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诺氟沙星是第三代喹诺酮类抗菌药物，具有广谱抗菌作用。近年来，由于诺氟沙星等抗生素的不合理使用，导致在部分水体、土壤和人体体液中均能检测到抗生素残留。诺氟沙星的毒理学研究表明，长时间使用会使细菌产生耐药性，进入食物链中危害人体健康，具有一定的生理生化毒性，已经给生态环境和人体健康造成了严重的威胁[1]，因此需要严格控制环境中诺氟沙星的残留量，以保证生态环境的可持续性。目前，对于诺氟沙星的去除方法主要有光催化降解[2-4]，超声强化电活化过硫酸盐[5]，活性炭吸附[6-7]，生物转盘反应[8]，生物炭[9-11]，活性污泥法[12]等。尽管这些方法具有高效的特点，但也存在设备要求高，过程复杂，耗时长等缺点。因此，开发一种简单、快速、性价比高的诺氟沙星去除方法十分必要。
分子印迹技术也称分子模板技术[13-14]，可以自定义结合位点，对模板分子的形状大小，官能团产生记忆效应，模板分子与功能单体形成多重结合位点，聚合过程中交联剂将其记忆下来，洗脱后留下相匹配的立体孔穴，可进行重复吸附。分子印迹技术广泛应用于固相萃取[15]、膜分离[16-19]、传感器[20-21]等领域，在生物大分子分离、手性化合物分离等方面有较大的应用潜力[22]。通过分子印迹技术制备的分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer, MIP），具有抗恶劣环境能力强，稳定性好，使用寿命长等优点。关于分子印迹聚合物膜的研究已有相关报道[23]，但制备过程复杂，制膜用材料种类多且合成条件要求高，不利于分子印迹膜材料的推广普及。
目前分子印迹共混膜多用于催化和萃取中[24-25]，未见其广泛应用于环境水处理中。本研究以诺氟沙星为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用本体聚合法制备分子印迹聚合物，而后与聚砜铸膜液按比例混合制备出可以在低压力下对诺氟沙星有特异性截留作用的分子印迹共混膜，为去除生活用水中的诺氟沙星提供参考技术。
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聚砜购于上海塑料工业联合公司曙光化工厂为工业品；N-甲基吡咯烷酮（NMP，分析纯）、N,N-二甲基甲酰胺（分析纯）、三氯甲烷（分析纯）、偶氮二异丁晴（AIBN，分析纯）、甲醇（分析纯）和乙酸（分析纯）均购于天津大茂化学试剂厂；诺氟沙星（NFEX，分析纯）、氧氟沙星（分析纯）、红霉素（分析纯）、克百威（分析纯）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA，分析纯）均购于上海麦克林有限公司；甲基丙烯酸（MAA，质量分数99%）购于美国Alfa Aesar化学有限公司；实验用水均为去离子水。
可调式涂膜器；JASCO-V630型紫外分光光度计；DZF真空干燥箱；膜性能评价仪；TDZ4-WS型台式离心机；JR-2型水浴锅；SCQ-2000超声波清洗器；Quanta 250型扫描电子显微镜；NicoLet 6700傅里叶变换红外光谱仪。
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称取0.3194 g（1 mmol）NFXC溶于10 mL体积比为8∶2氯仿和N,N-二甲基甲酰胺混合剂中，加入0.5164 g（6 mmol）MAA。在转速550 r·min−1条件下磁力搅拌6 h，使NFXC和MAA充分作用，加入5.9466 g（30 mmol）EGDMA和20 mg AIBN，振荡待其完全混溶，转移至50 mL 离心管中，通氮15 min 以除尽氧气，防止聚合过程中发生副反应，60 ℃的条件下经24 h 完全热聚合反应得到聚合物。将得到的聚合物研磨并过100目筛，配制甲醇∶乙酸（9∶1, V∶V）溶液作为洗脱液，索氏提取24 h 去除模板分子，再用甲醇溶液洗至中性，真空干燥后即得诺氟沙星分子印迹聚合物。
采用相转化法制备分子印迹共混膜。称取7 g预先干燥的聚砜溶入48 mL的NMP中，静止脱泡，得到澄清透明铸膜液，将分子印迹聚合物与铸膜液按比例混合，使两者处于均匀异相混合状态，再将共混液用刮膜器匀速涂在洁净、干燥的玻璃板上，蒸发10 s后，将玻璃板整体置于水凝固浴中凝结成膜，置于水中24 h去除多余溶剂，而后烘干保存。
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膜水通量是指单位时间内在一定压力下单位膜面积可通过溶液的体积流量，将制备完成的分子印迹共混膜置于膜性能分析仪中，室温条件，0.2 MPa 压力下用蒸馏水预压30 min，然后测定单位时间内通过膜的蒸馏水的体积，并用下列公式来计算膜水通量：
其中，J是水通量（L·m−2·h−1），V是溶液渗透的体积（L），A是有效膜表面积（m2），Δt是渗透时间（h）。
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膜截留率和水通量一样，也是膜性能表征的重要指标，配制10 mg·L−1诺氟沙星溶液，以醋酸为助溶剂，在室温条件下，0.2 MPa 压力下测试共混膜对诺氟沙星的截留率，过膜收集滤液，测其吸光度，对比标准曲线得出浓度后，用下列公式计算截留率：
其中，R是分离百分比（%），Cp是渗透溶液中诺氟沙星浓度（mg·L−1），Cf是进料溶液中的诺氟沙星浓度（mg·L−1）。
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剪取一定大小的膜片在水中浸润，用滤纸吸干膜表面水分后，用电子天平称量湿膜的质量Ww，而后将膜置于干净的表面皿内，放入60 ℃的烘箱中干燥至恒重，同样用天平称量其质量，记下干膜质量Wd，按下式计算孔隙率：
其中，Pr为膜的孔隙率（%）；Ww为湿膜的质量（g）；Wd为干膜的质量（g）。
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诺氟沙星分子印迹共混膜制备流程如图1所示，通过本体聚合法制备分子印迹聚合物，以诺氟沙星为模板分子，甲基丙烯酸为功单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为热引发剂，聚合反应成稳定络合物，诺氟沙星便被固定在其中。由文献可知诺氟沙星与甲基丙烯酸以氢键相结合[26]，通过洗脱液破坏其连接氢键，诺氟沙星分子便可随洗脱液脱离聚合物，留下立体孔穴作为特异性识别位点与诺氟沙星分子重新结合，实现对废水中诺氟沙星的吸附处理。将其与铸膜液混合制成分子印迹共混膜后，膜中孔结构相互连通，有利于分子的运输扩散，根据Piletsky门模型理论[27]，溶液通过膜时，分子主要通过分子扩散和压力进入膜内，溶液在膜孔之间相互流通，膜内分子印迹聚合物可对模板分子充分吸附。
利用扫描电子显微镜表征聚合物与共混膜微观结构如图2所示。从图2a中可以看到，前期制备的分子印迹聚合物为不定型状态，表面致密紧实；图2b为分子印迹共混膜微观形貌图，表面已形成细小膜孔结构，可供液体流动；图2c为共混膜横截面微观结构图，可以观察到聚合物镶嵌在共混膜结构之中，没有发生形状的变化。
利用傅里叶红外光谱法研究了诺氟沙星分子印迹聚合物的结构，MAA、EGDMA、分子印迹聚合物洗脱前后的红外光谱如图3所示。曲线a为MAA的红外光谱图，1623 cm−1 处为C=C双键伸缩振动峰，1701 cm−1处为羧基中C=O伸缩振动峰，2999 cm−1处图为羟基中—OH 伸缩振动峰。曲线b为EGDMA的红外光谱图，1642 cm−1处为C=C双键伸缩振动峰，1715 cm−1处为交联剂中C=O伸缩振动峰。
由曲线a和b可知，功能单体和交联剂的红外谱图存在明显差别。曲线c、d分别为诺氟沙星分子印迹聚合物洗脱后和洗脱前的红外光谱图，曲线c中962 cm−1处为—COOH吸收峰，1151 cm−1处为—OH 面外弯曲振动峰，1631 cm−1处为C=C伸缩振动峰，1733 cm-1处为羧基吸收峰，这些峰在曲线d中同样存在，说明聚合物结构主要是由MAA和EGDMA反应制得。从曲线d可以观察到，在930、1260 、1578 cm−1处呈现了分别代表诺氟沙星分子N—H，—OH和N—H等特征官能团的特征峰[28]，由此可推断样品为结合有模板分子诺氟沙星的分子印迹聚合物结构。曲线c中没有出现这些特征峰，说明经过洗脱后诺氟沙星已从聚合物中脱离出去。
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为保证分子印迹聚合物具有更好的吸附性能，对分子印迹共混膜的制备方法进行优化。改变模板分子诺氟沙星和功能单体甲基丙烯酸的聚合摩尔比，固定其它添加比例，聚合条件不变，测试不同合成比例聚合物的吸附量，选出吸附量最大的配比进行优化。取不同条件制备的分子印迹聚合物各100 mg，分别加入到10 mL以乙酸作为助溶剂浓度为1 g·L−1的诺氟沙星溶液中。将离心管置于25 ℃恒温振荡箱中，振荡吸附，经过不同时间取出离心管，离心后取上清液，检测其吸光度并根据标准曲线计算其浓度，绘制动力吸附曲线。对比不同合成比例的吸附平衡时间和最大吸附量，选择最优比例。
从图4中可以看到，4种不同配比分子印迹聚合物的吸附动力学曲线趋势相似，在前60 min内吸附量快速增长，而后缓慢上升，最终达到吸附平衡状态。而随着诺氟沙星与甲基丙烯酸摩尔比的增加，单位时间内聚合物对诺氟沙星的最大吸附量逐渐增加，当摩尔比为1∶6时达到最大值。此后随着摩尔比的增加，最大吸附量呈下降趋势。这是因为过多的甲基丙烯酸在聚合过程中自身相互缔合，促使聚合物的非特异性结合变强，从而对诺氟沙星的吸附量不断降低。本研究选取摩尔比1∶6为分子印迹聚合物的最优合成配比，最大吸附量为 31.41 mg·g−1。
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将分子印迹聚合物与铸膜液按不同比例混合，分子印迹聚合物在共混膜干膜中的质量百分数分别为0%、5.56%、14.62%、22.72%、37.50%、46.27%、53.90%、59.88%、63.84%和67.16%。在室温25 ℃和0.2 MPa条件下，考察不同比例对膜吸附性能的影响，按相同比例分别刮取3张相同大小膜，分别进行3次膜性能评价，取其平均值绘制图线，如图5所示。
图5a为共混膜对诺氟沙星的截留率，以乙酸为助溶剂配制浓度为100 mg·L-1的模拟废水分别过膜。随着聚合物添加量的增加，截留的诺氟沙星数量也逐渐增加，当添加量为59.88%时基本达到对该浓度废水的最大吸附量。图5b为膜水通量变化趋势，随着聚合物添加量的增加，水通量呈明显下降趋势。由于分子印迹聚合物具有致密结构，随着添加量的增加使得共混膜结构更加致密，孔隙率逐渐减小（见图5c），导致膜水通量逐渐下降。当聚合物添加量增至63.84%时，膜孔隙率无明显变化，此时膜水通量趋于稳定。
综上所述，聚合物添加量为63.84%时，膜截留率、水通量和孔隙率都基本趋于稳定，因此选取63.84%作为本研究的最优聚合物添加比例。
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选取不同有机污染物分子对制备的分子印迹共混膜进行选择性截留测试，分别配制浓度为100 mg·L−1的模拟废水，添加等体积的乙酸作为助溶剂。在室温0.2 MPa下过膜，测试分子印迹共混膜对4种物质的选择性截留率，以空白共混膜为对照组。如图6所示，选取与诺氟沙星同为喹酮类药物的氧氟沙星作为第二组对照，选取同为抗生素但属于不同种类的红霉素作为第三组对照，选取不同种类且结构不相似的农药克百威做为第四组对照。由图6可知，分子印迹共混膜对诺氟沙星具有较高的特异性截留率，说明聚合物中的识别孔穴可对模板分子进行特异性截留且具有较高的选择性。而对于其它分子只有膜孔结构的物理截留作用，但没有选择性。此外我们添加了活性炭共混膜作为截留对照，发现其虽然有较好的截留性能但缺少特异识别性，且截留过后无法对其进行洗脱不适于回收再利用。综上可知，分子印迹共混膜具有良好的选择吸附性能。
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配制浓度为10 mg·L−1的诺氟沙星模拟废水进一步考察分子印迹共混膜的重复使用性。在室温25 ℃和0.2 MPa压力下进行膜性能测试，实验重复进行五组，每组用甲醇∶乙酸（9∶1, V∶V）作为洗脱液洗脱。如图7所示，为洗脱5次对诺氟沙星截留率和膜水通量的影响趋势图。随着洗脱次数的增加，分子印迹共混膜对诺氟沙星的去除性能有一定的下降，可能是因为在重复洗脱的过程中破坏了少量聚合物中的印迹结合位点，但反复洗脱多次后逐渐趋于稳定并始终维持在80%以上，水通量基本维持不变的状态。洗脱次数对NIPM的截留率和水通量影响不大，因为NIPM对照组中不含任何结合位点，洗脱不会对其产生破坏作用。因此，洗脱次数对膜性能有一定的损耗作用，但共混膜仍维持较高的截留效率，具有很好的重复使用性。
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本研究以诺氟沙星为模板分子，利用本体聚合法制备了分子印迹聚合物，而后将其作为特异性截留材料与铸膜液混合，采用相转化法制备分子印迹共混膜，并用于特异性截留水中诺氟沙星。实验表明，诺氟沙星分子印迹聚合物对诺氟沙星具有特异吸附性，在诺氟沙星分子与功能单体摩尔比为1∶6条件下制备的聚合物具有最大平衡吸附量，分子印迹聚合物在共混膜干膜中的质量百分数为63.84%时，具有良好的水通量和截留性能。重复洗脱5次后，水通量维持不变，虽然截留性能稍有损耗，但仍维持在80%以上，具有良好的可重复使用性。在结构类似物中也具有较高的特异性截留性能。
诺氟沙星分子印迹共混膜的制备及应用
Preparation and application of norfloxacin molecularly imprinted blend membrane
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摘要: 本文以诺氟沙星为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用本体聚合法制备分子印迹聚合物，与聚砜铸膜液混合，制备出可以在低压力下对诺氟沙星有特异性截留作用的分子印迹共混膜。采用红外光谱对共混膜的结构进行表征，利用扫描电子显微镜对共混膜微观形貌进行表征。研究了聚合物的质量分数对共混膜水通量和截留率的影响，选出最佳混合比例并考察了选择性透过率。结果表明，当聚合物添加量为63.84%时，分子印迹基膜具有良好的支撑能力和较大的水通量。基于该基膜所制备的诺氟沙星分子印迹共混膜水通量为272.34 L·m−2·h−1（操作压力0.2 MPa），对诺氟沙星截留率为89.47%，具有很好的去除效果。Abstract: The molecularly imprinted polymer (MIP) was synthesized by bulk polymerization with norfloxacin as template molecules, methacrylic acid as the functional monomer, and ethylene glycol dimethacrylate as the crosslinker. Then norfloxacin MIP was mixed with polysulfone casting solution to prepare the molecularly imprinted blend membrane that can specifically trap norfloxacin under low pressure. Infrared spectroscopy was used to characterize the structure of the blend membrane, and the scanning electron microscope was used to characterize the micromorphology of the blend membrane. The influence of the mass fraction ratio of the polymer on the water flux and retention rate of the blend membrane was studied. The results show that the molecularly imprinted base membrane has a good supporting capacity and a large water flux when the polymer content is 63.84%. The water flux of the norfloxacin molecularly imprinted blend membrane prepared based on the base membrane is 272.34 L·m−2·h−1 (operating pressure 0.2 MPa), and the retention rate of norfloxacin is 89.47%, which shows a good removal effect.
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Key words:
- molecularly imprinted blend membrane /
- norfloxacin /
- retention rate
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邻苯二甲酸酯类化合物（phthalate esters， PAEs）是邻苯二甲酸酐与醇反应生成的化合物，它是提高聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）弹性的重要添加剂，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是目前使用量最大的一种邻苯二甲酸酯，用量高达80%[1]. DEHP广泛应用于儿童玩具、塑料包装、化妆品及各类医疗器械[2-3]. DEHP的广泛使用导致了不可避免的环境释放以及人体摄入. 大量实验指出我国人群DEHP的暴露剂量约为11—116 μg·kg−1·d−1，接近DEHP的每日可耐受摄入量（TDI）（20—140 μg·kg−1·d−1），表明 DEHP对人群的健康构成重大危害[4].
DEHP具有内分泌干扰效应，可以诱发生殖发育毒性、肝脏毒性、胚胎毒性等多种毒性[5-6]. DEHP通过消化道进入人体后在胃肠道的脂肪酶作用下水解成初级代谢物乙基己醇（2-EH）和邻苯二甲酸单乙基己基酯（mono-ethylhexyl phthalate，MEHP），再通过尿液排出体外[7]. 通过对尿液的单酯类物检测发现，原尿和酶解后的尿液中 MEHP 的检出率最高，平均检出率超过60% [8]. 此外，试验结果表明DEHP的毒性主要来源于其代谢物 MEHP，其毒性作用高达DEHP的10倍[9]. 同时，MEHP的动物实验表明，其主要分布在肾脏、膀胱和肝脏，其中肝脏为MEHP最主要的靶器官[10]. Thomas等的研究中，大鼠口服500 mg·kg−1 DEHP，30 min后，肝脏MEHP水平为12.5 mg·g−1 [11]. MEHP毒性作用主要体现在增加肝脏亲脂活性，导致肝脏中出现脂肪堆积，继而引发肝细胞脂肪变性[12].
肝脏在体内发挥着外源物质解毒和代谢脂类物质的主要作用. 肝脏内游离脂肪酸增加和甘油三酯沉积是肝脏脂质代谢紊乱的主要表现. 近年来，全球肥胖病与非酒精性脂肪肝患病率快速上升. 体内体外实验提示脂肪代谢紊乱会增加肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝病的患病危险度. 流行病学和毒理学研究报告称，接触DEHP会影响机体脂肪代谢，从而促进肥胖[13]. 体内实验表明大鼠用DEHP处理后，肝脏重量增加，主要机制可能与肝代谢酶改变有关[14]. 有体外实验表明，MEHP处理HepG2细胞后，激活了PPARα使脂肪酸的氧化分解受到抑制[9]，导致肝细胞内的脂质堆积并造成肝脏损伤. 在本课题组的前期研究发现，MEHP 处理后的HepG2 细胞的乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的亚型ACC1蛋白表达水平增加，最终使肝脏细胞中脂肪酸合成增加. 这些结果表明，MEHP 可能通过影响脂质合成相关基因或蛋白的表达，从而导致肝细胞脂肪代谢出现紊乱. 为此，本实验以HepG2细胞为实验对象，通过MEHP染毒，观察细胞内脂质代谢情况，并通过基因芯片高通量筛查差异基因，探讨MEHP对体外脂质合成的影响及其可能的作用机制.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 细胞培养与染毒
从中国科学院上海生命研究院细胞资源中心购买HepG2细胞. 细胞培养基含 10%胎牛血清、1%青霉素庆大霉素双抗. 细胞培养条件为37 ℃、5% CO2. 取指数生长期的细胞进行染毒，参考相关文献[9]及我国人群接触水平设置染毒浓度. 共设置5个染毒浓度 ：阴性对照（完全培养基）、阳性对照（1 mmol·L−1油酸）、0.01 、1 、10 μmol·L−1MEHP. 染毒48 h后进行相关实验.
1.2 细胞油红 O 染色
为了研究细胞中脂滴的蓄积，用油红O法对HepG2细胞进行染色. 5个实验组的细胞染毒48 h后进行染色. 主要步骤为：弃去孔中废弃培养基，用 PBS 漂洗细胞，4%（质量分数）多聚甲醛固定细胞，油红O染色30 min，60%（体积分数）异丙醇洗去多余染料，苏木精复染细胞核10 s. 用显微镜获取图像并观察细胞内脂滴情况.
1.3 芯片数据以及数据前处理
用1 μmol·L−1 MEHP处理的细胞进行芯片分析，Agilent （人）表达谱芯片由博奥晶典公司完成. 步骤如下：以待检测样品的 total RNA 为起始，进行体外扩增和荧光标记，然后用Oligo（dT）Primer 引物合成cRNA并进行纯化和反转录得到cDNA. 最后用 Klenow Fragment 酶合成带有荧光基团的DNA 进行芯片杂交. 用 Feature Extraction 提数软件对芯片杂交扫描后的图片数据进行处理分析.
1.4 差异基因的筛选
通过Ｒstudio limma包将芯片基因的数据进行处理，以表格格式导出并进一步筛选差异表达基因. 差异表达基因（DEG）定义为差异倍数 FC大于 1.5或小于0.67且 P值小于 0.05的基因.
1.5 DEG功能富集分析
将上述分析得出的DEG导入 DAVID在线数据库（
https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp ），进行GO分析. 通过对显著表达的基因进行功能注释分析，包括生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），进而了解差异表达基因的生物学意义. 以 P<0.05认为具有显著性.1.6 PCR验证
按照1.1节对处于指数生长期的细胞进行染毒，每个实验组设置6个平行对照，染毒48 h后提取RNA. 细胞样品用Trizol试剂裂解，提取总RNA. 用超微量分光光度计测定RNA的含量和纯度. 将符合条件的RNA （A260/A230>2.0，和A260/A280=1.8—2.0）样本用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA备用.
从具有显著性且参与脂质代谢过程的差异基因中选取丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基2（PDP2）、磷脂酶A2组 IVE（PLA2G4E）、脂肪酸去饱和酶 6（FADS6）、Q型蛋白酪氨酸磷酸酶受体（PTPRQ）、CD28、甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）作为目的基因，检测mRNA表达水平（荧光定量PCR仪为Line Gene 9600）. 引物信息如表1所示. 以GAPDH为内参，数据分析时取Ct值的平均值，用相对定量法2−△△ct法计算目的基因表达的变化情况. 采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，多组间比较使用单因素方差分析，事后比较用LSD 检验进行，P<0.05认为具有统计学意义.
表 1 实时定量PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time quantitative PCR基因Gene 引物Primer PDP2 S——GAAGATGAGGTGACAAGGAA F——GCCAGCACAAG MVD GAACTTA PLA2G4E S——TTCTGTCCTATGGCTCCTT F——GTTCTTCACTCGGCTCTG FADS6 S——CCTCAACCGCTATGTCTAC F——CGATGTGCTGGAAGATGT PTPRQ S——ATGTCTATATTGCGGCTGAA F——TTCTTACTTGCGTGGATTCT CD28 S——GCTCTTGGCTCTCAACTTA F——CCTGCTCCTCTTACTCCT SC5D S——CTTGCTGGAGATAAGAGGTT F——TATGGTGGTCTGTATGATGAG MVD S——CAAGGACTTCACCGAGGA F——GTAGGCTAGGCAGGCATA | Show Table
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1.7 基因表达谱数据动态分析
将细胞脂质代谢通路的基因输入 GEPIA 在线分析网站（http://gepia.cancer-pku.cn/），分析其在肝癌组织中的表达. P<0.05认为具有统计学意义.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 油红O 染色结果
如图1所示，阴性对照组细胞有明显的边界，细胞内没有脂滴存在. 油酸染毒的细胞可见大量明显着色的脂滴，主要分布在细胞膜内侧区域，大小不等. 与阴性对照组相比，0.01 μmol·L−1 MEHP剂量组未见明显改变；1、10 μmol·L−1 MEHP剂量组可观察到少量红色脂滴，且随着染毒浓度的增大，脂滴的数量也逐渐增加，暂时未见对细胞边界的影响. 在前期实验中本课题组对MEHP染毒的HepG2细胞中的甘油三酯（TG）含量进行了定量检测， TG含量结果与油红O染色结果相一致，提示较高剂量 MEHP 暴露可提高细胞中的脂质水平[8]. 这一结果表明， MEHP暴露后，导致HepG2细胞中的甘油三酯蓄积，从而引起肝细胞中的脂质沉积.
图 1 不同浓度MEHP染毒对HepG2细胞内脂肪积累的影响（×400）Figure 1. Effects of different concentrations of MEHP on lipid accumulation in HepG2 cells（×400）A:光镜下未染色HepG2细胞；B:阳性对照组；C:阴性对照组；D、E、F：0.01、1、10 μmol·L−1 MEHP组. →为 HepG2 细胞内红色脂滴.A: HepG2 cells were not stained under light microscope; B: Positive control group; C:Negative control group; D、E and F: 0.01、1 and 10 μmol·L−1 MEHP groups; →represents red lipid droplets.2.2 差异基因筛选
如图2所示，根据P<0.05，FC>1.5或<0.67的筛选标准，共筛选出93个差异表达基因（表2），其中上调的基因57个，下调的基因36个.
表 2 差异基因的表达情况Table 2. The expression of differentially expressed genesUp Down symbol lgFC P.Value symbol lgFC P.Value DPPA3 0.743871 0.000032637 TTTY14 −0.75345 0.000683968 MYLIP 0.685596 0.000320629 XLOC_008352 −0.691 0.001413602 XLOC_000888 0.664559 0.000498704 LOC100129112 −0.83639 0.001799658 LOC100127994 0.609364 0.00056601 SC5D −0.92097 0.002090916 SYT17 0.650856 0.000986627 XLOC_004178 −0.72657 0.002192512 XLOC_008003 0.727595 0.00115933 C14orf119 −0.78947 0.003595082 LOC100506487 0.589801 0.001543009 XLOC_l2_012082 −0.61338 0.004605101 FADS6 0.784036 0.002373877 XLOC_012908 −0.92876 0.006283058 AQP10 0.603687 0.00355145 GABRG1 −1.01945 0.007994 XLOC_001387 0.675839 0.003916862 NUMB −0.57939 0.008775398 KCNE4 0.831973 0.003949384 FLJ21408 −0.61905 0.009899712 XLOC_005215 0.65671 0.004608305 LOC100505657 −0.89616 0.010826125 OR5L1 0.922639 0.004609802 ZNF554 −0.60913 0.011699612 C14orf180 0.649561 0.005207664 XLOC_012871 −0.78553 0.01385829 RHOXF1 0.622636 0.007822227 XLOC_007131 −0.7273 0.014006601 PTPRQ 0.739332 0.008548009 XLOC_l2_014785 −0.66169 0.01855114 LOC286382 0.586815 0.008726912 PRO0611 −0.78996 0.018748849 ACOD1 0.61305 0.008957375 CREG2 −0.70749 0.018758137 LOC100130744 0.85844 0.009748146 XLOC_l2_004857 −0.66225 0.023632428 ZAP70 0.625018 0.010183849 PDP2 −0.80976 0.023933353 PLA2G4E 1.427762 0.011394311 XLOC_l2_011207 −0.57923 0.026335268 LOC652586 0.614123 0.011818286 XLOC_007761 −0.58384 0.027416794 XLOC_006019 0.666199 0.012002598 GNL3LP1 −0.6286 0.027632132 SLAMF7 0.896594 0.013447959 XLOC_l2_013646 −0.89314 0.028992205 XLOC_005433 0.588529 0.014072632 MVD −0.63712 0.031037423 KRTAP13-2 0.681023 0.014111061 LOC728065 −0.58089 0.031598939 XLOC_008237 0.804098 0.01445258 XLOC_l2_011011 −0.60147 0.033573436 XLOC_008244 0.677154 0.01652238 XLOC_001687 −1.03697 0.037696163 LOC100505966 0.836326 0.01818776 XLOC_004804 −0.68571 0.039579631 XLOC_001422 2.454291 0.018227482 LOC100507110 −0.60107 0.041523521 CSN2 1.0231 0.020348553 CACNG8 −0.61314 0.041704333 XLOC_003782 0.639271 0.021116476 SNORD70 −0.92894 0.044259091 XLOC_005572 0.585382 0.02204518 LOC100128126 −1.05439 0.044856832 XLOC_003349 1.233979 0.022738339 NPPA-AS1 −0.59523 0.048087643 XLOC_l2_00770 0.610547 0.023106187 XLOC_001550 −0.64752 0.04894801 SNORD115-48 0.719119 0.024508996 INE1 −1.017 0.0496582 SNORD115-4 0.688309 0.026211298 XLOC_001755 0.605516 0.028061446 ANK2 0.906401 0.029169596 CD28 0.589859 0.029610282 LOC100506563 1.019834 0.029837404 ANXA10 0.626939 0.030222491 CYBB 1.151916 0.03336549 XLOC_012064 1.019834 0.0345969 XLOC_013649 0.624561 0.035226312 XLOC_010183 1.380268 0.035959747 XLOC_006983 0.862151 0.040708371 XLOC_004274 0.720596 0.040795527 XLOC_008690 0.686422 0.041491936 XLOC_007888 0.852148 0.04152697 XLOC_l2_011145 0.704819 0.042378972 SLC24A4 0.757531 0.043335006 XLOC_013458 0.71734 0.043999913 TREML1 0.800135 0.047577606 TRIM49 0.796312 0.048328175 ANKDD1B 0.683738 0.049447534 DUSP21 0.604901 0.049510457 | Show TableDownLoad:
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2.3 差异基因的功能富集分析
通过对差异基因进行GO分析探讨差异基因所涉及的生物学过程，包括基因的３个部分：分子功能（MF）、细胞组分（CC）、生物过程（BP）. 结果显示，可以识别的基因一共有48个，显著富集的GO条目一共有13条（P<0.05），其中生物过程7条（图3）. 前5条通路及具体信息见表3，主要包括细胞脂质代谢过程（cellular lipid metabolic process）、T细胞阴性选择（negative T cell selection）、跨膜运输（transmembrane transport）、跨膜转运的调控（regulation of transmembrane transport）、先天免疫反应（innate immune response）；分子功能2条,包括被动跨膜转运活性（passive transmembrane transporter activity）、基质特异性跨膜转运蛋白活性（substrate-specific transmembrane transporter activity）；细胞组分4条，包括膜的外部成分（extrinsic component of membrane）、等离子体膜（plasma membrane）、质膜部分（plasma membrane part）.GO 分析表明, 最显著激活的通路是细胞脂质代谢通路，他由上调基因 FADS6、PTPRQ、CD28、 PLA2G4E 和下调基因 SC5D、PDP2、MVD 组成.
图 3 DAVID分析中生物过程通路的GO条目与基因Figure 3. Chord plot depicting the relationship between genes and GO terms of biological process表 3 DAVID分析中前5个通路（BP）与基因Table 3. Top 5 GO terms （BP） of the genes with the DAVID analysisGO TermGO 条目 Count数量 Genes基因 Fold Enrichment富集倍数 P Value P值 GO:0044255cellular lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 3.85628326776209 0.0068 GO:0045087innate immune response 5 TREML1, ZAP70, CYBB, ACOD1, SLAMF7 3.042438312 0.0494 GO:0055085transmembrane transport 7 SLC24A4, CACNG8, KCNE4, AQP10, CYBB, ANK2, GABRG1 3.024137931 0.0204 GO:0006629lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 5.660947851 0.0210 GO:0034762regulation of transmembrane transport 4 CACNG8, KCNE4, CYBB, ANK2 3.43652037617554 0.0300 | Show TableDownLoad:
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2.4 PCR验证
MEHP染毒后相关基因mRNA表达水平的变化如图4所示. 与阴性对照组相比，基因FADS6 在1 μmol·L−1 MEHP染毒样品内基因表达水平明显增加（P<0.05）；基因SC5D、PDP2在1 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05），MVD在10 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05）. 其中，基因SC5D、PDP2、MVD、FADS6的mRNA表达水平与芯片结果表达一致，基因PTPRQ、CD28、PLA2G4E结果不一致.
图 4 不同浓度MEHP染毒对 HepG2 细胞相关基因mRNA表达水平影响Figure 4. Effects of different concentrations of MEHP on mRNA expressions of relative genes in HepG2 cells本研究通过转录组数据分析探讨MEHP在HepG2细胞脂质代谢过程中发挥作用的基因，发现细胞脂质代谢通路上的基因FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E在代谢过程中起重要作用. 脂肪酸去饱和酶（FADS6）在多不饱和脂肪酸（PUFA）的合成途径中起关键作用，参与了PUFA合成过程中的限速步骤，并调节PUFA的代谢通量[15]. 据报道，FADS6的活性是调节生物体中多不饱和脂肪酸比例的主要因素,其活性改变会影响一些疾病，如炎症和肿瘤发生，2型糖尿病，心血管疾病，代谢紊乱和神经精神疾病[16]. Montell的研究发现，含不饱和脂肪酸的二脂酰甘油（DAG）比饱和脂肪酸的DAG对二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）有更强的亲和力，即肝脏合成 TG 首先利用不饱和脂肪酸, 更容易导致甘油三酯积累，而饱和脂肪酸多以 DAG 的形式蓄积[17].
本实验富集分析与PCR的结果显示，FADS6的mRNA表达水平升高，促进了HepG2细胞中多不饱和脂肪酸合成，这可能是HepG2细胞中甘油三酯合成增多进而出现脂肪堆积的原因. 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）参与胆固醇生物合成过程中的早期步骤. 通过Jump实验中转录组数据的KEGG分析显示，MVD参与SREBP激活基因表达、SREBP调节胆固醇生物合成、脂类和脂蛋白代谢等胆固醇代谢相关的通路，MVD的变化可调控乙酰乙酰-辅酶A的变化，进而改变）胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）的表达水平[18]，已有研究证明SREBP的上调导致肝细胞内胆固醇合成增加 [19] . 甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）是一种胆固醇生物合成酶，它催化乳甾醇（lathosterol）转化为7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol），参与胆固醇合成中的酶促反应通路[20]. 有文献报道SC5D基因缺陷会引起乳甾醇症（Lathosterolosis），一种罕见的常染色体隐性胆固醇生物合成障碍疾病[21]. SC5D基因在HepG2细胞中表达水平的改变导致细胞内胆固醇合成发生紊乱. 磷脂酶A2（PLA2）是一种参与脂蛋白代谢和炎症途径的酶，所产生的脂质介质对细胞代谢起重要调控作用. 有文献报道NAFLD病人血浆中PLA2水平和肝脏的脂肪变性程度呈显著正相关,这说明PLA2可能参与肝细胞代谢过程中[22]. 有研究证实PLA2过表达的肝脏甘油三酯（TG）含量显著增加，同时增加趋势与PLA2的表达趋势相一致[23]. PLA2G4E作为PLA2的一种，对肝脏细胞的代谢也有调控作用. 本研究中发现，芯片结果中PLA2G4E表达水平升高，提示PLA2G4E是MEHP诱导甘油三脂含量增加，扰乱肝细胞脂质代谢的原因之一.
2.5 关键差异基因的在肝癌中的表达
利用在线分析工具GEPIA分析以上基因在肝细胞癌组织的表达水平，如图5所示. 这7个基因在肝细胞癌组织中的表达变化对比正常组织没有显著性. 但是以上基因在HepG2肝癌细胞脂质代谢过程中的表达水平均具有明显改变，导致肝癌细胞脂质代谢紊乱、脂肪堆积.
图 5 关键基因在肝癌中的表达水平Figure 5. Relative expression comparison of key genes in liver cancer samples in GEPIA database非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种可逆性的疾病，但随着研究的不断深入， NAFLD的发病范围由单纯脂肪肝、脂肪肝、肝硬化发展到原发性肝细胞癌[24]. 多项研究证明NAFLD可逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH），从而导致肝硬化[25]，而肝硬化是除HBV、HCV引起原发性肝癌的另一主要原因. 因此假如高龄、胰岛素抵抗、肥胖等危险因素持续存在，NAFLD最终可引起肝癌. 同时Iris [26]的动物实验和Ertle[27] 的研究证实，NAFLD可不经肝硬化阶段发展为原发性肝癌. 由此可知，虽然以上基因在肝癌组织中的表达没有明显变化，但是对肝癌的前身——NAFLD发生发展具有重要作用.
3. 结论（Conclusion）
本研究以HepG2细胞为研究对象，结合油红O染色以及基因芯片等技术，发现MEHP暴露影响了细胞脂质代谢等信号通路，改变了关键因子FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E的表达水平，导致肝脏细胞中甘油三酯与胆固醇的合成增加，肝脏细胞出现脂肪蓄积. 综上所述，MEHP暴露可以通过改变细胞代谢相关基因引起肝脏细胞内脂质代谢紊乱.
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图 2 （a）聚合物表面微观形貌 （b）分子印迹共混膜表面形貌 （c）分子印迹共混膜截面形貌
Figure 2. （a） SEM of MIP surface （b） SEM of MIPM surface （c） SEM of MIPM cross-section
图 3 甲基丙烯酸（a）、乙二醇二甲基丙烯酸（b）、分子印迹聚合物洗脱后（c）和洗脱前（d）的红外光谱图
Figure 3. FT-IR spectra of MAA （a）, EGDMA （b）, MIP after （c） and before elution （d）
图 5 分子印迹共混膜性能比较：（a）膜截留率，（b）膜水通量和（c）膜孔隙率
Figure 5. Comparison of properties MIPM （a） retention rate, （b） water flux and （c） porosity
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