催化臭氧化3-氯酚中生物毒性的变化

盛钎; 魏建建; 吴江南; 马德华; 王连军

doi:10.7524/j.issn.0254-6108.2020062302

催化臭氧化3-氯酚中生物毒性的变化

南京理工大学环境与生物工程学院，江苏省化工污染控制和资源化高校重点实验室，南京，210094

通讯作者: Tel：17706337668，E-mail：madh@njust.edu.cn;

基金项目:
国家自然科学基金（51708292）资助

Study on the biological toxicity evolution during catalytic ozonation of 3-chlorophenol

Jiangsu Key Laboratory of Chemical Pollution Control and Resources Reuse, School of Environmental and Biological Engineering, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing, 210094, China

Corresponding author: MA Dehua, madh@njust.edu.cn ;

Fund Project: the National Natural Science Foundation of China (51708292)

摘要: 氯酚类化合物具有高毒性、难生物降解的特性，催化臭氧化是处理氯酚类废水的重要方法，但催化臭氧化部分氧化的特性常会导致生物毒性升高。为了识别催化臭氧化3-氯酚（3-CP）过程中的关键致毒因子，研究了不同pH下二氧化锰（MnO₂）催化臭氧化降解3-CP过程中总体生物毒性的变化规律，探究了急性生物毒性与常规污染指标3-CP浓度、总有机碳浓度（TOC）以及自由氯（FAC）浓度的相关性。结果表明，MnO₂催化臭氧化3-CP时，生物毒性不随母体污染物和TOC浓度同比例降低而是出现了先升高后下降的现象，尤其是当pH=3时，生物毒性最高值约为初始值的26倍。通过生物毒性与常规指标的相关性分析发现，处理过程中生物毒性的大小和自由氯浓度在pH=3—10时显著相关。催化臭氧化溶液中加入自由氯去除剂亚硫酸钠后，生物毒性几乎全部去除，最高点生物毒性去除率达到100%。由此推测，自由氯是MnO₂催化臭氧化3-CP中生成的高毒性中间产物，在生物毒性演变中起了关键作用。进一步研究发现，体系中的自由氯是由于臭氧分子氧化形成的，它的生成可能与共存的酚类有机物有关。
- 催化臭氧化 /
- 氯酚降解 /
- 生物毒性 /
- 自由氯.
Abstract: Chlorophenols are highly toxic and difficult to biodegrade. Catalytic ozonation is an critical method to degrade chlorophenols in wastewater, but the partial oxidation of catalytic ozonation often lead to the increased biological toxicity. In order to identify the key toxic factors in the degradation of 3-chlorophenol (3-CP) by catalytic ozonation of manganese dioxide (MnO₂), the acute toxicity evolution at different pH and its relationship with conventional pollution parameters including 3-CP concentration, total organic carbon (TOC) concentration and free active chlorine (FAC) concentration were studied. It was found that the acute toxicity of ozonated effluents increased firstly and then decreased during ozonation. The highest toxic unit was about 26 times of the initial value at pH=3. The biological toxicity and the free chlorine concentration during catalytic ozonation of 3-CP were significantly correlated at pH=3—10. After adding the free chlorine quencher sodium sulfite to the catalytic ozonated solution, the biological toxicity was almost completely removed, and the highest removal rate of biological toxicity reached 100%. Therefore, it is speculated that free chlorine is a highly toxic intermediate produced in MnO₂-catalyzed ozonation of 3-CP and plays a key role in the evolution of biological toxicity. Further study found that the free chlorine in the system was formed by the oxidation of ozone molecules, and its generation might be related to the coexisted phenolic organics.
- catalytic ozonation /
- chlorophenol degradation /
- biological toxicity /
- free chlorine.

阿特拉津（2-Chloro-4-ethylamino-6-isopropylamino-s-triazine，ATZ）是一种通过阻断叶绿体中质体醌结合蛋白和抑制光合作用来防治阔叶和禾草类杂草的选择性除草剂，土壤对其吸附性较低，因此极易向地表水、深层土壤和地下中迁移^[1]. 低浓度的阿特拉津显著降低作物的株高、根长、根干重，高浓度的阿特拉津甚至会导致植物死亡^[2]；阿特拉津影响雄性斑马鱼的神经发育和神经功能^[3]，已成为一种污染源并对动植物和人类健康造成不可忽视的风险^[4-5]. 由于阿特拉津严重的危害及影响，2004年在欧盟被禁止使用，但由于它价格低廉而在世界其他地区被广泛使用，仍是国际上销售的主要除草剂之一.

目前，环境中阿特拉津的去除方法主要有吸附法^[6]、光催化法^[7]、高级氧化法^[8]、植物修复法^[9-10]、生物法^[11]等，其中基于微生物降解的生物修复法不仅效率高，而且几乎不损害生态环境，并且可将ATZ转化为无毒或低毒的物质.很多研究者已筛选出能将阿特拉津作为唯一氮源或碳源的微生物，如细菌Pseudomonas sp. strain AKN5^[12]、Klebsiella sp. FH-1^[13]、Citricoccus sp. strain TT3^[14]、Arthrobacter sp. 30、Pseudomonas sp. AD39^[15]和真菌Pleuroyus ostreatus INCQS 40310^[16]等. 这些菌株对阿特拉津具有耐受性并能降解高浓度的阿特拉津，Enterobacter sp.LY-2^[17]对浓度为100 mg·kg⁻¹的污染土壤具有修复效果，14 d后阿特拉津浓度降低为9.9 mg·kg⁻¹；产脲节杆菌（Arthrobacter ureafaciens）CS3，培养2 d 可将50 mg·L⁻¹的阿特拉津完全降解^[18]. 虽然目前报道的去除阿特拉津的微生物种类较多，但仍然存在停滞期长，降解耗时较长，耐受性差等不足。而且大部分菌株来源于中国北部寒冷地区，东北多为黑土，呈中性或偏碱性、有机质及氮磷含量丰富，而长三角地区雨量充沛、气温较高，土壤通透性差、呈弱酸性、有机质及氮磷含量较低，这些菌株可能不适应长三角的土壤环境，因此有必要寻找适合长三角地区的高效阿特拉津降解微生物资源.

本研究从江苏省5个不同地区的农田土壤中筛选分离能适应长三角地区阿特拉津污染土壤的菌株，研究ATZ初始浓度、温度和pH对菌株繁殖和降解效果的影响，判断菌株的适用环境范围，并采用HPLC-MS测定ATZ的降解产物，推断可能存在的降解转化途径.

1. 材料与方法（Materials and methods）

1.1 主要试剂

阿特拉津（>97%）（C₁₈H₁₄ClN₅，分子量214.69，密度为1.2 g·cm⁻¹、沸点为200 ℃、熔点为174 ℃，难溶于水）、甲醇、乙醇、葡萄糖、C₆H₉Na₃O₉、C₉H₁₁NO、C₆H₇NO₃S、C₁₀H₉N等. 无机盐培养基（MSM）：Mg₂SO₄·7H₂O 0.1 g·L⁻¹、K₂HPO₄ 1 g·L⁻¹、KH₂PO₄ 1 g·L⁻¹、FeSO₄·7H₂O 0.025 g·L⁻¹、CaCl₂ 0.025 g·L⁻¹，适量阿特拉津；富集培养基（LB）：牛肉浸膏5 g·L⁻¹、胰蛋白胨10 g·L⁻¹、NaCl 5 g·L⁻¹，加15 g·L⁻¹琼脂即为固体培养基.

1.2 阿特拉津降解菌的筛选与分离纯化

取江苏省5个长期喷洒阿特拉津的农田表层土壤（0—10 cm）进行降解菌株的驯化. 将土壤样品（5 g）分别加入150 mL MSM培养基中（ATZ浓度为50 mg·L⁻¹），培养条件设置为 30 ℃、150 r·min⁻¹. 驯化7 d后将上清液转至新的MSM培养基中，重复3次适应过程. 最后，将梯度稀释的培养液涂布于LB固体培养基，待菌落长成后，将其进行多次划线分离和纯化，并于无机盐培养基验证降解效果. 最终，筛选出一株能够降解阿特拉津的菌株D2，并采用斜面培养基和甘油保存.

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 菌株的形态学观察

将菌株接种于固体培养基，2—3 d后观察长出菌落的形态（形状、色泽、透明程度等）；采用扫描电镜（Quanta FEG 250）观察菌株 D2放大50000倍后的表面形态.

1.3.2 生理生化试验

革兰氏染色试验、水解产酸、柠檬酸盐利用、V-P、过氧化氢酶等指标，具体测定方法依据《污染控制微生物实验》^[19]，并参照《常见细菌系统鉴定手册》^[20]与类似细菌进行比较.

1.3.3 16S rDNA基因序列分析

将菌株在固体培养基中划线分离，待菌落长成后进行16S rDNA基因鉴定，由上海天霖生物科技有限公司完成. 将D2的 16Sr DNA 基因序列在BLAST系统中与基因库进行比对分析，并使用MEGA 7.0软件绘制系统发育树.

1.4 菌株生长量的测定及生长模型拟合

采用紫外可见分光光度计（INESA-N4）测定菌株生长不同时间段的OD₆₀₀以推测菌株的生长情况，以原始溶液为空白对照绘制D2的生长曲线，并用 SGompertz模型^[21]（式（1））和Slogistic模型^[22]（式（3））拟合D2的生长曲线，并得到菌株最大比生长速率（μ₁、μ₂）：

$\mathrm{lg}{N}_{{t}_{1}}=\mathrm{lg}{N}_{0}+{a}_{1}\times {\mathrm{e}}^{-{\mathrm{e}}^{-{k}_{1}\left(X-{X}_{\mathrm{c}}\right)}}$

$(1)$

${\mu }_{1}=\frac{{a}_{1}\times {k}_{1}}{\mathrm{e}}$

$(2)$

式中，t为时间（h），N_t1为时间t时菌株的数量，N₀为初始菌株数量，X_c为达到最大升值速率的时间（h），μ₁为菌株的最大比生长速率（h⁻¹），a₁为菌株最大生长量.

${N}_{{t}_{2}}=\frac{{a}_{2}}{1+{\mathrm{e}}^{-{k}_{2}\left(X-{X}_{0}\right)}}$

$(3)$

${\mu }_{2}=\frac{{a}_{2}\times {k}_{2}}{4}$

$(4)$

式中，t为时间（h），N_t2为时间t时菌株的数量，X₀为达到最大升值速率的时间（h），μ₂为菌株的最大比生长速率（h⁻¹），a₂为菌株最大生长量.

1.5 菌株D2最佳降解条件的研究

为了探究环境因素对菌株降解阿特拉津的影响，将菌悬液按照体积比为2%的量接种到含阿特拉津的MSM培养基中，研究不同初始浓度（10、20、50、100、150、200 mg·L⁻¹）、不同pH（5.0、7.0、9.0）、不同温度（10、20、30、40 ℃）下菌株对阿特拉津的降解情况，以转速 150 r·min⁻¹ 避光培养，溶液经0.22 μm滤膜后测定阿特拉津的浓度.

1.6 阿特拉津及其降解产物的测定

阿特拉津的浓度采用岛津高效液相色谱仪（LC-20AT，Japan）测定. 检测条件：流动相为V（甲醇）：V（水）=60:40，流速为1.0 mL·min⁻¹，波长为220 nm. 降解产物定性分析采用带有高效液相色谱仪UltiMate 3000（Thermo Fisher Scientific，USA）和高分辨质谱仪5600 QTOF（AB SCIEX，Framingham，USA）的超高压液相质谱仪HPLC-MS，色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm ，2.1 mm×100 mm），以水（含有2 mmol·L⁻¹乙酸铵）和乙腈进行梯度洗脱. 条件：轰击能量，30 eV；雾化气压（GS1）：60 Psi，辅助气压，60 Psi；气帘气压，35 Psi；温度，650 ℃；喷雾电压，5000 V（正离子模式）或−4000 V（负离子模式）.

2. 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 阿特拉津高效降解菌株的分离与鉴定

采用以阿特拉津（50 mg·L⁻¹）为碳源和氮源的无机盐培养基对5个种植玉米的农田土壤经过驯化、分离，筛选出8株生长良好且菌落形态不同的菌株，最终选择一株降解效能最好的菌株，将其命名为D2.

菌株D2的菌落形态观察如图1（a），菌落较小，边缘整齐，浅黄色；革兰氏染色结果表明，D2为革兰氏阳性菌（图1b ）. 扫描电镜（×5000）下观察的菌株形态如图1（c）所示，D2呈杆状. 生理生化试验结果显示（表1），硝酸盐还原及过氧化氢酶试验均呈阳性，其余结果均为阴性.

图 1 菌株D2的形态特征

Figure 1. Morphological of strain D2

（a.在MSM上的菌落形态；b.在光学显微镜下的形态；c.在扫描电镜下的形态）

（a. Colony morphology of D2 in the plate medium；b. the image of D2 under the light microscope； c. the image of D2 under scanning electron microscopy）

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表 1 菌株D2的生理生化特性

Table 1. Physiological characteristic of strain D2

特征 Characteristic	结果 Results
革兰氏染色	+
淀粉水解	−
吲哚	−
甲基红	−
V-P产生	−
柠檬酸盐利用	−
硝酸盐还原	+
过氧化氢酶	+
注：“+”为阳性；“−”为阴性. Note：“+” means positive and “−” means negative.

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将PCR扩增后得到的基因片段进行测序，测序结果在 NCBI 上经 BLAST 分析目标序列与同源序列，并绘制系统发育树（图2），对比发现ATZ降解菌株D2与土壤芽孢杆菌（Solibacillus）的核苷酸序列相似率高达99.58%，因此菌株D2经鉴定为土壤芽孢杆菌.

图 2 菌株D2基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树

Figure 2. Phylogenetic tree of strain D2 based on 16Sr DNA gene sequence

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2.2 菌株D2的生长曲线及模型拟合

菌株D2的生长曲线见图3. 在LB培养基中，D2经过5 h的适应期后进入菌株代谢旺盛的对数期；12 h后OD₆₀₀达到1.0，此时的菌株增长速率最快；24 h后达到生长繁殖的峰值，此后OD₆₀₀不再增长，菌株数量相对趋于稳定.

图 3 菌株D2生长曲线的实验数据与“S”形生长模型拟合结果

Figure 3. Experimental and growth states of strain D2 due to S-shaped growth model

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采用SGompertz模型^[23]和Slogistic模型拟合菌株的生长曲线（表2，图3）. 结果显示，两种模型均可较好地拟合D2的生长曲线，拟合度（R²）分别为0.991和0.992，在第10 h左右D2到达最大比生长速率，随后比生长速率逐渐降低.

表 2 菌株生长曲线的SGompertz模型和Slogistic模型拟合参数对比

Table 2. Comparative list of bacteria growth due to SGompertz and Slogistic model

名称 Name	SGompertz model					Slogistic model
名称 Name	R²	a₁	K₁	X_C/h	μ₁/h⁻¹	R²	a₂	K₂	X₀/h	μ₂/h⁻¹
D2	0.991	1.995	0.279	9.647	0.214	0.992	1.958	0.454	10.950	0.222

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2.3 菌株D2对阿特拉津的降解特性研究

2.3.1 初始浓度对菌株降解阿特拉津的影响

污染物浓度对菌株的影响是评价菌株生长及降解能力的标准之一^[24]，D2在不同初始浓度下对ATZ的降解效果如图4所示. 当浓度为200 mg·L⁻¹时，D2对ATZ仍具有较高的去除能力，24 h的降解率为77.43%；初始浓度越低，D2的去除效率越高，将初始浓度为150、100、50、20、10 mg·L⁻¹的ATZ完全降解分别需要24、18、8、4、3 h.长三角洲地区农田土壤中ATZ浓度的平均值为5.7 ng·L⁻¹，检出率高达57.7%^[25]，菌株D2对ATZ的耐受性远高于环境中的平均浓度，因此它是一株在实际污染环境中具有应用价值的降解菌株.

图 4 不同阿特拉津初始浓度下菌株D2的降解效果

Figure 4. Degradation of atrazine by strain D2 under different initial atrazine concentrations

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2.3.2 温度和pH对菌株降解阿特拉津的影响

温度和pH会通过影响细菌的生长而影响其降解能力^[26-28]，不同温度（10、20、30、40 ℃）条件下，D2对初始浓度为100 mg·L⁻¹ ATZ的降解情况见图5a. 当温度为20—30 ℃时，D2在24 h内将ATZ完全降解；但在10 ℃和40 ℃下培养36 h时，D2对ATZ的降解率仅为16.33%和43.48%，说明低温和高温都会抑制菌株的代谢作用，这与菌株的酶活性密切相关^[29]. 另外，培养基的酸碱度也会影响细菌酶的合成和催化活性^[9]，细菌表面的电荷分布随着pH的改变而改变 ^[26]. 不同pH条件下，D2对初始浓度为100 mg·L⁻¹（培养温度为30 ℃）ATZ的降解率如图5b所示. 当pH为5.0、7.0和9.0 时，经过24 h，D2对ATZ的降解率分别为到91.42%、100%、100%. 据以往研究报道，pH为5.0和9.0时，阿特拉津降解菌（Enterobacter sp.）的降解率低于70%^[27]，菌株L-6 ^[28] 仅能适应碱性环境，当pH=6时，降解率为45.6%，因此菌株D2对pH具有较高的适应性.

图 5 不同温度和pH条件下菌株的降解效果

Figure 5. Degradation effects of atrazine by D2 with different temperatures and pH

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2.3.3 菌株D2的降解及生长动力学研究

在最佳降解条件下（2%的菌悬液接种量、温度为20 ℃、pH为9.0），将菌株D2接种至初始浓度为100 mg·L⁻¹的ATZ无机盐培养基中，生长及降解动态曲线如图6所示. 菌株D2的生长与ATZ浓度呈较强的负相关（表3，r=−0.983，P＜0.01），随着菌株的生长，阿特拉津的浓度急剧降低. 培养初期D2存在短暂的适应期，OD₆₀₀从0.046增至0.052；培养4 h后进入对数生长期，OD₆₀₀达到0.097，此时随着菌株的大量生长ATZ被快速降解；在培养14 h以后菌株进入静止期，此时菌株数量达到最大值，其OD₆₀₀为0.107，ATZ浓度降为6.41 mg·L⁻¹，降解率达到94.33%，在18 h时ATZ被完全去除. 实验结果表明，阿特拉津浓度的降低与D2的数量密切相关，证明菌株D2具有阿特拉津去除能力.

图 6 菌株D2的降解及生长动力学

Figure 6. Degradation and growth kinetics of D2

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表 3 浓度与OD₆₀₀的相关性分析

Table 3. Correlation analysis between concentration and OD600

	平均值 Average value	标准差 Standard deviation	浓度 Concentration	OD₆₀₀
浓度	41.093	44.110	1
OD₆₀₀	0.080	0.026	−0.983**	1
注：* P<0.05，** P<0.01.

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2.4 阿特拉津降解产物与降解途径研究

菌株D2于含ATZ的无机盐培养基进行培养，取12 h时的样品进行分析，采用高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）测定其降解产物，共检测出6种可能的代谢物（图7 b—g），质荷比（m/z）分别为146.00、184.12、198.13、202.08、212.15、188.07，与已知标准化合物和报道的阿特拉津代谢物的比较，这6种代谢物分别被确定为脱乙基脱异丙基阿特拉津（DACT）、羟基西玛津（HDMA）、羟基阿特拉津（HA）、西玛津（DMA）、阿特拉通（Atraton）和脱乙基阿特拉津（DEA）.

图 7 阿特拉津（a）及中间产物（b—g）的质谱图

Figure 7. The mass spectrometry of atrazine （a） and its intermediate products （b — g）.

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根据产物的结构组成和报道过的阿特拉津降解途径提出菌株D2降解阿特拉津的可能途径，结果如图8所示.

图 8 菌株D2降解阿特拉津的途径分析

Figure 8. The proposed degradation pathway of atrazine by strain D2 based on HPLC-MS.

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途径Ⅰ：首先羟基取代氯，形成脱氯羟基化的阿特拉津（HA），然后甲基取代HA的氢生成阿特拉通（Atraton），HA也可能通过脱甲基化反应转化为羟基西玛津（HDMA）.途径Ⅱ：阿特拉津的异丙基脱甲基化生成西玛津（DMA），然后DMA的氯被一个羟基取代，转化为羟基西玛津（HDMA）.途径Ⅲ：阿特拉津经N-脱烷基反应转化为脱乙基阿特拉津（DEA），随后DEA异丙基化为脱乙基脱异丙基阿特拉津（DACT）. Liu等^[30]在研究土壤中阿特拉津的降解途径时得到了相似的结果，阿特拉津可通过光解、水解及微生物降解转化为羟基阿特拉津、阿特拉通、扑灭津、脱乙基阿特拉津、羟基西玛津、西玛津、去乙基异丙基化阿特拉津等. 而Zhang 等^[31]和郭火生等^[32]还发现羟基阿特拉津可以被进一步水解为三聚氰酸.通过以上总结推测，阿特拉津的降解中间产物还会通过脱甲基化、脱烷基化和水解等产生三聚氰胺二酰胺（DEDIA）、去乙基异丙基化阿特拉津（DACT）和三聚氰酸等副产物.

2.5 菌株D2的降解能力

将本研究中的D2与已报道过具有阿特拉津降解能力的菌株进行对比，结果汇总如表4所示. 目前已经筛选出很多能以阿特拉津为唯一碳源或氮源生长的菌株，并适用于阿特拉津浓度范围为8—100 mg·L⁻¹的废水，但本研究中的新菌株D2具有更优异的降解性能. 已研究的菌株Acinetobacter lwoffii DNS32 ^[32]在 20 ℃和 35 ℃时，对阿特拉津的降解率约为 30%—35%，最佳生长pH为7—8，在酸性及pH高于8的条件下，菌株的生长及降解能力受到抑制；菌株C2^[33]在20 ℃、30 ℃、40 ℃下培养5 d后，降解率分别为86.7%、97.6%和21.9%；菌株SB5^[34]生长的温度范围是25—37 ℃，在pH=8的条件下完全降解ATZ需36 h. 本研究分离出的菌株D2在20 —30 ℃、pH为5.0 — 9.0的范围内，18 h以内即可将100 mg·L⁻¹的阿特拉津完全降解，远远快于培养时间为24 —264 h的其他菌株，且具有更强的pH和温度的适应性，在40 ℃的高温下仍具有一定的活性，降解率高于40%，在10 ℃的条件下，D2对ATZ的降解率仍有近20%. 另外，已报道的菌株大部分来源于北部寒冷地区，而菌株D2来源于江苏省农田土壤，更能适应夏季高温、有机质及氮磷含量低、弱酸性的土壤环境，可成为长三角地区阿特拉津污染土壤和废水修复的微生物资源.

表 4 已报道菌株对阿特拉津的降解效果的比较

Table 4. Comparison of atrazine degradation by strains has been reported

菌种 Strains	浓度/（mg·L⁻¹）Concentation	温度/℃Temperature	pH	地区Region	降解率/% Degradation	时间/h Time	文献来源Literature sources
Klebsiella sp. FH1	50	25	9	吉林	81.5%	264	[13]
LY-2	100	25 — 35	6 — 9	哈尔滨	98.7%	48	[17]
CS3	50	30	7	河北	100%	48	[18]
Arthrobacter sp. ZXY-2	50	30 — 35	8 — 9	哈尔滨	100%	6	[35]
Arthrobacter sp. DNS10	100	30	7.5	哈尔滨	99.41%	24	[36]
Paenarthrobacter sp. W11	100	30	7	吉林	97.1%	60	[37]
Paenarthrobacter sp. W24	100	30	7	吉林	94.2%	72	[38]
Arthrobacter sp. C2	100	30	7 — 9	吉林	100%	72	[33]
Pseudomonas sp.	20	30	/	巴西	99%	24	[39]
Achromobacter sp.	20	30	/	巴西	39%	48	[39]
Pencillium sp. yz11-22N2	8	28	7	/	91.2%	120	[40]
D2	100	20 — 30	5 — 9	江苏	100%	18	本研究

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3. 结论（Conclusions）

（1）从江苏省5个不同区域的农田土壤中筛选出一株以阿特拉津为唯一碳源和氮源生长的菌株D2，属于土壤芽孢杆菌（Solibacillus），该菌株能适应长三角地区环境，并有效降解水体和土壤中的阿特拉津.

（2）在pH 5.0—9.0、温度20—30 ℃的条件下，菌株具有良好的降解能力. 最适条件下，D2能在18 h内将100 mg·L⁻¹的ATZ完全降解，具有较高的耐受性及降解效率.

（3）D2主要通过脱氯羟基化、加氢脱烷基化、甲基化、脱烷基化和水解等将ATZ转化为羟基阿特拉津（HA）、阿特拉通（Atraton）、脱乙基阿特拉津（DEA）、西玛津（DMA）、羟基西玛津（HDMA）和脱乙基脱异丙基阿特拉津（DACT）.

图 1 MnO₂催化臭氧氧化3-CP装置示意图

Figure 1. Schematic diagram of catalytic ozonation of 3-CP with MnO₂

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图 2 纳米二氧化锰的XRD、FESEM、Zeta电位及吸附性能表征

Figure 2. Characterizations of nano manganese dioxide by XRD, FESEM, Zeta potential and adsorption properties

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图 3 不同pH条件下纳米MnO₂催化臭氧化3-CP

Figure 3. Ozonation of 3-CP catalyzed by nano-MnO₂ at different pH

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图 4 MnO₂催化臭氧化3-CP、吸附3-CP以及臭氧化MnO₂后毒性的变化

Figure 4. Changes of toxicity of MnO₂ catalytic ozonation/adsorption 3-CP and ozonation of MnO₂

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图 5 氯离子、羟基自由基和共存有机物对FAC的影响

Figure 5. Effects of (a) chloride ion, (b) hydroxyl radical and (c) coexisting organic compounds on free chlorine

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图 6 自由氯生成机制推测

Figure 6. Presumption of free chlorine generation mechanism

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表 1 急性毒性与各指标的相关性

Table 1. Correlation between acute toxicity and each index

常规指标Conventional index	皮尔森相关系数Pearson correlation coefficient (r)
常规指标Conventional index	pH=1	pH=3	pH=5	pH=7	pH=10	pH=12
3-CP浓度	0.957**	−0.344	0.118	0.232	0.175	0.822**
TOC	0.963**	0.267	0.503	0.542	0.600*	0.924**
自由氯	−0.282	0.764**	0.872**	0.759**	0.969**	0.760**
注：* P<0.05；** P<0.01。　　Note: * means P<0.05; ** means P<0.01.

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表 2 催化臭氧化氯离子过程反应方程式及速率常数

Table 2. Reaction equation and rate constant of catalytic ozonation of chloride ion

编号Number	反应方程式Reaction equation	速率常数Rate constant (k)	参考文献Reference
（1）	${\rm{OH\cdot + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{ClO}}{{\rm{H}}^{\rm{ - }}}{\rm{\cdot}}$	k₁=（4.2±0.2）×10⁹ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（2）	${\rm{ClO}}{{\rm{H}}^{\rm{ - }}}{\rm{\cdot + }}{{\rm{H}}^{\rm{ + }}} \longrightarrow {\rm{C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}}{\rm{ + OH\cdot}}$	k₂=（2.4±0.4）×10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（3）	${\rm{Cl\cdot + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{Cl}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot}}$	k₃=（7.8±0.8）×10⁹ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（4）	${\rm{2Cl}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot}} \longrightarrow {\rm{C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} + {\rm{C}}{{\rm{l}}_{\rm{2}}} \uparrow$	k₄=（3.5±2.7）×10⁹ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（5）	${{\rm{O}}_{\rm{3}}}{\rm{ + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{Cl}}{{\rm{O}}^{\rm{ - }}}{\rm{ + }}{{\rm{O}}_{\rm{2}}}$	k₅=2.48×10⁻³ L·mol⁻¹·s⁻¹	[32]
（6）	${\rm{Cl}}{{\rm{O}}^{\rm{ - }}}{\rm{ + }}{{\rm{H}}^{\rm{ + }}} \longrightarrow {\rm{HClO}}$	k₆=5.0×10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹	[36]
（7）	${\rm{HClO + }}{{\rm{H}}^{\rm{ + }}}{\rm{ + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{C}}{{\rm{l}}_{\rm{2}}} \uparrow + {{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{O}}$	k₇=2.14×10⁴ L²·mol⁻²·s⁻¹	[36]
注：反应（1）—（4）温度为297±2 K，反应（5）—（7）温度为298 K．　　Note: The temperature of reactions (1)—(4) is 297 ± 2 K, and reactions (5)—(7) is 298 K.

编号Number	反应方程式Reaction equation	速率常数Rate constant (k)	参考文献Reference
（1）	${\rm{OH\cdot + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{ClO}}{{\rm{H}}^{\rm{ - }}}{\rm{\cdot}}$	k₁=（4.2±0.2）×10⁹ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（2）	${\rm{ClO}}{{\rm{H}}^{\rm{ - }}}{\rm{\cdot + }}{{\rm{H}}^{\rm{ + }}} \longrightarrow {\rm{C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}}{\rm{ + OH\cdot}}$	k₂=（2.4±0.4）×10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（3）	${\rm{Cl\cdot + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{Cl}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot}}$	k₃=（7.8±0.8）×10⁹ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（4）	${\rm{2Cl}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot}} \longrightarrow {\rm{C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} + {\rm{C}}{{\rm{l}}_{\rm{2}}} \uparrow$	k₄=（3.5±2.7）×10⁹ L·mol⁻¹·s⁻¹	[35]
（5）	${{\rm{O}}_{\rm{3}}}{\rm{ + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{Cl}}{{\rm{O}}^{\rm{ - }}}{\rm{ + }}{{\rm{O}}_{\rm{2}}}$	k₅=2.48×10⁻³ L·mol⁻¹·s⁻¹	[32]
（6）	${\rm{Cl}}{{\rm{O}}^{\rm{ - }}}{\rm{ + }}{{\rm{H}}^{\rm{ + }}} \longrightarrow {\rm{HClO}}$	k₆=5.0×10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹	[36]
（7）	${\rm{HClO + }}{{\rm{H}}^{\rm{ + }}}{\rm{ + C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}} \longrightarrow {\rm{C}}{{\rm{l}}_{\rm{2}}} \uparrow + {{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{O}}$	k₇=2.14×10⁴ L²·mol⁻²·s⁻¹	[36]
注：反应（1）—（4）温度为297±2 K，反应（5）—（7）温度为298 K．　　Note: The temperature of reactions (1)—(4) is 297 ± 2 K, and reactions (5)—(7) is 298 K.

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图( 6) 表( 2)

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1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 主要试剂
1.2 阿特拉津降解菌的筛选与分离纯化
1.3 菌株的鉴定
1.4 菌株生长量的测定及生长模型拟合
1.5 菌株D2最佳降解条件的研究
1.6 阿特拉津及其降解产物的测定
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 阿特拉津高效降解菌株的分离与鉴定
2.2 菌株D2的生长曲线及模型拟合
2.3 菌株D2对阿特拉津的降解特性研究
2.4 阿特拉津降解产物与降解途径研究
2.5 菌株D2的降解能力
3. 结论（Conclusions）

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氯代苯酚类化合物具有高毒性、难降解和生物累积性的特征，是一种常见的持久性有机污染物^[1-3]，且广泛存在于土壤、沉积物、地表和地下水中。为了降低对受纳水体的污染，氯酚废水的处理至关重要。目前对于氯酚类废水的处理方法主要有生物降解法^[4-6]、物理吸附法^[7-8]、高级氧化法^[9-11]等。近年来，高级氧化技术以其氧化能力强、反应速度快、限制少和处理效率高等优点受到众多学者的青睐^[12]。臭氧氧化法是目前最具代表性且最有效的高级氧化法之一。众所周知，臭氧氧化有机物主要的两种方式：一是臭氧分子与有机物的直接反应；二是臭氧分解产生的羟基自由基（OH·）与有机物的间接反应^[13]。纳米二氧化锰作为催化剂能有效促进臭氧催化氧化过程中羟基自由基等活性物质的形成，使其对难降解有机污染物的去除更加迅速、彻底，是催化臭氧化中最常使用的催化剂之一^[14-17]。

目前，很多学者已经对催化臭氧化的降解效率及降解动力学等^[18-19]进行了研究，但鲜有研究其降解过程中的生物毒性变化及其关键的致毒因子。已有研究发现，由于臭氧的部分氧化特性，生成的大量降解中间产物的生物毒性可能大于母体污染物，造成母体污染物浓度降低而总体生物毒性升高的现象^[20].

本研究以3-CP作为模型污染物，探究二氧化锰催化臭氧化中生物毒性的变化规律，并识别高毒性的中间产物。在此基础上，研究催化臭氧化体系处理各类有机化合物过程中自由氯浓度的变化，以揭示高毒性中间产物的产生机理。

3. 结论（Conclusion）

MnO₂催化臭氧化3-氯酚时，生物毒性不随母体污染物和TOC浓度同比例降低而是出现了先升高后下降的现象，尤其是当pH=3时，生物毒性最高值约为初始值的26倍。通过生物毒性与常规指标的相关性分析发现，催化臭氧化3-CP过程中生物毒性的大小和自由氯浓度在pH=3—10时显著相关。催化臭氧化溶液中加入自由氯去除剂亚硫酸钠后，生物毒性几乎全部去除，最高点生物毒性去除率达到100%。故造成生物毒性升高的关键致毒因子是自由氯。在MnO₂催化剂的作用下，3-氯酚发生脱氯作用生成氯离子。当与酚类有机污染物及其中间产物共存时，臭氧分子能够迅速共氧化氯离子，生成次氯酸，造成生物毒性升高。

参考文献 (36)

催化臭氧化3-氯酚中生物毒性的变化

通讯作者: Tel：17706337668，E-mail：madh@njust.edu.cn;

Study on the biological toxicity evolution during catalytic ozonation of 3-chlorophenol

Corresponding author: MA Dehua, madh@njust.edu.cn ;

1. 材料与方法（Materials and methods）

1.1 主要试剂

1.2 阿特拉津降解菌的筛选与分离纯化

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 菌株的形态学观察

1.3.2 生理生化试验

1.3.3 16S rDNA基因序列分析

1.4 菌株生长量的测定及生长模型拟合

1.5 菌株D2最佳降解条件的研究

1.6 阿特拉津及其降解产物的测定

2. 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 阿特拉津高效降解菌株的分离与鉴定

2.2 菌株D2的生长曲线及模型拟合

2.3 菌株D2对阿特拉津的降解特性研究

2.3.1 初始浓度对菌株降解阿特拉津的影响

2.3.2 温度和pH对菌株降解阿特拉津的影响

2.3.3 菌株D2的降解及生长动力学研究

2.4 阿特拉津降解产物与降解途径研究

2.5 菌株D2的降解能力

3. 结论（Conclusions）

计量

出版历程

催化臭氧化3-氯酚中生物毒性的变化

通讯作者: Tel：17706337668，E-mail：madh@njust.edu.cn;

English Abstract

Study on the biological toxicity evolution during catalytic ozonation of 3-chlorophenol

Corresponding author: MA Dehua, madh@njust.edu.cn ;

全文HTML

1.1. 试剂

1.2. 纳米二氧化锰的制备

1.3. 实验装置

1.4. 急性毒性的测定

1.5. 分析测试

2.1. 纳米二氧化锰的表征

2.2. 催化臭氧化实验

2.2.1. 不同pH下纳米二氧化锰的催化降解效果

2.2.2. 不同pH下催化降解过程中毒性变化

2.2.3. 毒性与常规指标相关性分析

2.3. 自由氯生成机制研究

2.3.1. 氯离子对自由氯生成的影响

2.3.2. 羟基自由基对自由氯生成的影响

2.3.3. 共存有机物对自由氯生成的影响

2.3.4. 催化臭氧化中自由氯的生成机制

目录

全文HTML

1.1. 试剂

1.2. 纳米二氧化锰的制备

1.3. 实验装置

1.4. 急性毒性的测定

1.5. 分析测试

2.1. 纳米二氧化锰的表征

2.2. 催化臭氧化实验

2.2.1. 不同pH下纳米二氧化锰的催化降解效果

2.2.2. 不同pH下催化降解过程中毒性变化

2.2.3. 毒性与常规指标相关性分析

2.3. 自由氯生成机制研究

2.3.1. 氯离子对自由氯生成的影响

2.3.2. 羟基自由基对自由氯生成的影响

2.3.3. 共存有机物对自由氯生成的影响

2.3.4. 催化臭氧化中自由氯的生成机制