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动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展

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段培宇, 陈寒玉, 张宝忠, 祝慧娜, 李道荣. 动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展[J]. 环境化学, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
引用本文: 段培宇, 陈寒玉, 张宝忠, 祝慧娜, 李道荣. 动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展[J]. 环境化学, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
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DUAN Peiyu, CHEN Hanyu, ZHANG Baozhong, ZHU Huina, LI Daorong. Research progress of bioassay technology for antibiotic pollutants in animal-derived foods[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
Citation: DUAN Peiyu, CHEN Hanyu, ZHANG Baozhong, ZHU Huina, LI Daorong. Research progress of bioassay technology for antibiotic pollutants in animal-derived foods[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
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动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展

  • 河南工业大学环境工程学院，郑州，450001

    • 通讯作者: Tel：18623716700，E-mail：chypds@126.com; 
  • 基金项目:
    国家自然科学基金（U1704123）资助.

Research progress of bioassay technology for antibiotic pollutants in animal-derived foods

  • School of Environmental Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou, 450001, China

    • Corresponding author: CHEN Hanyu, chypds@126.com ; 
  • Fund Project: the National Natural Science Foundation of China （U1704123）.

摘要

  • 摘要: 抗生素类污染物在动物源性食品中的残留，因其对人类健康有着潜在危害而受到了广泛的关注，因此迫切需要建立快速、灵敏、高效、便捷的检测方法以便对其及时管理和防治。生物检测技术在实现对抗生素高灵敏度、高特异性、低成本、快速的检测方面具有很强的优势，主要包括微生物检测法、免疫分析法和生物传感器法等。本文基于免疫抗体和核酸适配体两种生物识别元件的检测原理和特点，对近年来采用这两种识别方式建立起的生物检测方法在动物源性食品中抗生素残留检测中的应用进行了综述。同时，对目前检测方法研究中存在的问题进行了综合评价，并对抗生素生物检测技术的未来发展做出展望。
    Abstract: The residues of antibiotic contaminants in animal-derived foods have received widespread attention due to their potential harm to human health. Thus, it is urgent to establish fast, sensitive, efficient and convenient detection method to manage and prevent antibiotic residues in time. Bioassay technology which mainly include microbiological assay, immunoassay and biosensor can achieve high sensitivity, high specificity, low cost and rapid detection of antibiotics. Based on detection principles and characteristics of antibodies and aptamers, this paper reviews the application of the bioassay technology established in recent years using these two biorecognition elements in the detection of antibiotic residues in animal-derived foods. In addition, this paper comprehensively evaluates the shortcomings in the current research and prospects the future development of antibiotic bioassay technology.

  • 我国重金属的生产量与消费量与日俱增，这带来了一系列环境污染问题[1-3]. 铬（Cr）具有高毒性、普遍性和持久性，被美国环保署（EPA）列为首要污染物之一[4]. Cr一般以两种形式存在于环境中：Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）. Cr（Ⅲ）毒性较小且不溶，而Cr（Ⅵ）毒性是Cr（Ⅲ）的100倍，且具有高度的溶解性和流动性[5]，对人体有严重危害[6]. 全球大约80%的Cr被开采后用于冶金行业[7]，这些Cr废弃物的自然浸出会使得Cr（Ⅵ）在环境中迁移，造成污染[8]. 我国每年产出大量的Cr废弃物[9]，土壤中Cr含量平均值已达78.94 mg·kg-1[10]，高于规定要求，需要对Cr污染土壤进行有效治理.

    零价铁（ZVI）具有比表面积大、反应活性高、还原能力强等优点，被广泛应用于Cr（Ⅵ）污染土壤的修复[11-12]. 黄铁矿（FeS2）常被用于吸附有机污染物和重金属，其成分为Fe2+和S22−还原基团，可以有效地促进Cr（Ⅵ）的还原与固定[13]. 但ZVI容易表面聚集，会降低其还原能力，且在施用过程中存在过度释放Fe的问题[14]，导致土壤孔隙度降低并引起骨料胶结，影响土壤结构[15]；天然黄铁矿表面钝化严重[16]，导致其与Cr（Ⅵ）反应较慢，这些问题限制了二者的应用. 生物炭（Biochar）是由富含碳的生物质在缺氧条件下热解产生的[17]，其原料来源广且价格低[18]，是一种环境友好型材料[19]. 生物炭表面官能团丰富，其中羟基、氧羧基和酚类官能团可与土壤中的污染物结合[20]，羧酸（COOH）、C=O等可与重金属结合[21]. 生物炭的多孔结构和大比表面积为重金属提供了可观的吸附位点[22]，可降低其在土壤中的迁移性[23]，已被广泛应用于土壤修复方面[24-25]. 此外，生物炭可作为ZVI等金属材料的载体[26]，起到分散作用，减缓钝化现象，有利于重金属污染的治理. 水热炭（Hydrochar）是指一定湿度的生物质在较低温度和一定压力下进行炭化得到的生物炭[27]. 相比热解炭，水热炭无需预处理，耗能低，产率高，孔隙结构发达，有机质含量更高[28-29]，对污染土壤具有良好的修复潜力. Teng等[30]利用Fe改性水热炭降低了土壤中Pb和Sb的生物有效性. Xia等[31]制备氨基改性水热炭，施用后土壤中Cu、Pb和Cd的生物有效性、淋溶毒性及在水稻中的富集量均不同程度下降. 然而相比于热解生物炭的广泛应用，水热炭针对特定土壤环境的改性应用研究较少，需要进一步进行实验探究.

    机械球磨法[32]可将材料尺寸粉碎至纳米级，并使元素分布均匀，经济高效且操作简单. 本实验采用机械球磨法将ZVI、黄铁矿分别负载在玉米秸秆水热炭上，制备成两种铁改性水热炭，主要目的如下：（1）通过土壤提取实验，研究ZVI、黄铁矿、水热炭及改性炭对土壤中Cr的固定作用，并测定土壤中有效铁的含量，验证两种改性水热炭是否有助于解决过度释放Fe的问题；（2）通过土柱淋溶实验进一步探索改性水热炭对土壤中Cr的固化效能，分析土壤中Cr的纵向迁移规律，同时对实验材料进行表征分析，初步探究水热炭对Cr污染土壤的机制，得出最佳改性水热炭.

    1.   材料与方法（Materials and methods）

    1.1   土壤与材料

    Cr污染土壤取自山东省某化工厂，土壤风干后，去除石子等杂质，研磨后过40目筛备用，同时取普通未污染土壤进行相同处理. 对两种土壤基本理化性质进行测定，结果见表1. 主要实验仪器见表2，实验所用零价铁（ZVI）平均粒径为48 μm；黄铁矿（FeS2）平均粒径为45 μm.

    表 1  土壤理化性质
    Table 1.  Soil physicochemical properties
    土壤SoilpH有机质/（g·kg−1）Organic matter阳离子交换容量/（cmol·kg−1）Cation exchange capacity总铬/（mg·kg−1）Total chromiumCr（Ⅵ）/（mg·kg−1）有效铁/（mg·kg−1）Available iron
    污染土壤8.49 ± 0.0540.64 ± 0.0521.84 ± 1.059540.51 ± 7.51059.51 ± 527.86 ± 2.51
    未污染土壤7.64 ± 0.0520.51 ± 1.0412.44 ± 0.75NDND4.86 ± 1.05
    　　注：ND未检出. ND, no detected.
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    表 2  主要实验仪器
    Table 2.  Main experimental instruments
    名称Instrument name型号Product model厂家Manufacturer
    火焰原子吸收分光光度计ICE 3500赛默飞世尔科技公司
    行星式球磨仪QXQM-80长沙天创粉末技术有限公司
    马弗炉SX2-8-10Z上海博迅实业有限公司医疗设备厂
    反应釜SLM100北京世纪森朗实验仪器有限公司
    恒温振荡摇床SHA-CA常州恒睿仪器设备制造有限公司
    扫描电子显微镜FEI Quanta 400 FEG美国FEI公司
    傅里叶变换红外光谱仪TENSOR Ⅱ德国布鲁克光谱仪器公司
    X射线光电子能谱仪K-Alpha赛默飞世尔科技公司
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    1.2   生物炭的制备与表征

    将玉米秸秆置于马弗炉中，在500 ℃下反应3 h，制得热解生物炭（BC）；将玉米秸秆与水以1:20的质量比混合后置于反应釜中，在300 ℃下反应1 h，制得水热生物炭（SBC）；将SBC分别与ZVI、黄铁矿以不同质量比置于球磨机中，以550 r·min−1运行3 h，制得不同炭铁质量比的ZVI改性水热生物炭（ZBC）和黄铁矿改性水热生物炭（HBC），所有制得的生物炭均过100目筛使其均质. 对改性水热炭的表面形貌、官能团以及施加到土壤前后的元素及价态的变化进行表征.

    1.3   实验设计

    1.3.1   土壤提取实验

    （1）热解炭与水热炭对土壤中Cr赋存形态的影响

    以8 g·kg−1 的投加量向20 g污染土壤分别投加BC、SBC，混匀后置于50 mL离心管，调土壤含水率为30%，静置15 d后采用Tessier法[33]对土壤的Cr进行提取分析，每个处理重复3次并作对照实验.

    （2）改性水热炭对土壤中Cr固化效能的影响

    以10 g·kg−1 的投加量向10 g污染土壤分别投加不同改性水热炭，混匀后置于锥形瓶中，再加入100 mL水后放置于摇床中，设置速度为120 r·min−1振荡48 h，分时间取上清液过0.45 μm滤膜后测定总铬浓度，每个处理重复3次并作对照实验.

    （3）不同材料对土壤中Cr固化效能的影响

    以不同投加量向20 g污染土壤分别投加不同材料，混匀后置于50 mL离心管，调土壤含水率为30%，静置15 d后测定土壤浸出液总铬浓度，并对投加ZVI、黄铁矿、ZBC和HBC的土壤有效铁含量进行测定，每个处理重复3次并作对照实验.

    1.3.2   土柱淋溶实验

    向Cr污染土壤中分别加入5 g·kg−1的ZBC和HBC，保持土壤含水率为30%，在恒温培养箱中培养20 d备用，并作未施加炭的对照实验（CK）. 土柱装置为高20 cm、内径4 cm的圆型有机玻璃柱，底部开口连接橡胶管，用于收集浸出液. 向土柱下层填充10 cm的未污染土壤，上层分别填充8 cm不同处理的污染土壤，每个处理重复3次. 从底部注水使土壤饱和后静置24 h，随后从顶部进行淋洗，淋洗液总体积为900 mL，采用间歇浸出法. 得到的浸出液过0.45 μm滤膜后测定总铬浓度. 实验结束后将土柱上下层分段取出，将上层土壤风干后过100目筛得到施加到土壤中的炭，并进行表征；测定下层土壤总铬与Cr（Ⅵ）浓度，观察Cr的纵向迁移性.

    1.4   测定方法

    土壤总铬浓度的测定参照HJ 491—2019，Cr（Ⅵ）浓度的测定参照HJ 1082—2019，土壤浸出液中总铬浓度的测定参照HJ 749—2015；土壤有效铁含量的测定采用火焰原子吸收分光光度法测定，测定前使用二乙基三氨五乙酸法浸提.

    2.   结果与讨论（Results and discussion）

    2.1   热解炭与水热炭对土壤中Cr赋存形态的影响

    Tessier五步提取法可以把土壤中的Cr分为5种形态，这些形态按照生物利用度和其毒性大小由低到高依次为残渣晶格结合态（RES）、有机质及硫化物结合态（OM）、铁锰氧化物结合态（FeMnOx）、碳酸盐结合态（Cab）、金属可交换态（EXC）. 结果如图1所示，与对照土壤相比，施用生物炭处理促进了EXC、Cab和FeMnOx向OM和RES转化，土壤中Cr的稳定性提高，毒性下降. EXC、Cab和FeMnOx组分主要由可溶性高、交换性较强的重金属离子及其碳酸盐态组成[34]，这些组分的减少说明生物炭施用后土壤中Cr的稳定性提高. 除生物炭的吸附作用外[35]，生物炭与Cr（Ⅵ）的静电吸引以及与Cr（Ⅲ）的络合反应[36]也可能是Cr稳定性提升的原因. 而与BC处理相比，SBC处理后（OM+RES）组分占比增加更为显著，这表明水热炭对土壤中Cr的固定效果更好，可能是由于水热炭拥有更丰富的表面官能团，通过配位键等作用将重金属由活性状态转化为惰性状态[37].

    图 1  BC、SBC施加后土壤中Cr的赋存形态
    Figure 1.  Speciation of chromium in soil after application of BC or SBC
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    2.2   改性水热炭对土壤中Cr固化效能的影响

    按炭铁质量比2:1、1:1、1:2，将ZVI改性水热炭依次记作Ⅰ-ZBC、Ⅱ-ZBC、Ⅲ-ZBC，将黄铁矿改性生物炭依次记作Ⅰ-HBC、Ⅱ-HBC、Ⅲ-HBC. 由图2可知，施用改性水热炭均降低浸出液总铬含量. 其中施用Ⅰ-ZBC、Ⅱ-ZBC、Ⅲ-ZBC浸出液总铬浓度分别下降27.4%、29.7%、30.0%，彼此无显著差异；施用Ⅰ-HBC、Ⅱ-HBC、Ⅲ-HBC浸出液总铬浓度分别下降32.0%、33.4%、38.9%，整体处理效果优于ZBC，Ⅲ-HBC处理效果突出.

    图 2  ZVI改性水热炭（a）、黄铁矿改性水热炭（b）对土壤中Cr固化效能的影响
    Figure 2.  Effect of ZVI modified hydrochar （a） or pyrite modified hydrochar （b） on the immobilization efficiency of Cr in soil
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    从图2中看出，Cr的释放过程分为两个阶段[38]. 第一阶段土壤表面吸附的Cr和土壤中迁移性较强的Cr（Ⅵ）迅速释放到溶液中，浸出液总铬浓度快速升高. 与对照实验（CK）相比，添加ZBC、HBC后总铬含量显著降低，且增长速率减缓. 在反应进行1 h后进入第二阶段，此时Cr的释放由土壤颗粒表面转为内部，释放速度降低. 施加ZBC、HBC的土壤浸出液总铬浓度在4 h达到最大值后呈下降趋势. 而未投加炭的对照组总铬浓度在6 h后变化趋于平稳，但仍呈上升状态. 因此，施加ZBC、HBC对土壤中的Cr有固定作用. 根据实验结果，选择处理效果较好的Ⅲ-ZBC和Ⅲ-HBC进行后续实验研究，后续提到的ZBC、HBC均为Ⅲ-ZBC、Ⅲ-HBC.

    2.3   不同材料对土壤中Cr固化效能的影响

    从图3可知，随材料投加量的增加，土壤浸出液中总铬含量整体均呈下降趋势. ZVI在投加量为8 g·kg−1时达到最佳处理效果，此时总铬含量为29.012 mg·L−1，与对照组相比降低27.5%. 增大投加量到10 g·kg−1时，总铬浓度反而上升，可能是高投加量下ZVI会因其磁性造成颗粒团聚，导致炭表面活性位点减少[14]. 且ZVI将Cr（Ⅵ）还原成Cr（Ⅲ）会在其表面形成氧化膜，阻碍活性位点与重金属接触[39]. 相比ZVI，黄铁矿处理效果更好，在投加量为8 g·kg−1时浸出液总铬含量降低到27.3 mg·L−1，与对照组相比降低31.8%. 在所有材料中，BC处理效果最差，投加量为10 g·kg−1时浸出液总铬含量仅降低13.4%，而SBC处理效果较好. 随SBC投加量的增加，其处理效果显著增强. 当投加量为10 g·kg−1时，浸出液总铬含量降低到26.4 mg·L−1，与对照组相比降低35.0%. 这可能是由于水热炭拥有更丰富的表面含氧官能团（如羧基、羟基等），对Cr有更强的吸附能力[40]. 两种改性水热炭处理效果更为优秀，且达到最佳处理效果所需投加量较低，节省材料使用量. 这可能是因为球磨改性后炭颗粒粒径变小，比表面积增大[41]，ZVI、黄铁矿较好地负载到炭骨架上，且铁颗粒的团聚现象减弱，增强改性炭对土壤中Cr的吸附和还原能力[26]. 在5 g·kg−1最佳投加量下，ZBC处理后浸出液总铬含量降低到26.0 mg·L−1，比对照组降低35.8%；而HBC处理效果最好，其浸出液总铬含量降低到24.5 mg·L−1，比对照组降低39.6%.

    图 3  ZVI、黄铁矿、BC、SBC、ZBC、HBC对土壤中Cr固化效能的影响
    Figure 3.  Effect of ZVI, pyrite, BC, SBC, ZBC, and HBC on the immobilization efficiency of Cr in soil
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    施用ZVI、黄铁矿等进行土壤修复时存在Fe释放过度的问题[14]，因此对投加ZVI、黄铁矿、ZBC和HBC的土壤中的有效铁含量进行测定，结果如图4所示.

    图 4  ZVI、黄铁矿、ZBC 和 HBC投加量对土壤有效铁含量的影响
    Figure 4.  Effect of dosage of ZVI, pyrite, ZBC, and HBC on available iron content in soil
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    随ZVI、黄铁矿投加量的增加，土壤中有效铁含量增加. 在最佳投加量8 g·kg−1的条件下，ZVI处理使土壤中有效铁含量增加40.1%，黄铁矿处理使土壤中有效铁含量增加10.1%. 而ZBC、HBC投加量的增加对土壤中有效铁含量影响较小，在投加量为5 g·kg−1的条件下，土壤中有效铁含量的分别增长0.6 mg·L−1和0.4 mg·L−1，涨幅均小于0.1%，有效解决Fe释放过度的问题.

    2.4   改性水热炭的表征及固化土壤中Cr的机制分析

    2.4.1   改性水热炭表面形貌及mapping分析

    6种改性水热炭的表面形貌及对应的mapping测试结果见图5，可以看到经过球磨后，ZVI、黄铁矿在炭表面分散，炭的表面粗糙，结构不规则. 低铁炭掺杂比的炭存在着Fe元素分布较少或颗粒团聚的现象[14]，这可能会导致炭有效孔隙和活性位点减少，降低炭的吸附能力. 随着铁炭掺杂比增大，Fe元素重量百分比上升，分布愈发均匀. 这可能是由于较多ZVI、黄铁矿可与水热炭在球磨过程中更充分地相互摩擦和碰撞，通过球磨介质的作用，使其在生物炭断裂、变形过程中分布到生物炭的表面及孔隙结构中[26]，增加炭的活性位点，增强对Cr的吸附能力[42].

    图 5  不同改性水热炭扫描电镜图及mapping图
    Figure 5.  Scanning electron microscope （SEM） and mapping images of different modified hydrochar
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    2.4.2   改性水热炭表面官能团分析

    为进一步探究水热炭改性后对土壤中Cr的固定机理，对SBC和6种改性水热炭的红外特征峰进行分析（图6）. O—H等氧化还原活性官能团被认为是生物炭氧化还原能力的驱动力[17]，可与重金属阳离子交换[43]. 1730—1734 cm−1处羧基、醛、酮和酯类基团上的C=O峰和1612—1615 cm−1处C=C、C=O峰的强度随着铁炭掺杂比的增加而增大，说明改性后炭含氧官能团增加. C=O等含氧官能团可以为重金属提供大量结合位点，增加炭吸附能力，形成络合物[21]. 543 cm−1处为Fe—O的弱峰[44]，证明Fe与含氧基团结合，成功地负载在水热炭表面.

    图 6  SBC及改性水热炭FTIR谱图
    Figure 6.  FTIR images of SBC and modified hydrochar
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    2.4.3   改性水热炭元素价态分析

    对两种改性水热炭施加到土壤前后的样品进行XPS测定，结果如图7所示. 观察全谱图可得，二者全谱图中均存在Fe峰，说明Fe成功负载到炭骨架上，其中HBC表面还存在S元素. 炭在施加到土壤后全谱图中均出现Cr峰，且O峰的强度增加，说明改性水热炭可能将Cr吸附在表面并形成铁铬氧化物. 对比施加前后的Fe2p谱图，代表Fe（Ⅱ）的峰强度均下降，Fe（Ⅲ）峰强度相对增强，表明ZBC、HBC中的Fe对土中的Cr（Ⅵ）具有还原能力. 在HBC的Fe2p谱图中，代表FeS2[45-46]的峰强度前后变化明显，这表明FeS2参与了对Cr（Ⅵ）的还原. Cr2p谱图中在577—579 eV处存在代表Cr（Ⅲ）的多重轨道分裂峰[47]，表明炭表面存在Cr的氧化物和氢氧化物；在580 eV附近存在代表Cr（VI）的弱峰且拟合较差，进一步说明ZBC、HBC将污染土中的Cr（Ⅵ）还原成Cr（Ⅲ），炭表面不存在或存在极少量的Cr（Ⅵ）.

    图 7  不同改性水热炭XPS谱图：
    Figure 7.  XPS images of different modified hydrochar
    （a） ZBC施加到土壤前后的全谱图；（b） ZBC施加到土壤前的Fe2p谱图；（c） ZBC施加到土壤后的Fe2p谱图；（d） HBC施加到土壤前后的全谱图XPS谱图；（e） HBC施加到土壤前的Fe2p谱图;（f） HBC施加到土壤后的Fe2p谱图；（g） ZBC施加到土壤后的Cr2p谱图；（h） HBC施加到土壤后的Cr2p谱图
    （a） XPS survey of ZBC before and after it was placed to the soil; （b） Fe2p image of ZBC before it was placed to the soil; （c） Fe2p image of ZBC after it was placed to the soil; （d） XPS survey of HBC before and after it was placed to the soil; （e） Fe2p image of HBC before it was placed to the soil; （f） Fe2p image of HBC after it was placed to the soil; （g） Cr2p image of ZBC after it was placed to the soil; （h） Cr2p image of HBC after it was placed to the soil
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    2.5   土柱淋溶实验

    2.5.1   土壤淋溶液中Cr的释放

    各土柱淋溶液中总铬累积含量变化如图8所示. 在淋溶初期，可溶态重金属快速释放到浸出液中[48]，淋溶液中的重金属累积量均快速增加，当淋溶液体积达到300 mL时，ZBC、HBC凭借表面官能团和优秀的吸附性能，将土壤颗粒内部释放的Cr（Ⅵ）还原为较稳定的Cr（Ⅲ）并吸附在炭表面，使得淋溶液中总铬含量的增长速率减缓，而CK淋溶液中的总铬含量一直呈快速上升状态. 实验结束时CK、ZBC、HBC淋溶液总铬含量分别为1700.22、1235.22、1031.49 mg·L−1. 与CK相比，ZBC、HBC总铬含量分别下降27.3%、39.3%，均表现出良好的Cr固定效果，降低了Cr的迁移性.

    图 8  土柱淋溶液累积总铬含量变化
    Figure 8.  Changes of cumulative total chromium content in soil column leaching solution
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    土壤中重金属迁移、释放和转化的影响因素复杂，采用动力学模型拟合重金属的累积释放有助于了解过程，阐述机理. 双常数速率方程、抛物线扩散方程常用于描述土壤化学过程，表达式如下：

    双常数速率方程：lny=a+blnx (1)
    抛物线扩散方程：y=a+bx0.5 (2)

    式中，y表示重金属释放量；x表示淋溶体积；a、b为常数.

    双常数速率方程是一种经验方程，可用于反映重金属与土壤表面吸附亲和力的差异[49]. 而抛物线扩散方程常用于描述土壤内部物质的扩散，反映多个扩散机制共同控制的动力学过程[50]. 采用这两种方程对土壤中Cr的累积释放过程进行拟合，得到结果如图9、表3所示. 总的来说两种动力学模型均能较好地描述各土柱淋溶时释放Cr的动力学过程，这说明Cr在炭土环境中的释放机制复杂. 其中双常数速率方程对CK的拟合效果更为优秀，其模拟结果R2值为0.9985. 这说明未投加改性水热炭时，土壤表面吸附点位对Cr亲和力的差异较大，不能有效固定Cr. 抛物线扩散方程对ZBC和HBC的拟合效果更为优秀，其模拟结果R2值分别为0.9954、0.9887. 这说明投加改性水热炭后，土壤表面的Cr被有效吸附，淋溶液中的Cr主要来自于土壤颗粒内部的扩散作用.

    图 9  双常数速率方程拟合图（a），抛物线扩散方程拟合图（b）
    Figure 9.  Fitting figure of two-constant rate equation （a） and parabolic diffusion equation （b）
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    表 3  总铬累积释放的动力学拟合结果
    Table 3.  Kinetic fitting results of cumulative release of total chromium
    土柱Soil column双常数速率方程Two-constant rate equation抛物线扩散方程Parabolic diffusion equation
    abR2abR2
    CK11.15070.75060.9985−346.683669.60500.9882
    ZBC24.34990.59190.9900−140.859849.73650.9954
    HBC32.31840.52030.9865−41.481538.59620.9887
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    2.5.2   Cr在土柱中的纵向迁移

    由图10可知，CK土柱中Cr表现出较强的纵向迁移性，在水的淋洗与重力沉降等作用下由上部污染土壤向下部未污染土壤迁移，最终CK土柱下部土壤中总铬浓度为1378.550 mg·kg−1，Cr（Ⅵ）浓度为197.802 mg·kg−1，污染严重. 与CK相比，施加ZBC和HBC后土柱下部土壤的总铬和Cr（Ⅵ）浓度明显下降，其中投加ZBC的土柱下部土壤中总铬含量相比CK降低31.4%，Cr（Ⅵ）浓度相比CK降低51.7%；投加HBC的土柱下部土壤中总铬含量相比CK降低56.3%，Cr（Ⅵ）浓度相比CK降低44.4%.

    图 10  各土柱中总铬与Cr（Ⅵ）浓度
    Figure 10.  Concentrations of total Chromium and Cr（Ⅵ） in each soil column
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    Cr（Ⅵ）在土壤中的离子态主要为HCrO4−和CrO4−，由于污染土壤pH为8.49，偏碱性，HCrO4−更多地转变为CrO4−. 负载ZVI的ZBC会与CrO4−在土壤中发生以下反应[51]：

    2CrO2−4+3Fe0+16H+→2Cr3++3Fe2++8H2O (3)
    CrO2−4+3Fe2++8H+→Cr3++3Fe3++4H2O (4)
    (1−x)Fe3++xCr3++3H2O→CrxFe1−x(OH)3+3H+ (5)

    通过Fe0、Fe2+的还原能力，最终将Cr（Ⅵ）还原成Cr（Ⅲ），并形成CrxFe1-x（OH）3，固定在土壤中. 从反应式可以看出，酸性条件更利于反应进行，而本实验污染土壤偏碱性，这可能是导致ZBC施加后总铬浓度降低效果较HBC差的一个原因. 而负载黄铁矿（FeS2）的HBC则与CrO4−在土壤中发生以下反应[52]：

    FeS2+CrO2−4+4H2O→Fe3++Cr3++2S0+8OH− (6)
    4S0+4OH−→S2O2−3+2HS−+H2O (7)
    HS−+S0→S2−2+H+ (8)

    且最终Fe3+与Cr3+会发生式（5）反应. 其中S0及其水解产物（S2O32−、S22−）可长期保持土壤对Cr（Ⅵ）的还原能力[52]. 结合XPS表征结果，可知HBC中的FeS2参加反应，而在整个氧化过程中，FeS2可向Fe3+和SO42−提供15个电子，更有利于对Cr（Ⅵ）的还原，故施加HBC后土柱总铬浓度下降明显，更多的Cr（Ⅵ）被还原成Cr（Ⅲ）固定在土壤中. 但ZBC施加后Cr（Ⅵ）浓度降低效果优于HBC，结合浸出液总铬浓度进行分析，可能是由于土壤偏碱性，ZBC与土壤中的Cr（Ⅵ）反应较缓，未完全反应的Cr（Ⅵ）随淋洗液的冲洗快速下沉，使得浸出液中总铬浓度明显升高，而土柱中Cr（Ⅵ）浓度下降. 总的来看，施加HBC后土柱及其淋洗液中的总铬浓度下降程度更大，说明其对污染土壤中的Cr具有更好的固定效果.

    3.   结论（Conclusion）

    （1）施加水热炭（SBC）使土壤中稳定性高、毒性低的有机质及硫化物结合态（OM）和残渣晶格结合态（RES）的Cr增加17%，处理效果优于热解炭（BC）.

    （2）土壤提取实验表明，较大铁炭掺杂比（2:1）制备的改性水热炭ZBC、HBC在低投加量（5 g·kg−1）下对土壤中的Cr表现出更好的固定效果，与对照组相比其土壤浸出液中总铬浓度分别降低了35.8%、39.6%，既节省了材料用量，且不存在向土壤中过度释放铁的现象.

    （3）土柱淋溶实验表明，Cr在炭土环境中的释放机制复杂，双常数速率方程对CK土柱拟合较好，表明未施加炭时，土壤表面吸附点位对Cr亲和力的差异较大，不能有效固定Cr；抛物线扩散方程对ZBC和HBC土柱拟合较好，表明投加炭后土壤表面的Cr被有效吸附，淋溶液中的Cr主要来自土壤颗粒内部的扩散作用.

    （4）土柱实验结束后，ZBC土柱下部未污染土壤中总铬含量相比CK降低了31.4%，Cr（Ⅵ）浓度相比CK降低了51.7%；HBC土柱下部未污染土壤中总铬含量相比CK降低了56.3%，Cr（Ⅵ）浓度相比CK降低了44.4%. 结合表征结果可得，ZBC、HBC可吸附对土中的Cr，水热炭负载的Fe对土中的Cr（Ⅵ）具有还原能力，可将其还原成Cr（Ⅲ）固定在土壤中. HBC中存在FeS2，有效参与对Cr（Ⅵ）的还原，对污染土壤中Cr的固化效果更好. 此材料可为水热炭修复重金属污染土壤的应用提供思路与探索.

  • 图 1  抗生素的免疫测定原理

    Figure 1.  Principles of the immunoassays for the detection of antibiotics.（A）ELISA（B）RIA（C）FIA（D）CLIA

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    图 2  胶体金免疫层析试纸的组成结构

    Figure 2.  Configuration of a CGIA test strip

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    表 1  基于不同纳米材料用于检测动物源性食品抗生素残留的免疫技术

    Table 1.  Immunoassay based on different nanomaterials for the screening of antibiotics in animal-derived foods

    检测类型 Assay mode纳米材料Nanomaterials抗生素 Antibiotics样品 Sample检测限/ (ng·mL−1）LOD 回收率/% Recovery参考文献 Reference
    FIA MNPs 环丙沙星 牛奶 8 90—100 [28]
    QDs 链霉素 牛奶 0.005 80.21—108.3 [29]
    四环素 80.5—109.2 [29]
    青霉素 82.4—101.4 [29]
    NaYF4∶Yb, Er 诺氟沙星 牛奶 0.01 82.37—132.22 [30]
    CLIA MNPs 氯霉素 食品 2×10−4 [31]
    AuNPs 虾、蜂蜜 3.3×10−4 [32]
    SiO2 虾、蜂蜜 3.3×10−5 83.7—115.1 [33]
    EIA MOFs/AuPt 马杜霉素 鸡蛋 0.045 96.4—106 [34]
    PAMAM-Au 诺氟沙星 牛奶、鸡蛋、猪肉 0.3837 91.6—106.1 [35]
    PEDOT/MWCNT 瘦肉精 牛肉 4.66 85—111 [36]
    检测类型 Assay mode纳米材料Nanomaterials抗生素 Antibiotics样品 Sample检测限/ (ng·mL−1）LOD 回收率/% Recovery参考文献 Reference
    FIA MNPs 环丙沙星 牛奶 8 90—100 [28]
    QDs 链霉素 牛奶 0.005 80.21—108.3 [29]
    四环素 80.5—109.2 [29]
    青霉素 82.4—101.4 [29]
    NaYF4∶Yb, Er 诺氟沙星 牛奶 0.01 82.37—132.22 [30]
    CLIA MNPs 氯霉素 食品 2×10−4 [31]
    AuNPs 虾、蜂蜜 3.3×10−4 [32]
    SiO2 虾、蜂蜜 3.3×10−5 83.7—115.1 [33]
    EIA MOFs/AuPt 马杜霉素 鸡蛋 0.045 96.4—106 [34]
    PAMAM-Au 诺氟沙星 牛奶、鸡蛋、猪肉 0.3837 91.6—106.1 [35]
    PEDOT/MWCNT 瘦肉精 牛肉 4.66 85—111 [36]
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-10-07
  • 录用日期:  2022-01-13
  • 刊出日期:  2022-02-27
段培宇, 陈寒玉, 张宝忠, 祝慧娜, 李道荣. 动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展[J]. 环境化学, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
引用本文: 段培宇, 陈寒玉, 张宝忠, 祝慧娜, 李道荣. 动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展[J]. 环境化学, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
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DUAN Peiyu, CHEN Hanyu, ZHANG Baozhong, ZHU Huina, LI Daorong. Research progress of bioassay technology for antibiotic pollutants in animal-derived foods[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
Citation: DUAN Peiyu, CHEN Hanyu, ZHANG Baozhong, ZHU Huina, LI Daorong. Research progress of bioassay technology for antibiotic pollutants in animal-derived foods[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(2): 581-590. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020100704
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动物源性食品中抗生素类污染物生物检测技术研究进展

    通讯作者: Tel：18623716700，E-mail：chypds@126.com; 
  • 河南工业大学环境工程学院，郑州，450001
  • 收稿日期:  2020-10-07
  • 录用日期:  2022-01-13
  • 网络出版日期:  2022-02-25
基金项目:
国家自然科学基金（U1704123）资助.

摘要: 抗生素类污染物在动物源性食品中的残留，因其对人类健康有着潜在危害而受到了广泛的关注，因此迫切需要建立快速、灵敏、高效、便捷的检测方法以便对其及时管理和防治。生物检测技术在实现对抗生素高灵敏度、高特异性、低成本、快速的检测方面具有很强的优势，主要包括微生物检测法、免疫分析法和生物传感器法等。本文基于免疫抗体和核酸适配体两种生物识别元件的检测原理和特点，对近年来采用这两种识别方式建立起的生物检测方法在动物源性食品中抗生素残留检测中的应用进行了综述。同时，对目前检测方法研究中存在的问题进行了综合评价，并对抗生素生物检测技术的未来发展做出展望。

English Abstract

    全文HTML

  • 抗生素在医疗、畜牧、养殖等行业广泛应用。由于不正当地使用和无组织排放，致使其大量流入环境介质中，近年来，国内外在水环境[1]、土壤[2]、动植物组织[3]等环境介质中均有抗生素的检出报道[4-5]。畜禽养殖业中抗生素的不合理使用引发了一系列潜在危害，主要体现在产生抗药基因、破坏生物体内的微环境、人畜共患病增多等方面。动物源性食品安全成为了重大问题，为了保证人类健康，世界卫生组织（WHO）和联合国粮食及农业组织（FAO）曾共同建立了农药和兽药的最大残留限量（MRL）标准来对其进行控制。

    检测食品中微量或痕量级别抗生素最常采用仪器法，有高效液相色谱法（HPLC）[6]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[7-9]、液相色谱-紫外-质谱法（LC-UV-MS）[10]、液相色谱-荧光检测方法[11]等。仪器检测法的灵敏度高，检测数据准确，但由于其前处理复杂、耗时长等劣势，限制了其在原位快速检测中的应用。生物检测技术因其高灵敏度、高选择性被广泛用于动物源性食品中的抗生素残留量检测研究。基于抗体的生物免疫检测技术最为成熟，研究应用也比较广泛。而稳定性好、适用范围广的核酸适配体与响应快、操作简便的传感器相结合成为了生物检测研究的热门发展方向。基于此，本文综述了以抗体和核酸适配体为生物识别元件的生物检测技术特点及其在动物源性食品中抗生素残留量检测的研究进展，并在归纳总结生物检测技术检测抗生素的研究基础上，预测抗生素检测技术未来的发展趋势。

    • 1.   基于抗体的免疫检测技术（Antibody-based immunoassay technology）

    • 免疫分析技术是基于抗体、抗原之间特异性结合的一种生物化学技术，被广泛应用于环境和食品行业中药物残留等有害物质的定性和定量。

      • 1.1.   酶联免疫吸附分析法（ELISA）

    • ELISA是通过被酶标记的抗体对抗生素的竞争，结合到固相包被抗原上，洗涤后加入酶底物，固定在载体（酶标板）上的酶催化底物出现显色反应，最后通过分光光度法（酶标仪）对待测物质进行定量分析。近年来，双斑点法、直接（图1A）和间接性竞争ELISA在检测抗生素残留研究方面皆有开发。

      直接性ELISA和间接性ELISA有着不同的优势，Ashu等[12]比较了两种ELISA测定抗生素的灵敏性，找到了一种特异性强、灵敏度高的多克隆抗体As172，采用直接竞争ELISA法建立了用于饲料中氟喹诺酮类抗生素的检测方法，其中该抗体对恩诺沙星的检测能力达20 ng·g−1，对8种氟喹诺酮类抗生素有高达42%的交叉反应率，可实现多种抗生素残留物的同时测定。为了使ELISA更加简便且节省抗原，Wei等[13]制备出6H3D5单克隆抗体，研究出了一种双斑点ELISA可同时检测卡那霉素（KANA）和链霉素，该方法的固相载体为硝酸纤维素膜（NCM），经酶促反应后从视觉上可观测到显色情况，其检测限分别为0.09 ng·mL−1和1.37 ng·mL−1。

      酶联免疫的方法操作简单，普适性强，但在其方法的特异性和灵敏度上，对抗体的要求比较高，因此，采用其他标记物的新方法也被研究。

      • 1.2.   放射免疫分析法（RIA）

    • RIA的检测原理为被放射性同位素标记的抗原与待测抗原竞争性结合有限的特异性抗体的位点（图1B），洗涤后加入闪烁液（示踪剂），经Charm闪烁计数器分析后，闪烁计数值越高，样品中待测物质浓度越低，常用于抗生素的定性与半定量检测。

      Meyer等[14]在购置的检测限为1 μg·L−1左右的Charm Ⅱ RIA的基础上加以优化，用于检测样品中残留的四环素类抗生素。结果表明，该RIA的灵敏度低于传统的LC/MS法，有待于开发灵敏度更高的RIA。为了拓宽RIA的适用范围，Yang和Carlson[15]将样品先经固相萃取（SPE）技术纯化后，再对四环素和磺酰胺进行半定量分析，该方法的检测限低至0.05 μg·L−1。Al-Mazeedi等[16]利用Charm Ⅱ RIA筛选出阳性和疑似阳性样品，而后通过LC/MS-MS进行确认，完成了1517份乳制品中四环素残留的调查。

      虽然放射免疫分析法无法对待测样品进行准确定量，但它适用于大批量样品筛查，针对RIA的假阳性结果，可对样品进一步浓缩纯化来改善解决。不过由于该方法中使用到的放射性物质对人类健康和生态环境有一定的危害，现如今已多被ELISA所取代。

      • 1.3.   荧光免疫分析法（FIA）

    • 荧光免疫分析通常采用荧光物质进行标记（图1C），有荧光色素、镧系螯合物以及荧光酶等化合物。FIA具有高特异性、高灵敏度、检测速度快等特点，但由于一般的荧光标记物产生荧光测定本底值较高。为了减少误差，开发出了时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA），利用了镧系螯合物的量子产率高、荧光寿命长等特性，通过时间分辨技术来测定荧光强度。

      Le等[17-18]利用Sm3+和Eu3+标记不同的抗体，将双标记TRFIA用于检测金霉素和强力霉素、磺胺二甲嘧啶和磺胺喹喔啉，其检测限在0.02—0.04 ng·mL−1。Ashuo等[19]利用生物素和链霉亲和素的高亲和度制备出了Eu3+微球-mAb荧光探针，建立了一种基于TRFIA的侧向免疫测定法。该试纸条可通过扫描QR码获取相应信息，搭配荧光读取器，可实现10 min左右完成牛奶样品中3种抗生素的实时检测，检测限分别为0.10、0.06、0.27 ng·mL−1。一些自身具备荧光特性的纳米材料（如上转换纳米颗粒（UCNPs））以及不具荧光特性的磁性纳米粒子（MNPs）也被广泛应用于检测环境样品中的抗生素残留（表1）。

      FIA是一种可靠且强大的筛选方法，其信号强度大，但量子点的最终荧光发射易受干扰，所以需对样品进行脱色，以达最佳效果。

      • 1.4.   化学发光免疫分析法（CLIA）

    • CLIA是将高灵敏度的化学发光技术和高特异性的免疫反应结合起来的一种操作简便、特异性强、灵敏度高、分析速度快、线性范围宽的超微量检测技术。它通过添加氧化剂或酶底物，使体系中化学发光物质被氧化至不稳定的激发态中间体，而后回到稳定的基态并发射光子，利用发光信号测量仪进行定量。CLIA有两大类型，一种是发光物质直接对抗体进行标记（图1D），加入发光启动剂即可；另一种是采用酶（如HRP）标记抗体，然后加入相应的发光酶底物（如鲁米诺Luminol）。

      Li等[20]制备出了一种能够同时识别32种磺酰胺的mAb，采用化学发光直接竞争酶免疫测定法（CL-dcELISA）对鸡肉进行检测。Yu等[21]采用CL-dcELISA，以单链可变片段（scFvs）代替抗体提高了与FQs的交叉反应性（CR），用于检测鱼虾类20种氟喹诺酮（FQs），其中诺氟沙星（NOR）的检出限为0.017 μg·kg−1，线性范围在0.04—1.08 μg·kg−1。不少学者将微流控芯片技术和纳米材料引入CLIA用于检测动物源性食品中抗生素的残留（表1），显著减少了试剂和样品用量，增强了发光系统。

      限制CLIA的有化合物的溶解度以及闪光的即时测量等因素，但是该方法的灵敏度远高于ELISA、FIA等，反应时间优于TRFIA，在免疫检测市场上，有着无可替代的地位。

      • 1.5.   胶体金免疫层析法（CGIA）

    • 胶体金通常是氯金酸（HAuCl4）在还原剂的作用下，聚合形成粒径均匀的金粒子，粒子间的静电作用使其形成了稳定的胶体状态。由于AuNPs表面的强吸附作用，可以很好地同蛋白质结合进行标记。当大量标记物聚集时，视觉上呈红色，在不使用仪器的情况下即可通过肉眼比色来完成检测物的定性与半定量。CGIA是在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线内固定好特异性抗原或抗体，样品加在样品垫，借助毛细作用向另一端流动（图2），到达T或C线相应的抗体或抗原被截留，实现分离，整个检测过程在10 min左右。

      Luo等[22]使用对马波沙星（MBF）有高灵敏度的M4E3 mAb开发了一种基于视觉的CGIA，检测限在1 ng·mL−1，还可灵敏地检测6种氟喹诺酮类似物，交叉率超过20%。Guo等[23]开发了一种用于筛选鸡胸肉中卡巴氧（CBX）和喹赛多（CYA）残留物的CGIA。该方法以（E）-2-（hydr甲基）喹喔啉1,4-二氧化物作半抗原制备了mAb，在最佳条件下，视觉检测限达8 μg·kg−1，利用条带扫描仪定量检出限为2.92 μg·kg−1、2.68 μg·kg−1。Xu等[24]则建立了一种无需进行样品前处理的CGIA，用于检测牛奶中的氯霉素（CAP）。与SERS技术结合，可极大提高检测的灵敏度，对新霉素的检测限低至0.216 pg·mL−1，证实该方法具有较高的重现性和稳定性[25]。

      CGIA无法进行多种抗生素的同时检测，但基于CGIA开发的试纸条与微流控芯片检测技术结合，经小型仪器扫描将色度值转化为电信号，在8 min内即可完成现场快速检测，具有良好的稳定性和准确性[26]。

      • 1.6.   电化学免疫分析法（EIA）

    • 电化学免疫传感器（EIS）是由生物感受器和换能器组成的一种小型分析设备。其原理为生物受体识别目标分析物会产生特定的生物信号，此信号通过换能器转换，成为可测量的电信号，分析物的浓度与电信号存在相对应的关系。利用高灵敏度、低成本的EIS可对痕量待测物完成准确定量。根据检测的信号类型不同，通常将EIS分为电流型、电容型、电位型和电导型4类。

      不同的纳米材料可不同程度地提升传感器的电化学性能（表1）。纳米酶是一种具有酶活性的纳米材料，其特点是成本低，稳定性强，在EIS的信号放大方面起着极其重要的作用。Xiao等[27]将二维的Cu-TCPP（Fe）用作纳米酶修饰于电极上，基于Cu2+和聚乙烯亚胺（PEI）的强亲和力致使酶活性降低，进而引起电化学电流下降的原理，开发了一种新型电化学免疫传感器，用于测定磺酰胺，检测限达0.395 ng·mL−1。但电极传感器的制造需耗费大量时间，可以通过批量生产来用于现场检测。

      抗体作为识别元件时，生物蛋白的特异性受制诸多因素制约，如pH、温度、存放时间等。而核酸适配体作为一种“化学抗体”，它具有良好的稳定性、可修饰性以及宽适用范围等特性，因而近年来被广泛应用于动物源性食品中抗生素的残留检测。

    2.   基于核酸适配体的生物检测技术（Aptamer-based bioassay technology）

    • 核酸适配体是通过SELEX，即指数富集的配体系统进化技术筛选出的单链DNA或RNA寡核苷酸序列。适配体有着复杂多样的二级结构，能够形成凸环、发夹、G-四联体等立体结构，这些结构特性使之被广泛应用于生物传感器的开发。它可通过范德华力、氢键、静电相互作用与靶分子相结合[37-38]，具有高度的亲和性和特异性。相对于抗体来说，适配体通过化学合成，减少了批次间的差异，缩短了生产时间，成本相对较低；良好的热稳定性，使其更易储存；经过化学修饰和标记后仍具有良好的特异性；适用范围更广泛，从离子到细胞的任何靶点，包括非免疫或有毒的靶点[39-40] 。由于适配体的优良特性，目前在分析动物源性食品中抗生素的残留检测应用中有着良好的前景。与基于抗体的酶联免疫吸附法相比，酶联适体法具有更高的灵敏度和回收率。一些基于适配体的生物传感器，如电化学适配体传感器、光学适配体传感器等[41]，不断被设计开发应用。适配体的可扩增性使得利用PCR技术实现信号放大成为可能。

      • 2.1.   基于核酸适配体的生物传感器抗生素检测技术

    • 核酸适配体生物传感器（aptamer biosensor，简称AB）是一种由生物识别元件和换能器组成的装置，其生物识别元件通常以核酸适配体为主。适配体具有易修饰性，与纳米材料结合可增强传感系统的灵敏度，提高传感器的性能。AB法通常会引入一定的物质用于放大信号系统，进一步提升传感器的灵敏度。当目标分析物接触识别元件时，若有目标物的存在，适配体则会适应型折叠形成特殊的空间结构与目标物特异性结合，换能器将结合瞬间的信号转换为物理信号，最后经电子系统放大并显示。对物理信号进行分析，就可以完成对于样品中目标物的定性与定量。

      • 2.1.1.   光学核酸适配体传感器

    • 光学生物传感器的换能器通常利用光的分光、荧光、折射等性质来对目标物进行定量检测。

      光学核酸适配体传感器中最常采用的是基于比色的检测，目前开发的比色核酸适配体传感器大都基于胶体的测定，最常用的就是AuNPs，由于AuNPs具有独特的光学性质和高消光系数，研究者们利用这些优势开发出来许多应用于抗生素检测的AB。也有一些研究者建立了一种酶联适体测定法[42-43]，通过测定吸光度来完成检测抗生素，具有较宽的线性检测范围和较低的检测限。

      较短的单链DNA（ssDNA）其表面密度更高，与载体有更强的亲和力、更好的动力学。Wu等[44]基于ssDNA这一特性，利用长链（CAP适配体）、短链（TET适配体）偶联于AuNPs表面造成密度差异这一原理引发的AuNPs溶液颜色变化，开发了一种无标记超灵敏比色适体传感器。Abedalwafa等[45]和 Liu等[46]都开发了一种便携式比色传感器条用于动物源性食品中KANA的检测。前者是通过谷氨酸（GA）接枝到乙酸纤维素（CA）来制备带有羧基的电纺纳米纤维膜（NFM），将KANA适体标记在NFM上，适体与cDNA@AuNPs偶联，以此获得比色生物传感器条，当KANA存在时，传感条由粉色变为白色，检测限低至2.5 nmol·L−1；后者是基于AuNPs-apt作探针和AgNPs-cDNA作为信号放大元件开发了检测KANA的试纸条传感器，通过仪器扫描可实现1—30 nmol·L−1的线性检测范围和0.0778 nmol·L−1的检测限。Emrani等[47]设计了一种荧光猝灭和比色适配体传感器，传感器基于AuNPs、双链DNA（dsDNA）和FAM标记的cDNA（互补链DNA）。当链霉素不存在时，溶液由红变蓝，有强烈的荧光；反之，溶液呈红色，荧光被AuNPs猝灭。THMS（三螺旋结构）的结构比dsDNA更加坚固，能够保护AuNPs免受盐诱导的聚集，利用这一特点，Ramezani等[48]设计了一种比色适配体传感器，对四环素的检测限为266 pmol·L−1。

      另一种最常采用的检测信号就是荧光强度，荧光信号一般是由荧光染料或是具有荧光性质的纳米材料发出的，适体与靶标特异性结合后，一些物质可通过荧光能量共振转移对荧光进行猝灭或使荧光信号得以释放，辅以一定手段对荧光信号进行放大，通过测定即可完成分析物的定量。

      MNPs、UCNPs[49-50]、GO[51]等纳米材料和噻唑橙[52]等荧光染料常被用于光学核酸适配体传感器，灵敏、快速的检测抗生素。 Yang等[53]使用典型的MB-SELEX技术进行磺胺二甲嘧啶（SMZ）适体的选择，并引入裸羧基MB和SMR-MB用于反选择，提高SMZ适体的特异性。筛选得到的SA07适体用于开发化学发光适配体传感器，与27种磺酰胺类抗生素几乎无交叉反应性，检测限为0.92 ng·mL−1。Liu等[54]开发了一种比例荧光传感器，其中适配体标记上荧光染料，锆卟啉MOF（PCN-222）作为荧光猝灭剂，PCN-222与apt通过π-π堆积、静电等相互作用吸附结合，由FRET发生荧光猝灭。该传感器可在26 min内完成残留于牛奶和虾中CAP的检测，检测范围0.1 pg·mL−1—10 ng·mL−1，检测限低至0.08 pg·mL−1。Rouhbakhsh等[55]使用成本低的液晶（LC）设计了一种无标记向列型LC适体传感器，其原理是利用靶标诱导适体构象转换进而改变LC的垂直取向，可通过偏振光学显微镜计算出图像的灰度强度来定量牛奶中四环素的浓度。

      表面等离子共振（SPR）的量子力学现象是SPR生物传感器的基本原理，平行于入射平面的偏振光撞击导电薄膜表面，在两种介质间产生的表面等离子激元被完全反射，当适配体结合分析物时，薄膜的折射率及共振角发生改变，反射光强度随结合分析物的质量呈比例变化。SPR生物传感器对于无标记、未经预处理的浑浊的样品也可完成高灵敏、高通量的检测。Wang等[56]在金膜表面引入了DNA四面体以纳米级距离定向的方式固定四环素适配体，提升了对TC的捕获效率，从而提高了SPR适体传感器的灵敏度，在蜂蜜样品中TC的回收率可达80.2%—114.3%，检测限为0.0069 μg·kg−1，较未引入DNA四面体的适体传感器低至10倍。

      表面增强拉曼散射（SERS）是一种高度灵敏的光学测量方法，它基于光在纳米级粗糙贵金属表面附近原子或分子上的增强的非弹性散射（拉曼散射）提供信号。SERS适体传感器有着极高的灵敏度，成本低、响应速度快等优势，使用各种纳米材料能够不同程度的提升SERS适体传感器的灵敏度。Nguyen等[57]开发了一种基于GO/AuNPs的SERS传感器用于检测牛奶中的KANA，该纳米复合材料有较高的热稳定性和低热辐射，降低了微流体检测系统中的闪烁效应，获得了1—100 nmol·L−1的线性范围，0.75 nmol·L−1的检测限。Jiang等[58]通过监测4-巯基苯甲酸（4-MBA）的特征峰强度变化来定量牛奶中KANA的浓度，4-MBA修饰于Au@AgNPs表面，适体加入时削弱了4-MBA的拉曼强度，当KANA存在时，恢复了对4-MBA的表面增强作用。Meng等在适配体连接的两种大小的AuNPs之间构建了拉曼热点，当鱼粉中存在OTC时，系统拉曼强度增加，其检测限低至4.35×10−3 fg·mL−1，回收率在91.29%—110.98%之间。

      • 2.1.2.   电化学核酸适配体传感器

    • 固定于电极上的适配体与目标分析物特异性结合，这一反应会被电极表面的电活性物质所识别，从而引起可测量的电性能，如电流、电势、电容，发生变化，由此可完成目标分析物灵敏的定量检测。为了增强电化学性能，经常采用导电纳米材料或化学物质（如β-CD（环糊精）[59]）来修饰电极，以放大信号，提高传感器的灵敏度。

      Chen等[60]基于场效应晶体管（FET）开发了一种可集成的小型电子传感器，用于检测妥布霉素。还原氧化石墨烯（rGO）纳米片用作通道材料，适体RNA作为探针偶联于rGO，并采用了MCH和PBA对未结合适体的位点进行封闭，降低特异性结合引起的误差，传感器可在5 s内做出反应，0.3 nmol·L−1的检测限。有人在笔状石墨电极（PGE）上依次固定了rGO和AuNPs，巯基化适配体偶联于AuNPs表面，组建了电化学适体传感器，成功应用于肉类及牛奶样品中磺胺二甲氧嘧啶[61]和四环素[62]的检测，在最佳条件下，检测范围宽至1×10−16—1×10−6 mol·L−1，检测限低至3×10−17 mol·L−1。石墨相氮化碳（g-C3N4）是一种2D半导体纳米材料，具有独特的光学、电子、机械和化学特性，广泛应用于生物传感器。Li等[63]将g-C3N4修饰于钒酸铋（BiVO4）电极表面，g-C3N4通过π-π共轭吸附固定DNA适配体，开发出了一种通用的光电化学（PEC）传感器，改变DNA适体即可实现对于抗生素的灵敏性检测。有人将适体探针和微芯片电泳（MCE）平台相结合，根据apt-分析物和dsDNA产生的峰位置及强度不同，对牛奶及鱼肉中的抗生素进行定量检测[64]。Huang等[65]将四环素的短适体（Apt40）和长适体（Apt76）混合物固定在金丝网印刷电极表面上，使二者有良好的空间序列可与含TC的蜂蜜样品有较大的接触面积，识别能力远高于使用单个适体，检测限为0.0073 ng·mL−1，96.45%—114.6%良好的回收率。

      基于核酸适配体的传感器有着高灵敏度、强选择性、响应速度快、成本低等特点，微量样品即可完成检测，被广泛应用于动物源性食品中抗生素的残留检测。而核酸适配体本身作为一段核苷酸序列是可以在体外利用聚合酶链式反应（PCR）技术进行扩增的，利用这一特性，不少学者开发出了基于适配体的新型抗生素生物检测方法。

      • 2.2.   基于聚合酶链式反应（PCR）扩增信号的抗生素测定技术

    • PCR技术能够实现在体外快速扩增目的DNA序列，早期应用于转基因和克隆技术，现被成功引入到环境监测领域。核酸适配体或互补寡核苷酸链通过标记生物素和链霉亲和素来与纳米磁珠载体进行结合，在外磁场作用下，可高效分离目标扩增DNA，减少后续PCR中的非特异性扩增，提高方法的特异性。

      Tao等[66]将抗体和DNA结合设计了一种用于检测牛奶中CAP的方法，把报告基因DNA连接在CAP抗体上，而后通过EDC/NHS交联法将其固定于磁珠表面，以此获得免疫磁珠。牛奶样品中的CAP结合到一部分免疫磁珠后，剩余的免疫磁珠被固定于表面有CAP的PCR管中，经洗涤后对报告基因进行实时荧光定量PCR（qPCR），样品中CAP的浓度与阈值循环（Ct）值呈正比，有0.0008 μg·L−1的检测限，回收率在75%—155%之间。与免疫磁分离（IMS）相比，适体磁捕获（AMC）的捕获效率随着靶标数量减少而提高[67]，与PCR信号放大技术的成功联用，实现了微量样品的高灵敏检测。Duan等[68]将互补链固定于磁珠上，适体与互补链杂交，当氯霉素（CAP）加入后，适体从磁珠上解离，收集含有适体的上清液进行qPCR，在最佳实验条件下，基于AMC的qPCR检测限为0.1 ng·mL−1，有0.1—20 ng·mL−1的线性检测范围。在AMC和PCR的基础上，Zhou等[69]结合微芯片电泳（MCE）阵列开发了一种可同时检测牛奶和鱼肉中KANA和CAP的传感器。适体固定于磁性金粒子上，与其互补链杂交，当待测物存在时，互补链被解离释放至上清液，将互补链与内标链共同扩增20个循环，产物通过MCE确定不同位置的电流强度，检测限分别达0.0025 nmol·L−1和0.006 nmol·L−1。除了单独利用PCR增强检测信号外，Ma等[70]设计了一种基于PCR和链霉亲和素（SA）双重放大的荧光偏振（FP）适体传感器，最佳条件下，对CAP的线性检测范围宽至0.001—200 nmol·L−1。适体和CAP孵育一段时间后，利用氧化石墨烯（GO）除去未结合适体，适体-CAP复合物作为模板，加入FAM标记的正向引物和生物素标记的反向引物后进行PCR，在产物中加入SA以增大分子量，该方法中FP与CAP的浓度呈正比。

      qPCR是用于基因序列快速测定、精准定量的重要技术。通过加入各种类型的荧光标记物，在扩增过程中，荧光信号随着PCR产物的增加而增强，从而完成分析物的高灵敏度测定。

    3.   结论与展望（Conclusion and perspective）

    • 综上所述，在对低浓度抗生素检测方法的研究中，基于抗体的免疫检测技术是高通量、高灵敏度、强特异性分析方法中不可或缺的一项，其应用领域及技术已经相当成熟。但RIA由于放射性元素危害人体健康，限制了其发展，逐渐被其他免疫技术所取代。基于CGIA的免疫试纸条技术可在十几分钟内完成样品的半定量测定，非常适宜于对抗生素的快速筛查，而荧光、化学发光和电化学免疫检测技术是提高检测技术灵敏度的良好选择，其最低检测限可达pg·mL−1，线性范围跨越2个数量级。与抗体识别元件相比更为稳定的适配体具有特异性强、热稳定性、成本低、易于修饰等特点，以其为识别元件的生物传感器检测方法研究发展迅速，广泛应用于动物源性食品中抗生素的检测。随着适配体筛选技术不断改进，越来越多的高特异性适配体被选出，进一步扩大了适配体识别元件的应用范围。PCR技术能够指数级地扩增模板信号，加上后续对产物进行凝胶电泳来定量或是加入荧光基团或染料可以进行全过程荧光定量，可实现对动物源性食品中痕量抗生素的检测。

      未来动物源性食品中抗生素的检测技术发展趋向于简便、高灵敏、高通量的快速原位检测。对于新的生物检测技术的开发，可从以下几个方面着手：

      （1）提高技术的选择性能：传统的生物抗体识别可被性能更加优越的核酸适配体所替代，因此，筛选出高特异性适配体以及提升适配体与靶物质的亲和度，提升技术抗扰能力是未来建立单一靶物质测定的研究方向之一。

      （2）降低技术的操作成本：目前食源性食品中抗生素的残留趋向于一大类抗生素乃至多种类抗生素残留，因此建立能够同时对多种抗生素产生反应的检测方法，可以提高其在实际样品中的实用性。例如可将不同抗生素的核酸适配体同时固定于丝网印刷电极或磁性粒子上。

      （3）研发微型智能化技术：计算机技术和微电子技术发展迅猛，设计开发适合原位快速检测的便携技术，借助计算机网络实现数据的实时在线监测分析，改善在市场应用的可行性。

    参考文献 (70)

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