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樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）是我国“三北”地区营建防护林的优良树种，具有适应性强、耐寒耐旱、根系发达等特性。因其可以将土壤中的水分紧紧留住，固定沙丘的流动从而起到防风固沙作用，在辽西北章古台地区有着大面积的栽植。近年来，学者们分别从土壤水分[1]、土壤养分[2]、土壤物理性质[3-4]、土壤酶活性[5-6]等方面对樟子松人工林的合理经营进行了研究。
土壤微生物作为土壤有机及无机复合体的组成部分，在森林生态系统的物质循环和能量流动中具有明显促进作用[7]。土壤微生物易受到环境条件的影响而发生变化，能产生快速灵敏的响应[8-10]，其中土壤微生物量通常可以反映土壤肥力状况。土壤微生物量主要包括土壤微生物量碳、氮、磷、硫，与土壤有机质、全氮等养分指标存在相关性[11]。土壤微生物量碳（MBC）能够体现土壤中有机碳的活性，周转周期较短，可以较为敏捷地指示土壤环境的细微变化，可用于预测土壤有机质早期变化[12]。而土壤微生物量氮（MBN）作为土壤氮素的贮藏库，具有较强的活跃性，能够参与土壤氮素循环转化[13]。土壤呼吸强度可以反映土壤微生物的活性，土壤呼吸作用影响大气碳循环，在土壤碳源输送中扮演着重要角色[14]。通过土壤呼吸所释放的CO2既可以作为土壤植物和动物的活性指标，还可以检测土壤肥力和土壤透气性[15]。因而土壤微生物可以作为评估土壤质量及肥力变化最为敏感同时也最具潜力的指标[16-17]。
目前，国内外关于森林生态系统对土壤微生物的影响多集中于土地利用类型[18]、森林类型[19-20]和林木根系[21]方面。对于樟子松人工林，李陆平等[22]研究了幼林龄到中龄林下土壤微生物类群（细菌、真菌、放线菌）数量变化特征。林雅超等[23]研究了中龄林和成熟林下樟子松土壤微生物量动态变化规律。然而对樟子松人工林全生育周期（幼龄林到过熟林）下土壤微生物特性尚未系统开展。本文对不同林龄樟子松人工林土壤微生物量碳、氮、土壤呼吸变化规律进行研究，可为人工林经营管理提供科学基础。
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研究区位于科尔沁沙地东南缘的辽宁省阜蒙县彰武台镇樟子松试验示范林（42°43′—42°51′N，121°53′—122°22′E）。属典型的温带半干旱半湿润气候区的季风大陆性气候，年均气温为7.9 ℃，最高温度38.3 ℃，最低温度-34.4 ℃，昼夜温差大，全年四季变化明显，且雨热同期。平均风速3.8 m·s−1，最大风速30 m·s−1，年均降水量497 mm，年均蒸发量1450 mm，蒸发量大于降水量，平均无霜期156 d。该地土壤类型为风沙土，抗风、抗旱的沙生植物为优势种。
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在樟子松人工林勘查的基础上，选取地形、气候、水文、土壤质地等立地条件相对均一地段，分别选取林龄为10 a、20 a、30 a、40 a、50 a和60 a的樟子松人工林（表1）。根据国家林业行业标准中主要树种龄级与龄组划分（LY/T 2908—2017）[24]及樟子松人工林生长特性，本研究中将其龄期划分为幼龄林（10 a、20 a）、中龄林（30 a）、近熟林（40 a）、成熟林（50 a）和过熟林（60 a）。选择荒草沙地作为对照（CK），各林龄分别设置4块20 m×20 m的标准地。2018年8月，采用S形取样法，每个标准地中布设10个取样点，用土钻分别取0—20 cm、20—40 cm、40—60 cm、60—80 cm和80—100 cm 的5个深度的土样。将同一土层样品混合均匀后过0.25 mm筛，剔除杂质装入塑封袋放入冰箱待测。
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土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸浸提法测定，对土壤分别进行熏蒸处理和未熏蒸处理，利用0.5 mol·L−1 K2SO4溶液进行浸提[25]。土壤微生物量碳（MBC）和土壤微生物量氮（MBN）分别用下式计算[26]：
式中，EC、EN分别为熏蒸和未熏蒸土样之差；KEC、KEN分别为氯仿熏蒸杀死的微生物体中碳、氮被浸提出来的比例，KEC一般取0.38，KEN一般取0.45[26-27]。
土壤微生物碳、氮熵计算公式如下：
土壤养分指标按照鲍士旦编著的《土壤农化分析》[28]进行测定。其中，土壤有机碳采用重铬酸钾-稀释热法，土壤全氮采用凯式定氮法，土壤碱解氮采用碱解扩散法，土壤全磷采用浓H2SO4消煮-钼锑抗比色法，土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法。土壤呼吸强度采用室内密闭培养NaOH碱液吸收法，NaOH的浓度为0.1 mol·L−1，恒温培养24 h[29]。
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各指标测定后所获得的数据转化为风干土计算。运用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析和Duncan模型进行显著性检验（P ˂0.05）；相关性分析利用Pearson检验；聚类分析采用系统聚类法；冗余分析（Redundancy analysis, RDA）利用Canoco 5.0软件分析。
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对不同林龄、不同土层樟子松人工林土壤微生物指标进行经典统计分析，计算各指标变异系数，划分土壤微生物指标的变异程度。MBC、MBN、土壤24 h呼吸强度的变化范围分别为246.19—82.41 、11.39—2.71 、3.22—1.19 mg·kg−1，平均值分别为165.19、5.96 、1.92 mg·kg−1。MBC/MBN、土壤微生物碳熵、土壤微生物氮熵的变化范围分别为64.90%—18.17%、2.84%—1.44%、5.92%—1.26%，平均值分别为30.31%、1.99%、2.98%。不同微生物量指标的变异程度各不相同，其变异程度大小依次为MBN>土壤微生物氮熵>MBC/MBN>土壤呼吸强度>MBC>土壤微生物碳熵，指标变异范围为15.08%—30.70%。
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不同林龄、不同土层土壤MBC、MBN、土壤呼吸强度特征如表2所示。在垂直方向上，荒草沙地（CK）与樟子松人工林林下土壤MBC、MBN含量及土壤呼吸强度均呈现表聚性。不同林龄樟子松人工林土壤MBC、MBN含量随着林龄增加总体呈现出先升高后平稳再下降的变化趋势，这与杨涛等[30]的研究结果相一致。樟子松林下土壤MBC含量显著高于荒草沙地（CK），10 a、20 a、60 a 土壤MBN含量与荒草沙地差异不显著，30—50 a MBN含量与其他林龄间具有显著性差异。在40 a时MBC含量达到最大值209.27 mg·kg−1，而MBN峰值则出现在50 a时，为8.21 mg·kg−1。上述结果表明幼龄期植物凋落物输入较低，对土壤养分的需求量较多。中龄期自疏作用会使冠层的郁闭度降低，光照增强，土壤微生物的繁殖速率有所增加[31]。土壤呼吸强度随林龄增加先增大后减小，荒草沙地土壤呼吸强度大于10 a，与20 a间无显著性差异。原因主要为土壤呼吸的强弱与微生物性质及对养分利用情况有关[32]，樟子松林下枯落物C/N较荒草沙地枯落物高，而C/N比较高的枯落物分解较慢[33]，且草本植物枯落物分解速率明显高于木质植物，因此营林初期樟子松土壤呼吸速率不高。60 a时土壤呼吸强度减弱可能是受到成熟林期樟子松冠幅较大的影响使林下土壤温度偏低，低温不利于枯落物的分解[34]，导致呼吸作用减弱。
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不同林龄、不同土层土壤MBC/MBN、土壤微生物碳、氮熵特征如表3所示。MBC/MBN总体上呈现出随着土层加深而增大的趋势。林下土壤MBC/MBN在各土层处均显著大于CK，表明在从荒草沙地到林地转变过程中，MBC/MBN显著提高。10—50 a樟子松人工林土壤MBC/MBN无显著性差异，其均值在20—40范围内，60 a时大幅上升，均值达到50.99。表明由成熟林向过熟林转变过程中，MBC/MBN再次大幅提高。在这两个转变过程中，土壤微生物群落中真菌比例大幅提高，这与牛小云等[35]、李陆平等[22]提出的真菌数量随林龄增大而增多结果一致。原因在于，其一，林地木质类枯枝落叶较荒草沙地丰富，纤维素是枯落物理化性质的代表物，分解纤维素导致真菌富集[36]，因此林地MBC/MBN高于荒草沙地；其二，过熟林樟子松病害变多，而植物的病害多为真菌病害，因此MBC/MBN提高[37]。
土壤微生物碳熵和氮熵可以反映土壤微生物量对土壤营养库的贡献程度，熵值越高，微生物所固定的养分就越多[38]。土壤微生物碳熵与氮熵都用百分号来表示，可以有效避免因对不同土壤类型有机碳含量差异而导致的问题[39]。土壤微生物碳熵、氮熵均随土壤深度的增加而不断减小，最大碳熵值出现在0—20 cm土层处，最大氮熵值则出现在20—40 cm土层处。表明表层土单位数量有机碳、氮能维持的微生物生物量高，微生物活性强。
林地土壤微生物碳、氮熵显著大于荒草沙地，原因在于林地中枯落物积累量多，能够为土壤提供更加充足的营养，使土壤微生物变得更加活跃[40]。本研究发现土壤微生物碳、氮熵均随林龄的不断增加呈现出M型曲线变化，幼龄林和过熟林熵值低。表明幼龄林和过熟林固碳固氮能力弱，成熟林土壤微生物量活性较强。土壤微生物碳熵在40 a时达到最大，与其他林龄间具有显著性差异；土壤微生物氮熵在30 a达到最大，与其他林龄间差异显著。
土壤微生物碳、氮熵受土壤类型、气候等因素影响，土壤微生物碳熵变化范围一般为0.27%—7.0%[41]。微生物碳熵较大，说明土壤微生物的活性较高，加快了有机碳的周转速率。本研究中土壤微生物碳熵在各林龄之间变化范围较小，为1.66%—2.84%；土壤微生物氮熵在各林龄之间的变化范围较大，为1.51%—5.10%，其最小值均低于且最大值均大于温带森林土壤微生物碳熵（1.8%—2.8%）与氮熵（3.4%—5.9%）[42]。结果可能是由于本研究林龄跨度大，土壤类型、管理措施以及土壤样本采集的时间有所不同，因此土壤微生物碳、氮熵范围较大。
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对不同林龄及土层的6个微生物指标进行聚类分析，结果如图1所示。从图1（a）可看出，分析结果将林龄分为4类。第一类为10 a和20 a，此时樟子松均为幼龄林期，樟子松人工林在生长初期大量吸收土壤养分，导致土壤生境的稳定性逐渐减弱；第二类中30 a处于中龄林，此时林木之间存在着对光、水以及养分等较为激烈的竞争；第三类为40 a和50 a，樟子松人工林处于稳定生长的成熟期，对土壤养分需求量基本趋于稳定，土壤微生物量有所积累；第四类为60 a，此时樟子松林已进入过熟林阶段，土壤微生物性质减弱。图1（b）是对不同土层进行聚类分析。第一类是0—20 cm，第二类是20—40 cm、40—60 cm和60—80 cm，第三类是80—100 cm。0—20 cm土层水热条件较好，更接近腐殖质层，土壤性质相近，为一类；80—100 cm属于底层土，可供土壤吸收利用的养分含量有所降低，为一类。从分类结果看出，林龄和土层对土壤微生物性质具有不同程度的影响，且该结果与前面所得结论即6个微生物指标的变化特征基本一致。
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土壤微生物指标与樟子松人工林地上与地下因素的相关性分析见表4。从微生物与养分关系角度上，总体上，微生物指标与AP均未表现出显著相关性；除土壤微生物氮熵外，其他微生物指标与TN、HN养分相关性不显著；MBC、MBC/MBN与SOC显著正相关；除MBC/MBN外，剩余微生物指标与TP极显著正相关，表明TP是影响微生物指标的主要因素。从微生物指标与樟子松生长指标关系角度，MBC与生长指标均极显著正相关；MBN与胸径、冠幅显著正相关；MBC/MBN与株高极显著正相关；土壤微生物氮熵与胸径显著正相关，表明MBC与MBN对樟子松的生长发育有显著的促进作用。
采用冗余分析（RDA）可以更好地揭示不同林龄和不同土层深度樟子松人工林土壤微生物指标与土壤养分指标之间的相关关系，结果如图2所示。第一排序轴和第二排序轴解释了土壤微生物指标与土壤养分关系总变异的98.67%，其中第一排序轴可以解释各指标与土壤养分总变异的79.22%，第二排序轴能解释微生物指标与土壤养分变异的19.45%。MBC、MBN、土壤呼吸强度总体与土壤TP、SOC呈较为显著的正相关，与AP呈负相关。从箭头的连线长度可以看出其对土壤微生物指标的影响程度，TP、SOC对不同林龄样地微生物指标的影响较大，其中TP对变异的解释度为63.3%。林龄为10 a、20 a、60 a的樟子松人工林与土壤微生物指标间的相关性不强，由此进一步反映出幼龄林与过熟林土壤养分水平不高。
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随着土层深度增加，土壤MBC、MBN及土壤呼吸强度呈现表聚性。原因在于林地浅层土壤距离腐殖质层最近，能更有效地利用水分及养分。土壤氧气含量随土壤垂直深度增加而减少，氧气含量越大，为土壤微生物提供的可降解底物越多，更能促进土壤微生物活性。深层土氧气含量较少，好氧微生物活动耗氧导致氧化还原电位下降，抑制了土壤微生物的活性，呼吸作用减弱。土壤微生物熵随着土层深度增加呈现出“先增后减”的变化规律。深层土壤MBC/MBN大于表层土壤，因MBC/MBN能反映真菌和细菌的占比状况，真菌所占比例越大，其MBC/MBN则越大。所以表层土壤真菌比例相对较小，对枯落物的分解能力相对较弱。通过相关关系表明SOC与MBC/MBN显著正相关，因此需要施入有机肥以提高表层覆盖物的降解能力。
樟子松在近熟林和成熟林期土壤微生物性质最佳，而过熟林土壤微生物各指标显著下降。由此表明近熟林和成熟林根系分泌物及凋落物有所积累，为土壤微生物新陈代谢和自身合成提供了较多的能量来源，土壤微生物量持续增加。过熟林期由于樟子松出现衰退现象，死亡率和病害率增加，土壤性质恶化，导致土壤微生物量下降。
沙地不同林龄樟子松人工林土壤微生物量特征
Characteristics of soil microbial biomass in Pinus sylvestris var. mongolica plantations with different ages in sandy land
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摘要: 为揭示不同林龄沙地樟子松人工林土壤微生物性质的变化规律，选择10、20、30、40、50、60 a生科尔沁沙地樟子松人工林为研究对象，测定分析了土壤微生物量碳（MBC）、土壤微生物量氮（MBN）、土壤呼吸强度、土壤微生物量碳氮比（MBC/MBN）、土壤微生物碳、氮熵等特征的变化。结果表明，随林龄增加，MBC和MBN均先增大后平稳再下降，二者最大值分别出现在40 a和50 a；土壤呼吸强度、土壤微生物碳、氮熵都呈现出上升-下降-上升-下降的变化趋势，且各指标均在60 a最小，表明过熟林微生物性质恶化；MBC/MBN先维持稳定，后期大幅度增大，在60 a时达到最大。随着土层深度增加，MBC、MBN及呼吸强度呈现表聚性；土壤微生物碳、氮熵呈现出先增后减的变化规律，深层MBC/MBN大于表层土壤。微生物各指标与樟子松人工林地上部分存在正相关关系，与全磷呈显著正相关关系。冗余分析表明，全磷、有机碳对不同林龄樟子松林下土壤微生物量影响显著。综上所述，樟子松近熟林和成熟林期微生物各指标达到最佳，过熟林时微生物活性差。Abstract: To reveal the changing laws of soil microbial properties of Pinus sylvestris var. mongolica plantation with different ages in sandy land, we determined and analyzed the changes of soil microbial biomass C(MBC) and N(MBN), soil respiratory intensity, soil microbial biomass C/N(MBC/MBN), soil microbial quotient and other characteristics changes in P. sylvestris var. mongolica plantations at 10, 20, 30, 40, 50, and 60 a in Horqin sandy land. The results showed that with the increase of forest age, both MBC and MBN first increased, then remained stable and finally decreased, and the maximum values of the two respectively appeared at 40 a and 50 a; The soil respiratory intensity, soil microbial carbon and nitrogen entropy all showed a change trend of increased—decreased—increased—decreased, and the minimum values of each index appeared at 60 years, indicating that the microbial properties of the over-mature stand have deteriorated; MBC/MBN remained stable at first, then increased substantially, and reached its maximum at 60 years. As the soil depth increased, MBC, MBN and respiratory intensity showed the surface aggregation; the change law of microbial quotient increased first and then decreased, and MBC/MBN of deep soil was greater than that of surface soil. Microbial indicators had a positive correlation with the above—ground part of P. sylvestris var. mongolica plantation, and had a significant positive correlation with total phosphorus. Redundancy analysis showed that TP and SOC had significant effects on soil microbial biomass at different stand ages of P. sylvestris var. mongolica. The microbial indicators reached the best in near—mature and mature stand, and its microbial activity was poor in over—mature stand.
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Key words:
- sandy land /
- Pinus sylvestris var. mongolica plantation /
- stand age /
- microbial biomass
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目前，国内外普遍在水源水体中检测到了不同种类的微量污染物[1-2]。这些微量污染物经过传统水处理工艺包括混凝、沉淀、过滤很难有效去除[3-4]。因此，高级氧化工艺如催化臭氧、紫外过氧化氢、紫外氯联合、芬顿等对微量污染物的强化去除方面的研究成为热点[5-8]。
多相芬顿技术作为高级氧化技术的一种，与活性炭工艺联用不仅可以去除水中天然有机物，还可以去除水中的有机农药、抗生素、内分泌干扰物等难降解的微量污染物，降低由微量污染物导致的水体毒性[9-12]。与其他深度处理技术相比，其不需要增加光、声、电等辅助设施，通常对温度和压力无要求，故具有非常广阔的应用前景[13]。
双酚A作为一种微量污染物，会影响人的内分泌系统，目前，对其降解的相关研究较多，除了化学法之外，也有采用微生物方法对其进行降解的研究[14-15]。在本研究中，首先以工业化合成的多相芬顿催化剂建立了多相芬顿催化柱，在北京某水厂进行了多相芬顿催化对天然有机物(NOM)的降解去除研究。在经过200 d运行后，通过对催化柱不同位置的催化剂进行取样，利用小试实验考察了生物膜对不同浓度双酚A去除效果的影响，最后为了分析生物膜的作用，对催化剂表面生物膜群落结构等进行了表征。本研究结果表明多相芬顿技术是一种很有应用前景的去除微量污染物的实用技术。
1. 材料与方法
1.1 中试装置及运行条件
中试装置建在北京市某自来水厂实验基地内，装置采用的水处理工艺流程包括混凝-沉淀-砂滤-多相芬顿催化氧化-活性炭过滤，装置及流程图如图1所示。本研究所使用的多相芬顿催化剂以氧化铝小球为载体，以铜、钴等化合物为主要成分，并以吨级规模工业合成(目前尚未商品化生产)，LYU等[16]对该类催化剂已有较多的研究报道。多相芬顿催化柱流量30 L·min−1、水力停留时间为15 min、投加过氧化氢量为0.15 mmol·L−1、活性炭柱流量为30 L·min−1、水力停留时间为15 min、反冲周期为7 d。
1.2 小试装置及运行条件
由于该水厂原水中没有检测到双酚A的存在，而且考虑到在水厂中人为添加微量污染物实验排水会影响环境，因此，在中试现场对水体中NOM进行了为期200 d的去除研究，同时考察了对消毒副产物和致病微生物控制效果，相关的研究结果[17]已发表。芬顿催化柱高度为4.0 m，经过长时间运行之后，在芬顿催化柱上、中、下层(柱高分别为3.6、1.8和0.5 m处)分别取适量材料，之后在实验室进行双酚A去除的小试研究。把上、中、下3层催化剂材料分别填装，共填装6根小柱(柱子尺寸40 mm×30 cm)：3根小柱分别装填上、中、下3层的多相芬顿催化剂，另外3根小柱装填上、中、下3层经过超声振荡并清洗后无生物膜的多相芬顿催化剂。
实验分别在2种条件下运行，一种配制进水双酚A浓度为10 μg·L−1，运行条件与中试相同，停留时间为15 min；另一种条件配制进水双酚A浓度为5 mg·L−1、停留时间为40 min。2种实验条件分别连续运行7 d，并于第2、4和6天取样，分析2种条件下双酚A的去除率，且考察了生物膜对双酚A去除效果的影响。
1.3 中试进水水质
中试实验流程进水采用水厂水源水经预氯化后水，经检测水质如下：温度为(20±2) ℃、浊度为3.0 NTU、DOC为(3.5±0.6) mg·L−1、pH=7.6~8.6、硬度为80~126 mg·L−1(以CaCO3计)、碱度为75~126 mg·L−1(以CaCO3计)、其他各种离子(2~3 mg·L−1
NO−3 -N、4~8 mg·L−1 Cl－、0.2~0.5 mg·L−1 F－、21~36 mg·L−1SO2−4 )。1.4 分析方法
水中溶解性有机碳 (DOC) 采用TOC分析仪(TOC-VCPH，SHIMADZU, Japan)。H2O2浓度利用辣根过氧化氢酶采用分光光度法分析。
在进行催化剂上生物膜采样时，首先把催化剂进行冷冻干燥然后称取一定量的催化剂利用灭菌棉签擦拭催化剂表面，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行冲洗，然后把棉签和磷酸盐缓冲溶液一起进行超声震荡，收集PBS溶液[17]。催化柱上中下层出水各采集1 L溶液。上、中、下3层出水及生物膜各取样3个，分别标记为生物膜上层(RS1.1、RS1.2、RS1.3)，生物膜中层(RS2.1、RS2.2、RS2.3)，生物膜下层(RS3.1、RS3.2、RS3.3)，上层出水(RS4.1、RS4.2、RS4.3)，中层出水(RS5.1、RS5.2、RS5.3)和下层出水(RS6.1、RS6.2、RS6.3)。
把溶液过0.45 µm聚碳酸酯膜，然后用Fast DNA spin kit for soil(Qbiogene，Solon，OH)试剂盒进行DNA基因提取。利用7300实时荧光定量聚合酶链式反应系统仪器(7300 Real Time PCR System)分析检测总细菌(16S rRNA)，用于表征催化剂表面的微生物量。同时基于IonS5TMXL测序平台，利用单端测序方法构建小片段文库进行单端测序。通过对Reads剪切过滤，OTU(operational taxonomic units)聚类，β多样性分析采用算术均值的非加权配对平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)聚类分析。最后根据16S测序数据进行基于KEGG数据库的功能预测。
对传统的热提取方法进行了优化，以提取生物膜中微生物的胞外多聚物(EPS)，具体步骤参照文献中的方法[18]。然后用Folin苯酚比色法测定EPS中的蛋白质，以牛血清白蛋白为标准物质。用苯酚硫酸比色法测定EPS中的多糖，以葡萄糖为标准物质，并使用三维荧光(EEM)对EPS进行成分分析。
低浓度双酚A首先利用固相萃取柱进行浓缩，然后利用超高效液相色谱四极杆-飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS，ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q-TOF，Waters)。
2. 结果与讨论
2.1 多相芬顿对溶解性有机碳(DOC)的去除效果
多相芬顿催化柱中试实验连续运行200 d，运行周期内多相芬顿催化柱进出水溶解性有机碳(DOC)变化如图2所示。砂滤出水(多相芬顿催化柱进水)的DOC为(3.12±0.51) mg·L−1，经过多相芬顿催化剂处理后DOC值降低至(1.96±0.49) mg·L−1，在相同运行时间条件下比砂滤出水降低了42%~63%。由图2可以看出，多相芬顿催化柱对NOM有很好的去除效果。另外，在中试运行120 d以后，多相芬顿出水DOC出现稳中有降的趋势，这可能与生物膜的形成有关。
图 2 多相芬顿催化柱运行期间进出水DOC的变化Figure 2. Changes of DOC in influents and effluents during the running process of the heterogeneous Fenton column2.2 生物膜对双酚A去除的影响
为了分析生物膜对芬顿催化剂去除双酚A的影响，我们对上、中、下3层具有不同生物膜的催化剂材料分别进行了小试实验。根据国家标准《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)中生活饮用水水质参考指标及限值规定，饮用水中双酚A浓度不得高于10 µg·L−1，因此，我们选择此浓度为低浓度进行研究。图3反映了不同起始浓度下双酚A的降解率。如图3(a)所示，在停留时间仍然为15 min且在不加H2O2的条件下，低浓度(10 µg·L−1)双酚A在无生物膜的上、中、下3层催化剂中的去除率分别为24.9%、27.6%和28.3%，而在有生物膜的上、中、下3层催化剂上去除率分别为36.0%、37.4%和37.8%。该结果说明，上、中、下3层催化剂洗去生物膜后，对双酚A去除效果基本相同，而具有不同生物膜群落组成的上、中、下3层催化剂对其去除效果也基本相同。但是，有生物膜的催化剂明显比没有生物膜的催化剂去除效果更好。
图 3 不同起始浓度下双酚A的去除率Figure 3. Removal rate of bisphenol A at different initial concentrations除了低浓度双酚A，本研究还进行了高浓度5 mg·L−1双酚A的去除实验，由于其浓度较高，控制停留时间为40 min，结果如图3(b)所示。与低浓度双酚A的实验结果类似，有生物膜的催化剂比没有生物膜催化剂对双酚A的去除率较高，而且有生物膜的催化剂从上层到下层其对双酚A的去除能力有逐渐增强趋势，在下层中对双酚A的去除率达到了39%。
因此，在中试条件下，控制多相芬顿催化柱流量30 L·min−1，水力停留时间为15 min，投加过氧化氢量为0.15 mmol·L−1，冲洗周期为7 d的条件下，多相芬顿催化柱表面形成的生物膜影响了小试过程中双酚A的去除，使得双酚A去除率有所提高，同时发现，随着停留时间的延长，下层生物膜影响较大。
2.3 多相芬顿催化剂表面生物膜表征
1)微生物群落多样性。根据实验分析方法描述，对催化柱上中下3层进行生物膜和出水中微生物采样分析，图4所示为6组样品的所有平行样，共18个，在微生物门水平(phylum level)上对其多样性基于进化序列差异(unweighted unifrac)距离矩阵进行的UPGMA聚类树分析。由图4可以看出，生物膜和水中微生物各自聚类在一起，这说明生物膜和水中微生物存在差别。有研究[19]表明，过滤过程中生物膜对其出水中微生物存在决定作用，该结果上层出水与生物膜相似性高，中下层出水与生物膜差别大，这可能是由于H2O2从催化剂底部投加，中、下层为H2O2初始反应阶段，产生的羟基自由基对水体中微生物生长影响较大。另外，中层生物膜RS2.1、RS2.2、RS2.3和下层生物膜RS3.1、RS3.2、RS3.3聚类在一起，相似度较高，与上层生物膜有一定差别，该结果同样说明，随着反应不断进行，H2O2浓度有搜降低，从而影响了生物膜群落组成。有研究[20]表明，加氯消毒过程对微生物群落结构影响较大，该结果也说明，多相芬顿反应投加H2O2能够影响微生物群落结构组成。
图 4 基于Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类树Figure 4. UPGMA cluster tree based on Unweighted Unifrac distance matrix2)微生物群落组成。为了进一步分析生物膜及出水中微生物群落组成，对生物膜及出水微生物在属水平上相对丰度在前10的微生物进行作图分析(每组样品3个平行样取平均值作图)，如图5所示。通过对比分析发现，上层生物膜RS1中赫山单胞菌属(Herminiimonas)、慢生根瘤菌属(Bardyrhizobium)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)和旱杆菌属(Aridibacter)4种微生物菌属较多，其对应的相对丰度分别为23.9%、20.5%、8.5%和7.3%。中层生物膜RS2中这4种菌属分别降低至2.1%、5.6%、0.3%和0.06%，下层生物膜RS3这4种微生物菌种降低至2.2%、6.3%、0.3%和0.2%。但是在中层RS2和下层RS3生物膜中Reyranella菌属和生丝微菌属(Hyphomicrobium)含量明显升高。RS2中相对丰度分别为12.2%和3.1%，RS3中分别为19.4%和4.7%。另外，催化柱上、中、下3层出水微生物变化较大，在上层出水RS4中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、水杆菌属(Aquabacterium)、赫山单胞菌属(Herminiimonas)和慢生根瘤菌属(Bardyrhizobium)相对丰度较高。中层出水RS5中Aquicella和生丝微菌属(Hyphomicrobium)相对丰度较高。下层出水RS6中赫山单胞菌属(Herminiimonas)、慢生根瘤菌属(Bardyrhizobium)、柄杆菌属(Caulobacter)相对丰度高。结果表明，相比于生物膜，不同层出水中微生物群落组成变化较大。另外，投加H2O2是从催化柱下面投加，H2O2接触到催化剂表面生成羟基自由基(∙OH)对有机物进行降解并灭活微生物，随着反应进行从下层到上层H2O2浓度逐渐降低。因此，生物膜中赫山单胞菌属(Herminiimonas)、慢生根瘤菌属(Bardyrhizobium)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)和旱杆菌属(Aridibacter)相对丰度从下层到上层逐渐增加，但是芬顿催化柱中层和下层生物膜群落组成相似，其中，Reyranella菌属和生丝微菌属(Hyphomicrobium)含量明显比上层高。
3)微生物功能分析。根据测序样品在数据库中的功能注释及丰度信息，从功能查阅层面进行聚类分析。其中，微生物功能分析包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、关于人类疾病、新陈代谢、有机系统、无法归类和无功能共8种。在环境信息处理和新陈代谢方面，中层和下层催化剂生物膜的微生物功能更强。以上结果说明，受周围环境H2O2和有机物浓度的影响，中层和下层催化剂生物膜的微生物表现出更强的代谢能力。
通过对生物膜上微生物16S rRNA进行定量分析，发现下层微生物总细菌含量最多，微生物基因拷贝数高达8个对数量级；中层其次，上层最少，分别为7.8个和7.7个对数量级(图6(a))。由对催化剂表面生物膜上胞外多聚物EPS表征结果可以看出，在中、下层的生物膜上微生物EPS中蛋白质含量较高，分别高达624.3 ng·g−1和642.8 ng·g−1(图6(b))。
图 6 生物膜总细菌基因拷贝数和EPS中多糖及蛋白质含量Figure 6. Gene copies of total bacteria and concentration of polycarbonate and proteins in EPS of biofilm因此，中试过程中从催化柱下部投加H2O2溶液，起始投加量为5 mg L−1，随着反应的进行，从下到上的H2O2浓度逐渐降低，出水H2O2浓度为0.45 mg L−1。随着催化柱从下到上H2O2浓度变化及其对有机物的降解，多相芬顿催化柱上、中、下3层出水中微生物群落组成变化较大，但是生物膜上微生物群落存在相似性，其中，中层和下层相似度高。上层生物膜中微生物以赫山单胞菌属(Herminiimonas)和慢生根瘤菌属(Bardyrhizobium)为主，而中层和下层生物膜中微生物以Reyranella菌属和生丝微菌属(Hyphomicrobium)为主。另外，中层和下层生物膜中微生物量相比上层多，代谢能力强，生物膜上微生物分泌的EPS多，蛋白质含量高，微生物吸附性能有所增强[21]，这可能会影响催化柱对天然有机物和微量污染物的去除。小试实验结果证明，生物膜的形成影响了对双酚A的去除。在停留时间为15 min时，有生物膜的催化柱明显比没有生物膜的催化柱对10 µg·L−1双酚A的去除率高，但对于有生物膜的上、中、下层，其对双酚A的去除率差别不大。当停留时间在40 min后，有生物膜的催化柱比没有生物膜的催化柱对5 mg·L−1双酚A去除率要高，而且下层对双酚A的去除率最高，可能与下层生物膜中Reyranella菌属和生丝微菌属(Hyphomicrobium)含量较高有关。
在多相芬顿催化体系中，H2O2除了与释放到溶液中的少量金属离子发生链反应外，主要与催化剂发生界面反应，多相芬顿反应需要高活性的催化剂，其可提高H2O2的利用率[13]。本研究结果表明，在多相芬顿催化柱运行过程中，很难避免生物膜的形成，而对于微量污染物双酚A，生物膜可以提高对其的去除效果。但是，生物膜对不同种类和浓度的污染物去除的影响还需要进行深入的研究和探索，从而更好的优化运行多相芬顿催化柱，以便能尽早的解决实际问题。另外，建议今后要深入开展生物膜对芬顿反应去除不同微量污染物的影响研究。
3. 结论
1)多相芬顿催化柱在中试运行过程中对天然有机物表现出良好的去除效果，而实验过程中形成的生物膜可提高对双酚A的去除率。在无生物膜条件下，多相芬顿反应对双酚A的去除率低于30%，而在生物膜形成后，对双酚A的去除率可提高到36%~39%。
2)通过对催化柱上生物膜进行表征，发现催化柱生物膜上微生物群落存在相似性，其中，中层和下层相似度高。上层生物膜中微生物以赫山单胞菌属(Herminiimonas)和慢生根瘤菌属(Bardyrhizobium)为主，而中层和下层生物膜中微生物以Reyranella菌属和生丝微菌属(Hyphomicrobium)为主。
3)随着生物膜上微生物群落组成的变化，多相芬顿催化柱由上层到下层生物膜上生物量有所增加，微生物代谢活性增强，从而分泌更多的胞外多聚物，这可能是有生物膜的催化柱特别是下层催化柱可更好地去除双酚A的主要原因。
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图 1 不同林龄、不同土层样地聚类分析树状图
Figure 1. Cluster analysis tree diagram of different stand ages and different soil samples
图 2 土壤微生物指标与土壤养分的RDA排序图
Figure 2. RDA sorting diagram on soil microbial indexes and soil nutrients
表 1 标准地基本情况
Table 1. Basic overview of the plots
样地 Plot Z10 Z20 Z30 Z40 Z50 Z60 林龄/a Tree age 10 20 30 40 50 60 密度/（plants·hm−2） Density 625 625 675 675 650 650 树高/m Height 3.28 7.80 9.25 11.27 11.01 13.04 胸径/cm DBH 7.50 13.31 16.69 20.92 19.61 20.59 东西平均冠幅/m Wew 2.59 3.6 4.01 4.3 4.59 4.62 南北平均冠幅/m Wsn 2.42 4.21 4.10 4.69 4.72 4.92 枯落物厚度/cm Litter depth 8.11 10.04 12.67 16.89 16.66 13.11 郁闭度 Canopy density 0.5 0.7 0.8 0.7 0.8 0.6 有机碳/（g·kg−1） SOC 5.96 5.96 8.85 8.31 10.73 11.16 全氮/（g·kg−1） TN 0.26 0.24 0.16 0.21 0.24 0.27 碱解氮/（mg·kg−1） HN 7.25 4.77 2.54 4.89 7.30 6.97 全磷/（g·kg−1） TP 0.92 1.0 1.11 1.12 1.04 1.01 有效磷/（mg·kg−1） AP 10.52 4.59 7.94 6.33 4.74 6.41 注：Z10、Z20、Z30、Z40、Z50、Z60分别为10年生、20年生、30年生、40年生、50年生和60年生樟子松人工林. Note: Z10, Z20, Z30, Z40, Z50, Z60 were respectively 10, 20, 30, 40, 50, and 60 a P. sylvestris var. mongolica plantations. 
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表 2 不同林龄土壤微生物量碳、土壤微生物量氮、土壤呼吸强度特征
Table 2. Characteristics of MBC,MBN and soil respiration intensity with different stand ages
土壤微生物指标Soil microbial indexes 土层深度/cmSoil depth 林龄/aStand ages CK 10 20 30 40 50 60 土壤微生物量碳/（mg·kg−1） 0—20 60.74 Da 133.83 Ca 158.17 Ba 206.76 ABa 246.19 Aa 242.91 Aa 206.48 ABa 20—40 41.09 Db 103.09 Cb 142.30 Ba 186.63 ABb 213.49 Aab 207.70 Ab 191.31 Aab 40—60 32.43 Db 98.61 Cbc 117.25 Cb 171.33 Bb 206.68 Ab 201.60 Ab 174.25 Bb 60—80 32.51 Db 95.86 Cbc 100.65 Cb 163.76 Bb 194.37 Ab 186.05 Ac 175.83 ABb 80—100 32.60 Db 82.41 CDc 88.54 Cc 141.42 Bc 185.63 Ab 172.87 Ac 159.72 ABc 0—100 39.87 Db 102.76 Cb 121.38 Cb 173.98 Bb 209.27 Ab 202.23 ABb 181.52 ABb 土壤微生物量氮/（mg·kg−1） 0—20 4.72 Ca 4.85 Ca 6.72 ABa 11.39 Aa 10.08 Aa 10.23 Aa 5.43 Ba 20—40 4.40 Ca 4.28 Ca 5.94 BCb 9.47 Ab 7.56 Bb 9.04 Aab 4.78 Cb 40—60 2.73 Cb 3.24 Cb 4.84 Bbc 7.39 Abc 6.88 ABb 7.63 Ac 3.27 Cbc 60—80 2.27 Cb 3.78 BCb 4.41 Bc 5.29 Bc 6.48 ABb 8.22 Ab 2.71 Cc 80—100 2.68 Bb 2.71 Bc 3.27 Bc 5.26 Ac 4.85 Ac 5.95 Ac 2.72 Bc 0—100 3.36 Bab 3.77 Bb 5.04 Bb 7.76 Abc 7.17 Ab 8.21 Ab 3.78 Bbc 土壤呼吸强度/（mg·kg−1·24h−1） 0—20 2.28 Ba 1.70 Ca 2.30 Ba 3.22 Aa 1.55 Ca 3.03 Aa 1.62 Ca 20—40 2.19 ABa 1.44 Bb 2.19 ABa 2.60 Ab 1.21 Cb 2.63 Ab 1.47 Bab 40—60 1.92 ABab 1.46 Bb 1.94 ABb 2.38 Abc 1.19 Cb 2.94 Aa 1.22 Cb 60—80 1.92 Bab 1.70 Ba 2.23 Aa 2.14 ABc 1.21 Cb 2.46 Ab 1.23 Cb 80—100 1.69 Bb 1.22 Cc 1.72 Bc 2.61 Ab 1.45 BCab 2.44 Ab 1.24 Cb 0—100 2.00 Ba 1.50 Cab 2.07 Bab 2.59 Ab 1.33 Cb 2.70 Aa 1.36 Cb 注：不同大写字母表示同一土层不同林龄间差异显著，不同小写字母表示同一林龄不同土层间差异显著（下同）。 Note: Different capital letters indicate significant differences between different stand ages in the same soil layer, and different lowercase letters indicate significant differences between different soil layers of the same stand age （the same below）.
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表 3 不同林龄土壤微生物量碳氮比、土壤微生物碳熵、土壤微生物氮熵特征
Table 3. Characteristics of soil MBC/MBN, microbial C quotien and microbial N quotient with different stand ages
土壤微生物指标Soil microbial indexes 土层深度/cmSoil depth 林龄/aStand ages CK 10 20 30 40 50 60 土壤微生物量碳氮比MBC/MBN 0—20 12.86 Da 27.60 ABa 23.58 Bb 18.17 Cc 24.42 Bc 23.82 Bb 38.03 Ab 20—40 9.33 Db 24.08 Bb 23.97 Bab 19.72 Cc 28.25 Bb 22.96 Bb 40.00 Ab 40—60 11.87 Db 30.42 Ba 24.22 Ca 23.18 Cbc 30.03 Bb 26.44 BCa 53.24Aab 60—80 14.29 Da 25.35 BCb 22.82 Cb 30.93 Ba 30.00 Bb 22.65 Cb 64.90 Aa 80—100 12.17 Da 30.42 BCa 27.04 Ca 26.87 Cb 38.31 Ba 29.04 BCa 58.81 Aa 0—100 12.11 Ca 27.58 Ba 24.33 Ba 23.77 Bbc 30.20 Bb 24.98 Bb 50.99 Aab 土壤微生物碳熵/%Soil microbial C quotien 0—20 0.57 Ca 1.97 Ba 2.48 Aa 2.50 Aa 2.84 Aa 2.35 Aa 1.78 Ba 20—40 0.43 Ca 1.98 ABa 2.55 Aa 2.17 Aa 2.52 Aa 1.77 Bab 1.71 Ba 40—60 0.35 Cb 1.93 ABa 1.96 Aab 1.73 Bb 2.58 Aa 1.93 ABa 1.73 Ba 60—80 0.36 Cb 1.52 BCb 1.72 Bb 1.92 ABa 2.33 Ab 1.69 Bb 1.61 Bb 80—100 0.38 Cb 1.48 Bb 1.59 Bb 1.71 ABb 2.44 Aab 1.68 Bb 1.44 Bb 0—100 0.42 Da 1.78 BCab 2.06 Bab 2.01 BCa 2.54 Aa 1.88 BCa 1.66 Cab 土壤微生物氮熵/%Soil microbial N quotien 0—20 1.39 Cc 1.41 Cb 2.26 Ba 5.44 Aa 3.85 ABa 3.12 ABb 1.51 Cb 20—40 1.83 BCab 1.71 Ca 2.35 Ba 5.92 Aa 4.01 ABa 4.63 Aa 1.85 BCa 40—60 1.61 Cb 1.34 Db 2.31 BCa 5.65 Aa 3.76 Ba 3.92 Bb 1.60 Cb 60—80 1.62 BCb 1.86 BCa 2.13 Bab 3.89 Ab 3.52 ABa 4.50 Aa 1.26 Cc 80—100 2.23 Ba 1.38 Cb 1.80 BCb 4.60 Aab 3.06 ABb 3.38 ABb 1.34 Cc 0—100 1.74 Cb 1.54 Cb 2.17 Cab 5.10 Aa 3.64 Ba 3.91 Bb 1.51 Cb
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表 4 土壤微生物指标与环境因素的相关性（n=360）
Table 4. Correlation between soil microbial indexes and environmental factors （n=360）
指标Indexes 株高Heigh 胸径Diameter 冠幅Crown 有机碳SOC 全氮TN 碱解氮HN 全磷TP 有效磷AP 土壤微生物量碳MBC 0.748** 0.816** 0.743** 0.685** 0.215 0.253 0.604** −0.303 土壤微生物量氮MBN 0.284 0.390* 0.354* 0.314 0.129 0.134 0.543** −0.258 土壤呼吸强度Soil respiratory intensity 0.012 0.114 0.124 −0.100 0.178 0.108 0.478** −0.218 土壤微生物碳熵Soil microbial C quotien 0.103 0.201 0.141 −0.273 0.051 0.021 0.459** −0.066 土壤微生物量碳氮比MBC/MBN 0.427** 0.323 0.309 0.347* −0.009 0.050 −0.132 0.143 土壤微生物氮熵Soil microbial N quotien 0.260 0.376* 0.319 0.173 −0.508** −0.429** 0.686** −0.144 注：*表示显著相关（P ˂ 0.05），**表示极显著相关（P ˂ 0.01）. Note:*indicates significant correlation （P ˂0.05）, **indicates extremely significant correlation （P ˂0.01）.
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