测试化合物中，四环素类抗生素购自Sigma-Aldrich化学制品有限公司，硝酸银、β-内酰胺类、氨基糖苷类、多肽类、大环内酯类抗生素以及唑啉类杀菌剂、表面活性剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纳米银溶液购自宇瑞（上海）化学有限公司，纯度均为分析纯以上，化合物的基本信息如表1。

本实验中使用的模式生物E.coli（Escherichia coli K-12 MG1655），菌种冻干粉购自Biovector生物科技有限公司（北京）。

受试化合物在毒性试验中采用不超过总体积0.1%的二甲基亚砜（DMSO）助溶后，用1 %NaCl溶液配制成待测化合物母液。实验时再用1%NaCl溶液将待测化合物母液稀释成等对数梯度系列，将化合物溶液加入96孔酶标板中，每孔包含80 μL的待测化合物溶液（作为实验组）或1 %的NaCl溶液（作为对照组），80 μL的2.5倍LB培养基和40 μL工作菌液。最后将96孔酶标板放置在37ºC下，转速为165 r·min⁻¹的培养箱中培养24 h至E.coli到平台期后，用酶标仪测定波长600 nm处，96孔板每孔的光密度（optical density，OD₆₀₀）。通过剂量-效应曲线得到抑制率达到50 %时对应的化合物浓度即为EC₅₀，根据单一化合物的EC₅₀，配制化合物A与化合物B在1∶1、1∶5和5∶1毒性比的混合溶液，然后按照单一毒性测定方法测定系列混合溶液的联合毒性。

单一毒性结果采用抑制率Inhibition（%）来表征，联合毒性作用采用毒性单位（Toxicity Unit TU）值来表述，抑制率及TU值的计算如下式：

式（1）中，OD_600,0为E.coli在无染毒作用下的对照组OD平均值，OD_600，i为测试化合物作用下实验组的OD平均值。式（2）中，C_A、C_B是混合体系产生50 %抑制效应时化合物A、B各自的摩尔浓度（mol·L⁻¹），EC_50A和EC_50B是单一化合物A、B分别作用产生50%抑制效应时的浓度。根据采用Broderius的联合毒性作用判别标准^[13]，当 TU<0.8认为两组分间为协同效应；0.8≤TU≤1.2认为两组分间为相加效应；TU>1.2认为两组分间为拮抗效应。

银系抗菌剂与8种有机抗菌剂对大肠杆菌的单一毒性数据如表1所示。其中，毒性最大的为多肽类抗生素PMX，其−lgEC₅₀为6.59 mol·L⁻¹。所有抗菌剂中的毒性大小排序为：多肽类抗生素PMX>氨基糖苷类抗生素GEN>四环素类抗生素TC>大环内酯类抗生素ERY>AgNPs>唑啉类杀菌剂MIT>AgNO₃>糖肽类抗生素VA>表面活性剂DTAB>β-内酰胺类抗生素PVP。

基于前人对于银系抗菌剂的研究，纳米银和硝酸银的作用机制如图1所示，AgNO₃通过释放Ag⁺来发挥其抗菌性，Ag⁺能吸附在带负电的细菌细胞壁上，并能够穿透细胞膜进入细胞内部，与细菌中蛋白酶上的巯基（—SH）迅速结合，使蛋白酶丧失活性，同时，也可以通过浓缩DNA使其失去复制能力而引起DNA的降解来抑制细菌的生长繁殖^[14-15]。AgNPs抗菌机理主要由于其自身的尺寸很小而具有较高比表面积，从而呈现较高的反应活性，释放出Ag⁺发挥其抗菌作用；同时，AgNPs还可以通过扩散或内吞作用进入细胞，引起线粒体功能障碍，造成线粒体呼吸链的破坏，增加活性氧（ROS）的产生并抑制了三磷酸腺苷ATP的合成，从而导致DNA损伤、细胞内的蛋白质受损，当生成的ROS超过细胞抗氧化防御系统的能力时，发生氧化损伤，最终抑制细菌的增殖^[16]。本研究中，AgNO₃和AgNPs的-logEC₅₀分别为4.51 mol·L⁻¹和4.78 mol·L⁻¹，说明AgNO₃与AgNPs的抗菌活性相差不大。因此，推测实验中AgNO₃与AgNPs的可能都是主要Ag⁺来发挥毒性作用。该推测与已有研究^[17-18]中表明AgNO₃和AgNPs主要是通过释放Ag⁺来发挥其抗菌性的结论一致。

基于前人对于有机抗菌剂的作用机理的研究，将本文研究的有机抗菌的作用机理归纳为以下两个方面：一是与细胞壁和细胞膜系统相互作用；二是与细菌核糖体相互作用。

多肽类抗生素PMX和表面活性剂DTAB主要通过作用于细菌的细胞膜上来表达毒性（图2（a））。多肽类抗生素PMX的靶标是在膜的脂多糖（LPS）组件上，通过与LPS的脂质A成分直接相互作用来透化细菌外膜OM，随后插入并破坏内膜磷脂双分子层的物理完整性，使细胞内成分外漏而造成细菌死亡^[19-20]。表面活性剂DTAB由于其分子中疏水的碳氢长链容易插入到细胞膜磷脂双层，从而引起细胞膜损伤，最终导致细菌死亡^[21]。β-内酰胺类抗生素PVP和糖肽类抗生素VA主要通过作用于细菌的细胞壁上来发挥其抗菌性（图2（b））。β-内酰胺类抗生素PVP主要靶位为青霉素结合蛋白（PBPs），由于其结构可充当粘肽D-丙氨酰-D-丙氨酸（D-Ala-D-Ala）的末端的-CO-N-，从而竞争性地与PBPs结合，阻碍了细菌细胞壁肽聚糖生物合成，使细胞的外形难以维持，引起溶菌，最终导致细菌死亡^[22-23]。糖肽类抗生素VA通过与D-Ala-D-Ala末端的肽聚糖前体小肽特异性结合，抑制细菌细胞壁肽聚糖的延伸与交联，从而使细菌细胞发生溶解死亡^[24]。唑啉类杀菌剂MIT的抗菌机理（图2（c））区别于其他抗菌剂的作用机理，其主要通过断开微生物细胞中的蛋白质键，并迅速与之发生作用，从而抑制细胞呼吸和ATP的合成，最终导致细菌死亡^[25]。

氨基糖苷类抗生素GEN、四环素类抗生素TC和大环内酯类抗生素ERY主要通过作用于核糖体来发挥其毒性（图2（d））。氨基糖苷类抗生素GEN穿过细胞后，与核糖体30s亚基的氨基酰-tRNA位点（A位点）的密码子-反密码子识别区附近的保守序列结合，从而导致翻译的准确性下降，最终抑制细菌蛋白质的合成，导致细菌死亡^[26]。四环素TC进入细菌胞后作用于核糖体中提供遗传密码翻译场所的30S亚基上，通过阻止氨基酰–tRNA与A位点结合，从而抑制蛋白质合成^[27-28]。大环内酯类抗生素ERY可以与50S亚单位结合从而抑制50S核糖体大亚基的形成，进而阻碍50S大亚基内的催化肽酰转移反应，最终导致蛋白合成能力降低，抑制细菌生长^[29-30]。

AgNO₃和AgNPs与8种有机抗菌剂的二元联合（1∶1、1∶5和5∶1毒性比）毒性实验结果如表2所示，结合实验结果绘制抗菌剂联合作用的TU分布图（图3），可以看出，AgNO₃和AgNPs与多肽类抗生素PMX、表面活性剂DTAB、β-内酰胺类抗生素PVP和唑啉类杀菌剂MIT对E.coli在所有毒性比的联合作用下呈现相加效应，而与糖肽类抗生素VA混合作用会产生较弱的协同效应（TU值越大协同效应越弱）。同时，AgNO₃和AgNPs与氨基糖苷类抗生素GEN在所有毒性比（1∶1、1∶5和5∶1）混合作用下均产生了明显的协同效应，与四环素类抗生素TC和大环内酯类抗生素ERY在1∶1和1∶5毒性比的作用下呈现协同效应。

为了探究联合毒性实验中银系抗菌剂中的主要抗菌因子，对这8种有机抗菌剂分别与AgNO ₃和AgNPs在1∶1、1∶5和5∶1毒性比联合作用的${\mathrm{T}\mathrm{U}}_{{\mathrm{A}\mathrm{g}\mathrm{N}\mathrm{O}}_{3}}$和${\mathrm{T}\mathrm{U}}_{\mathrm{A}\mathrm{g}\mathrm{N}\mathrm{P}\mathrm{s}}$进行了回归分析：

通过线性回归分析发现，${\mathrm{T}\mathrm{U}}_{{\mathrm{A}\mathrm{g}\mathrm{N}\mathrm{O}}_{3}}$和${\mathrm{T}\mathrm{U}}_{\mathrm{A}\mathrm{g}\mathrm{N}\mathrm{P}\mathrm{s}}$之间有较好的相关性（R²=0.703，P>0.01）。因此，推测在本研究的联合毒性实验中AgNO₃和AgNPs在混合体系中的抗菌性可能也主要Ag⁺来发挥其毒性作用。

基于AgNO₃和AgNPs与8种有机抗菌剂的二元联合毒性实验结果，可以看出氨基糖苷类抗生素GEN与银系抗菌剂的联合在所有毒性比混合下均呈现协同效应。那么银系抗菌剂与其他的氨基糖苷类抗生素联合可以产生协同效应吗？它们的联合协同机制又是怎样的呢？这些问题还有待进一步的讨论。因此，需进一步开展银系抗菌剂与多种氨基糖苷类抗生素的联合毒性效应研究。

为了探索银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素联合协同作用是否具有普遍性，选择5种氨基糖苷类抗生素（STR、NEO、TM、KAN和ISE）与AgNO₃和AgNPs在1∶1、1∶5和5∶1毒性比联合的毒性作用，5种氨基糖苷类抗生素的单一毒性如表1中所示，其中，毒性最大的为妥布霉素TM，其−lgEC₅₀为6.36 mol·L⁻¹。这5种氨基糖苷类抗生素的毒性大小排序为：TM>NEO>STR>ISE>KAN。

银系抗菌剂与这5种氨基糖苷类抗生素联合毒性实验结果如表3所示，结合实验结果绘制抗菌剂联合作用的TU分布图（图4）。可以看出，AgNO₃和AgNPs与4种氨基糖苷类抗生素（TM、NEO、STR、KAN）对大肠杆菌的二元联合效应在1∶1、1∶5和5∶1毒性比混合时均呈现协同效应。而AgNO₃和AgNPs与氨基糖苷类抗生素ISE在1∶1、1∶5和5∶1毒性比混合时基本呈现相加效应，且ISE仅与AgNPs（5 nm）在1∶1毒性比混合作用呈现协同效应。

基于以上的实验研究可知，银系抗菌剂与大部分的氨基糖苷类抗生素对大肠杆菌的二元联合毒性作用呈现协同效应。结合银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素单一毒性作用机制，银系抗菌剂的主要抗菌因子Ag⁺的作用靶点在蛋白酶上，使蛋白质无法有效分解，导致细菌死亡。而氨基糖类抗生素通过作用在核糖体上，最终抑制细菌蛋白质的合成，从而发挥其毒性。银系抗菌剂与氨基糖类抗生素的二元混合体系共同阻碍了蛋白质的合成与降解，破坏了蛋白质合成与代谢的整个过程。因此，推测银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素的联合协同效应可能是由于它们单一毒性作用的靶蛋白具有通路一致性，从而相互促进，共同作用产生协同作用（图5）。

此外，结合AgNO₃和AgNPs与5种氨基糖苷类抗生素联合毒性结果（图4），可以看出AgNO₃和AgNPs与氨基糖苷类抗生素在1∶1和5∶1毒性比混合时比1∶5毒性比混合作用呈现更强的协同效应（TU值越小表明协同效应越强），基于Herisse等^[31]的研究所表明的Ag⁺可以增加大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素的吸收，推测在AgNO₃和AgNPs与氨基糖苷类抗生素混合体系中，银系抗菌剂的主要抗菌因子Ag⁺可能会促进大肠杆菌摄入更多的氨基糖苷类抗生素的从而产生更强的协同效应。

基于上述研究，可以看出将具有作用通路一致性的银系抗菌剂和氨基糖苷类抗生素混合能够达到协同抗菌的目的。此外，在本文研究中，四环素类抗生素TC和大环内酯类抗生素ERY也都是通过作用于核糖体来表现毒性效应，而它们与银系抗菌剂的联合毒性也能在很大程度上表现出协同效应，这也进一步印证了作用通路一致性对于抗菌剂联用表现协同效应的重要性。因此，在今后的临床治疗中可以考虑银系抗菌剂与作用在核糖体上的抗菌剂联合用药。同时还可以进一步探索作用靶蛋白具有通路一致性的其他种抗菌剂之间的联合效应，以期可以寻找更多的抗菌治疗方案以提高抗菌剂抗菌疗效，并减少细菌耐药性问题。

本文所研究的受试生物为大肠杆菌，而大肠杆菌作为一种革兰氏阴性菌，其细胞壁有一层外膜，由脂蛋白、β-barrel蛋白、脂多糖和磷脂等组成。研究表明，革兰氏阴性菌的病原能力通常与其细胞壁组成相关，同种抗菌剂对于革兰氏阴性菌可能具有类似的抑菌效果^[32]。因此，本文研究的银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素对大肠杆菌的协同作用与机制，可以为常见的克雷白杆菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌的感染治疗提供参考。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的细胞壁组成成分和结构不同，使得这两类细菌对于抗菌剂会产生不同的敏感性。对于金黄色葡萄菌、链球菌、肠球菌和利斯特菌等常见的革兰氏阳性菌，本文研究的银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素的联合抗菌效果还需要开展相关的毒性实验进行探索验证。

此外，本文所研究的银系抗菌剂和多种有机抗菌剂的联合效应可以为环境中抗菌剂混合暴露的风险评价提供依据。抗菌剂主要通过医疗废水、生活污水、生产厂家以及畜禽和水产养殖业等废弃排放进入生态环境中，并通过食物链在整个环境中产生毒害作用，对微生物、水生生物和人类造成潜在危害^[33-34]。同时，多种抗菌剂在进入环境后会存在联合暴露的可能，而抗菌剂以不同种类和不同比例联合暴露时可能会产生不同的联合毒性作用。基于本文的研究结果，可以推测银系抗菌剂与不同的有机抗菌剂以不同比例在环境中混合暴露是可能会造成不同程度的环境风险，而银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素由于作用靶蛋白的通路一致性在环境中联合暴露时可能会带来更大的环境风险。因此，当作用靶蛋白具有通路一致性的抗菌剂在环境中联合暴露时，其环境风险值得研究与关注。

（1）AgNO₃和AgNPs无论在单一毒性实验中，还是与有机抗菌剂的混合作用中，它们都主要通过释放Ag⁺来发挥其对E.coli的毒性作用。

（2）不同有机抗菌剂与银类抗菌剂混合会产生不同的联合效应，其中氨基糖苷类抗生素与银系抗菌剂联合作用呈现更好的联合抗菌效果，且混合体系中银系抗菌剂占比更多时，其协同效应更强。

（3）银系抗菌剂与氨基糖苷类抗生素的协同作用机制可能是由于作用在蛋白酶上的银系抗菌剂与作用在核糖体上的氨基糖苷类抗生素的二元混合体系共同阻碍了蛋白质的降解与合成，它们的作用靶蛋白具有通路一致性。本研究能够为探索更多抗菌剂的联合协同治疗方案以及评价多种抗菌剂在环境中可能产生的混合暴露风险提供参考依据。