土壤微生物量氮（MBN）作为土壤氮素的贮藏库，具有较强的活跃性，能够参与土壤氮素循环转化[13]。土壤呼吸强度可以反映土壤微生物的活性，土壤呼吸作用影响大气碳循环，在土壤碳源输送中扮演着重要角色[14]。通过土壤呼吸所释放的CO2既可以作为土壤植物和动物的活性指标，还可以检测土壤肥力和土壤透气性[15]。因而土壤微生物可以作为评估土壤质量及肥力变化最为敏感同时也最具潜力的指标[16-17]。
目前，国内外关于森林生态系统对土壤微生物的影响多集中于土地利用类型[18]、森林类型[19-20]和林木根系[21]方面。对于樟子松人工林，李陆平等[22]研究了幼林龄到中龄林下土壤微生物类群（细菌、真菌、放线菌）数量变化特征。林雅超等[23]研究了中龄林和成熟林下樟子松土壤微生物量动态变化规律。然而对樟子松人工林全生育周期（幼龄林到过熟林）下土壤微生物特性尚未系统开展。本文对不同林龄樟子松人工林土壤微生物量碳、氮、土壤呼吸变化规律进行研究，可为人工林经营管理提供科学基础。
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研究区位于科尔沁沙地东南缘的辽宁省阜蒙县彰武台镇樟子松试验示范林（42°43′—42°51′N，121°53′—122°22′E）。属典型的温带半干旱半湿润气候区的季风大陆性气候，年均气温为7.9 ℃，最高温度38.3 ℃，最低温度-34.4 ℃，昼夜温差大，全年四季变化明显，且雨热同期。平均风速3.8 m·s−1，最大风速30 m·s−1，年均降水量497 mm，年均蒸发量1450 mm，蒸发量大于降水量，平均无霜期156 d。该地土壤类型为风沙土，抗风、抗旱的沙生植物为优势种。
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在樟子松人工林勘查的基础上，选取地形、气候、水文、土壤质地等立地条件相对均一地段，分别选取林龄为10 a、20 a、30 a、40 a、50 a和60 a的樟子松人工林（表1）。根据国家林业行业标准中主要树种龄级与龄组划分（LY/T 2908—2017）[24]及樟子松人工林生长特性，本研究中将其龄期划分为幼龄林（10 a、20 a）、中龄林（30 a）、近熟林（40 a）、成熟林（50 a）和过熟林（60 a）。选择荒草沙地作为对照（CK），各林龄分别设置4块20 m×20 m的标准地。2018年8月，采用S形取样法，每个标准地中布设10个取样点，用土钻分别取0—20 cm、20—40 cm、40—60 cm、60—80 cm和80—100 cm 的5个深度的土样。将同一土层样品混合均匀后过0.25 mm筛，剔除杂质装入塑封袋放入冰箱待测。
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土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸浸提法测定，对土壤分别进行熏蒸处理和未熏蒸处理，利用0.5 mol·L−1 K2SO4溶液进行浸提[25]。土壤微生物量碳（MBC）和土壤微生物量氮（MBN）分别用下式计算[26]：
式中，EC、EN分别为熏蒸和未熏蒸土样之差；KEC、KEN分别为氯仿熏蒸杀死的微生物体中碳、氮被浸提出来的比例，KEC一般取0.38，KEN一般取0.45[26-27]。
土壤微生物碳、氮熵计算公式如下：
土壤养分指标按照鲍士旦编著的《土壤农化分析》[28]进行测定。其中，土壤有机碳采用重铬酸钾-稀释热法，土壤全氮采用凯式定氮法，土壤碱解氮采用碱解扩散法，土壤全磷采用浓H2SO4消煮-钼锑抗比色法，土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法。土壤呼吸强度采用室内密闭培养NaOH碱液吸收法，NaOH的浓度为0.1 mol·L−1，恒温培养24 h[29]。
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各指标测定后所获得的数据转化为风干土计算。运用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析和Duncan模型进行显著性检验（P ˂0.05）；相关性分析利用Pearson检验；聚类分析采用系统聚类法；冗余分析（Redundancy analysis, RDA）利用Canoco 5.0软件分析。
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对不同林龄、不同土层樟子松人工林土壤微生物指标进行经典统计分析，计算各指标变异系数，划分土壤微生物指标的变异程度。MBC、MBN、土壤24 h呼吸强度的变化范围分别为246.19—82.41 、11.39—2.71 、3.22—1.19 mg·kg−1，平均值分别为165.19、5.96 、1.92 mg·kg−1。MBC/MBN、土壤微生物碳熵、土壤微生物氮熵的变化范围分别为64.90%—18.17%、2.84%—1.44%、5.92%—1.26%，平均值分别为30.31%、1.99%、2.98%。不同微生物量指标的变异程度各不相同，其变异程度大小依次为MBN>土壤微生物氮熵>MBC/MBN>土壤呼吸强度>MBC>土壤微生物碳熵，指标变异范围为15.08%—30.70%。
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不同林龄、不同土层土壤MBC、MBN、土壤呼吸强度特征如表2所示。在垂直方向上，荒草沙地（CK）与樟子松人工林林下土壤MBC、MBN含量及土壤呼吸强度均呈现表聚性。不同林龄樟子松人工林土壤MBC、MBN含量随着林龄增加总体呈现出先升高后平稳再下降的变化趋势，这与杨涛等[30]的研究结果相一致。樟子松林下土壤MBC含量显著高于荒草沙地（CK），10 a、20 a、60 a 土壤MBN含量与荒草沙地差异不显著，30—50 a MBN含量与其他林龄间具有显著性差异。在40 a时MBC含量达到最大值209.27 mg·kg−1，而MBN峰值则出现在50 a时，为8.21 mg·kg−1。上述结果表明幼龄期植物凋落物输入较低，对土壤养分的需求量较多。中龄期自疏作用会使冠层的郁闭度降低，光照增强，土壤微生物的繁殖速率有所增加[31]。土壤呼吸强度随林龄增加先增大后减小，荒草沙地土壤呼吸强度大于10 a，与20 a间无显著性差异。原因主要为土壤呼吸的强弱与微生物性质及对养分利用情况有关[32]，樟子松林下枯落物C/N较荒草沙地枯落物高，而C/N比较高的枯落物分解较慢[33]，且草本植物枯落物分解速率明显高于木质植物，因此营林初期樟子松土壤呼吸速率不高。60 a时土壤呼吸强度减弱可能是受到成熟林期樟子松冠幅较大的影响使林下土壤温度偏低，低温不利于枯落物的分解[34]，导致呼吸作用减弱。
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不同林龄、不同土层土壤MBC/MBN、土壤微生物碳、氮熵特征如表3所示。MBC/MBN总体上呈现出随着土层加深而增大的趋势。林下土壤MBC/MBN在各土层处均显著大于CK，表明在从荒草沙地到林地转变过程中，MBC/MBN显著提高。10—50 a樟子松人工林土壤MBC/MBN无显著性差异，其均值在20—40范围内，60 a时大幅上升，均值达到50.99。表明由成熟林向过熟林转变过程中，MBC/MBN再次大幅提高。在这两个转变过程中，土壤微生物群落中真菌比例大幅提高，这与牛小云等[35]、李陆平等[22]提出的真菌数量随林龄增大而增多结果一致。原因在于，其一，林地木质类枯枝落叶较荒草沙地丰富，纤维素是枯落物理化性质的代表物，分解纤维素导致真菌富集[36]，因此林地MBC/MBN高于荒草沙地；其二，过熟林樟子松病害变多，而植物的病害多为真菌病害，因此MBC/MBN提高[37]。
土壤微生物碳熵和氮熵可以反映土壤微生物量对土壤营养库的贡献程度，熵值越高，微生物所固定的养分就越多[38]。土壤微生物碳熵与氮熵都用百分号来表示，可以有效避免因对不同土壤类型有机碳含量差异而导致的问题[39]。土壤微生物碳熵、氮熵均随土壤深度的增加而不断减小，最大碳熵值出现在0—20 cm土层处，最大氮熵值则出现在20—40 cm土层处。表明表层土单位数量有机碳、氮能维持的微生物生物量高，微生物活性强。
林地土壤微生物碳、氮熵显著大于荒草沙地，原因在于林地中枯落物积累量多，能够为土壤提供更加充足的营养，使土壤微生物变得更加活跃[40]。本研究发现土壤微生物碳、氮熵均随林龄的不断增加呈现出M型曲线变化，幼龄林和过熟林熵值低。表明幼龄林和过熟林固碳固氮能力弱，成熟林土壤微生物量活性较强。土壤微生物碳熵在40 a时达到最大，与其他林龄间具有显著性差异；土壤微生物氮熵在30 a达到最大，与其他林龄间差异显著。
土壤微生物碳、氮熵受土壤类型、气候等因素影响，土壤微生物碳熵变化范围一般为0.27%—7.0%[41]。微生物碳熵较大，说明土壤微生物的活性较高，加快了有机碳的周转速率。本研究中土壤微生物碳熵在各林龄之间变化范围较小，为1.66%—2.84%；土壤微生物氮熵在各林龄之间的变化范围较大，为1.51%—5.10%，其最小值均低于且最大值均大于温带森林土壤微生物碳熵（1.8%—2.8%）与氮熵（3.4%—5.9%）[42]。结果可能是由于本研究林龄跨度大，土壤类型、管理措施以及土壤样本采集的时间有所不同，因此土壤微生物碳、氮熵范围较大。
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对不同林龄及土层的6个微生物指标进行聚类分析，结果如图1所示。从图1（a）可看出，分析结果将林龄分为4类。第一类为10 a和20 a，此时樟子松均为幼龄林期，樟子松人工林在生长初期大量吸收土壤养分，导致土壤生境的稳定性逐渐减弱；第二类中30 a处于中龄林，此时林木之间存在着对光、水以及养分等较为激烈的竞争；第三类为40 a和50 a，樟子松人工林处于稳定生长的成熟期，对土壤养分需求量基本趋于稳定，土壤微生物量有所积累；第四类为60 a，此时樟子松林已进入过熟林阶段，土壤微生物性质减弱。图1（b）是对不同土层进行聚类分析。第一类是0—20 cm，第二类是20—40 cm、40—60 cm和60—80 cm，第三类是80—100 cm。0—20 cm土层水热条件较好，更接近腐殖质层，土壤性质相近，为一类；80—100 cm属于底层土，可供土壤吸收利用的养分含量有所降低，为一类。从分类结果看出，林龄和土层对土壤微生物性质具有不同程度的影响，且该结果与前面所得结论即6个微生物指标的变化特征基本一致。
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土壤微生物指标与樟子松人工林地上与地下因素的相关性分析见表4。从微生物与养分关系角度上，总体上，微生物指标与AP均未表现出显著相关性；除土壤微生物氮熵外，其他微生物指标与TN、HN养分相关性不显著；MBC、MBC/MBN与SOC显著正相关；除MBC/MBN外，剩余微生物指标与TP极显著正相关，表明TP是影响微生物指标的主要因素。从微生物指标与樟子松生长指标关系角度，MBC与生长指标均极显著正相关；MBN与胸径、冠幅显著正相关；MBC/MBN与株高极显著正相关；土壤微生物氮熵与胸径显著正相关，表明MBC与MBN对樟子松的生长发育有显著的促进作用。
采用冗余分析（RDA）可以更好地揭示不同林龄和不同土层深度樟子松人工林土壤微生物指标与土壤养分指标之间的相关关系，结果如图2所示。第一排序轴和第二排序轴解释了土壤微生物指标与土壤养分关系总变异的98.67%，其中第一排序轴可以解释各指标与土壤养分总变异的79.22%，第二排序轴能解释微生物指标与土壤养分变异的19.45%。MBC、MBN、土壤呼吸强度总体与土壤TP、SOC呈较为显著的正相关，与AP呈负相关。从箭头的连线长度可以看出其对土壤微生物指标的影响程度，TP、SOC对不同林龄样地微生物指标的影响较大，其中TP对变异的解释度为63.3%。林龄为10 a、20 a、60 a的樟子松人工林与土壤微生物指标间的相关性不强，由此进一步反映出幼龄林与过熟林土壤养分水平不高。
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随着土层深度增加，土壤MBC、MBN及土壤呼吸强度呈现表聚性。原因在于林地浅层土壤距离腐殖质层最近，能更有效地利用水分及养分。土壤氧气含量随土壤垂直深度增加而减少，氧气含量越大，为土壤微生物提供的可降解底物越多，更能促进土壤微生物活性。深层土氧气含量较少，好氧微生物活动耗氧导致氧化还原电位下降，抑制了土壤微生物的活性，呼吸作用减弱。土壤微生物熵随着土层深度增加呈现出“先增后减”的变化规律。深层土壤MBC/MBN大于表层土壤，因MBC/MBN能反映真菌和细菌的占比状况，真菌所占比例越大，其MBC/MBN则越大。所以表层土壤真菌比例相对较小，对枯落物的分解能力相对较弱。通过相关关系表明SOC与MBC/MBN显著正相关，因此需要施入有机肥以提高表层覆盖物的降解能力。
樟子松在近熟林和成熟林期土壤微生物性质最佳，而过熟林土壤微生物各指标显著下降。由此表明近熟林和成熟林根系分泌物及凋落物有所积累，为土壤微生物新陈代谢和自身合成提供了较多的能量来源，土壤微生物量持续增加。过熟林期由于樟子松出现衰退现象，死亡率和病害率增加，土壤性质恶化，导致土壤微生物量下降。
沙地不同林龄樟子松人工林土壤微生物量特征
Characteristics of soil microbial biomass in Pinus sylvestris var. mongolica plantations with different ages in sandy land
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摘要: 为揭示不同林龄沙地樟子松人工林土壤微生物性质的变化规律，选择10、20、30、40、50、60 a生科尔沁沙地樟子松人工林为研究对象，测定分析了土壤微生物量碳（MBC）、土壤微生物量氮（MBN）、土壤呼吸强度、土壤微生物量碳氮比（MBC/MBN）、土壤微生物碳、氮熵等特征的变化。结果表明，随林龄增加，MBC和MBN均先增大后平稳再下降，二者最大值分别出现在40 a和50 a；土壤呼吸强度、土壤微生物碳、氮熵都呈现出上升-下降-上升-下降的变化趋势，且各指标均在60 a最小，表明过熟林微生物性质恶化；MBC/MBN先维持稳定，后期大幅度增大，在60 a时达到最大。随着土层深度增加，MBC、MBN及呼吸强度呈现表聚性；土壤微生物碳、氮熵呈现出先增后减的变化规律，深层MBC/MBN大于表层土壤。微生物各指标与樟子松人工林地上部分存在正相关关系，与全磷呈显著正相关关系。冗余分析表明，全磷、有机碳对不同林龄樟子松林下土壤微生物量影响显著。综上所述，樟子松近熟林和成熟林期微生物各指标达到最佳，过熟林时微生物活性差。Abstract: To reveal the changing laws of soil microbial properties of Pinus sylvestris var. mongolica plantation with different ages in sandy land, we determined and analyzed the changes of soil microbial biomass C(MBC) and N(MBN), soil respiratory intensity, soil microbial biomass C/N(MBC/MBN), soil microbial quotient and other characteristics changes in P. sylvestris var. mongolica plantations at 10, 20, 30, 40, 50, and 60 a in Horqin sandy land. The results showed that with the increase of forest age, both MBC and MBN first increased, then remained stable and finally decreased, and the maximum values of the two respectively appeared at 40 a and 50 a; The soil respiratory intensity, soil microbial carbon and nitrogen entropy all showed a change trend of increased—decreased—increased—decreased, and the minimum values of each index appeared at 60 years, indicating that the microbial properties of the over-mature stand have deteriorated; MBC/MBN remained stable at first, then increased substantially, and reached its maximum at 60 years. As the soil depth increased, MBC, MBN and respiratory intensity showed the surface aggregation; the change law of microbial quotient increased first and then decreased, and MBC/MBN of deep soil was greater than that of surface soil. Microbial indicators had a positive correlation with the above—ground part of P. sylvestris var. mongolica plantation, and had a significant positive correlation with total phosphorus. Redundancy analysis showed that TP and SOC had significant effects on soil microbial biomass at different stand ages of P. sylvestris var. mongolica. The microbial indicators reached the best in near—mature and mature stand, and its microbial activity was poor in over—mature stand.
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Key words:
- sandy land /
- Pinus sylvestris var. mongolica plantation /
- stand age /
- microbial biomass
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餐厨垃圾是指餐馆、饭店、单位食堂等的饮食剩余物，以及后厨的果蔬、肉食、油脂、面点等的加工过程废弃物。近年来，我国的餐厨垃圾产生量每年以超过10%的速度持续增长[1-2]。若不经妥善处理，餐厨垃圾会腐烂变质，进而污染土壤和水体，同时散发恶臭气体、传播疾病，危害人群健康[3]。传统的餐厨垃圾处理方式如填埋、焚烧等处理过程中可能会导致渗滤液中的高浓度有机污染物进入土壤和地下水，再加上填埋产生的甲烷、焚烧产生的二噁英等也可能进入空气，因此，传统的处理方式存在二次污染的可能[4]。利用厌氧发酵等生化方法对餐厨垃圾进行无害化和资源化利用是绿色有效的[5]。将餐厨垃圾固液分离后，固相经一定的处理可制得生物蛋白，液相经过定向生物转化、高效分离加以利用。该过程可获得的产品包括乳酸、乙醇、丁醇、己酸、氢气、沼气等。这些产物为增值化学品，具有较高的利用价值[6]。
乳酸是三大有机酸之一，已广泛应用于酿酒、医药、食品、化妆品、卷烟、制革等领域。此外，乳酸还是一种重要的生物基平台化合物，可作为生产原料制造其他化学品，如聚乳酸、丙烯酸、丙酸、2,3-戊二酮、丙酮酸、丙烯、乳酸酯(绿色环保溶剂)、乳酸盐等[7]，具有广阔的应用前景。以乳酸为主要原料聚合生成的聚乳酸，是一种新型的生物降解材料，为重要的塑料替代品。随着各国对抗塑料污染、鼓励开发生物降解塑料等政策的实施，聚乳酸市场需求快速增长，并成为乳酸的第一大应用领域。以乳酸为原料制造聚乳酸，其市场占比约为37.5%。
由于化学法生产乳酸往往产生DL-乳酸的外消旋混合物，因此，目前在工业上应用较多的是发酵法，约占乳酸生产的90%以上[8]。但微生物发酵生产乳酸存在3个主要瓶颈：一是适应复杂底物的优势乳酸工程菌的选育；二是发酵底物和营养物质的高成本；三是下游工艺(分离和纯化步骤)的复杂和高成本。
餐厨垃圾有机物含量高，含有丰富的氮、磷及微量元素，是很好的生物发酵培养基。在利用餐厨垃圾进行乳酸发酵前往往需要先经过预处理过程，以便于微生物更好地利用底物。生物发酵产乳酸的流程图如图1所示。
本文从餐厨垃圾乳酸发酵技术的高产菌株选育、与其他废物协同发酵及缓解产物抑制的原位分离耦合发酵3个方面，对国内外相关研究进行综述，并梳理餐厨垃圾乳酸发酵领域的新进展，以期为解决该领域存在的瓶颈问题、促进其产业化提供参考。
1. 乳酸发酵用微生物
1.1 细菌
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是最常见且在工业中使用最多的细菌，为革兰氏阳性菌，是无芽孢的球菌或棒状菌。LAB利用单糖或二糖来发酵产乳酸，其适宜的生长温度为5~45 ℃，pH为5.5~6.5。氨基酸、核苷酸、矿物质、维生素、脂肪、碳水化合物等均可作为其营养来源[9]。另外，LAB分布广泛，种类众多，从各种物质中分离和筛选出的野生型LAB是获得可发酵和遗传稳定菌株的最主要来源，已有多种菌株用于乳酸生产中[10]。然而，受自身和发酵环境所限制，野生乳酸菌的发酵能力也有限，因此，分离得到高产量的野生乳酸菌是LAB研究的主要内容。
乳酸发酵可分为同型发酵、异型发酵和双岐发酵3种途径，其反应式分别如式(1)~(3)所示。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3) 同型发酵是通过糖酵解途径(embden meyerhof pathway，EMP)得到乳酸，该过程产物纯度高，糖产乳酸的理论转化率为100%。然而，由于该过程存在微生物的其他生理活动，如细胞生长、蛋白质合成等，故实际转化率会低于理论转化率。一般认为，实际转化率达到80%以上者，即为同型乳酸发酵。异型发酵和双岐发酵途径的理论转化率仅为50%。
从环境中分离得到乳酸菌是相对快捷的方法。WANG等[11]利用自行分离得到能耐高温的TY50乳酸菌，可在温度为45 ℃，pH为5.5~6.0的条件下发酵餐厨垃圾产乳酸。该课题组还利用TD46乳酸菌对餐厨垃圾进行不灭菌发酵，产生的乳酸浓度比未接种乳酸菌的对照组提高了75.1%[12]。KWAN等[13]先用泡盛曲霉或米曲霉对餐厨垃圾进行水解，之后利用干酪乳杆菌(Shirota)对餐厨垃圾发酵产乳酸，乳酸产率可达0.27 g·g−1(以单位干重餐厨垃圾的乳酸产量计)。
芽孢杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧菌，也可用于生产乳酸。PLEISSNER等[14]利用食品废物和烘焙废物的混合物制乳酸，将用真菌酶水解后再进行脱脂的产物作为凝结芽孢杆菌生产乳酸的氮源，效果较好，并降低了成本。SAKAI等[15]分离出一种地衣芽孢杆菌TY7，在50 ℃下对餐厨垃圾进行不灭菌发酵，可产生40 g·L−1的L-乳酸，其光学纯度为97％，生产率为2.5 g·(L·h)−1。该课题组还利用嗜热芽孢杆菌，在55 ℃、pH为5.5的情况下发酵5 d，积累了86 g·L−1的乳酸，光学纯度为97%[16]。高温发酵环境会使该芽孢杆菌在与餐厨垃圾中土著菌群的竞争中处于优势，又由于其对pH相对敏感，故利用该芽孢杆菌发酵的关键就是控制温度的同时也要控制pH，以保证产生高质量的L-乳酸。
1.2 真菌
真菌也可用以生产乳酸。与细菌相比，部分真菌可直接利用淀粉等大分子底物，而不需先进行糖化。其中，米根霉的相关应用较多，它对营养需求相对较低，对环境的适应性很强，可利用底物很广。此外，米根霉丝状结构富含蛋白质，发酵后的残渣可作为粗蛋白原料再利用。液态发酵时，米根霉易沉降，有利于后续菌液分离。然而，菌丝体的形态和氧气供应会影响乳酸的生产率[10]。周群等[17]采用米根霉AS3.819对厨余垃圾进行不灭菌发酵，研究了pH对乳酸生产的影响。该研究发现，发酵液中还原糖浓度呈先上升后下降的趋势，pH为8时乳酸产量最大，达到60 g·L−1，60 h内乳酸的产生速率为1 g·(L·h)−1。L-乳酸为主要的异构体产物，其乳酸光学纯度可达99%。利用真菌来进行餐厨垃圾乳酸发酵的研究相对较少，所能利用的菌种也较为局限，因此，在分离、筛选高效真菌菌株方面还有很多内容可研究。以上内容提到的细菌和真菌产乳酸的研究成果汇总见表1。
表 1 以餐厨垃圾为底物利用细菌及真菌进行乳酸发酵的成果Table 1. Summary of recent studies of lactic acid fermentation with bacteria and fungi on food waste底物 菌种 预处理 发酵模式 温度/℃ pH 光学纯度 乳酸产量/(g·L−1) 产率/(g·g−1) 生产率/(g·(L·h)−1) 参考文献 餐厨垃圾 乳酸菌TY50 — 不灭菌 45 5.5~6.0 — 36.29 0.44 1.01 [11] 餐厨垃圾 乳杆菌TD46 — 不灭菌 30 5.5~6.0 — 28.85 0.39 0.60 [12] 餐厨垃圾 干酪乳杆菌Shirota 真菌水解 批式 37 6.0 — 93.2 0.93 1.55 [13] 餐厅废物+烘焙废物 凝结芽孢杆菌 真菌水解、提取脂质 — 52 — — 37 — — [14] 餐厨垃圾 地衣芽孢杆菌 TY7 加酶糖化 不灭菌 50 7.0 97% 40 — 2.5 [15] 餐厨垃圾 凝结芽孢杆菌 加酶糖化 不灭菌 55 6.5 97% 86 — 1.36 [16] 餐厨垃圾 米根霉AS3.819 — 不灭菌 34 8 99% 60 — 1 [17] | Show Table
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1.3 基因工程菌
为满足商业的要求，可利用基因工程技术改造发酵用乳酸菌株，以使其光学纯度更高、营养物质需求更少、乳酸产量和生产率更高，并达到提高其底物特异性、消除质粒及抗生素标记[10]等目的。
雷森林[18]利用基因工程的方法改造并研究了毕赤酵母对餐厨垃圾的发酵作用，分别克隆了凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因、米曲霉的淀粉酶基因、黑曲霉的糖化酶基因，然后将这3种基因同时表达在1株毕赤酵母中。利用此菌株，在不外加商业淀粉酶的情况下，最高乳酸产量是16.8 g·L−1，为理论产值的48%。常被用于改造的菌种中，有乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌、米根霉及一些藻类等[19]。将菌种本不具备的相关基因通过基因工程的手段进行表达，可减少所用相关酶的量，从而降低成本。但目前基因工程菌种对工业生产条件和环境的适应能力不强，这也限制了其大规模应用。因此，工程菌的进一步研究方向为改善微生物的代谢能力，提高工程菌的产酸效率，尽量降低副产物，增加工程菌对环境的适应性及对副产物的耐受性，从而进一步降低发酵成本。
1.4 混合菌
单一菌种会受到自身条件及发酵过程中的底物、产物的限制，因此，利用混合菌共发酵来提高底物利用率和乳酸产率也逐渐被关注。KIM等[20]利用以乳酸杆菌为主要菌种的土著混合菌对餐厨垃圾进行乳酸发酵时发现，在50 ℃时发酵效果最好，当水力停留时间为1 d时，乳酸质量浓度可达40 g·L−1。陈佳奇[21]将几种确定的菌种进行混合发酵研究，发现可利用解淀粉芽孢杆菌和德氏乳杆菌对餐厨垃圾进行底物不灭菌混合发酵，当发酵温度为45 ℃、接种间隔为1.5 h、初始发酵pH为6.5时，乳酸产率最高，可达0.351 g·g−1(以每克总固质量所产乳酸质量计)。
餐厨垃圾中含各种各样的土著菌种，如产酶菌、乳酸菌等。利用土著菌群进行发酵亦可取得较好效果。ZHANG等[22]利用餐厨垃圾中的土著菌群进行发酵，并研究了乳酸的纯度和微生物菌群。结果表明：L-乳酸是主要异构体产物，且pH在酸性或碱性条件下光学纯度比中性更高；菌群中乳酸菌和梭菌属占主要部分。WANG等[23]利用分离出的2种野生乳酸菌株TH165和TD175对餐厨垃圾进行发酵，可产生33.80 g·L−1的乳酸，比不接种的对照组高36.9%。黄林丽等[24]分别以调酸发酵和泡菜水发酵菌种作为混合菌种，在灭菌和未灭菌的情况下分别进行餐厨垃圾的发酵。结果表明，未灭菌组的乳酸含量均高于灭菌组，且金黄色葡萄球菌和沙门氏菌没被检出。TASHIRO等[25]使用海洋动物资源堆肥中的微生物群对餐厨垃圾进行分批发酵。通过设置一系列温度梯度进行发酵研究发现，在50 ℃时乳酸产量为34.5 g·L−1。
用产酶菌代替酶制剂，可大大降低原料的预处理成本[26]，特别是将糖化酶的生产、酶解糖化和乳酸发酵在同一反应器内进行。该过程可节省反应器体积，降低购酶费用和投资成本，是一个新的发展方向。例如，可利用一些糖化酶生产菌与乳酸生产菌混合培养，直接转化淀粉等碳水化合物生产乳酸，如黑曲霉(糖化酶生产菌)和米根霉(乳酸生产菌)同为好氧菌，有望能在同一反应器中混合培养产乳酸，可增加底物糖的浓度，实现同步糖化发酵，从而增加发酵效率。
虽然混合菌进行发酵效果更好，但需要考虑各菌种的最适生长条件、功能及协同性，需开发具有共生作用和协同作用的酶生产菌和乳酸生产菌。因此，选择合适的菌种搭配、进行不同菌群的发酵过程研究是当前使用混合菌发酵的重点。
2. 餐厨垃圾与其他生物质废物混合发酵
利用单一餐厨垃圾为底物时，虽然其营养丰富，但所含淀粉和葡萄糖等极易降解，碳源消耗速度较快，乳酸迅速生成积累使发酵系统易酸化而发生产物抑制进而影响乳酸产量。因此，将餐厨垃圾与木质纤维素、活性污泥等生物质废物进行混合发酵，有利于发酵底物营养元素的优势互补，并缓解餐厨垃圾易酸化的问题。
2.1 餐厨垃圾与木质纤维类废物的混合发酵
利用木质纤维素类废物发酵产乳酸需外加氮源和生长因子(如酵母膏)，而且木质纤维素本身结构复杂，不易被微生物降解，其预处理成本较高。将餐厨垃圾与木质纤维类废物混合发酵，可调节底物碳氮比，使底物营养均衡，也可延缓系统的酸化，从而促进乳酸发酵过程。
ZHENG等[27]分别将苦参药渣(含纤维素28.3%、半纤维素23.6%、木质素14.6%)与餐厨垃圾以不同混合比(以干重计)(0∶1，1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶0)混合后，接入种子培养液，再加入酶制剂，并在35 ℃、140 r·min−1的恒温摇床中进行乳酸发酵。结果表明，混合物料共发酵生成的乳酸浓度均比仅餐厨垃圾或仅苦参药渣发酵的乳酸浓度高；当苦参药渣与餐厨垃圾质量比为1∶1.5时，得到的L-乳酸浓度最高，可达48.4 g·L−1，说明物料之间具有明显协同效应。此混合比条件下的糖酸转化率为0.904 g·g−1，分别是相同质量单独原料分别产乳酸量的6倍(苦参药渣)或1.8倍(餐厨垃圾)以上。WANG等[28]同样研究了两种原料的协同作用，将碱预处理后的苦参残渣与餐厨垃圾以1∶1.5的比例混合，并进行同步糖化发酵，获得乳酸浓度可达67.5 g·L−1。同时还发现，将碱预处理液间隔24 h添加到发酵体系并调节pH，可提高乳酸产量；特别是当碱预处理液回用50%的乳酸产量时，比不回用的对照组增加了34.3%。这是由于碱预处理液的间歇式添加使得发酵体系pH更稳定，可减轻餐厨垃圾酸化；又因为碱预处理液中含有某些抑制性物质，抑制了产乙醇酵母的生长但不影响乳酸菌生长和代谢，使得更多的可发酵糖转化为乳酸。而餐厨垃圾为整个体系提供了丰富的氮源，从而降低了药渣发酵的额外氮源添加量。
汪群慧等[29]将菌糠添加到餐厨垃圾中发酵产乳酸。菌糠是栽培并采收食用菇后的剩余培养基或培养料，含有氨基酸、微量元素及水解效率高的微生物等。当10 g菌糠与50 g餐厨垃圾共发酵时，乳酸产率(以每克底物(干重)产乳酸的质量计)为0.30 g·g−1，比仅用餐厨垃圾时的产率提高了2.33倍。后续还需研究餐厨垃圾与菌糠在不同混合比条件下的共发酵系统中碳氮营养互补、多组分协同降解的机理，探究菌糠中所含高木质纤维素物料、pH调理性物料(石灰粉或石膏粉等)对缓解系统酸化的作用，以及菌糠中多种微量元素(如Zn、Se、Mn和Fe等)、生物活性物质(纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等)对餐厨垃圾-菌糠共发酵产乳酸的促进作用。菌糠中含有很多细菌和真菌，当它与餐厨垃圾共发酵时，存在与乳酸发酵菌群竞争底物的问题。同时，氧化乳酸的微生物、底物投加方式、发酵系统温度和pH调控方式等必将影响该发酵过程核心功能微生物群落的变化。如何抑制与乳酸菌竞争的菌群，从而保证产乳酸发酵菌群的优势生长，是餐厨垃圾-菌糠混合发酵系统成功构建的关键。
2.2 餐厨垃圾与活性污泥混合发酵
我国餐厨垃圾的碳氮比(C/N)一般为10~30，而活性污泥的C/N较低，约为6~16[30]。由于污泥中微生物种类多，故将二者进行混合发酵并进行组分性质互补研究。XUE等[31]以活性污泥和餐厨垃圾为混合底物，利用混合微生物菌群进行阴极电发酵产乳酸，在阴极上施加了−100 mV电压来刺激发酵过程，得到乳酸生产率为0.657 8 g·(L·h)−1，比没有外部电压的另一组提高了4.73倍。这可能是由于施加电压增加了某些微生物的生命活动或者酶活。
ZHANG等[32]研究了pH和温度对餐厨垃圾和活性污泥混合发酵过程的乳酸浓度和光学纯度变化的影响，并通过响应面(response surface methodology，RSM)分析验证多因素交互作用效果。结果表明，随着温度的升高，乳酸生产的最佳pH会降低；在发酵温度为35 ℃、初始底物(以COD计)质量浓度 25.51 g ·L−1时，最佳pH为9；若发酵温度50 ℃、初始底物(以COD计)质量浓度21.01 g·L−1时，最适pH为7。最高速率均为活性污泥和餐厨垃圾共发酵3 d后获得，且产乳酸菌的最佳生存条件与高速率生产条件相一致。
XU等[33]以餐厨垃圾和活性污泥作为底物，利用重复分批发酵方式进行乳酸发酵，乳酸产率可达(以每克有机物(单位体积底物COD)对应产生乳酸的质量计)0.72 g·g−1，乳酸生产率可达0.53 g·(L·h)−1。与分批反应器相比，重复分批反应器中关键水解酶活性得以增加。废活性污泥含有丰富的微生物群落，虽可以提高乳酸发酵过程中的水解酸化作用，但也会不可避免引入消耗乳酸及产生挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)的菌种。因此，在将餐厨垃圾和废活性污泥混合发酵中，需严格控制温度和pH，以避免产生过多的VFA及L-乳酸产量的下降。LI等[34]在餐厨垃圾发酵产乳酸时添加活性污泥，并开发了碱性发酵技术。结果表明，添加污泥及间歇性碱性发酵不仅明显改善了水解步骤，还抑制了乳酸消耗和D-乳酸的产生，L-乳酸产率以每克有机物(以单位体积底物COD对应产生乳酸的质量计)为0.52 g·g −1，光学纯度为100%。
3. 原位分离耦合乳酸发酵
在乳酸发酵过程中，乳酸不断积累会造成体系的pH下降，导致发酵液酸化并使发酵过程减慢、底物利用率低，进而影响乳酸产率及产量。因此，需要采用合适的方法边发酵边将乳酸分离出来(即原位分离乳酸发酵技术)，以降低乳酸的抑制作用，提高发酵效率。表2所示的3种原位分离乳酸发酵技术已受到较多关注和研究。
表 2 常用的原位分离技术及优缺点Table 2. Common in-situ separation techniques and their advantages and disadvantagess方法 优点 缺点 萃取分离 耗能低，选择性好、无细菌污染 萃取剂有一定毒性，其分配系数较低 吸附分离 分离效果好，吸附剂可再生循环利用 部分吸附剂选择性不高，且成本较高 膜分离 可连续进行，效果好 膜易被污染而影响过滤效果 | Show TableDownLoad:
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3.1 原位萃取发酵技术
原位乳酸萃取发酵也称为萃取分离耦合乳酸发酵，即在发酵过程中利用有机溶剂连续萃取发酵产物，以消除乳酸抑制。以液体为萃取剂时，如含有目标产物的原料也是液体，则称为液液萃取。根据萃取剂的不同，又分为溶剂萃取、双水相萃取、超临界流体萃取、液膜萃取等。萃取剂的基本要求即分配系数高，自身消耗少，对发酵体系的毒害影响小。十二烷醇、油醇、叔胺Alamine-336等是常用的萃取剂，萃取剂与细胞直接接触会产生毒害作用。常用的减轻溶剂毒性的方法有：使用膜将溶剂与细胞分开(渗透萃取)；细胞固定化；在固定化载体中包埋豆油等植物油。陈敏等[35]使用三辛胺和油醇混合溶剂，利用固定化细胞方法进行了萃取发酵，经过24 h发酵后，乳酸产量比对照组提高了60%，且可有效提取乳酸，同时对乳酸菌毒性也较小。WASEWAR等[36]研究了反应萃取在原位分离中的使用，比较了辛醇、甲基异丁酮(methylisobutylketone，MIBK)和癸醇的添加对从一种叔胺(Alamine 336)中提取乳酸的效果。结果表明，辛醇的提取效果最好，并且进行半连续操作更便捷，且不消耗额外试剂，不产生大量废物。
相较于传统有机相-水相的溶剂萃取，双水相萃取是全新的替代方法。这两相大多数情况下由水与非挥发性成分组成，可避免挥发性有机成分的使用。除此之外，该萃取方法还具备如下优势：含水量高(70%～90%)适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活；不存在有机溶剂残留问题；易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。这是其他分离技术无法比拟的。KWON等[37]探究了聚合阳离子、聚乙基亚胺(polyethylimine，PEI)和不带电聚合物(羟乙基)纤维素(hydroxyethyl cellulose，HEC)组成的双水相体系萃取乳酸发酵的潜力。在无pH控制的情况下，乳酸乳球菌在PEI/ HEC两相发酵体系中添加质量分数为20 g·L−1的葡萄糖进行分批发酵，与PEI或HEC单相发酵体系相比，乳酸产量和细胞生物膜分别提高了3~4倍，乳酸优先分布到富含PEI的底相中。
萃取剂本身的性质、对乳酸的分配系数及可能的毒性，都是制约其大规模应用于发酵生产的影响因素。为了能将萃取法更多应用于原位发酵提取中，需进一步开发高效、绿色、成本更低的萃取剂。
3.2 原位吸附发酵技术
原位乳酸吸附发酵也称吸附分离耦合乳酸发酵，即利用特定固体吸附剂(如树脂、活性炭等)在发酵过程中通过吸附分离将乳酸从发酵液中移除。BONK等[38]在餐厨垃圾发酵产乳酸的同时，采用活性炭进行原位分离：实验前将活性炭洗涤筛分；实验中直接与发酵液接触；吸附后利用丙酮来进行脱附。该项研究结果表明，即使在含有颗粒物的餐厨垃圾发酵液中，也可以用活性炭进行原位分离，并没有发生明显的孔隙堵塞导致效率下降的情况。该研究实现了更高的产率，并提高了乳酸的纯度。然而，在实际应用中，活性炭和丙酮的循环使用次数还有待进一步研究。
由于活性炭易吸附饱和，不但吸附乳酸还会吸附糖等其他物质，因此，从工业化生产的角度来对比，离子交换树脂法以选择性强、交换(吸附)容量大、操作简单、易于自动化控制等优点具有较强的竞争力。ATAEI等[39]使用Amberlite树脂(IRA-400，Cl−)在自动控制pH的条件下从发酵液中原位分离乳酸。在pH=6.1，温度为37 ℃时生产率最大，使用该原位分离系统发酵38 h后，乳酸的最大质量浓度为37.4 g·L−1，其乳酸生产率是不采用原位分离系统的5倍。GARRETT等[40]使用Amberlite™ IRA-67弱碱树脂进行乳酸提取，将乳酸质量浓度控制在20 g·L−1以内；该系统产率是常规分批补料发酵的1.3倍；对该树脂进行表征，其吸附曲线与Langmuir等温线相吻合，且发酵108 d后，树脂仍具有较好的稳定性，可有效原位分离乳酸。ZHANG等[41]利用凝结芽孢杆菌进行乳酸发酵，利用10种离子交换树脂进行原位分离，发现其中的335树脂效果最好。WANG等[42]利用树脂吸附回收乳酸，发酵液循环回发酵罐，使乳酸产量提高了23％，达到183.4 g·L−1。
吸附剂的高吸附容量有利于产物的及时分离，可明显降低产物抑制作用。开发选择性更好、吸附容量更高、成本更低、寿命更长、机械强度和化学稳定性更好的吸附剂是进一步研究的主要内容。
3.3 原位膜分离发酵技术
将膜组件与常规发酵罐集成在一起，当目标产物达到一定浓度时，及时将其从发酵体系中移除，可减少产物抑制，并使发酵过程保持较高的细胞浓度。应用较多的膜类型有：渗析(扩散排阻)、电渗析(离子排阻)、微滤和超滤(分子排阻)、纳滤等。
JEANTET等[43]研究了生物反应器中乳酸的半连续生产与纳滤膜耦合技术，纳滤膜部分是MSP006239 Prolab 系统配备Nanomax 50 Millipore (R76A) 膜，使用该技术实现的最高生产率为7.1 g·(L·h)−1，乳酸质量浓度为55 g·L−1,发酵44 d后超过99%的膜污染是可逆的，并且通过水冲洗即很容易恢复到初始渗透通量。SIKDER等[44]将纳滤分离和细胞循环发酵产乳酸相结合，发现NF3复合聚酰胺膜可保留94％的糖，乳酸的光学纯度为85.6％。WANG等[45]将中空纤维超滤膜和发酵罐耦合，进行了6批次的发酵，乳酸的产率及细胞密度持续上升，且重复分批发酵的反应稳定性较高，底物可被有效利用，是一种提高产率的有效方法。TALEGHANI等[46]制备了一种纳滤膜TFC-NF，并与另外3种商用纳滤膜进行了膜分离发酵效果比较，结果显示自制膜对目标产物的排斥因子更低。
电渗析技术也是常用的膜分离技术。BOONTAWAN等[47]研究了电渗析法提取发酵乳酸中乳酸浓度的影响，发现临界浓度为80 g·L−1，溶液中的乳酸浓度最高可达185 g·L−1。GAO等[48]使用连续电渗析发酵法(electrodialysis fermentation，EDF)来生产乳酸，进料葡萄糖浓度为175 g·L−1，发酵持续了350 h以上，乳酸最大生产率为8.18 g·(L·h)−1，转化率为71%，乳酸产量是常规EDF的19.5倍、间歇EDF的9.7倍。WANG等[49]将双极膜电渗析和发酵过程耦合进行连续发酵，乳酸回收率达到69.5%，净产量约为1.32 mol·L−1。
原位膜分离发酵中，体系内的细胞浓度比常规发酵中更高，底物利用更快，在减少产物抑制的情况下能保持一定的底物量，可明显提高乳酸产率。但是，膜生物反应器的生物膜控制及系统运行的监控是必须要考虑的因素，而且膜组件成本较高，且在运行中需要注意膜污染问题及膜组件的更换和清洗，因此，开发新型膜组件以降低成本、延长寿命、提高效率是原位膜分离发酵技术推广应用的关键。
3.4 乳酸镁结晶分离耦合乳酸发酵
在温度高于34.5 ℃时，乳酸镁的溶解度低于乳酸钙[50]。WANG等[51]用镁碱(MgO)为中和剂，利用乳酸镁在水溶液中具有较低溶解度的优势，实现了乳酸镁结晶在线移除(或原位分离)，降低了产物抑制效应，并采用HCl酸化、异戊醇萃取、浓缩萃余液得到MgCl沉淀，再进行热解得到MgO和HCl，实现了重复利用。含乳酸的萃取液用水反萃取，浓缩后得到乳酸产品，萃取液异戊醇回用。该工艺相比于钙盐分离工艺，没有任何固体或液体废物排放，可减少活性炭脱色、阴阳离子交换等工艺，且操作简单，是一种新的原位分离耦合乳酸发酵模式。
4. 餐厨垃圾乳酸发酵的新进展
4.1 开放式发酵体系中各菌群的协同调控
传统的纯物质乳酸发酵一般为原料灭菌后接入乳酸菌，再在无菌条件下进行发酵，称为非开放式发酵模式。而发酵原料不灭菌接入乳酸菌，无需严格的无菌操作即进行乳酸发酵则称为开放式发酵模式。开放式发酵的工艺简单、节能，可降低乳酸生产成本。
本课题组在前期研究中多次验证了餐厨垃圾采用不灭菌的开放式发酵是可行的，且乳酸菌在发酵过程中成为优势菌株，其乳酸产量达到、甚至超过原料灭菌的非开放式发酵[52-53]。SAKAI等[54]也发现，厨余垃圾在不灭菌的开放式乳酸发酵时，间歇调节pH到中性可有效富集产乳酸细菌群。TANAKA等[55]在开放式发酵过程中通过控制pH、抑制土著微生物生长，进而提高了脱脂麦麸产乳酸的光学纯度。邹慧等[56]将嗜淀粉乳杆菌接种到餐厨垃圾中，比较了开放式与非开放式发酵中乳酸的产量及占比。在发酵96 h后，开放式发酵体系中的乳酸产量比非开放式高54%。姜华[57]关注了开放式发酵过程中的乳酸、总糖、可溶性糖及细菌数量变化，认为餐厨垃圾适合作为乳酸发酵的底物，且相比传统非开放式发酵，开放式发酵明显提高了乳酸产量。其原因可能是：土著菌参与了大分子的水解，将其转化成小分子可溶糖，为乳酸菌提供了丰富的底物。张波等[58]通过对温度和pH的调控，提高开放式发酵系统中目标产物-乳酸的光学纯度，使餐厨垃圾在45℃条件下发酵144 h后，获得的乳酸光学纯度达到97%。
在实际乳酸发酵工程应用中常通过延迟添加碱性缓冲剂的办法，使发酵液呈酸性来抑制开放式发酵体系中的杂菌繁殖。如可在发酵开始后8 h左右分批添加碳酸钙，这样可利用发酵初期产生的少量乳酸来抑制杂菌生长。ZHAO等[59]的研究表明，底物不灭菌，仅添加乳酸菌至餐厨垃圾后放置1~3 d，即会生成高浓度的乳酸，从而使pH下降，病原菌类的金黄色葡萄球菌落和大肠杆菌落数比不加乳酸菌的对照组分别减少了99.9%和99.8%。
针对不灭菌的开放式发酵系统，可采用宏基因组、宏转录组学及荧光定量PCR等现代分子生物学手段，定性与定量解析其微生物群落的变化；需确定复杂底物乳酸发酵过程的关键功能菌群，阐明乳酸菌(尤其是L-乳酸菌)、水解酸化菌、真菌等各菌群之间的相互作用和关系(拮抗、协同和共生作用)；需通过复杂底物胞外水解酶、乳酸菌胞内分解代谢关键酶等相关酶活的测定，揭示酶活与系统运行状态之间的动态关联，阐明底物向乳酸转化的机理。
4.2 高细胞密度发酵技术
高细胞密度是一个相对概念，一般认为上限值为150~200 g·L−1，下限值为20~30 g·L−1。然而，对于一些极端微生物或自养微生物，若细胞浓度达到1 g·L−1也可算高细胞密度。广义来讲，凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值均可称为高细胞密度。采用分批补料发酵、细胞循环发酵和固定化细胞发酵等培养技术，均可提高细胞密度(即菌体生物量)，从而提高体积产率。
分批补料发酵是在微生物的分批发酵中，向反应器内补加一定量的底物，从而使培养液中的底物浓度保持在一定范围内，以满足微生物的生长需要。与批式发酵相比，相同量的底物分多次添加，可明显降低底物抑制作用，但添加底物的量、添加次数及添加频率等都是需要考虑的因素。
细胞循环发酵即将上一批次发酵的部分或全部乳酸菌细胞接种于下一批次。与普通的批次发酵或分批补料发酵相比，细胞循环发酵提高了乳酸菌的生物量，降低了设备投资和生产成本，节省了发酵罐清洁和灭菌及种子液培养的时间和成本，也便于下游分离纯化。
固定化细胞发酵是将细胞通过一定的方法约束在一定空间界限内，限制其自由移动，但保留其催化活性。固定化细胞技术可获得更高的细胞浓度，细胞可重复利用，同时在稀释率较高时也不会发生洗脱现象。此外，其单位容积的产率高，发酵液中菌体含量少，有利于产品的分离纯化。陶静等[60]探索了海藻酸钠、琼脂和明胶-戊二醛3种载体，进行固定化乳酸菌发酵实验。结果表明，使用海藻酸钠更为合理，其最佳反应条件为：海藻酸钠浓度2%，接种量15%，凝胶珠直径为2~2.5 mm，氯化钙浓度为5%。目前，固定化细胞技术在乳酸发酵中使用较少，载体也限制了生化反应所需的扩散作用，但其成本低且可操作性好的特点使固定化细胞乳酸发酵引起了业界越来越多的关注。
4.3 生物强化乳酸发酵技术
为提高乳酸产率，添加一些物质来强化生物发酵过程也是一种新思路。之前较多的研究集中在铁材料促进甲烷发酵，而对发酵过程中产生的有机酸的影响关注较少[61]。JIN等[62]探究了纳米零价铁(nanoscale zero-valent iron，NZVI)对餐厨垃圾发酵产VFA的影响，反应48 h后乙酸比例最大，占到了72%，并发现NZVI可提高多种关键酶的活性，改变微生物群落结构。此外，在发酵过程中乳酸产量与NZVI剂量呈正相关。铁材料作为微生物营养元素和高效催化剂，可促进底物水解，还可与有机酸直接反应，达到缓解底物酸化的作用(Fe0 +2H+
⇌ 添加NZVI可促进乳酸产生，而氧化还原电位的调整可能来自于NZVI的电子供应，因此，向微生物群落提供电子也会影响乳酸发酵。施加一定电压以提供电子是一个新的思路。XUE等[31]使用两级电化学系统，发酵反应室连接负电极，通电为之提供负电压，与未通电相比，乳酸的生产率和光学纯度均得到了提高，说明电流提供的电子可能促进了丙酮酸到乳酸的转化。有研究已证实，微生物电解池(microbial electrolysis cells，MEC)可有效缓解VFA带来的酸抑制作用[63]，构建阴极电化学发酵产乳酸系统，在阴极室提高还原力，可使得乳酸产量和产率明显提高。将电化学技术更多地应用到乳酸发酵系统，甚至作为预处理，亦可作为发酵方法研究的重要方向。
4.4 更高附加值产品的延伸制取
为获得更有价值的产品，将乳酸作为中间产物向其他产物转化的研究亦越来越多。ZHU等[64]进行了接种Ruminococcaceae bacterium CPB6菌将乳酸转化为正己酸的研究，在pH为6.0~6.5、温度为(30±1)℃的条件下，初始乳酸质量浓度为20 g·L−1，分批进行实验，中间补充乳酸，最终产生己酸23.41 g·L−1。己酸在食品、医药及化学工业中用途广泛，是食品添加剂、香水、抗癌药己雷琐辛等的主要原料，也可作为表面活性剂生产中的添加剂。
由于发酵液中的葡萄糖和甘露糖会抑制木糖代谢途径，因此，直接发酵葡萄糖半纤维素水解液生产木糖醇的效率较低。RIVAS等[65]采用先接种乳酸菌、转换葡萄糖和甘露糖为乳酸，然后微滤去除乳酸菌，并接种发酵微生物转化木糖为木糖醇，从而使发酵的效率得以提高。
程琪越[66]将玉米秸秆和淀粉作为底物，接种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 11454)进行同步糖化发酵，生产乳链菌肽和乳酸。若在食品中加入十万分之几到万分之几乳链菌肽，将可抑制引起食物腐败的许多革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌、链球菌、微球菌等)生长和繁殖，并生成一种高效、无毒的天然食品防腐剂。该项研究表明，在淀粉质量浓度为40 g·L−1, 糖化酶添加量为100 U·g−1、CaCO3添加量为2.5%、Tween-80添加量为1 mL的条件下，得到的产物乳链菌肽最高效价为2 516.42 IU·mL−1, 乳酸质量浓度为37 g·L−1，达到理论产率的84%。
有些乳酸菌还可产生一种新型的天然抗菌物质-苯乳酸，与乳酸菌产生的细菌素(如乳链球菌素)相比，苯乳酸是小分子物质，其抑菌谱宽、稳定性高，已成为乳酸菌抑菌能力的有效标志之一。作为一种新型生物防腐剂，苯乳酸在乳品工业中具有广阔应用前景。
此外，生物法乳酸脱水制造丙烯酸的成本约为1.1×104元·t−1。而目前丙烯酸售价已经高达1.4×104～1.8×104元·t−1。南京工业大学开发的利用微生物将乳酸脱水制丙烯酸技术的转化率已达到85%[67]。可以通过减少石化原料的消耗、减少有毒中间产物的产生，使乳酸转化成丙烯酸的成本大大降低。
近年来，用木糖渣发酵联产乳酸和聚氨基葡萄糖、生物发酵联产L-乳酸和L-赖氨酸、粗甘油生物发酵联产1,3-丙二醇和乳酸、用玉米芯发酵联产低聚木糖和乳酸等的可行性研究亦有报道，已实现了高附加值产品的生物炼制过程。此外，餐厨垃圾与其他生物质废物混合发酵联产乳酸和有机肥等的研究也获得较好的经济效益和环境效益，可最大限度地实现废物的减量化和资源化。
5. 结语
1)市场对于乳酸和聚乳酸的需求量日益增加。尽管相关研究取得了一定进展，但目前利用餐厨垃圾发酵产乳酸技术仍有一些限制因素。
2)发酵菌种是乳酸生产的主体。可从环境中分离发酵效果好的野生乳酸细菌，或利用已分离得到的效果较好的乳酸细菌作为发酵菌株。再将其接种至餐厨垃圾中，通过相关实验优化对餐厨垃圾这类复杂底物的适应性等，进而获得适宜参与餐厨垃圾发酵的相关菌种。米根霉等真菌因可直接利用淀粉及所产乳酸的高光学纯度而受到较多关注。利用基因工程技术筛选或改造出可产生高效水解酶、生命活动受pH等环境因素影响小、能适应餐厨垃圾复杂底物，并可高效利用糖类、生产更高质量、更高纯度乳酸的菌株，将是乳酸发酵领域急待突破的关键技术。
3)此外，还需开发新的发酵工艺，如将不同菌种混合进行发酵，改变单一菌种发酵的方式或者利用不同配比的底物等，可有效地改善微生物对底物的利用。尤其是利用细胞循环、固定化细胞等高细胞密度发酵技术，可缩小反应器体积，缩短生产周期，减少设备投资，并在一定程度上减少废水量，降低生产成本，提高综合生产效率。
4)各种原位分离耦合乳酸发酵技术可从发酵系统中选择性地分离乳酸，可有效减少产物抑制作用。其中，原位萃取发酵技术重点在选择对微生物无害，且萃取效果好、成本低的萃取剂。在原位吸附发酵技术中，要选择性质稳定、吸附容量大、可回收利用、寿命长的吸附剂，采用负载金属、改变孔隙结构等方法来加强其吸附能力。开发新的膜材料、优化膜分离工艺、改善膜清洗方式等，都有益于解决原位膜分离发酵技术的膜污染堵塞、膜寿命和成本问题。
5)生物炼制被认为是化学炼制的替代方式。餐厨垃圾作为生物质废物的一种，其乳酸衍生物及发酵联产高附加值产品的潜力很大，需继续深入研究，以期更好地实现餐厨垃圾的无害化与资源化利用。
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图 1 不同林龄、不同土层样地聚类分析树状图
Figure 1. Cluster analysis tree diagram of different stand ages and different soil samples
图 2 土壤微生物指标与土壤养分的RDA排序图
Figure 2. RDA sorting diagram on soil microbial indexes and soil nutrients
表 1 标准地基本情况
Table 1. Basic overview of the plots
样地 Plot Z10 Z20 Z30 Z40 Z50 Z60 林龄/a Tree age 10 20 30 40 50 60 密度/（plants·hm−2） Density 625 625 675 675 650 650 树高/m Height 3.28 7.80 9.25 11.27 11.01 13.04 胸径/cm DBH 7.50 13.31 16.69 20.92 19.61 20.59 东西平均冠幅/m Wew 2.59 3.6 4.01 4.3 4.59 4.62 南北平均冠幅/m Wsn 2.42 4.21 4.10 4.69 4.72 4.92 枯落物厚度/cm Litter depth 8.11 10.04 12.67 16.89 16.66 13.11 郁闭度 Canopy density 0.5 0.7 0.8 0.7 0.8 0.6 有机碳/（g·kg−1） SOC 5.96 5.96 8.85 8.31 10.73 11.16 全氮/（g·kg−1） TN 0.26 0.24 0.16 0.21 0.24 0.27 碱解氮/（mg·kg−1） HN 7.25 4.77 2.54 4.89 7.30 6.97 全磷/（g·kg−1） TP 0.92 1.0 1.11 1.12 1.04 1.01 有效磷/（mg·kg−1） AP 10.52 4.59 7.94 6.33 4.74 6.41 注：Z10、Z20、Z30、Z40、Z50、Z60分别为10年生、20年生、30年生、40年生、50年生和60年生樟子松人工林. Note: Z10, Z20, Z30, Z40, Z50, Z60 were respectively 10, 20, 30, 40, 50, and 60 a P. sylvestris var. mongolica plantations.
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表 2 不同林龄土壤微生物量碳、土壤微生物量氮、土壤呼吸强度特征
Table 2. Characteristics of MBC,MBN and soil respiration intensity with different stand ages
土壤微生物指标Soil microbial indexes 土层深度/cmSoil depth 林龄/aStand ages CK 10 20 30 40 50 60 土壤微生物量碳/（mg·kg−1） 0—20 60.74 Da 133.83 Ca 158.17 Ba 206.76 ABa 246.19 Aa 242.91 Aa 206.48 ABa 20—40 41.09 Db 103.09 Cb 142.30 Ba 186.63 ABb 213.49 Aab 207.70 Ab 191.31 Aab 40—60 32.43 Db 98.61 Cbc 117.25 Cb 171.33 Bb 206.68 Ab 201.60 Ab 174.25 Bb 60—80 32.51 Db 95.86 Cbc 100.65 Cb 163.76 Bb 194.37 Ab 186.05 Ac 175.83 ABb 80—100 32.60 Db 82.41 CDc 88.54 Cc 141.42 Bc 185.63 Ab 172.87 Ac 159.72 ABc 0—100 39.87 Db 102.76 Cb 121.38 Cb 173.98 Bb 209.27 Ab 202.23 ABb 181.52 ABb 土壤微生物量氮/（mg·kg−1） 0—20 4.72 Ca 4.85 Ca 6.72 ABa 11.39 Aa 10.08 Aa 10.23 Aa 5.43 Ba 20—40 4.40 Ca 4.28 Ca 5.94 BCb 9.47 Ab 7.56 Bb 9.04 Aab 4.78 Cb 40—60 2.73 Cb 3.24 Cb 4.84 Bbc 7.39 Abc 6.88 ABb 7.63 Ac 3.27 Cbc 60—80 2.27 Cb 3.78 BCb 4.41 Bc 5.29 Bc 6.48 ABb 8.22 Ab 2.71 Cc 80—100 2.68 Bb 2.71 Bc 3.27 Bc 5.26 Ac 4.85 Ac 5.95 Ac 2.72 Bc 0—100 3.36 Bab 3.77 Bb 5.04 Bb 7.76 Abc 7.17 Ab 8.21 Ab 3.78 Bbc 土壤呼吸强度/（mg·kg−1·24h−1） 0—20 2.28 Ba 1.70 Ca 2.30 Ba 3.22 Aa 1.55 Ca 3.03 Aa 1.62 Ca 20—40 2.19 ABa 1.44 Bb 2.19 ABa 2.60 Ab 1.21 Cb 2.63 Ab 1.47 Bab 40—60 1.92 ABab 1.46 Bb 1.94 ABb 2.38 Abc 1.19 Cb 2.94 Aa 1.22 Cb 60—80 1.92 Bab 1.70 Ba 2.23 Aa 2.14 ABc 1.21 Cb 2.46 Ab 1.23 Cb 80—100 1.69 Bb 1.22 Cc 1.72 Bc 2.61 Ab 1.45 BCab 2.44 Ab 1.24 Cb 0—100 2.00 Ba 1.50 Cab 2.07 Bab 2.59 Ab 1.33 Cb 2.70 Aa 1.36 Cb 注：不同大写字母表示同一土层不同林龄间差异显著，不同小写字母表示同一林龄不同土层间差异显著（下同）。 Note: Different capital letters indicate significant differences between different stand ages in the same soil layer, and different lowercase letters indicate significant differences between different soil layers of the same stand age （the same below）.
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表 3 不同林龄土壤微生物量碳氮比、土壤微生物碳熵、土壤微生物氮熵特征
Table 3. Characteristics of soil MBC/MBN, microbial C quotien and microbial N quotient with different stand ages
土壤微生物指标Soil microbial indexes 土层深度/cmSoil depth 林龄/aStand ages CK 10 20 30 40 50 60 土壤微生物量碳氮比MBC/MBN 0—20 12.86 Da 27.60 ABa 23.58 Bb 18.17 Cc 24.42 Bc 23.82 Bb 38.03 Ab 20—40 9.33 Db 24.08 Bb 23.97 Bab 19.72 Cc 28.25 Bb 22.96 Bb 40.00 Ab 40—60 11.87 Db 30.42 Ba 24.22 Ca 23.18 Cbc 30.03 Bb 26.44 BCa 53.24Aab 60—80 14.29 Da 25.35 BCb 22.82 Cb 30.93 Ba 30.00 Bb 22.65 Cb 64.90 Aa 80—100 12.17 Da 30.42 BCa 27.04 Ca 26.87 Cb 38.31 Ba 29.04 BCa 58.81 Aa 0—100 12.11 Ca 27.58 Ba 24.33 Ba 23.77 Bbc 30.20 Bb 24.98 Bb 50.99 Aab 土壤微生物碳熵/%Soil microbial C quotien 0—20 0.57 Ca 1.97 Ba 2.48 Aa 2.50 Aa 2.84 Aa 2.35 Aa 1.78 Ba 20—40 0.43 Ca 1.98 ABa 2.55 Aa 2.17 Aa 2.52 Aa 1.77 Bab 1.71 Ba 40—60 0.35 Cb 1.93 ABa 1.96 Aab 1.73 Bb 2.58 Aa 1.93 ABa 1.73 Ba 60—80 0.36 Cb 1.52 BCb 1.72 Bb 1.92 ABa 2.33 Ab 1.69 Bb 1.61 Bb 80—100 0.38 Cb 1.48 Bb 1.59 Bb 1.71 ABb 2.44 Aab 1.68 Bb 1.44 Bb 0—100 0.42 Da 1.78 BCab 2.06 Bab 2.01 BCa 2.54 Aa 1.88 BCa 1.66 Cab 土壤微生物氮熵/%Soil microbial N quotien 0—20 1.39 Cc 1.41 Cb 2.26 Ba 5.44 Aa 3.85 ABa 3.12 ABb 1.51 Cb 20—40 1.83 BCab 1.71 Ca 2.35 Ba 5.92 Aa 4.01 ABa 4.63 Aa 1.85 BCa 40—60 1.61 Cb 1.34 Db 2.31 BCa 5.65 Aa 3.76 Ba 3.92 Bb 1.60 Cb 60—80 1.62 BCb 1.86 BCa 2.13 Bab 3.89 Ab 3.52 ABa 4.50 Aa 1.26 Cc 80—100 2.23 Ba 1.38 Cb 1.80 BCb 4.60 Aab 3.06 ABb 3.38 ABb 1.34 Cc 0—100 1.74 Cb 1.54 Cb 2.17 Cab 5.10 Aa 3.64 Ba 3.91 Bb 1.51 Cb
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表 4 土壤微生物指标与环境因素的相关性（n=360）
Table 4. Correlation between soil microbial indexes and environmental factors （n=360）
指标Indexes 株高Heigh 胸径Diameter 冠幅Crown 有机碳SOC 全氮TN 碱解氮HN 全磷TP 有效磷AP 土壤微生物量碳MBC 0.748** 0.816** 0.743** 0.685** 0.215 0.253 0.604** −0.303 土壤微生物量氮MBN 0.284 0.390* 0.354* 0.314 0.129 0.134 0.543** −0.258 土壤呼吸强度Soil respiratory intensity 0.012 0.114 0.124 −0.100 0.178 0.108 0.478** −0.218 土壤微生物碳熵Soil microbial C quotien 0.103 0.201 0.141 −0.273 0.051 0.021 0.459** −0.066 土壤微生物量碳氮比MBC/MBN 0.427** 0.323 0.309 0.347* −0.009 0.050 −0.132 0.143 土壤微生物氮熵Soil microbial N quotien 0.260 0.376* 0.319 0.173 −0.508** −0.429** 0.686** −0.144 注：*表示显著相关（P ˂ 0.05），**表示极显著相关（P ˂ 0.01）. Note:*indicates significant correlation （P ˂0.05）, **indicates extremely significant correlation （P ˂0.01）.
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[1] 魏晓婷, 雷泽勇, 韩辉. 章古台沙地不同林龄樟子松人工林土壤水分研究 [J]. 干旱区资源与环境, 2016, 30(06): 115-121. WEI X T, LEI Z Y, HAN H. Soil moistures characteristics of different- aged Pinus sylvestris var. mongolica artificial forests in Zhanggutai sandy area [J]. Journal of Arid Land Resources and Environment, 2016, 30(06): 115-121(in Chinese).
[2] 张日升. 章古台沙地针叶人工林对土壤养分的影响 [J]. 防护林科技, 2016(12): 10-12. ZHANG R S. Effects of coniferous plantations in Zhanggutai sandland on soil nutrients [J]. Protection Forest Science and Technology, 2016(12): 10-12(in Chinese).
[3] 段民福, 廖超英, 孙长忠, 等. 毛乌素沙地樟子松人工林土壤物理性质的时空变异规律 [J]. 西北农业学报, 2012, 21(3): 188-192. doi: 10.3969/j.issn.1004-1389.2012.03.036 DUAN M F, LIAO C Y, SUN C Z, et al. Spatio-temporal variabilities of soil physical properties of Pinus sylvestris var. mongolica artificial forest in Mu Us desert [J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2012, 21(3): 188-192(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1004-1389.2012.03.036
[4] 牛沙沙, 周永斌, 刘丽颖, 等. 不同林龄樟子松人工林土壤理化性质 [J]. 东北林业大学学报, 2015, 43(2): 47-50,62. doi: 10.3969/j.issn.1000-5382.2015.02.011 NIU S S, ZHOU Y B, LIU L Y, et al. Soil Properties in Pinus sylvestris var. mongolica Plantation of Different Ages [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2015, 43(2): 47-50,62(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-5382.2015.02.011
[5] 赵燕娜, 廖超英, 李晓明, 等. 毛乌素沙地不同林龄樟子松人工林土壤酶活性变化特征 [J]. 西北林学院学报, 2014, 29(2): 1-5,19. doi: 10.3969/j.issn.1001-7461.2014.02.01 ZHAO Y N, LIAO C Y, LI X M, et al. Evolution of soil enzyme activities of Pinus sytvestris var. mongolica plantation at different ages in muus sandland [J]. Journal of Northwest Forestry University, 2014, 29(2): 1-5,19(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1001-7461.2014.02.01
[6] 于德良, 雷泽勇, 张岩松, 等. 沙地樟子松人工林土壤酶活性及其影响因子 [J]. 干旱区研究, 2019, 36(03): 621-629. YU D L, LEI Z Y, ZHANG Y S, et al. Soil enzyme activity and its affecting factors under Pinus sylvestris var. mongolica plantation in sandy land [J]. Arid Zone Research, 2019, 36(03): 621-629(in Chinese).
[7] LEGAY N, CLÉMENT J C, GRASSEIN F, et al. Plant growth drives soil nitrogen cycling and N-related microbial activity through changing root traits [J]. Fungal Ecology, 2020, 44: 100910. doi: 10.1016/j.funeco.2019.100910 [8] KHAN A G. Role of soil microbes in the rhizospheres of plants growing on trace metal contaminated soils in phytoremediation [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2005, 18(4): 355-364. doi: 10.1016/j.jtemb.2005.02.006 [9] 刘爽, 王传宽. 五种温带森林土壤微生物生物量碳氮的时空格局 [J]. 生态学报, 2010, 30(12): 3135-3143. LIU S, WANG C K. Spatio-temporal patterns of soil microbial biomass carbon and nitrogen in five temperate forest ecosystems [J]. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(12): 3135-3143(in Chinese).
[10] 王宝荣, 杨佳佳, 安韶山, 等. 黄土丘陵区植被与地形特征对土壤和土壤微生物生物量生态化学计量特征的影响 [J]. 应用生态学报, 2018, 29(01): 247-259. WANG B R, YANG J J, AN S S, et al. Effects of vegetation and topography features on ecological stoichiometry of soil and soil microbial biomass in the hilly-gully region of the Loess Plateau, China [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2018, 29(01): 247-259(in Chinese).
[11] 徐阳春, 沈其荣, 冉炜. 长期免耕与施用有机肥对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响 [J]. 土壤学报, 2002, 39(1): 89-96. XU Y C, SHEN Q R, RAN W. Effects of zero-tillage and application of manure on soil microbial biomass C, N, and P after sixteen years of cropping [J]. Acta Pedologica Sinica, 2002, 39(1): 89-96(in Chinese).
[12] 李陆平, 廖超英, 李晓明, 等. 毛乌素沙地樟子松人工林对土壤微生物及酶活性的影响 [J]. 西北林学院学报, 2012, 27(3): 12-16. doi: 10.3969/j.issn.1001-7461.2012.03.03 LI L P, LIAO C Y, LI X M, et al. Effects on soil microorganism and enzyme activities of artificial Pinus sylvestris var. mongolica in mu us sand land [J]. Journal of Northwest Forestry University, 2012, 27(3): 12-16(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1001-7461.2012.03.03
[13] 仇少君, 彭佩钦, 刘强, 等. 土壤微生物生物量氮及其在氮素循环中作用 [J]. 生态学杂志, 2006, 25(4): 443-448. doi: 10.3321/j.issn:1000-4890.2006.04.018 QIU S J, PENG P Q, LIU Q, et al. Soil microbial biomass nitrogen and its role in nitrogen cycling [J]. Chinese Journal of Ecology, 2006, 25(4): 443-448(in Chinese). doi: 10.3321/j.issn:1000-4890.2006.04.018
[14] 严俊霞, 秦作栋, 李洪建, 等. 黄土高原地区柠条人工林土壤呼吸 [J]. 林业科学, 2010, 46(3): 1-8. doi: 10.11707/j.1001-7488.20100301 YAN J X, QIN Z D, LI H J, et al. Soil respiration characters in a Caragana plantation in loess plateau region [J]. Scientia Silvae Sinicae, 2010, 46(3): 1-8(in Chinese). doi: 10.11707/j.1001-7488.20100301
[15] 刘恩科, 赵秉强, 李秀英, 等. 长期施肥对土壤微生物量及土壤酶活性的影响 [J]. 植物生态学报, 2008, 32(1): 176-182. doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.01.020 LIU E K, ZHAO B Q, LI X Y, et al. Biological properties and enzymatic activity of arable soils affected by long-term different fertilization systems [J]. Journal of Plant Ecology, 2008, 32(1): 176-182(in Chinese). doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.01.020
[16] BURTON J, CHEN C R, XU Z H, et al. Soil microbial biomass, activity and community composition in adjacent native and plantation forests of subtropical Australia [J]. Journal of Soils and Sediments, 2010, 10(7): 1267-1277. doi: 10.1007/s11368-010-0238-y [17] ROVIRA P, JORBA M, ROMANYÀ J. Active and passive organic matter fractions in Mediterranean forest soils [J]. Biology and Fertility of Soils, 2010, 46(4): 355-369. doi: 10.1007/s00374-009-0437-0 [18] MORENO J L, TORRES I F, GARCÍA C, et al. Land use shapes the resistance of the soil microbial community and the C cycling response to drought in a semi-arid area [J]. Science of the Total Environment, 2019, 648: 1018-1030. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.08.214 [19] BARGALI K, MANRAL V, PADALIA K, et al. Effect of vegetation type and season on microbial biomass carbon in Central Himalayan forest soils, India [J]. CATENA, 2018, 171: 125-135. doi: 10.1016/j.catena.2018.07.001 [20] 林尤伟, 金光泽. 冻融期去根处理对小兴安岭6种林型土壤微生物量的影响 [J]. 生态学报, 2016, 36(19): 6159-6169. LIN Y W, JIN G Z. Effects of root resectioning on soil microbial biomass in six forest types in the Xiaoxing'an Mountains during freezing-thawing cycles [J]. Acta Ecologica Sinica, 2016, 36(19): 6159-6169(in Chinese).
[21] 丁令智, 满秀玲, 肖瑞晗, 等. 寒温带森林根际土壤微生物量碳氮含量生长季内动态变化 [J]. 林业科学, 2019, 55(7): 178-186. doi: 10.11707/j.1001-7488.20190720 DING L Z, MAN X L, XIAO R H, et al. Dynamics of soil microbial biomass carbon and nitrogen in the soil of rhizosphere during growing season in the cold temperate forests [J]. Scientia Silvae Sinicae, 2019, 55(7): 178-186(in Chinese). doi: 10.11707/j.1001-7488.20190720
[22] 李陆平, 廖超英, 李晓明, 等. 毛乌素沙地樟子松人工林土壤微生物数量变化 [J]. 干旱地区农业研究, 2013, 31(1): 157-160. doi: 10.3969/j.issn.1000-7601.2013.01.029 LI L P, LIAO C Y, LI X M, et al. Changes of soil microorganism of artificial Pinus sylvestris var. mongolica in Mu Us sandland [J]. Agricultural Research in the Arid Areas, 2013, 31(1): 157-160(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-7601.2013.01.029
[23] 林雅超, 高广磊, 丁国栋, 等. 沙地樟子松人工林土壤理化性质与微生物生物量的动态变化 [J]. 生态学杂志, 2020, 39(5): 1445-1454. LIN Y C, GAO G L, DING G D, et al. Dynamics of soil physicochemical properties and microbial biomass in a Pinus sylvestris var. mongolica plantation [J]. Chinese Journal of Ecology, 2020, 39(5): 1445-1454(in Chinese).
[24] 国家林业局. 中华人民共和国林业行业标准: 主要树种龄级与龄组划分 LY/T 2908—2017[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017: 4. State Forestry Administration of the People's Republic of China. Forestry Standard of the People's Republic of China: Regulations for age-class and age-group division of main tree-species. LY/T 2908—2017[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017: 4(in Chinese).
[25] 胡婵娟, 刘国华, 吴雅琼. 土壤微生物生物量及多样性测定方法评述[J]. 生态环境学报, 2011, 20(Z1): 1161-1167. HU C J, LIU G H, WU Y Q. A review of soil microbial biomass and diversity measurements[J]. Ecology and Environmental Sciences, 2011, 20(Z1): 1161-1167(in Chinese).
[26] WU J, JOERGENSEN R G, POMMERENING B, et al. Measurement of soil microbial biomass C by fumigation-extraction—an automated procedure [J]. Soil Biology and Biochemistry, 1990, 22(8): 1167-1169. doi: 10.1016/0038-0717(90)90046-3 [27] VANCE E D, BROOKES P C, JENKINSON D S. An extraction method for measuring soil microbial biomass C [J]. Soil Biology and Biochemistry, 1987, 19(6): 703-707. doi: 10.1016/0038-0717(87)90052-6 [28] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 3版. 北京: 中国农业出版社, 2000: 50-51. BAO S D. Soil and Agricultural Chemistry Analysis[M]. Beijing: Chinese Agriculture Press, 2000: 50-51(in Chinese).
[29] YIM M H, JOO S J, SHUTOU K, et al. Spatial variability of soil respiration in a larch plantation: Estimation of the number of sampling points required [J]. Forest Ecology and Management, 2003, 175(1-3): 585-588. [30] 杨涛, 徐慧, 李慧, 等. 樟子松人工林土壤养分、微生物及酶活性的研究 [J]. 水土保持学报, 2005, 19(3): 50-53. doi: 10.3321/j.issn:1009-2242.2005.03.013 YANG T, XU H, LI H, et al. Soil nutrient, microorganism and enzyme activity in Pinus sylvestris Plantations [J]. Journal of Soil Water Conservation, 2005, 19(3): 50-53(in Chinese). doi: 10.3321/j.issn:1009-2242.2005.03.013
[31] 吴祥云, 姜凤岐, 李晓丹, 等. 樟子松人工固沙林衰退的规律和原因 [J]. 应用生态学报, 2004, 15(12): 2225-2228. doi: 10.3321/j.issn:1001-9332.2004.12.006 WU X Y, JIANG F Q, LI X D, et al. Decline regularity and causes of Pinus sylvestris var. mongolica plantation on sandy land [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2004, 15(12): 2225-2228(in Chinese). doi: 10.3321/j.issn:1001-9332.2004.12.006
[32] 卜涛, 张水奎, 宋新章, 等. 几个环境因子对凋落物分解的影响 [J]. 浙江农林大学学报, 2013, 30(5): 740-747. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.05.017 BU T, ZHANG S K, SONG X Z, et al. Effects of several environmental factors on litter decomposition [J]. Journal of Zhejiang A & F University, 2013, 30(5): 740-747(in Chinese). doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.05.017
[33] 郭绪虎, 肖德荣, 田昆, 等. 滇西北高原纳帕海湿地湖滨带优势植物生物量及其凋落物分解 [J]. 生态学报, 2013, 33(5): 1425-1432. doi: 10.5846/stxb201208271209 GUO X H, XIAO D R, TIAN K, et al. Biomass production and litter decomposition of lakeshore plants in Napahai wetland, Northwestern Yunnan Plateau, China [J]. Acta Ecologica Sinica, 2013, 33(5): 1425-1432(in Chinese). doi: 10.5846/stxb201208271209
[34] 关阅章, 刘安田, 仲启铖, 等. 滨海围垦湿地芦苇凋落物分解对模拟增温的响应 [J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2013(5): 27-34. GUAN Y Z, LIU A T, ZHONG Q C, et al. Responses of decomposition of Phragmites australis litter to simulated temperature enhancement in the reclamed coastal wetland [J]. Journal of East China Normal University (Natural Science), 2013(5): 27-34(in Chinese).
[35] 牛小云, 孙晓梅, 陈东升, 等. 辽东山区不同林龄日本落叶松人工林土壤微生物、养分及酶活性 [J]. 应用生态学报, 2015, 26(9): 2663-2672. NIU X Y, SUN X M, CHEN D S, et al. Soil microorganisms, nutrients and enzyme activity of Larix kaempferi plantation under different ages in mountainous region of eastern Liaoning Province, China [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2015, 26(9): 2663-2672(in Chinese).
[36] 杨曾奖, 曾杰, 徐大平, 等. 森林枯枝落叶分解及其影响因素 [J]. 生态环境, 2007, 16(2): 649-654. YANG Z J, ZENG J, XU D P, et al. The processes and dominant factors of forest litter decomposition: A review [J]. Ecology and Environment, 2007, 16(2): 649-654(in Chinese).
[37] 杨传波, 黄敬林, 李宝年, 等. 樟子松树栖真菌群落物种多样性及其与病害的关系 [J]. 东北林业大学学报, 2004, 32(5): 94-96. doi: 10.3969/j.issn.1000-5382.2004.05.034 YANG C B, HUANG J L, LI B N, et al. The relationship between the species diversity of dendrocola mycoflora on Pinus sylvestris var. mongolica and disease [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2004, 32(5): 94-96(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-5382.2004.05.034
[38] 杨成德, 龙瑞军, 陈秀蓉, 等. 东祁连山高寒草甸土壤微生物量及其与土壤物理因子相关性特征 [J]. 草业学报, 2007, 16(4): 62-68. doi: 10.3321/j.issn:1004-5759.2007.04.010 YANG C D, LONG R J, CHEN X R, et al. Study on microbial biomass and its correlation with the soil physical properties under the alpine grassland of the east of Qilian Mountains [J]. Acta Prataculturae Sinica, 2007, 16(4): 62-68(in Chinese). doi: 10.3321/j.issn:1004-5759.2007.04.010
[39] LIAO J D, BOUTTON T W. Soil microbial biomass response to woody plant invasion of grassland [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(5): 1207-1216. doi: 10.1016/j.soilbio.2007.12.018 [40] 陈婷, 郗敏, 孔范龙, 等. 枯落物分解及其影响因素 [J]. 生态学杂志, 2016, 35(7): 1927-1935. CHEN T, XI M, KONG F L, et al. A review on litter decomposition and influence factors [J]. Chinese Journal of Ecology, 2016, 35(7): 1927-1935(in Chinese).
[41] 任天志. 持续农业中的土壤生物指标研究 [J]. 中国农业科学, 2000, 33(1): 68-75. REN T Z. Soil bioindicators in sustainable agriculture [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2000, 33(1): 68-75(in Chinese).
[42] DEVI N B, YADAVA P S. Seasonal dynamics in soil microbial biomass C, N and P in a mixed-oak forest ecosystem of Manipur, North-east India [J]. Applied Soil Ecology, 2006, 31(3): 220-227. doi: 10.1016/j.apsoil.2005.05.005 -
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