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地下水是维持人类生存和发展的一种最重要资源和生态环境因子[1]。近年来，我国经历了快速城市化和工业化，然而，污水的处理能力未能保持同步增长(尤其在农村地区)、农业化肥和农药过量使用、地下水超采严重等问题，已经引起地下水水化学特征发生改变[2-4]。众所周知，地下水水化学改变不仅能够干扰多种生态过程，同时也降低了地下水的使用价值[5]。因此，掌握地下水水化学的演化规律对于可持续利用地下水尤为重要[6-8]。
地下水水化学演化主要受控于自然因素和人类活动的综合影响。地下水水化学特征与自然因素（水文地质条件、包气带岩性、水岩交互作用和海水入侵）密切相关[9-10]。安乐生等研究发现，黄河三角洲浅层地下水化学特点形成的关键驱动因素是黄河入海流路变迁和海水入侵[11]。人类活动（如污水排放、农业施肥、地下水超采等）也严重影响了地下水水化学演化规律。Zhang等研究发现，地下水水化学特征受到了生活污水、工业污水和水岩交互作用的混合影响, 因此，为防止该地区地下水水质恶化，首先要控制污水的排放 [12]。郭高轩等研究表明，潮白河冲洪积扇不同深度地下水水化学具有分层分带特征，且在人类活动强烈区域，浅层地下水水质略差[13]。
中牟县位于郑州市东部新城区，地下水资源是该地区工农业生产的主要供水水源。近年来，随着人口的迅速增长和工业的高速发展、农业灌溉面积极速扩大，地下水的开采量日益增加。基于 2019 年对该地区地下水位统调工作发现，中牟县城一带已经形成一个较大的浅层地下水降落漏斗，并且研究区内人类活动强烈，存在农业面源污染、固体废弃物堆放场和工业污染等3类潜在污染来源，可能对地下水水化学特点构成一定影响。目前，针对该地区地下水水化学演化规律尚未开展深入研究工作，对该地区居民的健康饮水和社会经济可持续发展构成潜在威胁。
本研究针对郑州市中牟县地下水水化学演化机理开展研究，联合应用piper三线图、Gibbs图、离子比例系数法和多元统计技术等手段，识别研究区水化学特征，揭示该地区地下水水化学形成演化机制，探讨控制地下水水化学特征的主控因素，以期为快速城市化地区地下水的可持续开发利用提供科学依据。
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中牟县位于北纬34°26′—34°56′、东经113°46′—114°12′之间，地处中原腹地、河南省中部偏东，隶属郑州市。研究区属暖温带半干旱气候，具明显的大陆季风气候特征，四季分明。多年平均气温14.25℃，多年平均降雨量约为616 mm，年内降水多集中在7—9月，占全年降雨量的40%—48%. 多年平均蒸发量1769.8 mm，平均相对湿度66.3%。研究区总面积为917 km2，主要的土地利用类型为农业用地（68.7%）、居民区（9.2%）、工矿用地（4.3%）、水域（16.2%）（包括湿地和水体）和裸地（1.6%）（图1）。
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研究区地貌类型为黄河冲积平原，地下水类型主要为松散岩类孔隙水，其含水层分布广，厚度大，水量丰富，可分为浅层水（<80 m）和中深层水（80—400 m）。浅层含水层主要由山前冲洪积与黄河冲积的细砂层组成，深度主要为 40—60 m，该含水层组埋藏浅，其下为一组粉质粘土或粉土弱透水层，与下伏中深层含水层组相隔，厚25—45 m。浅层水易于开采，为农业用水主要开采层，井深25—55 m。中深层含水层组底板埋深310—350 m，其下为厚层粘土夹薄层砂或砂的透镜体，粘土层厚度一般15—40 m，具有很好的隔水性，属承压水类型。中深层水是目前城乡小型集中供水的主要开采层，井深一般在100—300 m 左右。其含水层岩性为中砂、细砂、粗砂等，厚30—80 m，导水系数125—390 m2·d−1，贮水系数4×10−3，单位涌水量3—5 m3·h−1·m−1。地下水主要的补给来源为大气降水、河道侧漏和灌溉回水，主要的排泄方式为人工开采。
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2020年6—8月采集郑州市中牟县地下水样品93组（图1），包括农业用地站点48个，湿地站点19个，住宅用地站点20个和工矿用地站点6个。采样点布设的原则主要依据不同的土地利用类型平均布设采样点，如果预布设站点区域内无地下水井，可以适当调整，但要保证2个采样点之间的距离大于1 km。地下水主要取自民井和农业灌溉井，采样井的深度范围是25—150 m。采样前抽水洗井10 min，用原水样清洗采样瓶3次，分别采集 1.5 L 和 0.5 L 水样各1瓶，用于分析阴阳离子。分析阳离子的水样加1∶1的
HNO−3 调节水样 pH<2。样品采集后，密封瓶口放入冷藏箱运回实验室，在48 h 内完成样品测试. -
样品测试的指标包括pH、TDS、K+、Na +、Ca2+、Mg2+、
NH+4 、NO−3 、NO−2 、SO2−4 、Cl−、CO2−3 、HCO−3 和总硬度（TH）。其中pH采用多参数水质分析仪—美国哈希HQ40D现场测定。其余指标参照国家饮用天然矿泉水检验方法标准(GB/T 8538-2008)测试。 -
（1）水化学类型判定。本研究按照舒克列夫分类法，即阴阳离子毫克当量百分比大于25%时参与命名。对研究区采样点地下水化学类型定名，并绘制出了地下水化学类型Piper三线图。
（2）地下水化学控制因素识别。选用Gibbs图识别地下水化学控制作用。通常情况下，水样位于 Gibbs 图右下角，表明其受大气降水作用影响较大，水样位于Gibbs 图左中部，表明岩石风化作用是该地区水化学的主要控制作用，而受蒸发结晶作用控制的水样将落于Gibbs 图右上角。
（3）离子来源识别。联合应用Ca2+/Na+ VS
HCO−3 /Na+和Mg2+/Na+ VSHCO−3 /Na+比值端元图识别地下水中离子来源。当水样点离子比值为HCO−3 /Na+=120，Ca2+/Na+= 50，Mg2+/Na+ =10时，表明地下水受碳酸盐岩风化作用控制为主；当水样点离子比值为HCO−3 /Na+=2±1，Ca2+/Na+= 0.35±0.15，Mg2+/Na+=0.24±0.12时，表明地下水主要受硅酸盐岩风化作用控制；而蒸发盐风化作用控制的水样通常位于比值图的左下角。（4）衬度系数方差。方差（Variance）用于刻画一个随机变量对其数学期望（均值）的离散程度。由于地下水各化学组分的绝对数值范围可能相差很大，无法进行方差的对比，为此，先求出每个样本每个变量（Xi）与该变量均值（
¯X ）的比值，这里定义为衬度系数V，即Vi=Xi¯X ，由于衬度系数V的平均值为1，因此各变量就转化为均值相等的另一个变量（其衬度系数），然后对各变量的衬度系数求方差，即可进行方差对比。衬度系数方差（Vσi2）的计算公式如下：
式中，Vi是地下水第i个化学组分的衬度系数；
¯Vi 是地下水第i个化学组分的衬度系数的平均值。当Vσi2> 1时，说明该化学组分受人类活动影响强烈；当0.5<Vσi2<1时，说明该组分受中等强度的人类活动影响；当Vσi2<0.5时，说明该组分受人类活动影响较小。
此外，运用Spearman’s 秩相关系数分析了不同土地利用类型地下水水化学组分之间的相关关系。数据分析使用 R 语言(4.0.3)、Origin(2019b)和Arcgis 10.5。
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研究区pH值的范围介于6.71—8.51之间，均值为7.62，地下水为中性到弱碱性水，样品的超标率为1.1%(表1)。TDS 变化范围为200—1408 mg·L−1，均值为612 mg·L−1。地下水样品中
CO2−3 的浓度均低于检出限，因此未参与统计。地下水中阳离子的大小排序为Ca2+ > Na+ > Mg2+ >K+ >NH+4 ，而阴离子的大小排序是HCO−3 >SO2−4 > Cl− >NO−3 >NO−2 。其中，超标率最高的阳离子是NH+4 ，超标率为6.5%，超标率最高的阴离子为NO−3 ，超标率为19.4%，反映出研究区地下水受到了人类活动的强烈影响，如化肥，污水等 [14]。TH反映了水中多价金属离子含量的总和，是地下水中一个重要的化学指标。在本研究区内，地下水TH的浓度范围介于28.3—978 mg·L−1之间，均值为414 mg·L−1，超标率高达39.8%，是研究区地下水中最主要的污染因子。饮用水中TH的浓度较高，可能诱发多种疾病，如血管疾病急性心肌梗塞和湿疹[15,16]。因此，当地环境管理者应当高度关注。 -
Piper三线图常用来表征地下水化学成分的演化规律[18]。由图2 可以看出，研究区地下水主要的水化学类型为HCO3-Ca(Mg)型，占总水样的46.2%。近年来，由于人类活动的干扰，地下水水化学类型趋于复杂化，出现了Cl型水（18.3%），Na型水（39.8%）和SO4型水（3.2%）。不同土地利用类型下地下水水化学类型有明显的区别。正如表2显示，在农业用地和工矿用地中，地下水主要的水化学类型是HCO3-Ca(Mg)型，但是，农业用地受到施肥的影响，水化学类型出现了Cl型水（20.8%）和SO4型水（6.25%）。住宅用地地下水主要的水化学类型是HCO3-Ca(Mg)型水（40.0%），并且Na型水出现的比例高达55.0%。此外，在湿地（郑州黄河湿地自然保护区）内，Na型水是地下水主要的水化学类型，占比高达89.5%，这主要与湿地地下水受到黄河水和污水处理厂回水混合影响有关。
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地下水化学组分的形成机制主要受控于大气降雨、岩石风化、蒸发浓缩和混合作用等[19]。正如图3显示，地下水采样点的离子含量投点绝大部分落于Gibbs图中间位置，表明岩石风化是研究区地下水水化学离子组分的主要控制因素。但是，研究区部分采样点，有向右上方区域偏移的趋势，说明蒸发-浓缩作用对研究区地下水的水化学组分也有一定的影响。此外，部分点位超出了岩石分化的控制边界，说明这些采样点的水化学组分受到人类活动的影响。
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衬度系数方差可用于区分地下水化学组分的形成以天然条件演化作用为主，还是受人类活动影响较大。地下水化学组分的衬度系数方差越大，表明该组分受人类活动影响就越强烈[20]。由表3可见，整体上看，在不同土地利用类型中地下水中的Ca2+、Mg2+和
HCO−3 均受人类活动影响较小。然而，农业用地、居住用地和工矿用地地下水三氮（NH+4 、NO−3 和NO−2 ）的衬度系数方差值均大于1，表明三者均受到人类活动的强烈的影响。值得注意的是，在农业用地地下水中，K+的衬度系数方差值大于1， Cl−、SO2−4 和K+的衬度系数方差值介于0.5—1之间，说明农业的活动对它们存在强烈和中等强度的影响。此外，在住宅用地地下水中，人类活动对Cl−和K+有中等强度的影响，而人类活动对工矿用地地下水中Cl−和SO2−4 也存在强烈和中等强度的影响。 -
为了进一步探讨地下水化学组分的来源，联合应用Ca2+/Na+ VS
HCO−3 /Na+和Mg2+/Na+ VSHCO−3 /Na+比值端元图来进一步区分地下水水化学组分是来自碳酸盐岩风化、硅酸盐岩风化还是蒸发盐岩风化[21]。由图4可以看出，研究区内水样主要集中于硅酸盐岩与碳酸盐岩控制端元之间，表明研究区地下水化学组分主要受控于硅酸盐岩与碳酸盐风化溶解，并且以硅酸盐岩风化为主。 -
地下水化学组分之间的相互关系可以反映各离子的物质来源[22]。在本研究中，对农业用地、住宅用地和湿地地下水水化学组分分别做了相关性分析（表4），结果表明，农业用地地下水水化学组分，除三氮（NH4+、NO3−和NO2−）外，其余水化学组分之间均表现出极显著的正相关关系，表征它们来自于共同的来源。地下水中TDS、K+、Na +、Ca2+、Mg2+和HCO3− 主要来自于地层岩石风化[23-24]。在该研究区，这些离子主要受控于硅酸盐岩风化作用控制。NH4+与Cl−、TDS、SO42-、K+、Na +、Mg2+和HCO3−之间表现出显著或极显著的正相关关系。众所周知，NH4+主要来自于生活污水和化肥[25-26]，并且污水和化肥中也含有一定量的Cl−、SO42-、K+和Na+。由于这些地下水样品在农业地区，因此，地下水中NH4+主要来自于化肥。水环境中NO3−的来源包括生活污水、化肥、粪肥、大气降雨等[27-28]。值得注意的是NO3−和NH4+表现出极显著的负相关关系，首先说明二者来自于共同的污染源-化肥。其次，由于NH4+在氧化环境下极易发生硝化反应转化为NO3−[29]，从而降低水环境中NH4+的浓度。在这个地区，地下水处于氧化环境（DO的均值约为5.02 mg·L−1），并且NO3−的平均浓度高达61.7 mg·L−1，而NH4+的平均浓度仅为0.085 mg·L−1，表明地下水中发生了强烈硝化作用，所以二者表现出极显著的负相关关系。
在住宅用地，地下水中TDS、Cl−、SO42-、K+、Ca2+、Mg2+和HCO3−均表现出极显著的正相关关系，表征它们主要来自于地层岩石风化。值得关注的是Na+与NH4+表现出显著的正相关关系，表明二者有共同的来源。正如前面分析，水环境中的Na+与NH4+可能来自于生活污水和化肥[26]。由于采样站点位于住宅用地，并且村庄四周密布农田，且存在垃圾填埋场。因此，污水管网的破损，垃圾填埋场的渗漏，以及农业的施肥都会对其造成影响。与农业用地相似，NO3−和NH4+表现出显著的负相关关系，表明二者主要来自于生活污水和化肥，且地下水中发生了硝化作用。
在湿地，水化学指标TDS、Cl−、
SO2−4 、Na+、Ca2+和Mg2+均表现出极显著或显著的正相关关系，表征它自于共同的源-地层岩石风化。在湿地地下水中NH+4 的平均浓度（0.458 mg·L−1）要显著高于农业用地（0.085 mg·L−1）和住宅用地（0.087 mg·L−1）。但是，NO−3 的平均浓度（0.511 mg·L−1）要显著小于农业用地（61.7 mg·L−1）和住宅用地（43.8 mg·L−1），这主要是由于湿地地下水受到了黄河的补给以及污水处理厂回水的影响。NO−3 和NH+4 表现出显著的负相关关系。但是，NO−3 的浓度是非常低的，这可能是由于地下水与黄河河水交换强烈，受到了黄河河水稀释的影响。此外，湿地由于长期处于水饱和状态，地下水可能发生反硝化作用，进而降低地下水中NO−3 的浓度[30-31]。 -
（1）郑州市中牟县地下水pH的变化范围介于6.71—8.51之间，处于中性到弱碱性。地下水中阳离子的大小排序为Ca2+> Na+> Mg2+>K+>
NH+4 ，而阴离子的大小排序是HCO−3 >SO2−4 >Cl−>NO−3 >NO−2 。TH和NO−3 是该地区地下水中最主要的污染因子。（2）地下水水化学类型主要为HCO3-Ca(Mg)型，占总水样的46.2%。农业用地受到施肥的影响，水化学类型出现了Cl型水和SO4型水。而湿地受黄河水和污水处理厂回水补给的混合影响，导致主要的水化学类型改变为HCO3-Ca·Mg·Na型水。
（3）基于Gibbs模型分析表明，中牟县地下水水化学组分主要控制因素是岩石风化作用。人类活动对水化学组分也存在一定的影响。其中，三氮受人类活动影响强烈，而Na+、K+、
SO2−4 和Cl−也受到不同程度人类活动的影响。（4）基于相关性分析，在不同土地利用类型下，地下水水化学组分除三氮（NH4+、NO3−和NO2−）外，均表现出极显著或显著的正相关关系，表征它们来自于地层岩石风化。而NH4+和NO3−表现出显著的负相关关系，二者主要来自于化肥和生活污水。在农业用地和住宅用地中地下水可能发生强烈的硝化作用，但在湿地，地下水受到黄河河水的稀释，且地下水可能发生了反硝化作用。
（5）上述研究结果表明，生活污水和化肥是该地区地下水主要的污染源。因此，建议当地政府和环保部门要严格立法和监管，禁止生活污水的不达标排放。此外，农业管理者应该推广科学施肥策略（如测土配方施肥，因时和因作物施肥，施用缓释肥等）来提高肥料的利用率，防止过量施肥对地下水的污染。
郑州市中牟县地下水水化学特征及控制因素
Research of groundwater chemical characteristics and controlling factors in Zhongmu County, Zhengzhou City
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摘要: 地下水是维持人类生存和发展的重要资源。近年来，由于人类活动的强烈干扰，导致地下水的水化学特征发生改变，严重影响了其使用价值和生态功能。本研究以郑州市中牟县作为研究地区，联合应用Piper三线图、Gibbs图、离子比例系数法和多元统计技术，探究该地区地下水化学演变特征及形成机制，结果表明，中牟县地下水主要的阳离子是Ca2+ 和Na+，主要的阴离子是
HCO−3 和 Cl−。地下水主要的水化学类型为HCO3-Ca(Mg)型，占总水样的46.2%。农业用地受到施肥的影响，水化学类型出现了Cl型水（20.8%）和SO4型水（6.25%），住宅用地由于受到生活污水的影响，出现了高比例的Na型水（55.0%）。而在湿地，地下水受到黄河水和污水处理厂回水混合影响，导致其主要的水化学类型转变为HCO3-Ca(Mg)·Na型。中牟县地下水水化学组分主要控制因素是岩石风化作用，并且主要受控于硅酸盐岩风化，而人类活动对水化学组分也存在一定的影响。相关性分析表明，在不同土地利用类型下，除NH+4 、NO−3 和NO−2 外，其余水化学组分之间表现出显著的正相关关系，表征它们主要来自地层岩石风化。NH+4 和NO−3 表现出显著的负相关关系，说明二者主要来自于化肥和生活污水。在农业用地和住宅用地中地下水可能发生强烈的硝化作用，但是，湿地地下水可能发生了反硝化作用。研究结果可为中牟县地下水可持续开发利用提供理论依据和数据支撑。Abstract: Groundwater is an important resource for human survival and development. In recent years, due to the strong interference of human activities, the hydrochemical characteristics of groundwater have changed, which has seriously affected its use value and ecological function. In this study, the evolution characteristics and formation mechanism of groundwater chemistry in Zhongmu County, Zhengzhou City, were analyzed by using Piper trilinear diagram, Gibbs diagram, ion proportion coefficient and multivariate statistical techniques. The results showed that the main cations of groundwater in the study area were Ca2+ and Na+, and the anions were dominated byHCO−3 and Cl−. The main hydrochemical type of groundwater was HCO3-Ca(Mg), which accounts for 46.2% of the total water samples. Affected by agricultural activities, Cl type water (20.8%) and SO4 type water (6.25%) were found in agricultural land. Residential land was affected by domestic sewage, Na type water (55.0%) accounted for a high proportion. However, in wetlands, groundwater was affected by the mixed action of Yellow River and sewage treatment water, resulting in the major hydrochemical type changed to HCO3-Ca (Mg)-Na. The main controlling factor for the chemical composition of groundwater in Zhongmu County was rock weathering (silicate rock weathering). Human activities also have an effect on the chemical composition of groundwater. Correlation analysis showed that the main groundwater hydrochemical components (exceptNH+4 ,NO−3 andNO−2 ) in different land use type have a significant positive correlation, which indicated that they came from rock weathering.NH+4 andNO−3 showed a significant negative correlation, indicating that they mainly came from fertilizer and domestic sewage. Strong nitrification may occur in groundwater in agricultural and residential lands, while in wetlands, denitrification may occur in aquifers. The results can provide theoretical basis and data support for sustainable development and utilization of groundwater in Zhongmu County.-
Key words:
- Hydrochemistry /
- evolution law /
- controlling factor /
- ion source
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邻苯二甲酸酯类化合物（phthalate esters， PAEs）是邻苯二甲酸酐与醇反应生成的化合物，它是提高聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）弹性的重要添加剂，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是目前使用量最大的一种邻苯二甲酸酯，用量高达80%[1]. DEHP广泛应用于儿童玩具、塑料包装、化妆品及各类医疗器械[2-3]. DEHP的广泛使用导致了不可避免的环境释放以及人体摄入. 大量实验指出我国人群DEHP的暴露剂量约为11—116 μg·kg−1·d−1，接近DEHP的每日可耐受摄入量（TDI）（20—140 μg·kg−1·d−1），表明 DEHP对人群的健康构成重大危害[4].
DEHP具有内分泌干扰效应，可以诱发生殖发育毒性、肝脏毒性、胚胎毒性等多种毒性[5-6]. DEHP通过消化道进入人体后在胃肠道的脂肪酶作用下水解成初级代谢物乙基己醇（2-EH）和邻苯二甲酸单乙基己基酯（mono-ethylhexyl phthalate，MEHP），再通过尿液排出体外[7]. 通过对尿液的单酯类物检测发现，原尿和酶解后的尿液中 MEHP 的检出率最高，平均检出率超过60% [8]. 此外，试验结果表明DEHP的毒性主要来源于其代谢物 MEHP，其毒性作用高达DEHP的10倍[9]. 同时，MEHP的动物实验表明，其主要分布在肾脏、膀胱和肝脏，其中肝脏为MEHP最主要的靶器官[10]. Thomas等的研究中，大鼠口服500 mg·kg−1 DEHP，30 min后，肝脏MEHP水平为12.5 mg·g−1 [11]. MEHP毒性作用主要体现在增加肝脏亲脂活性，导致肝脏中出现脂肪堆积，继而引发肝细胞脂肪变性[12].
肝脏在体内发挥着外源物质解毒和代谢脂类物质的主要作用. 肝脏内游离脂肪酸增加和甘油三酯沉积是肝脏脂质代谢紊乱的主要表现. 近年来，全球肥胖病与非酒精性脂肪肝患病率快速上升. 体内体外实验提示脂肪代谢紊乱会增加肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝病的患病危险度. 流行病学和毒理学研究报告称，接触DEHP会影响机体脂肪代谢，从而促进肥胖[13]. 体内实验表明大鼠用DEHP处理后，肝脏重量增加，主要机制可能与肝代谢酶改变有关[14]. 有体外实验表明，MEHP处理HepG2细胞后，激活了PPARα使脂肪酸的氧化分解受到抑制[9]，导致肝细胞内的脂质堆积并造成肝脏损伤. 在本课题组的前期研究发现，MEHP 处理后的HepG2 细胞的乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的亚型ACC1蛋白表达水平增加，最终使肝脏细胞中脂肪酸合成增加. 这些结果表明，MEHP 可能通过影响脂质合成相关基因或蛋白的表达，从而导致肝细胞脂肪代谢出现紊乱. 为此，本实验以HepG2细胞为实验对象，通过MEHP染毒，观察细胞内脂质代谢情况，并通过基因芯片高通量筛查差异基因，探讨MEHP对体外脂质合成的影响及其可能的作用机制.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 细胞培养与染毒
从中国科学院上海生命研究院细胞资源中心购买HepG2细胞. 细胞培养基含 10%胎牛血清、1%青霉素庆大霉素双抗. 细胞培养条件为37 ℃、5% CO2. 取指数生长期的细胞进行染毒，参考相关文献[9]及我国人群接触水平设置染毒浓度. 共设置5个染毒浓度 ：阴性对照（完全培养基）、阳性对照（1 mmol·L−1油酸）、0.01 、1 、10 μmol·L−1MEHP. 染毒48 h后进行相关实验.
1.2 细胞油红 O 染色
为了研究细胞中脂滴的蓄积，用油红O法对HepG2细胞进行染色. 5个实验组的细胞染毒48 h后进行染色. 主要步骤为：弃去孔中废弃培养基，用 PBS 漂洗细胞，4%（质量分数）多聚甲醛固定细胞，油红O染色30 min，60%（体积分数）异丙醇洗去多余染料，苏木精复染细胞核10 s. 用显微镜获取图像并观察细胞内脂滴情况.
1.3 芯片数据以及数据前处理
用1 μmol·L−1 MEHP处理的细胞进行芯片分析，Agilent （人）表达谱芯片由博奥晶典公司完成. 步骤如下：以待检测样品的 total RNA 为起始，进行体外扩增和荧光标记，然后用Oligo（dT）Primer 引物合成cRNA并进行纯化和反转录得到cDNA. 最后用 Klenow Fragment 酶合成带有荧光基团的DNA 进行芯片杂交. 用 Feature Extraction 提数软件对芯片杂交扫描后的图片数据进行处理分析.
1.4 差异基因的筛选
通过Ｒstudio limma包将芯片基因的数据进行处理，以表格格式导出并进一步筛选差异表达基因. 差异表达基因（DEG）定义为差异倍数 FC大于 1.5或小于0.67且 P值小于 0.05的基因.
1.5 DEG功能富集分析
将上述分析得出的DEG导入 DAVID在线数据库（
https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp ），进行GO分析. 通过对显著表达的基因进行功能注释分析，包括生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），进而了解差异表达基因的生物学意义. 以 P<0.05认为具有显著性.1.6 PCR验证
按照1.1节对处于指数生长期的细胞进行染毒，每个实验组设置6个平行对照，染毒48 h后提取RNA. 细胞样品用Trizol试剂裂解，提取总RNA. 用超微量分光光度计测定RNA的含量和纯度. 将符合条件的RNA （A260/A230>2.0，和A260/A280=1.8—2.0）样本用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA备用.
从具有显著性且参与脂质代谢过程的差异基因中选取丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基2（PDP2）、磷脂酶A2组 IVE（PLA2G4E）、脂肪酸去饱和酶 6（FADS6）、Q型蛋白酪氨酸磷酸酶受体（PTPRQ）、CD28、甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）作为目的基因，检测mRNA表达水平（荧光定量PCR仪为Line Gene 9600）. 引物信息如表1所示. 以GAPDH为内参，数据分析时取Ct值的平均值，用相对定量法2−△△ct法计算目的基因表达的变化情况. 采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，多组间比较使用单因素方差分析，事后比较用LSD 检验进行，P<0.05认为具有统计学意义.
表 1 实时定量PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time quantitative PCR基因Gene 引物Primer PDP2 S——GAAGATGAGGTGACAAGGAA F——GCCAGCACAAG MVD GAACTTA PLA2G4E S——TTCTGTCCTATGGCTCCTT F——GTTCTTCACTCGGCTCTG FADS6 S——CCTCAACCGCTATGTCTAC F——CGATGTGCTGGAAGATGT PTPRQ S——ATGTCTATATTGCGGCTGAA F——TTCTTACTTGCGTGGATTCT CD28 S——GCTCTTGGCTCTCAACTTA F——CCTGCTCCTCTTACTCCT SC5D S——CTTGCTGGAGATAAGAGGTT F——TATGGTGGTCTGTATGATGAG MVD S——CAAGGACTTCACCGAGGA F——GTAGGCTAGGCAGGCATA | Show Table
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1.7 基因表达谱数据动态分析
将细胞脂质代谢通路的基因输入 GEPIA 在线分析网站（http://gepia.cancer-pku.cn/），分析其在肝癌组织中的表达. P<0.05认为具有统计学意义.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 油红O 染色结果
如图1所示，阴性对照组细胞有明显的边界，细胞内没有脂滴存在. 油酸染毒的细胞可见大量明显着色的脂滴，主要分布在细胞膜内侧区域，大小不等. 与阴性对照组相比，0.01 μmol·L−1 MEHP剂量组未见明显改变；1、10 μmol·L−1 MEHP剂量组可观察到少量红色脂滴，且随着染毒浓度的增大，脂滴的数量也逐渐增加，暂时未见对细胞边界的影响. 在前期实验中本课题组对MEHP染毒的HepG2细胞中的甘油三酯（TG）含量进行了定量检测， TG含量结果与油红O染色结果相一致，提示较高剂量 MEHP 暴露可提高细胞中的脂质水平[8]. 这一结果表明， MEHP暴露后，导致HepG2细胞中的甘油三酯蓄积，从而引起肝细胞中的脂质沉积.
图 1 不同浓度MEHP染毒对HepG2细胞内脂肪积累的影响（×400）Figure 1. Effects of different concentrations of MEHP on lipid accumulation in HepG2 cells（×400）A:光镜下未染色HepG2细胞；B:阳性对照组；C:阴性对照组；D、E、F：0.01、1、10 μmol·L−1 MEHP组. →为 HepG2 细胞内红色脂滴.A: HepG2 cells were not stained under light microscope; B: Positive control group; C:Negative control group; D、E and F: 0.01、1 and 10 μmol·L−1 MEHP groups; →represents red lipid droplets.2.2 差异基因筛选
如图2所示，根据P<0.05，FC>1.5或<0.67的筛选标准，共筛选出93个差异表达基因（表2），其中上调的基因57个，下调的基因36个.
表 2 差异基因的表达情况Table 2. The expression of differentially expressed genesUp Down symbol lgFC P.Value symbol lgFC P.Value DPPA3 0.743871 0.000032637 TTTY14 −0.75345 0.000683968 MYLIP 0.685596 0.000320629 XLOC_008352 −0.691 0.001413602 XLOC_000888 0.664559 0.000498704 LOC100129112 −0.83639 0.001799658 LOC100127994 0.609364 0.00056601 SC5D −0.92097 0.002090916 SYT17 0.650856 0.000986627 XLOC_004178 −0.72657 0.002192512 XLOC_008003 0.727595 0.00115933 C14orf119 −0.78947 0.003595082 LOC100506487 0.589801 0.001543009 XLOC_l2_012082 −0.61338 0.004605101 FADS6 0.784036 0.002373877 XLOC_012908 −0.92876 0.006283058 AQP10 0.603687 0.00355145 GABRG1 −1.01945 0.007994 XLOC_001387 0.675839 0.003916862 NUMB −0.57939 0.008775398 KCNE4 0.831973 0.003949384 FLJ21408 −0.61905 0.009899712 XLOC_005215 0.65671 0.004608305 LOC100505657 −0.89616 0.010826125 OR5L1 0.922639 0.004609802 ZNF554 −0.60913 0.011699612 C14orf180 0.649561 0.005207664 XLOC_012871 −0.78553 0.01385829 RHOXF1 0.622636 0.007822227 XLOC_007131 −0.7273 0.014006601 PTPRQ 0.739332 0.008548009 XLOC_l2_014785 −0.66169 0.01855114 LOC286382 0.586815 0.008726912 PRO0611 −0.78996 0.018748849 ACOD1 0.61305 0.008957375 CREG2 −0.70749 0.018758137 LOC100130744 0.85844 0.009748146 XLOC_l2_004857 −0.66225 0.023632428 ZAP70 0.625018 0.010183849 PDP2 −0.80976 0.023933353 PLA2G4E 1.427762 0.011394311 XLOC_l2_011207 −0.57923 0.026335268 LOC652586 0.614123 0.011818286 XLOC_007761 −0.58384 0.027416794 XLOC_006019 0.666199 0.012002598 GNL3LP1 −0.6286 0.027632132 SLAMF7 0.896594 0.013447959 XLOC_l2_013646 −0.89314 0.028992205 XLOC_005433 0.588529 0.014072632 MVD −0.63712 0.031037423 KRTAP13-2 0.681023 0.014111061 LOC728065 −0.58089 0.031598939 XLOC_008237 0.804098 0.01445258 XLOC_l2_011011 −0.60147 0.033573436 XLOC_008244 0.677154 0.01652238 XLOC_001687 −1.03697 0.037696163 LOC100505966 0.836326 0.01818776 XLOC_004804 −0.68571 0.039579631 XLOC_001422 2.454291 0.018227482 LOC100507110 −0.60107 0.041523521 CSN2 1.0231 0.020348553 CACNG8 −0.61314 0.041704333 XLOC_003782 0.639271 0.021116476 SNORD70 −0.92894 0.044259091 XLOC_005572 0.585382 0.02204518 LOC100128126 −1.05439 0.044856832 XLOC_003349 1.233979 0.022738339 NPPA-AS1 −0.59523 0.048087643 XLOC_l2_00770 0.610547 0.023106187 XLOC_001550 −0.64752 0.04894801 SNORD115-48 0.719119 0.024508996 INE1 −1.017 0.0496582 SNORD115-4 0.688309 0.026211298 XLOC_001755 0.605516 0.028061446 ANK2 0.906401 0.029169596 CD28 0.589859 0.029610282 LOC100506563 1.019834 0.029837404 ANXA10 0.626939 0.030222491 CYBB 1.151916 0.03336549 XLOC_012064 1.019834 0.0345969 XLOC_013649 0.624561 0.035226312 XLOC_010183 1.380268 0.035959747 XLOC_006983 0.862151 0.040708371 XLOC_004274 0.720596 0.040795527 XLOC_008690 0.686422 0.041491936 XLOC_007888 0.852148 0.04152697 XLOC_l2_011145 0.704819 0.042378972 SLC24A4 0.757531 0.043335006 XLOC_013458 0.71734 0.043999913 TREML1 0.800135 0.047577606 TRIM49 0.796312 0.048328175 ANKDD1B 0.683738 0.049447534 DUSP21 0.604901 0.049510457 | Show TableDownLoad:
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2.3 差异基因的功能富集分析
通过对差异基因进行GO分析探讨差异基因所涉及的生物学过程，包括基因的３个部分：分子功能（MF）、细胞组分（CC）、生物过程（BP）. 结果显示，可以识别的基因一共有48个，显著富集的GO条目一共有13条（P<0.05），其中生物过程7条（图3）. 前5条通路及具体信息见表3，主要包括细胞脂质代谢过程（cellular lipid metabolic process）、T细胞阴性选择（negative T cell selection）、跨膜运输（transmembrane transport）、跨膜转运的调控（regulation of transmembrane transport）、先天免疫反应（innate immune response）；分子功能2条,包括被动跨膜转运活性（passive transmembrane transporter activity）、基质特异性跨膜转运蛋白活性（substrate-specific transmembrane transporter activity）；细胞组分4条，包括膜的外部成分（extrinsic component of membrane）、等离子体膜（plasma membrane）、质膜部分（plasma membrane part）.GO 分析表明, 最显著激活的通路是细胞脂质代谢通路，他由上调基因 FADS6、PTPRQ、CD28、 PLA2G4E 和下调基因 SC5D、PDP2、MVD 组成.
图 3 DAVID分析中生物过程通路的GO条目与基因Figure 3. Chord plot depicting the relationship between genes and GO terms of biological process表 3 DAVID分析中前5个通路（BP）与基因Table 3. Top 5 GO terms （BP） of the genes with the DAVID analysisGO TermGO 条目 Count数量 Genes基因 Fold Enrichment富集倍数 P Value P值 GO:0044255cellular lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 3.85628326776209 0.0068 GO:0045087innate immune response 5 TREML1, ZAP70, CYBB, ACOD1, SLAMF7 3.042438312 0.0494 GO:0055085transmembrane transport 7 SLC24A4, CACNG8, KCNE4, AQP10, CYBB, ANK2, GABRG1 3.024137931 0.0204 GO:0006629lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 5.660947851 0.0210 GO:0034762regulation of transmembrane transport 4 CACNG8, KCNE4, CYBB, ANK2 3.43652037617554 0.0300 | Show TableDownLoad:
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2.4 PCR验证
MEHP染毒后相关基因mRNA表达水平的变化如图4所示. 与阴性对照组相比，基因FADS6 在1 μmol·L−1 MEHP染毒样品内基因表达水平明显增加（P<0.05）；基因SC5D、PDP2在1 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05），MVD在10 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05）. 其中，基因SC5D、PDP2、MVD、FADS6的mRNA表达水平与芯片结果表达一致，基因PTPRQ、CD28、PLA2G4E结果不一致.
图 4 不同浓度MEHP染毒对 HepG2 细胞相关基因mRNA表达水平影响Figure 4. Effects of different concentrations of MEHP on mRNA expressions of relative genes in HepG2 cells本研究通过转录组数据分析探讨MEHP在HepG2细胞脂质代谢过程中发挥作用的基因，发现细胞脂质代谢通路上的基因FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E在代谢过程中起重要作用. 脂肪酸去饱和酶（FADS6）在多不饱和脂肪酸（PUFA）的合成途径中起关键作用，参与了PUFA合成过程中的限速步骤，并调节PUFA的代谢通量[15]. 据报道，FADS6的活性是调节生物体中多不饱和脂肪酸比例的主要因素,其活性改变会影响一些疾病，如炎症和肿瘤发生，2型糖尿病，心血管疾病，代谢紊乱和神经精神疾病[16]. Montell的研究发现，含不饱和脂肪酸的二脂酰甘油（DAG）比饱和脂肪酸的DAG对二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）有更强的亲和力，即肝脏合成 TG 首先利用不饱和脂肪酸, 更容易导致甘油三酯积累，而饱和脂肪酸多以 DAG 的形式蓄积[17].
本实验富集分析与PCR的结果显示，FADS6的mRNA表达水平升高，促进了HepG2细胞中多不饱和脂肪酸合成，这可能是HepG2细胞中甘油三酯合成增多进而出现脂肪堆积的原因. 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）参与胆固醇生物合成过程中的早期步骤. 通过Jump实验中转录组数据的KEGG分析显示，MVD参与SREBP激活基因表达、SREBP调节胆固醇生物合成、脂类和脂蛋白代谢等胆固醇代谢相关的通路，MVD的变化可调控乙酰乙酰-辅酶A的变化，进而改变）胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）的表达水平[18]，已有研究证明SREBP的上调导致肝细胞内胆固醇合成增加 [19] . 甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）是一种胆固醇生物合成酶，它催化乳甾醇（lathosterol）转化为7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol），参与胆固醇合成中的酶促反应通路[20]. 有文献报道SC5D基因缺陷会引起乳甾醇症（Lathosterolosis），一种罕见的常染色体隐性胆固醇生物合成障碍疾病[21]. SC5D基因在HepG2细胞中表达水平的改变导致细胞内胆固醇合成发生紊乱. 磷脂酶A2（PLA2）是一种参与脂蛋白代谢和炎症途径的酶，所产生的脂质介质对细胞代谢起重要调控作用. 有文献报道NAFLD病人血浆中PLA2水平和肝脏的脂肪变性程度呈显著正相关,这说明PLA2可能参与肝细胞代谢过程中[22]. 有研究证实PLA2过表达的肝脏甘油三酯（TG）含量显著增加，同时增加趋势与PLA2的表达趋势相一致[23]. PLA2G4E作为PLA2的一种，对肝脏细胞的代谢也有调控作用. 本研究中发现，芯片结果中PLA2G4E表达水平升高，提示PLA2G4E是MEHP诱导甘油三脂含量增加，扰乱肝细胞脂质代谢的原因之一.
2.5 关键差异基因的在肝癌中的表达
利用在线分析工具GEPIA分析以上基因在肝细胞癌组织的表达水平，如图5所示. 这7个基因在肝细胞癌组织中的表达变化对比正常组织没有显著性. 但是以上基因在HepG2肝癌细胞脂质代谢过程中的表达水平均具有明显改变，导致肝癌细胞脂质代谢紊乱、脂肪堆积.
图 5 关键基因在肝癌中的表达水平Figure 5. Relative expression comparison of key genes in liver cancer samples in GEPIA database非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种可逆性的疾病，但随着研究的不断深入， NAFLD的发病范围由单纯脂肪肝、脂肪肝、肝硬化发展到原发性肝细胞癌[24]. 多项研究证明NAFLD可逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH），从而导致肝硬化[25]，而肝硬化是除HBV、HCV引起原发性肝癌的另一主要原因. 因此假如高龄、胰岛素抵抗、肥胖等危险因素持续存在，NAFLD最终可引起肝癌. 同时Iris [26]的动物实验和Ertle[27] 的研究证实，NAFLD可不经肝硬化阶段发展为原发性肝癌. 由此可知，虽然以上基因在肝癌组织中的表达没有明显变化，但是对肝癌的前身——NAFLD发生发展具有重要作用.
3. 结论（Conclusion）
本研究以HepG2细胞为研究对象，结合油红O染色以及基因芯片等技术，发现MEHP暴露影响了细胞脂质代谢等信号通路，改变了关键因子FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E的表达水平，导致肝脏细胞中甘油三酯与胆固醇的合成增加，肝脏细胞出现脂肪蓄积. 综上所述，MEHP暴露可以通过改变细胞代谢相关基因引起肝脏细胞内脂质代谢紊乱.
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表 1 研究区地下水水化学参数统计表
Table 1. Descriptive statistics of groundwater hydrochemical parameters in the study area.
均值Mean value 最小值Minimum value 最大值Maximum value 标准差Standard deviation 超标率/%Exceed standard rate 国标Ⅲ类Standard(Ⅲ) pH 7.62 6.71 8.51 0.26 1.1 6.5—8.5 TDS/(mg·L−1) 612 200 1408 231 3.2 1000 K+/(mg·L−1) 2.10 0.27 10.6 2.00 — — Na+/(mg·L−1) 69.5 6.72 208 48.5 1.1 200 Ca2+/(mg·L−1) 107 7.86 281 47.5 — — Mg2+/(mg·L−1) 36.1 2.90 87.0 16.6 — — HCO3−/(mg·L−1) 418 165 792 137 — — Cl−/(mg·L−1) 67.3 5.21 190 49.6 0 250 SO42-/(mg·L−1) 71.8 4.03 248 47.9 0 250 NO3−/(mg·L−1) 42.4 0.20 338 66.3 19.4 88.6 NH4+/(mg·L−1) 0.159 0.002 1.106 0.237 6.5 0.64 NO2−/(mg·L−1) 0.160 0.002 1.960 0.307 0 3.29 TH/(mg·L−1) 414 28.3 978 159 39.8 450 注：国标Ⅲ类指地下水质量标准Ⅲ类（GB/T14848-2017）[17]. Note: Standard is grade Ⅲ standard for groundwater quality in China (GB/T14848-2017)[17].
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表 2 研究区不同土地利用类型地下水水化学类型统计表
Table 2. Statistic table of groundwater hydrochemistry type of different land use in the study area
水化学类型Hydrochemical type 水化学类型出现比例/%Proportions of hydrochemical type 农业用地Agricultural land 住宅用地Residential Land 湿地Wetland 工矿用地Industrial land HCO3-Ca(Mg) 58.3 40.0 10.5 83.3 Cl型水 20.8 20.0 10.5 16.7 Na型水 20.8 55.0 89.5 0 SO4型水 6.25 0 0 0
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表 3 中牟县地下水化学成分衬度系数方差表
Table 3. variance analysis of contrast coefficient of groundwater hydrochemical compositions in the Zhongmu County
水化学组分Hydrochemical compositions 农业用地Agricultural land 住宅用地Residential land 湿地Wetland 工矿用地Industrial land SO42− 0.513 0.267 0.283 0.796 Cl− 0.644 0.517 0.189 1.798 NH4+ 2.855 4.751 0.353 1.359 NO2− 4.938 3.168 1.297 1.949 NO3− 1.520 1.980 0.428 3.789 HCO3− 0.151 0.045 0.065 0.049 Na+ 0.725 0.279 0.183 0.443 K+ 1.232 0.933 0.380 0.156 Ca2+ 0.161 0.418 0.067 0.167 Mg2+ 0.256 0.140 0.092 0.100
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表 4 研究区农业用地地下水水化学组分的相关性分析
Table 4. Correlation analysis of groundwater hydrochemistry component of agricultural land in the study area
TH TDS SO42− Cl− NH4+ NO2− NO3− HCO3− Na+ K+ Ca2+ Mg2+ 农业用地 TH 1 0.950** 0.713** 0.877** 0.267 0.347* 0.132 0.778** 0.699** 0.663** 0.928** 0.916** TDS 1 0.801 0.922** 0.320* 0.337* 0.186 0.776** 0.796** 0.666** 0.850** 0.939** SO42− 1 0.750** 0.325* 0.093 −0.029 0.606** 0.709** 0.630** 0.624** 0.719** Cl− 1 0.396** 0.262 0.102 0.710** 0.764** 0.616** 0.815** 0.853** NH4+ 1 0.168 −0.496** 0.506** 0.532** 0.393** 0.188 0.402** NO2− 1 0.321* 0.170 0.176 0.030 0.356* 0.303* NO3− 1 −0.292* −0.222 −0.125 0.253 −0.003 HCO3− 1 0.879** 0.668** 0.587** 0.895** Na+ 1 0.642** 0.496** 0.880** K+ 1 0.619** 0.646** Ca2+ 1 0.732** Mg2+ 1 住宅 TH 1 0.767** 0.674** 0.734** −0.363 0.139 0.438 0.465* −0.344 0.513* 0.958** 0.681** TDS 1 0.893** 0.890** −0.122 0.159 0.283 0.626** 0.241 0.598** 0.684** 0.624** SO42− 1 0.832** −0.111 0.197 0.314 0.448* 0.266 0.352 0.593** 0.653** Cl− 1 −0.158 0.158 0.229 0.472* 0.111 0.543* 0.695** 0.614** NH4+ 1 0.272 −0.543* 0.19 0.480* −0.133 −0.436 −0.016 NO2− 1 0.193 0.002 0.06 0.252 0.257 0.207 NO3− 1 −0.373 −0.441 0.065 0.487* 0.099 HCO3− 1 0.424 0.564** 0.333 0.43 Na+ 1 0.089 −0.445* 0.032 K+ 1 0.471* 0.460* Ca2+ 1 0.531* Mg2+ 1 湿地 TH 1 0.946** 0.639** 0.722** −0.031 0.217 0.421 0.786** 0.789** 0.298 0.883** 0.818** TDS 1 0.611** 0.736** 0.109 0.098 0.333 0.830** 0.918** 0.291 0.787** 0.823** SO42− 1 0.756** 0.053 0.14 0.379 0.16 0.416 0.077 0.685** 0.391 Cl− 1 0.213 0.225 0.235 0.302 0.600** −0.057 0.705** 0.505* NH4+ 1 0.2 −0.552* 0.055 0.176 −0.301 −0.175 0.048 NO2− 1 0.265 0.043 −0.021 0.108 0.157 0.219 NO3− 1 0.168 0.213 0.169 0.315 0.463* HCO3− 1 0.844* 0.396 0.565* 0.821* Na+ 1 0.281 0.591** 0.825* K+ 1 0.296 0.261 Ca2+ 1 0.556* Mg2+ 1 注：** 表示在 0.01 水平上线性相关，* 表示在 0.05 水平上线性相关. Note：** P<0.01; * P<0.05.
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